| 热词 | 蛋白 质谱 样本 裂解 溶液 蛋白质 脱氧胆酸 氯乙酰胺 胆酸 浓度 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN201910350963.7 | 申请日 | 2019-04-28 |
| 公开(公告)号 | CN110208448A | 公开(公告)日 | 2019-09-06 |
| 申请人 | 北京谷海天目生物医学科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 秦钧; 汪宜; 丁琛; 宋雷; 刘明伟; 杨星; | 第一发明人 | 秦钧 |
| 权利人 | 北京谷海天目生物医学科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 北京谷海天目生物医学科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市海淀区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市海淀区杏石口路80号中央液态冷热源环境系统产业基地项目B区2号楼3层301—183号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：102206 |
| 主IPC国际分类 | G01N30/88 | 所有IPC国际分类 | G01N30/88 ; G01N30/06 |
| 专利引用数量 | 6 | 专利被引用数量 | 1 |
| 专利权利要求数量 | 12 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京康信知识产权代理有限责任公司 | 专利代理人 | 韩建伟; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 蛋白质 组样本处理 试剂 盒 、处理方法及应用。该试剂盒包括：三(2-羰基乙基)磷 盐酸 盐、2,2-二氯乙酰胺、脱 氧 胆酸钠以及缓冲液。应用本发明的技术方案，蛋白质组样本处理前，将本发明试剂盒中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠以及缓冲液配成处理液，其中，通过脱氧胆酸钠来对细胞/组织样本进行裂解和细胞内全蛋白变性，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐作为还原剂，2,2-二氯乙酰胺作为烷基化试剂，蛋白质组样本在处理液中数分钟即可完成裂解与还原烷基化。也就是说，在本发明中裂解与还原、烷基化一步完成，这样使得蛋白质组样本处理流程简单，而且节约了时间。 | ||
| 权利要求 | 1.一种蛋白质组样本处理试剂盒，其特征在于，包括：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠以及缓冲液。 |
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| 说明书全文 | 蛋白质组样本处理试剂盒、处理方法及应用技术领域[0001] 本发明涉及蛋白质组检测技术领域，具体而言，涉及一种蛋白质组样本处理试剂盒、处 理方法及应用。 背景技术[0002] 近年来，质谱技术飞速发展。质谱公司推出了具有超高分辨率的质谱仪，并具有多个检 测器。这种质谱仪配合高压液相使用，极大提高了基于质谱的蛋白质组学检测效率，使得大 规模临床样本蛋白质组数据集构建成为可能。 [0003] 目前，实验室中质谱和液相色谱样品的制备广泛使用8M尿素裂解蛋白，辅以10mM DTT (二硫苏糖醇)、10mM IAA(碘乙酰胺)还原、烷基化后进行消化得到肽样品。在一种典型 的操作中，肽样品首次sRP液相分离采用洗脱乙腈浓度依次为6％、9％、12％、15％、18％、 21％、25％、30％和35％(体积浓度)，得到的9个浓度洗脱溶液合并(6％和25％合并，9％ 和 30％合并，12％和35％合并)后分为6组分的肽段，真空抽干后用于质谱检测。但是，这 种样本制备流程繁琐、制备周期长，效率低下，不利于推广到临床广泛应用；而且，肽样品 首次sRP液相分离效率低下，耗费质谱机时过多，产生巨额检测费用，超出人民群众的平均 支付能力。 发明内容[0004] 本发明旨在提供一种蛋白质组样本处理试剂盒、处理方法及应用，以解决现有技术中蛋 白质组样本处理流程繁琐、时间长的技术问题。 [0006] 进一步的，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液，摩尔浓度为 50～150mM；2,2-二氯乙酰胺为2,2-二氯乙酰胺溶液，摩尔浓度为300～500mM；脱氧胆酸钠为 脱氧胆酸钠溶液，质量体积浓度为5％～20％W/V；优选的，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的摩 尔浓度为100mM；2,2-二氯乙酰胺溶液的摩尔浓度为400mM；脱氧胆酸钠溶液的质量体积浓 度为5％～20％W/V；更优选的，脱氧胆酸钠溶液质量体积浓度为10％W/V。 [0007] 进一步的，试剂盒中的试剂使用时须做稀释使三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的终浓度为 5～15mM；2,2-二氯乙酰胺的终浓度为30～50mM；脱氧胆酸钠的终浓度为0.5％～2％W/V；优 选的，试剂盒包含摩尔浓度为100mM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液，摩尔浓度为400mM的 2,2-二氯乙酰胺溶液，质量体积浓度为5％～20％W/V的脱氧胆酸钠溶液，使用时，按照三(2- 羰基乙基)磷盐酸盐溶液：2,2-二氯乙酰胺溶液：脱氧胆酸钠溶液：缓冲液：质谱水体积比为1：1：1：1：6配制成混合溶液。 [0008] 进一步地，缓冲液为Tris-HCl pH＝8.0～8.8。 [0009] 根据本发明的另一方面，提供了一种蛋白质组样本的处理方法。该处理方法包括采用上 述任一种蛋白质组样本处理试剂盒进行处理。 [0010] 进一步地，包括以下步骤：S1，配置包含三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱 氧胆酸钠和缓冲液的处理液；S2，将蛋白质组样本加入处理液后加热变性，然后进行超声裂 解，得到裂解液；S3，将裂解液离心吸取上清，即得到全蛋白裂解液；S4，酶消化全蛋白裂 解液，得到肽样品；以及S5，对肽样品进行sRP液相分离，得到的肽段用于质谱检测。 [0011] 进一步地，处理液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为10mM；2,2-二氯乙酰胺的浓度为 40mM；脱氧胆酸钠的浓度为0.5％～2％W/V。 [0013] 进一步地，S2中，加热变性的温度为90～98℃，时间为1～6min；优选的，超声裂解的时 间为2～5分钟，其中3秒钟超声，3秒钟间歇，振幅25％，超声裂解之后置于冰上静置裂解 15分钟。 [0014] 进一步地，处理方法还包括对S3中得到的全蛋白裂解液进行蛋白浓度测定的步骤；优选 的，S4中采用胰酶消化全蛋白裂解液。 [0015] 进一步地，sRP液相分离包括：将肽样品使用反相C18分离柱进行分离，洗脱乙腈体积 浓度依次为12％、21％和35％，合并12％和35％的洗脱液，得到2组分的肽段，真空抽干后 用于质谱检测；优选的，在使用C18分离柱之前使用体积浓度为40％～80％的乙腈进行冲洗， 然后使用pH＝10的缓冲液平衡C18分离柱；优选的，质谱检测为全蛋白深度覆盖质谱检测； 更优选的，所述质谱检测的条件为离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级质谱分辨率120000， AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300～1400；二级质谱母离子采用数据依 赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms，动态排除 18s， 质谱采集时间150分钟。 [0016] 根据本发明的再一方面，提供了一种如上述蛋白质组样本的处理方法在蛋白质组质谱检 测中的应用；优选的，蛋白质组样本为胃癌蛋白。 [0017] 应用本发明的技术方案，蛋白质组样本处理前，将本发明试剂盒中的三(2-羰基乙基)磷盐 酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠以及缓冲液配成处理液，其中，通过脱氧胆酸钠来对细胞 /组织样本进行裂解和细胞内全蛋白变性，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐作为还原剂，2,2-二氯乙酰 胺作为烷基化试剂，蛋白质组样本在处理液中数分钟即可完成裂解与还原烷基化。也就是说， 在本发明中裂解与还原、烷基化一步完成，这样使得蛋白质组样本处理流程简单，而且节约 了时间。附图说明 [0019] 图1示出了实施例2Fusion质谱单针深度覆盖结果，三次重复性实验稳定达到6000+蛋白 鉴定数。 [0020] 图2示出了实施例2三次生物重复实验相关性：均在0.9以上。 [0021] 图3示出了实施例1三次重复实验中蛋白检测数目，其中70％蛋白数目在三次重复实验 中都能够检测到。 具体实施方式[0022] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 [0023] 目前，现有技术中蛋白质组样本处理存在流程繁琐、制备周期长，效率低下等问题，这 很不利于蛋白质组质谱检测推广到临床广泛应用。基于目前的状况，本发明提出了下列技术 方案，以解决现有技术中蛋白质组样本处理流程繁琐、时间长的技术问题。 [0024] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种蛋白质组样本处理试剂盒。该蛋白质组样本 处理试剂盒包括：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、2,2-二氯乙酰胺(CAA)、脱氧胆酸钠(DOC， 一种可以和胰酶兼容的表面活性剂)以及缓冲液。 [0025] 应用本发明的技术方案，蛋白质组样本处理前，将本发明试剂盒中的三(2-羰基乙基)磷盐 酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠以及缓冲液配成处理液，其中，通过脱氧胆酸钠来对细胞 /组织样本进行裂解和细胞内全蛋白变性，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐作为还原剂，2,2-二氯乙酰 胺作为烷基化试剂，蛋白质组样本在处理液中数分钟即可完成裂解与还原烷基化。