[0001] 本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种从鳝鱼鱼皮中提取的多糖。

[0002] 黄鳝不仅为席上佳肴，其肉、血、头、皮均有一定的药用价值。据《本草纲目》记载，黄鳝有补血、补气、消炎、消毒、除风湿等功效。黄鳝肉性味甘、温，有补中益血，治虚损之功效，民间用以入药，可治疗虚劳咳嗽、湿热身痒、痔瘘、肠风痔漏、耳聋等症。祖国医学认为，它有补气养血、温阳健脾、滋补肝肾、祛风通络等医疗保健功能。

[0003] 鳝鱼的表皮中含有丰富的多糖，鳝鱼多糖具有很好的抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗病毒，降血糖、降血脂等功效，其提取方法尚未见报道。

[0004] 本发明的目的在于提供一种从鳝鱼鱼皮中提取的多糖，利用活性多肽和反复冻融法对鱼皮细胞壁破碎，提高多糖得率，并且通过分离纯化进一步提高多糖纯度，提取的多糖分子量低，降血糖和降血脂效果显著，人体易吸收。

[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：从鳝鱼鱼皮中提取的多糖，多糖的提取步骤如下：预处理；细胞破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，本发明通过上述提取步骤提取得到的鳝鱼皮多糖得率高，纯度高而且多糖分子量低，人体易吸收，提取所需设备少，提取成本低。

[0006] 优选的，预处理步骤为：取新鲜鳝鱼鱼皮，干燥处理，粉碎，过40-60目筛网，石油醚除脂，得脱脂鳝鱼鱼皮粉末，对鳝鱼鱼皮干燥粉碎有利于缩短多糖提取的时间，提高多糖得率，并且去除了鱼皮中的脂肪，避免脂肪影响最后得到的多糖纯度。

[0007] 优选的，细胞破碎步骤为：取鱼皮粉末过筛，制成溶液固液比1:10 14并加入鱼皮~重量0.3% 0.7%的活性多肽，选用磷酸钠盐缓冲液pH=6.5 6.8作为提取剂，反复冻融，梯度~ ~
超声波辅助冻融，离心，得粗蛋白提取液，在鱼皮多糖提取之前进行细胞壁破碎处理，利用活性多肽和反复冻融的方法使细胞壁破裂较为彻底，促进胞内物质溶出，不破坏其中有效成分，而且在反复冻融过程中梯度提升超声波功率，逐步提高细胞壁的破碎，逐步破坏细胞壁，使细胞内容物缓慢释放，可显著提升了鳝鱼鱼皮多糖的得率。

[0008] 优 选 的 ， 活 性 多 肽 的 氨 基 酸 序 列 为 ：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYPGKLCACVNCSR，该活性多肽具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于水中，亲脂性使其与鱼皮细胞膜结合，使细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，有利于鱼皮多糖得率，利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎，大大缩短了提取时间，提取效果好，得到的粗多糖含量高，还有效避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性。

[0009] 优选的，细胞破碎步骤中反复冻融是在-20℃和37℃，反复冻融3-4次，每次2-3h，梯度超声波功率为400-600w，时间为10-15min，每隔5 10min超声波功率增强15 20w，直至~ ~反复冻融结束，利用活性多肽和反复冻融的方法使细胞壁破裂较为彻底，促进胞内物质溶出，不破坏其中有效成分，而且在反复冻融过程中梯度提升超声波功率，逐步提高细胞壁的破碎，逐步破坏细胞壁，使细胞内容物缓慢释放，可显著提升了鳝鱼鱼皮多糖的得率。

[0010] 优选的，多糖提取步骤为：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，离心得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为4500-6000Da，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得鱼皮粗多糖，通过透析选取低分子量的鱼皮多糖，利于人体吸收，还有利于提取的多糖的降血糖和降血脂效果。

[0011] 优选的，多糖柱层析步骤为：将鱼皮多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱3.5×25cm，蒸馏水洗脱，NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，NaCl洗脱，收集洗脱液真空浓缩，透析，通过分离纯化进一步提高多糖纯度，提取的多糖分子量低，溶解性好。

