一种循环肿瘤细胞的分离纯化方法
| 热词 | 细胞 肿瘤 肿瘤细胞 离心 淋巴 分离 4ml 循环 纯化 分钟 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202211520444.9 | 申请日 | 2022-11-29 |
| 公开(公告)号 | CN115896026A | 公开(公告)日 | 2023-04-04 |
| 申请人 | 四川大学华西医院; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 陈飘飘; 詹梓炫; | 第一发明人 | 陈飘飘 |
| 权利人 | 四川大学华西医院 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 四川大学华西医院 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：四川省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：四川省成都市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：四川省成都市武侯区国学巷37号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：610041 |
| 主IPC国际分类 | C12N5/09 | 所有IPC国际分类 | C12N5/09 |
| 专利引用数量 | 5 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京中济纬天专利代理有限公司 | 专利代理人 | 郭萍; |
| 摘要 | 本 发明 提供了一种循环 肿瘤 细胞的分离纯化方法，涉及 生物 医学技术领域，该分离纯化方法包括以下步骤：采集血样置于 冰 盒中；混合血样和缓冲液并且加入淋巴分离液后离心；收集淋巴细胞层和透明分离液层，且加入缓冲液混匀，再次离心；弃去上清后留下沉淀的细胞，加入红细胞裂解液，静置后再次离心；加入胎 牛 血清得到测试液。本发明的分离纯化方法只需要一些常规生化 试剂 ，以及一些简单操作，实现循环肿瘤细胞的富集纯化，降低成本。 | ||
| 权利要求 | 1.一种循环肿瘤细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种循环肿瘤细胞的分离纯化方法技术领域背景技术[0002] 人外周血中的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)是一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是指从肿瘤病灶脱离并播散进入人外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。通常地，循环肿瘤细胞提示了人体内肿瘤的存在以及可能的转移。由于临床上超过90％的癌症死亡都是由转移造成的，而循环肿瘤细胞提供了人体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤转移性病灶的来源，因此，从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。 [0003] 然而，循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10mL血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此，从外周血中高效富集分离并灵敏的检测极少量的CTCs，实现其精准定量是目前临床面临的重要挑战，也是近年来的研究热点。循环肿瘤细胞的精准定量主要包括两步核心策略：(1)捕获和富集，(2)识别和检测。捕获和富集通常涉及循环肿瘤细胞和材料的物理相互作用或抗体‑抗原相互作用；检测与识别包括各种方法和技术，例如荧光显微镜、荧光光谱法、流式细胞术、表面增强拉曼散射仪或电化学方法等。 [0004] 在循环肿瘤细胞富集方面，以往研究多利用对细胞表面特异性蛋白的识别，同时借助磁珠、微流控、电极、纳米材料等辅助分离，实现外周血中CTCs的富集提纯。然而，目前临床应用依然是使用非均相免疫磁珠富集等策略，其过程为非均相、操作复杂耗时、样本通量小、以抗体为识别探针导致成本较高，以及具有一定生物安全隐患。 发明内容[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞的分离纯化方法，以解决现有技术中采用的循环肿瘤细胞富集方法，使用非均相免疫磁珠富集等策略，过程为非均相、操作复杂耗时、样本通量小、以抗体为识别探针导致成本较高，以及具有一定生物安全隐患的技术问题。 [0006] 为了实现上述目的，本发明提供了一种循环肿瘤细胞的分离纯化方法，包括以下步骤： [0007] S1：采集血样置于冰盒中； [0008] S2：混合血样和缓冲液并且加入淋巴分离液后离心； [0009] S3：收集淋巴细胞层和透明分离液层，且加入缓冲液混匀，再次离心； [0010] S4：弃去上清后留下沉淀的细胞，加入红细胞裂解液，静置后再次离心； [0011] S5：加入胎牛血清得到测试液。 [0012] 根据一种可选实施方式，步骤S1中血样为全血或者外周血。 [0014] 根据一种可选实施方式，步骤2和步骤3中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。 [0015] 根据一种可选实施方式，步骤2中离心后的第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。 [0016] 根据一种可选实施方式，步骤2中的磷酸盐缓冲液与血样的体积一致，步骤3中的淋巴细胞层和透明分离液层与磷酸液缓冲液的体积一致。 [0017] 根据一种可选实施方式，步骤2中的离心时间为20分钟，升速为1，降速为1。 [0018] 根据一种可选实施方式，步骤3中的离心时间为7分钟，升速为9，降速为9。 [0019] 本发明提供的循环肿瘤细胞的分离纯化方法，具有以下技术效果： [0020] 该种循环肿瘤细胞的分离纯化方法，只需要一些常规生化试剂，以及一些简单操作，实现循环肿瘤细胞的富集纯化，降低成本，并且处理后的样本，可直接用于多种定量方法中，另外所用试剂和耗材可随时替换使用，不依赖于实验室条件。附图说明 [0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0022] 图1是本发明一实施例循环肿瘤细胞的分离纯化方法的实验流程图； 具体实施方式[0023] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。 [0024] 实施例1： [0025] 本实施例对A549细胞进行分离纯化 [0026] 1)使用一次性密闭乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采血管采集外周血，置于冰盒中； [0027] 2)将取回的4mL血加4mL磷酸盐缓冲液(PBS)吹打混匀； [0028] 3)取两个15mL离心管，每个离心管中加入4mL血和PBS混合液，小心缓慢加入到4mL淋巴分离液中(淋巴分离液用之前反复颠倒混匀)； [0029] 4)4℃，800g离心，升速调为1，降速调为1，离心20分钟；(此时离心管由上至下分为4层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层：为透明分离液层；第四层： 为红细胞层；(上升下降加离心时间大约40分钟)； [0030] 5)收集第二层的环状乳白色淋巴细胞层和第三层的透明分离液层共约4mL，并加入等体积的PBS稀释液混匀，充分混匀后，4℃，2000rpm离心，升速调为9，降速调为9，离心7分钟； [0031] 6)弃去上清留沉淀的细胞，并加入5‑8mL红细胞裂解液，静置10分钟； [0032] 7)4℃，500g分离，升速调为9，降速调为9，离心10min，弃去上清后，沉淀即是所需的淋巴细胞和游离的A549细胞； [0033] 8)加入1mL胎牛血清(FBS)得到测试液。 [0034] 实施例2： [0035] 本实施例对肝癌SMMC‑772细胞进行分离纯化 [0036] 1)使用一次性密闭乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采血管采集外周血，置于冰盒中； [0037] 2)将取回的4mL血加4mL磷酸盐缓冲液(PBS)吹打混匀； [0038] 3)取两个15mL离心管，每个离心管中加入4mL血和PBS混合液，小心缓慢加入到4mL淋巴分离液中(淋巴分离液用之前反复颠倒混匀)； [0039] 4)4℃，800g离心，升速调为1，降速调为1，离心20分钟；(此时离心管由上至下分为4层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层：为透明分离液层；第四层： 为红细胞层；(上升下降加离心时间大约40分钟)； [0040] 5)收集第二层的环状乳白色淋巴细胞层和第三层的透明分离液层共约4mL，并加入等体积的PBS稀释液混匀，充分混匀后，4℃，2000rpm离心，升速调为9，降速调为9，离心7分钟； [0041] 6)弃去上清留沉淀的细胞，并加入5‑8mL红细胞裂解液，静置10分钟； [0042] 7)4℃，500g分离，升速调为9，降速调为9，离心10min，弃去上清后，沉淀即是所需的淋巴细胞和游离的肝癌SMMC‑7721细胞； [0043] 8)加入1mL胎牛血清(FBS)得到测试液。 [0044] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 |
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