也就是说， 在本发明中裂解与还原、烷基化一步完成，这样使得蛋白质组样本处理流程简单，而且节约 了时间。另外，本发明试剂盒较常规的8M尿素法处理蛋白质组样本除了具备操作方便快捷 的优点外，在后续检测中还能鉴定到更多的目的肽段。 [0026] 优选的，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液，摩尔浓度为50～150mM； 2,2-二氯乙酰胺为2,2-二氯乙酰胺溶液，摩尔浓度为300～500mM；脱氧胆酸钠为脱氧胆酸钠溶 液，质量体积浓度为5％～20％W/V。在此浓度下，便于试剂盒的保存，使用时稀释方便。更优 选的，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的浓度为100mM；2,2-二氯乙酰胺溶液的浓度为400mM； 脱氧胆酸钠溶液的浓度为10％W/V(g/mL)。试剂盒中的试剂使用时须做稀释使三(2-羰基乙 基)磷盐酸盐的终浓度为5～15mM；2,2-二氯乙酰胺的终浓度为30～ 50mM；脱氧胆酸钠的终浓 度为0.5％～2％W/V。在此浓度范围内能够更快更好的处理蛋白质组样品。 [0027] 在本发明一优选的实施例中，所述试剂盒包含摩尔浓度为100mM的三(2-羰基乙基)磷盐 酸盐溶液，摩尔浓度为400mM的2,2-二氯乙酰胺溶液，质量体积浓度为5％～20％W/V的脱氧 胆酸钠溶液，使用时，按照三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液：2,2-二氯乙酰胺溶液：脱氧胆酸钠 溶液：缓冲液：质谱水体积比为1：1：1：1：6配制成混合溶液。 [0028] 缓冲液能够起到pH调节作用，为了使处理后的蛋白质组样品能够更快更好的进行酶解， 优选的，缓冲液为Tris-HCl pH＝8.8，以保证处理后的蛋白质组样品pH>8.0；由于本发明中 三(2-羰基乙基)磷盐酸盐不影响胰酶的功能，所以，采用本发明试剂盒处理后的蛋白质组样品 能采用胰酶进行溶液内酶解，可以进一步提高蛋白质组样品处理的效率，缩短时间，推进临 床应用的推广。 [0029] 在本发明的整体发明构思下，根据本发明另一典型的实施方式，提供了一种蛋白质组样 本的处理方法。该方法包括采用上述蛋白质组样本处理试剂盒进行处理。蛋白质组样本处理 前，将本发明试剂盒中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠以及缓冲液 配成处理液，其中，通过脱氧胆酸钠来对细胞/组织样本进行裂解和细胞内全蛋白变性，三(2- 羰基乙基)磷盐酸盐作为还原剂，2,2-二氯乙酰胺作为烷基化试剂，蛋白质组样本在处理液中数 分钟即可完成裂解与还原烷基化。也就是说，在本发明中裂解与还原、烷基化一步完成，这 样使得蛋白质组样本处理流程简单，而且节约了时间。 [0030] 在本发明一种典型的实施方式中，蛋白质组样本的处理方法包括以下步骤：S1，配置包 含三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、2,2-二氯乙酰胺、脱氧胆酸钠和缓冲液的处理液；S2，将蛋白质 组样本加入处理液后加热变性，然后进行超声裂解，得到裂解液；S3，将裂解液离心吸取上 清，即得到全蛋白裂解液；S4，酶消化全蛋白裂解液，得到肽样品；以及S5，对肽样品进行 sRP液相分离，得到的肽段用于质谱检测。 [0031] 由于本发明中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐不影响胰酶的功能，所以，采用本发明试剂盒处理后 的蛋白质组样品能采用胰酶进行溶液内酶解，可以进一步提高蛋白质组样品处理的效率，缩短时 间。 [0032] 优选的，处理液中所述处理液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为5～15mM；2,2-二氯乙 酰胺的浓度为30～50mM；脱氧胆酸钠的浓度为0.5％～2％W/V。 [0033] 为了更充分的处理蛋白质组样本，S2中，处理液与蛋白质组样本的体积质量比为3～8：1， 优选为5:1；优选的，将蛋白质组样本加入处理液后进行研磨。更优选的，S2中，加热变性的 温度为90～98℃，优选为95℃，时间为5min，使蛋白进行充分变性。超声裂解的时间为2～5 分钟(优选为3分钟)，其中3秒钟超声，3秒钟间歇，振幅25％，超声裂解之后置于冰上静 置裂解15分钟。 [0034] 为了方便后续实验，处理方法还包括对S3中得到的全蛋白裂解液进行蛋白浓度测定的步 骤。 [0035] 在本发明一种典型的实施方式中，sRP液相分离包括：将肽样品使用反相C18分离柱进 行分离，洗脱乙腈体积浓度依次为12％、21％和35％，合并12％和35％的洗脱液，得到2组 分的肽段，真空抽干后用于质谱检测。如此，将现有技术中9个洗脱浓度做优化至12％、 21％、 和35％(体积浓度)3个梯度洗脱溶液，然后12％和35％合并，分为2组分的肽段，极大的 节约了质谱机时与检测费用，同时不影响鉴定效果，能极大的加快检测速度；特别是，在本 发明的试剂盒及方法应用于胃癌蛋白质组的检测，能够极大的加快利用胃癌分型的199个蛋 白标志物，将胃癌的精准分型、预后推广到临床的速度。 [0036] 优选的，在使用C18分离柱之前使用体积浓度为40％～80％(优选50％)的乙腈进行冲洗， 然后使用pH＝10的缓冲液平衡C18分离柱；本发明处理后的蛋白质组样品可用于质谱检测等， 例如质谱检测为全蛋白深度覆盖质谱检测。更优选的，质谱检测的条件为离子扫描模式，电 喷雾电压2kV，一级质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核 比300～1400；二级质谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3， 最大离子注入时间35ms，动态排除18s，质谱采集时间150分钟。 [0037] 在本发明一种典型的实施方式中，如上述蛋白质组样本的处理方法在蛋白质组质谱检测 中的应用；由于采用本发明的试剂盒及方法处理的蛋白质组样本操作简单、时间短，且费用 低，所以很适合用于临床检测，例如胃癌检测。 [0038] 在本发明中通过DOC(脱氧胆酸钠，一种可以和胰酶兼容的表面活性剂)来对细胞/组织 样本进行裂解和细胞内全蛋白变性，而且处理液中的硫醇还原剂TCEP(三(2-羰基乙基)磷盐 酸盐)和烷基化试剂CAA(2,2-二氯乙酰胺)在样品95℃热变性和超声破碎过程中同时对样 品全蛋白进行还原烷基化，并且在后续实验中仍然用溶液内酶解的方法对样品蛋白进行酶解 处理，最终得到的肽段用于sRP液相分离12％、21％、和35％(体积浓度)3个梯度洗脱溶 液(12％和35％合并)分为2组分的肽段，能极大的加快检测速度。 [0039] 下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。 [0040] 实施例1 [0041] 本实施例试剂盒包含A、B、C、D四种溶液，成分如下表1： [0042] 表1 [0043]溶液名称 成分 A Tris-HCl pH＝8.8 B 400mM CAA溶液 C 100mM TCEP溶液 D 10％(W/V)DOC溶液 [0044] 蛋白质组样本处理前，先将试剂盒中A、B、C三种溶液与质谱水按照1:1:1:6的配方配制 成混合溶液，最后再加入1份的D溶液，混合均匀，配制完成处理液。 [0045] 本实施例样本：胃癌组织和癌旁正常组织 [0046] 操作如下： [0047] 1、称取空EP管重量并做好标记。每一对癌组织(Tumor，T)及配对的癌旁正常组织(Nearby tissue,N)样本保证同时平行处理。组织样本由-80℃取出后，首先在EP管内称重并 核对、记录，埋入冰盒。在EP管中加入约5倍处理液，使用一次性研磨棒碾碎。 [0048] 2、把匀浆化的组织样本于95℃金属浴上加热变性5min后冰上冷却。此时完成组织样本 初步破碎、蛋白变性和还原烷基化。随后进行三分钟超声裂解(3秒开始，3秒间歇，振幅25％)， 之后置于冰上裂解15分钟，期间不时弹动。 [0049] 3、裂解液于14000g，15℃条件下离心10分钟，吸取上清至新EP管，记录上清体积，即 为全蛋白裂解液。 [0050] 4、考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定，记录蛋白浓度。每例样本取相当于100μg 全蛋白的裂解液，并用50mM NH4HCO3溶液补充体积至100μl，余下部分存于-80℃冰箱，登 记入库。 [0051] 5、按照胰酶：蛋白为1：50的比例(质量比)，确定用于消化蛋白的胰酶量，在全蛋白 裂解液中加入3/4胰酶的量，全部转入0.5ml离心管中，37℃旋转消化过夜。次日添加剩余 1/4胰酶，消化4小时。消化完成后加入1/100体积甲酸终止消化，并离心取上清，于离心浓 缩仪中旋干，得到消化后肽样品。每一个组织样本对应一个肽样品即胃癌蛋白样品。 [0052] 6、sRP液相分离：肽样品首次分离，使用用Tip头填充的反相C18分离柱。该反相C18 分离柱是在Tip头底部制作C18筛板，将C18填料悬浮于乙腈并填充于Tip头中，制作为分 离柱。使用50％乙腈对该分离柱进行两次冲洗，pH＝10的缓冲液(10mM碳酸氢铵)平衡分 离柱，同时使用pH＝10的缓冲液对旋干后的肽样品复溶，复溶后的肽样品重复四次载入分离 柱，之后采用逐渐升高的梯度比例乙腈溶液进行肽样品洗脱，洗脱乙腈浓度依次为12％、21％、 和35％(体积浓度)，得到的3个浓度洗脱溶液合并(12％和35％合并)分为2组分的肽段， 于离心浓缩仪中旋干后用于质谱检测。 [0053] 7、将洗脱后的各组分肽段组分使用10％甲酸水溶液溶解，取5μL进行液质联用系统检测。 采用赛默飞世尔Fusion质谱和nLC1000液相系统，30cm分析柱，150分钟检测梯度。色谱条 件：预柱2cm，填料为3μ粒径C18粉末，分析柱30cm，填料为1.9μm粒径C18粉末，流动 相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B相梯度5％-40％，液相梯 度150分钟。流动相流速为600nL/min。质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级 质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300-1400；二级质 谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms， 动态排除18s，质谱采集时间150分钟。