[0012] 作为优选，冷冻干燥温度为-38℃至-36℃。

[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用活性多肽和反复冻融的方法使细胞壁破裂较为彻底，促进胞内物质溶出，不破坏其中有效成分，而且在反复冻融过程中梯度提升超声波功率，逐步提高细胞壁的破碎，逐步破坏细胞壁，使细胞内容物缓慢释放，显著提升了鳝鱼鱼皮多糖的得率，提取得到的鳝鱼皮多糖得率高，纯度高而且多糖分子量低，人体易吸收，提取所需设备少，提取成本低。

[0014] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：实施例1：
从鳝鱼鱼皮中提取的多糖，多糖的提取步骤如下：预处理；细胞破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，具体操作步骤如下：
1）预处理：取新鲜鳝鱼鱼皮，干燥处理，粉碎，过48目筛网，石油醚除脂，得脱脂鳝鱼鱼皮粉末；
2）细胞破碎步骤为：取鱼皮粉末过筛，制成溶液固液比1:14并加入鱼皮重量0.4%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH=6.6作为提取剂，在-20℃和37℃，反复冻融3次，每次3h，梯度超声波辅助冻融，超声波功率为450w，时间为12min，每隔6min超声波功率增强18w，直至反复冻融结束，
6200r/min条件下离心8min，得粗蛋白提取液，添加的活性多肽具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于水中，亲脂性使其与鱼皮细胞膜结合，使细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，有利于鱼皮多糖得率，利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎，大大缩短了提取时间，提取效果好，得到的粗多糖含量高，还有效避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性；
3）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的4倍，乙醇浓度为96%，乙醇醇沉时间为8h，6500r/min离心14min，得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为5000Da，自来水流水透析42h，蒸馏水透析18h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得鱼皮粗多糖；
4）多糖柱层析：将鱼皮多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱
3.5×25cm，蒸馏水洗脱，用0 2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0Ml/min，收集洗脱液，~
将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.2mL/min，收集洗脱液真空浓缩，流水透析44h，蒸馏水透析48h；
5）将透析液于-37℃条件下冷冻干燥，得鱼皮多糖。

[0015] 实施例2：从鳝鱼鱼皮中提取的多糖，多糖的提取步骤如下：预处理；细胞破碎；多糖提取；多糖柱层析；冷冻干燥，具体优选操作步骤如下：
1）预处理：取新鲜鳝鱼鱼皮，干燥处理，粉碎，过50目筛网，石油醚除脂，得脱脂鳝鱼鱼皮粉末；
2）细胞破碎步骤为：取鱼皮粉末过筛，制成溶液固液比1:12并加入鱼皮重量0.5%的活性多肽，活性多肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFAACGTAHYSSCTHYPGKLCACVNCSR，选用磷酸钠盐缓冲液pH=6.7作为提取剂，在-20℃和37℃，反复冻融4次，每次3h，梯度超声波辅助冻融，超声波功率为600w，时间为14min，每隔8min超声波功率增强15w，直至反复冻融结束，
5800r/min条件下离心8min，得粗蛋白提取液，添加的活性多肽具有亲水性和亲脂性，亲水性使其溶于水中，亲脂性使其与鱼皮细胞膜结合，使细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，有利于鱼皮多糖得率，利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎，大大缩短了提取时间，提取效果好，得到的粗多糖含量高，还有效避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性；
3）多糖提取：将粗蛋白提取液旋蒸浓缩，乙醇醇沉，加入的乙醇为藻液体积的5倍，乙醇浓度为97%，乙醇醇沉时间为8h，7000r/min离心11min，得粗多糖，复溶，加入三氯乙酸脱蛋白，透析，透析袋的透过分子量为4500Da，自来水流水透析43h，蒸馏水透析18h，乙醇醇沉，沉淀物真空冷冻干燥，得鱼皮粗多糖；
4）多糖柱层析：将鱼皮多糖配成水溶液，上tris缓冲液预平衡DE52纤维素离子交换柱
3.5×25cm，蒸馏水洗脱，用0 2.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0Ml/min，收集洗脱液，~
将洗脱液分经Sephacryl S-400柱层析1.6cm×80cm，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.2mL/min，收集洗脱液真空浓缩，流水透析44h，蒸馏水透析48h；
5）将透析液于-36℃条件下冷冻干燥，得鱼皮多糖。

[0016] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

[0017] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。