搜库：以Mascot搜索引擎对数据进行检索。蛋白酶 选择trypsin，最大漏切2个位点，一级搜索质量偏差不大于20ppm，二级搜索质量偏差不大 于 0.5Da。固定修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，使用 正反库交叉搜索，蛋白水平设定1％错误发现率。 [0054] 8、搜库：基于Proteome Discovery平台搜库，以Mascot搜索引擎对数据进行检索。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，蛋白水平 1％错误发 现率。 [0055] 实施例2 [0056] 本实施例试剂盒包含A、B、C、D四种溶液，成分如下表2： [0057] 表2 [0058]溶液名称 成分 A Tris-HCl pH＝8.8 B 400mM CAA溶液 C 100mM TCEP溶液 D 10％(W/V)DOC溶液 [0059] 蛋白质组样本处理前，先将试剂盒中A、B、C三种溶液与质谱水按照1:1:1:6的配方配制 成混合溶液，最后再加入1份的D溶液，混合均匀，配制完成处理液。 [0060] 本实施例样本：胃癌组织和癌旁正常组织 [0061] 操作如下： [0062] 1、称取空EP管重量并做好标记。每一对癌组织(Tumor，T)及配对的癌旁正常组织 (Nearby tissue,N)样本保证同时平行处理。组织样本由-80℃取出后，首先在EP管内称重并 核对、记录，埋入冰盒。在EP管中加入约5倍处理液，使用一次性研磨棒碾碎。 [0063] 2、把匀浆化的组织样本于95℃金属浴上加热变性5min后冰上冷却。此时完成组织样本 初步破碎、蛋白变性和还原烷基化。随后进行三分钟超声裂解(3秒开始，3秒间歇，振幅25％)， 之后置于冰上裂解15分钟，期间不时弹动。 [0064] 3、裂解液于14000g，15℃条件下离心10分钟，吸取上清至新EP管，记录上清体积，即 为全蛋白裂解液。 [0065] 4、考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定，记录蛋白浓度。每例样本取相当于100μg 全蛋白的裂解液，并用50mM NH4HCO3溶液补充体积至100μl，余下部分存于-80℃冰箱，登 记入库。 [0066] 5、按照胰酶：蛋白为1：50的比例(质量比)，确定用于消化蛋白的胰酶量，在全蛋白 裂解液中加入3/4胰酶的量，全部转入0.5ml离心管中，37℃旋转消化过夜。次日添加剩余 1/4胰酶，消化4小时。消化完成后加入1/100体积甲酸终止消化，并离心取上清，于离心浓 缩仪中旋干，得到消化后肽样品。每一个组织样本对应一个肽样品即胃癌蛋白样品。 [0067] 6、将旋干后的肽段使用10％甲酸水溶液溶解，取5μL进行液质联用系统检测。采用赛默 飞世尔Fusion质谱和nLC1000液相系统，30cm分析柱，150分钟检测梯度。色谱条件：预柱 2cm，填料为3μ粒径C18粉末，分析柱30cm，填料为1.9μm粒径C18粉末，流动相A为0.1％ 甲酸水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B相梯度5％-40％，液相梯度150分钟。 流动相流速为600nL/min。质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级质谱分辨率 120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300-1400；二级质谱母离子采 用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms，动态排 除 18s，质谱采集时间150分钟。搜库：以Mascot搜索引擎对数据进行检索。蛋白酶选择trypsin， 最大漏切2个位点，一级搜索质量偏差不大于20ppm，二级搜索质量偏差不大于 0.5Da。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，使用正反库交叉搜 索，蛋白水平设定1％错误发现率。 [0068] 7、搜库：基于Proteome Discovery平台搜库，以Mascot搜索引擎对数据进行检索。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，蛋白水平 1％错误发 现率。 [0069] 实施例3 [0070] 本实施例试剂盒包含A、B、C、D四种溶液，成分如下表3： [0071] 表3 [0072]溶液名称 成分 A Tris-HCl pH＝8.8 B 400mM CAA溶液 C 100mM TCEP溶液 D 10％(W/V)DOC溶液 [0073] 蛋白质组样本处理前，先将试剂盒中A、B、C三种溶液与质谱水按照1:1:1:6的配方配制 成混合溶液，最后再加入1份的D溶液，混合均匀，配制完成处理液。 [0074] 本实施例样本：胃癌组织和癌旁正常组织 [0075] 操作如下： [0076] 1、称取空EP管重量并做好标记。每一对癌组织(Tumor，T)及配对的癌旁正常组织 (Nearby tissue,N)样本保证同时平行处理。组织样本由-80℃取出后，首先在EP管内称重并 核对、记录，埋入冰盒。在EP管中加入约5倍处理液，使用一次性研磨棒碾碎。 [0077] 2、把匀浆化的组织样本于95℃金属浴上加热变性5min后冰上冷却。此时完成组织样本 初步破碎、蛋白变性和还原烷基化。随后进行三分钟超声裂解(3秒开始，3秒间歇，振幅25％)， 之后置于冰上裂解15分钟，期间不时弹动。 [0078] 3、裂解液于14000g，15℃条件下离心10分钟，吸取上清至新EP管，记录上清体积，即 为全蛋白裂解液。 [0079] 4、考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定，记录蛋白浓度。每例样本取相当于100μg 全蛋白的裂解液，并用50mM NH4HCO3溶液补充体积至100μl，余下部分存于-80℃冰箱，登 记入库。 [0080] 5、按照胰酶：蛋白为1：50的比例(质量比)，确定用于消化蛋白的胰酶量，在全蛋白 裂解液中加入3/4胰酶的量，全部转入0.5ml离心管中，37℃旋转消化过夜。次日添加剩余 1/4胰酶，消化4小时。消化完成后加入1/100体积甲酸终止消化，并离心取上清，于离心浓 缩仪中旋干，得到消化后肽样品。每一个组织样本对应一个肽样品即胃癌蛋白样品。 [0081] 6、sRP液相分离：肽样品首次分离，使用用Tip头填充的反相C18分离柱。该反相C18 分离柱是在Tip头底部制作C18筛板，将C18填料悬浮于乙腈并填充于Tip头中，制作为分 离柱。使用50％乙腈对该分离柱进行两次冲洗，pH＝10的缓冲液(10mM碳酸氢铵)平衡分 离柱，同时使用pH＝10的缓冲液对旋干后的肽样品复溶，复溶后的肽样品重复四次载入分离 柱，之后采用逐渐升高的梯度比例乙腈溶液进行肽样品洗脱，洗脱乙腈浓度依次为12％、21％、 和35％(体积浓度)，得到的3个浓度洗脱溶液即为3组分的肽段，于离心浓缩仪中旋干后用 于质谱检测。 [0082] 7、将洗脱后的各组分肽段组分使用10％甲酸水溶液溶解，取5μL进行液质联用系统检测。 采用赛默飞世尔Fusion质谱和nLC1000液相系统，30cm分析柱，150分钟检测梯度。色谱条 件：预柱2cm，填料为3μ粒径C18粉末，分析柱30cm，填料为1.9μm粒径C18粉末，流动 相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B相梯度5％-40％，液相梯 度150分钟。流动相流速为600nL/min。质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级 质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300-1400；二级质 谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms， 动态排除18s，质谱采集时间150分钟。搜库：以Mascot搜索引擎对数据进行检索。蛋白酶 选择trypsin，最大漏切2个位点，一级搜索质量偏差不大于20ppm，二级搜索质量偏差不大 于 0.5Da。固定修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，使用 正反库交叉搜索，蛋白水平设定1％错误发现率。 [0083] 8、搜库：基于Proteome Discovery平台搜库，以Mascot搜索引擎对数据进行检索。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，蛋白水平 1％错误发 现率。 [0084] 上述实施例1、实施例2、实施例3结果如下： [0085] 图1示出了实施例2Fusion质谱单针深度覆盖结果，三次重复性实验稳定达到6000+蛋白 鉴定数。 [0086] 图2示出了实施例2三次生物重复实验相关性：均在0.9以上。 [0087] 表4示出了实施例2单组份单针与实施例1两组份双针、实施例3三组分三针蛋白鉴定 结果对比，说明采用两组份双针的方法较单组份单针蛋白鉴定数有很大的提升，并且与三组 分三针蛋白鉴定数非常接近，是一种成熟的方法(其中组分数为1的是实施例2的结果，组 分数为2的为实施例1的结果，组分数为3的为实施例3的结果；F1、F2、F3分别表示各实 施例中的各组分)。 [0088] 表4 [0089] [0090] 图3示出了实施例1三次重复实验中蛋白检测数目，其中70％蛋白数目在三次重复实验 中都能够检测到。 [0091] 如方法所示，样本处理步骤简单、便捷，相比原技术方法节省2h的制备时间，节省150min 质谱机时，极大的提高了效率。 [0092] 实施例4 [0093] 本实施例试剂盒包含A、B、C、D四种溶液，成分如下表5： [0094] 表5 [0095]溶液名称 成分 A Tris-HCl pH＝8.8 B 400mM CAA溶液 C 100mM TCEP溶液 D 5％(W/V)DOC溶液 [0096] 蛋白质组样本处理前，先将试剂盒中A、B、C三种溶液与质谱水按照1:1:1:6的配方配制 成混合溶液，最后再加入1份的D溶液，混合均匀，配制完成处理液。 [0097] 本实施例样本：胃癌组织和癌旁正常组织 [0098] 操作如下： [0099] 1、称取空EP管重量并做好标记。每一对癌组织(Tumor，T)及配对的癌旁正常组织 (Nearby tissue,N)样本保证同时平行处理。组织样本由-80℃取出后，首先在EP管内称重并 核对、记录，埋入冰盒。在EP管中加入约5倍处理液，使用一次性研磨棒碾碎。 [0100] 2、把匀浆化的组织样本于95℃金属浴上加热变性5min后冰上冷却。此时完成组织样本 初步破碎、蛋白变性和还原烷基化。随后进行三分钟超声裂解(3秒开始，3秒间歇，振幅25％)， 之后置于冰上裂解15分钟，期间不时弹动。 [0101] 3、裂解液于14000g，15℃条件下离心10分钟，吸取上清至新EP管，记录上清体积，即 为全蛋白裂解液。 [0102] 4、考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定，记录蛋白浓度。每例样本取相当于100μg 全蛋白的裂解液，并用50mM NH4HCO3溶液补充体积至100μl，余下部分存于-80℃冰箱，登 记入库。 [0103] 5、按照胰酶：蛋白为1：50的比例(质量比)，确定用于消化蛋白的胰酶量，在全蛋白 裂解液中加入3/4胰酶的量，全部转入0.5ml离心管中，37℃旋转消化过夜。次日添加剩余 1/4胰酶，消化4小时。消化完成后加入1/100体积甲酸终止消化，并离心取上清，于离心浓 缩仪中旋干，得到消化后肽样品。每一个组织样本对应一个肽样品即胃癌蛋白样品。 [0104] 6、sRP液相分离：肽样品首次分离，使用用Tip头填充的反相C18分离柱。该反相C18 分离柱是在Tip头底部制作C18筛板，将C18填料悬浮于乙腈并填充于Tip头中，制作为分 离柱。使用50％乙腈对该分离柱进行两次冲洗，pH＝10的缓冲液(10mM碳酸氢铵)平衡分 离柱，同时使用pH＝10的缓冲液对旋干后的肽样品复溶，复溶后的肽样品重复四次载入分离 柱，之后采用逐渐升高的梯度比例乙腈溶液进行肽样品洗脱，洗脱乙腈浓度依次为12％、21％、 和35％(体积浓度)，得到的3个浓度洗脱溶液合并(12％和35％合并)分为2组分的肽段， 于离心浓缩仪中旋干后用于质谱检测。 [0105] 7、将洗脱后的各组分肽段组分使用10％甲酸水溶液溶解，取5μL进行液质联用系统检测。 采用赛默飞世尔Fusion质谱和nLC1000液相系统，30cm分析柱，150分钟检测梯度。色谱条 件：预柱2cm，填料为3μ粒径C18粉末，分析柱30cm，填料为1.9μm粒径C18粉末，流动 相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B相梯度5％-40％，液相梯 度150分钟。流动相流速为600nL/min。质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级 质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300-1400；二级质 谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms， 动态排除18s，质谱采集时间150分钟。搜库：以Mascot搜索引擎对数据进行检索。蛋白酶 选择trypsin，最大漏切2个位点，一级搜索质量偏差不大于20ppm，二级搜索质量偏差不大 于 0.5Da。固定修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，使用 正反库交叉搜索，蛋白水平设定1％错误发现率。 [0106] 8、搜库：基于Proteome Discovery平台搜库，以Mascot搜索引擎对数据进行检索。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，蛋白水平 1％错误发 现率。 [0107] 实施例5 [0108] 本实施例试剂盒包含A、B、C、D四种溶液，成分如下表6： [0109] 表6 [0110] [0111] [0112] 蛋白质组样本处理前，先将试剂盒中A、B、C三种溶液与质谱水按照1:1:1:6的配方配制 成混合溶液，最后再加入1份的D溶液，混合均匀，配制完成处理液。 [0113] 本实施例样本：胃癌组织和癌旁正常组织 [0114] 操作如下： [0115] 1、称取空EP管重量并做好标记。每一对癌组织(Tumor，T)及配对的癌旁正常组织 (Nearby tissue,N)样本保证同时平行处理。组织样本由-80℃取出后，首先在EP管内称重并 核对、记录，埋入冰盒。在EP管中加入约5倍处理液，使用一次性研磨棒碾碎。 [0116] 2、把匀浆化的组织样本于95℃金属浴上加热变性5min后冰上冷却。此时完成组织样本 初步破碎、蛋白变性和还原烷基化。随后进行三分钟超声裂解(3秒开始，3秒间歇，振幅25％)， 之后置于冰上裂解15分钟，期间不时弹动。 [0117] 3、裂解液于14000g，15℃条件下离心10分钟，吸取上清至新EP管，记录上清体积，即 为全蛋白裂解液。 [0118] 4、考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定，记录蛋白浓度。每例样本取相当于100μg 全蛋白的裂解液，并用50mM NH4HCO3溶液补充体积至100μl，余下部分存于-80℃冰箱，登 记入库。 [0119] 5、按照胰酶：蛋白为1：50的比例(质量比)，确定用于消化蛋白的胰酶量，在全蛋白 裂解液中加入3/4胰酶的量，全部转入0.5ml离心管中，37℃旋转消化过夜。次日添加剩余 1/4胰酶，消化4小时。消化完成后加入1/100体积甲酸终止消化，并离心取上清，于离心浓 缩仪中旋干，得到消化后肽样品。每一个组织样本对应一个肽样品即胃癌蛋白样品。 [0120] 6、sRP液相分离：肽样品首次分离，使用用Tip头填充的反相C18分离柱。该反相C18 分离柱是在Tip头底部制作C18筛板，将C18填料悬浮于乙腈并填充于Tip头中，制作为分 离柱。使用50％乙腈对该分离柱进行两次冲洗，pH＝10的缓冲液(10mM碳酸氢铵)平衡分 离柱，同时使用pH＝10的缓冲液对旋干后的肽样品复溶，复溶后的肽样品重复四次载入分离 柱，之后采用逐渐升高的梯度比例乙腈溶液进行肽样品洗脱，洗脱乙腈浓度依次为12％、21％、 和35％(体积浓度)，得到的3个浓度洗脱溶液合并(12％和35％合并)分为2组分的肽段， 于离心浓缩仪中旋干后用于质谱检测。 [0121] 7、将洗脱后的各组分肽段组分使用10％甲酸水溶液溶解，取5μL进行液质联用系统检测。 采用赛默飞世尔Fusion质谱和nLC1000液相系统，30cm分析柱，150分钟检测梯度。色谱条 件：预柱2cm，填料为3μ粒径C18粉末，分析柱30cm，填料为1.9μm粒径C18粉末，流动 相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B相梯度5％-40％，液相梯 度150分钟。流动相流速为600nL/min。质谱条件：正离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级 质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300-1400；二级质 谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为35％，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms， 动态排除18s，质谱采集时间150分钟。搜库：以Mascot搜索引擎对数据进行检索。蛋白酶 选择trypsin，最大漏切2个位点，一级搜索质量偏差不大于20ppm，二级搜索质量偏差不大 于 0.5Da。固定修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，使用 正反库交叉搜索，蛋白水平设定1％错误发现率。 [0122] 8、搜库：基于Proteome Discovery平台搜库，以Mascot搜索引擎对数据进行检索。固定 修饰为Alkylation，可变修饰为Acetyl(Protein N-term)与Oxidation(M)，蛋白水平 1％错误发 现率。 [0123] 实施例1、实施例4、实施例5、对比结果如表7所示： [0124] 表7 [0125]实验 组分 蛋白数 肽段 PSM 谱图 实施例1 F1+F2 8174 57801 97577 278968 实施例4 F1+F2 7235 43826 76792 205843 实施例5 F1+F2 8356 59604 99873 302618 [0126] 实施例1缓冲液为Tris-HCl PH＝8.8，10％(W/V)DOC溶液，可鉴定到8174个蛋白； [0127] 实施例4缓冲液为Tris-HCl PH＝8.8，5％(W/V)DOC溶液，可鉴定到7235个蛋白，DOC 质量体积浓度过低，裂解效率降低，蛋白鉴定数有所下调； [0128] 实施例5缓冲液为Tris-HCl PH＝8.0，20％(W/V)DOC溶液，可鉴定到8356个蛋白，蛋 白鉴定数没有太大的提升。实际使用中，脱氧胆酸钠使用量过大，会使质谱仪器性能降低， 加大仪器的清洗频次，影响鉴定效率，因此不宜使用质量体积浓度过高的DOC溶液。因而选 择10％(W/V)DOC溶液更为有效。 [0129] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果： [0130] 1)蛋白质组样本裂解在本发明试剂盒试剂配制的处理液中数分钟即完成了裂解与还原烷 基化，而现有广泛使用的方法则是使用8M脲进行裂解，然后进行梯度稀释浓度至2M以下之 后，取100μg全蛋白裂解液，加入10mM DTT，在56℃摇床震荡30分钟，冷却至室温后加入 10mM IAA,置于避光条件下30分钟，完成还原烷基化过程，操作繁琐，且费时。 [0131] 2)sRP液相分离优化过程，最终仅需得到2个组分，而不影响鉴定效果。而现有的sRP 液相分离操作实操过程费时费力，无法推广到临床的批量制备。本发明优化后，同等人力、 同等时间的情况下能完成5倍样本量的制备，极大的提高了生产效率，便于扩大规模。 [0132] 3)组分优化至2个，节约质谱机时420min，1.5h即可完成一个样本的检测，极大的节约 样本检测费用，达到大部分人民能够接受的程度，加速临床推广。 [0133] 4)质谱为双组份双针深度覆盖，蛋白鉴定数达到8000水平，远超单组份单针，也逼近 三针三组份的水平。 [0134] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
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