一种简便的低内毒素鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取方法 |
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| 申请号 | CN201710670695.8 | 申请日 | 2017-08-08 | 公开(公告)号 | CN107488237A | 公开(公告)日 | 2017-12-19 |
| 申请人 | 江苏大学; | 发明人 | 吴亮; 王廷廷; 陈盛霞; 阴晴; 姜旭淦; 卢叶; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种简便的低内毒素鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取方法，属于 生物 材料 制备技术领域；本发明所述方法首先采用裂解液和超声法共同破裂鲍曼不动杆菌，再使用CTAB溶液第一次去除细菌脂多糖等内毒素，再分别使用25% 乙醇 和80%乙醇沉淀已获得的鲍曼不动杆菌荚膜多糖，以进一步去除细菌脂多糖和核酸等杂质，最终获得低内毒素含量的鲍曼不动杆菌荚膜多糖；本发明建立了一套简便、快速、廉价的鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取方法，其内毒素低，可以用于体内试验研究。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种简便的低内毒素鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取方法，其特征在于，所述方法按照如下步骤进行： |
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| 说明书全文 | 一种简便的低内毒素鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取方法技术领域背景技术[0002] 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是引起医院内感染的主要病原菌，可引起患者呼吸机相关性肺炎、泌尿道感染、脓毒血症等多系统感染。曾经的鲍曼不动杆菌并不被临床医生所重视，但随着近年来临床分离多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌比例的明显升高，加之该菌具有强大的获得耐药性和克隆传播能力，目前鲍曼不动杆菌已成为在全球范围内广泛流行并呈现高度耐药的常见致病菌。由于多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌感染的普遍性，以及新的有效抗菌药物研发的迟滞，仅依靠抗生素治疗已无法有效控制临床鲍曼不动杆菌的感染，而通过增强人体自身免疫力改善机体的免疫状态进来达到治疗的目，是对现有抗生素治疗方案的一种有效补充。 [0003] 鲍曼不动杆菌是目前临床最严重的医院内感染病原体之一，其耐药性也非常严重，单独依靠现有抗生素已无法满足临床需求，急需一种安全有效的疫苗提高人体在抵御鲍曼不动杆菌感染能力，或与抗生素联合使用提高患者治愈率。 [0004] 荚膜是带荚膜细菌的主要毒力因子之一，在细菌逃避人体的非特异性防御中发挥重要作用。同时，荚膜也是特异性免疫反应的保护性抗原，是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗成份的靶抗原之一。现已有流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒沙门菌和肺炎链球菌等多种细菌荚膜多糖产品，此类细菌荚膜多糖免疫刺激性强，副作用小，在临床使用中发现可以有效地调节、增强和恢复人体免疫力，提高人体抗感染的能力。但目前尚未见有鲍曼不动杆菌荚膜多糖产品，也尚未见有使用鲍曼不动杆菌荚膜多糖增强体体免疫力和预防细菌感染的报道。从鲍曼不动杆菌中分离纯化荚膜多糖的困难在于其荚膜表达量较低，远不及流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒沙门菌和肺炎链球菌等，如果使用常规的Sepharose 4B柱纯化法（反向高压液相色谱技术），其产量非常低，无法满足临床需求。而单独使用乙醇沉淀或十六烷基三甲基溴化胺（Cetavlon, CTAB）沉淀虽然可以去除细菌核酸，但对细菌内毒素去除效果较弱，其纯化产品注射入人体会引起严重内毒素反应。因此研发鲍曼不动杆菌荚膜药物或疫苗最大障碍在于改良现有荚膜提纯技术，以提高荚膜纯化产率，缩短操作时间，降低费用，以满足临床预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的需求。 发明内容[0006] 未达到上述技术目的，本发明采用如下技术手段：本发明方法首先采用裂解液和超声法共同破裂鲍曼不动杆菌，再使用CTAB溶液第一次去除细菌脂多糖等内毒素，再分别使用25%乙醇和80%乙醇沉淀已获得的鲍曼不动杆菌荚膜多糖，以进一步去除细菌脂多糖和核酸等杂质，最终获得低内毒素含量的鲍曼不动杆菌荚膜多糖。 [0007] 该方法提取的荚膜多糖，其内毒素含量远低于安全浓度，非常适合于制备疫苗用于鲍曼不动杆菌感染的预防和辅助治疗。 [0008] 具体的，本发明中提取鲍曼不动杆菌荚膜多糖的试剂包括：（1） 10% CTAB 溶液：称取氯化钠40.95克加水溶解，然后定容至1000 mL即为0.7 mol/L氯化钠溶液；称取10 g CTAB以0.7 mol/L氯化钠溶液并定容至100 mL即为10%CTAB/NaCl溶液。 [0009] （2）5 mol/L CaCl2溶液：称取CaCl2 55.1 g，溶解于80 mL双蒸水，反复搅拌使其溶解，并最终加双蒸水定容至100 mL，室温下保存。 [0010] （3）细菌裂解液：含有40mM Tris-HCl、20mM CH3COONa、1mM EDTA-Na2、1% SDS，上述溶液配制好后，再使用NaOH溶液将上述溶液酸碱度调节至pH8.0。 [0011] 利用上述试剂提取鲍曼不动杆菌荚膜步骤如下：（1）细菌培养：在羊血琼脂平板上挑取数个新鲜鲍曼不动杆菌菌落，使用灭菌磷酸盐（PBS）缓冲液（pH 7.4）稀释至OD600=1。将上述鲍曼不动杆菌悬液均匀涂布于40个血琼脂平板上，每个平板接种细菌菌液10 μL，恒温培养箱中（35℃～37℃）培养16 h～24 h 。 [0012] （2）细菌收集：每个羊血琼脂平板内滴加30 mL灭菌PBS缓冲液反复吹打重悬细菌，将重悬的菌液全部转移至4个灭菌圆底离心管（50 mL）内，以8 000 rpm离心10 min收集菌体沉淀，弃去上清。再加入灭菌PBS缓冲液重复洗涤2次，每管细菌沉淀中加入30 mL细菌裂解液。 [0013] （3）破碎菌体：细菌中加入裂解液后以粗口吸管反复抽吸10～20次，使细菌与裂解液充分混合。将上述离心管置于冰水浴中，放入超声探头通过超声波进一步破碎细菌（超声波功率200 W，每次持续3 min，间隔1 min，重复10次）。超声破碎结束后，通过8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下），将各管上清液倒入新圆底离心管中用于后续荚膜多糖提取。 [0014] （4）去除内毒素：在将细菌裂解上清液中加入适量10% CTAB溶液，使CTAB最终溶液为1%，充分搅拌混匀后，室温下静置0.5 h～1 h以形成沉淀。静置离心收集沉淀。向沉淀物中加入5 mol/L CaCl2溶液至终浓度为1 mol/L，使用电磁搅拌仪搅拌1 h～3 h直至沉淀重新溶解，通过8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集上清液。 [0015] （5）沉淀荚膜多糖：在上清液中加入95%乙醇至最终浓度为25%，4℃中静置过夜（8 h～12 h），8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集上清。次日在上清液中加入冰上预冷的95%乙醇至最终浓度为80%，在室温下充分混匀使荚膜多糖沉淀，8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集荚膜多糖沉淀，使用无水乙醇洗涤荚膜多糖沉淀2次，即得鲍曼不动杆菌荚膜多糖。将上述荚膜多糖溶于10 mL灭菌三蒸水中，于-70℃中长期保存。 [0016] 与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：鲍曼不动杆菌荚膜是一种非常有效的免疫调节剂，可以显著提高患者对鲍曼不动杆菌感染的抵抗能力，在临床鲍曼不动杆菌的治疗以及预防鲍曼不动杆菌院内感染中将发挥巨大作用。本发明所提供方法最大特点是可以高效去除提纯产物中细菌内毒素，其产物中内毒素含量远低于远低于体内注射制剂内毒素限量（0.03 EU/ mL）。虽然色谱柱纯化法是目前最佳清除细菌内毒素的方法，色谱柱成本高昂，纯化操作也费时耗力，本发明中巧妙通过配合使用CTAB溶液和不同浓度乙醇溶液反复沉淀细菌荚膜，可以高效地清除提纯产物中内毒素含量；并且该方法成本低廉，操作简便，无需复杂昂贵仪器设备。此外，本发明中方法提纯荚膜产量显著高于色谱柱，极有利于大量生产荚膜用于制备鲍曼不动杆菌疫苗。 附图说明 具体实施方式[0018] 下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行阐述，以便本领域技术人员更好的理解本发明的技术内容。 [0019] 实施例1：鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取（1）细菌培养：复苏鲍曼不动杆菌，将此菌接种于羊血琼脂平板（美国BD Difco公司），置于37℃中培养16 h～24 h生长至形成肉眼可见菌落，挑取数个新鲜鲍曼不动杆菌菌落，使用灭菌磷酸盐（PBS）缓冲液（pH7.4）稀释至OD600=1。将上述鲍曼不动杆菌悬液均匀涂布于 40个羊血琼脂平板上，每个平板接种细菌菌液10 μL，恒温培养箱中（37℃）培养16 h～24 h直至形成菌苔。 [0020] （2）细菌收集：在每个羊血琼脂平板内滴加30 mL灭菌PBS缓冲液反复吹打冲洗细菌，将冲洗出的菌液全部转移至4个灭菌圆底离心管（50 mL）内，以8 000 rpm离心10 min收集菌体沉淀，弃去上清。再加入灭菌PBS缓冲液重复洗涤2次，每管细菌沉淀中加入30 mL细菌裂解液。 [0021] （3）破碎菌体：细菌中加入裂解液后以粗口玻璃吸管反复抽吸10次～20次，使细菌与裂解液充分混合。将上述离心管置于冰水浴中，放入超声探头通过超声波进一步破碎细菌（超声波功率200 W，每次持续3 min，间隔1 min，重复10次）。超声破碎结束后，通过8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下），将各管上清液倒入新的圆底离心管中用于后续荚膜多糖提取。 [0022] （4）去除内毒素：在细菌裂解上清液中加入适量10% CTAB溶液，使CTAB最终溶液浓度为1%，充分搅拌混匀后，室温下静置0.5 h～1 h以形成沉淀。静置离心收集沉淀。向沉淀物中加入5 mol/L CaCl2溶液至终浓度为1 mol/L，使用电磁搅拌仪搅拌1 h～3 h使部分沉淀重新溶解，通过8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集上清液。 [0023] （5）沉淀荚膜多糖：在上清液中加入95%乙醇至最终浓度为25%，4℃中静置过夜，8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集上清。次日在上清液中冰上预冷的95%乙醇至最终浓度为80%，在室温下充分混匀使荚膜多糖沉淀，8 000 rpm离心20 min（在4℃条件下）离心收集荚膜多糖沉淀，使用无水乙醇洗涤荚膜多糖沉淀2次，即得鲍曼不动杆菌荚膜多糖。将上述荚膜多糖溶于10 mL灭菌三蒸水中，于-70℃中长期保存。 [0024] 实施例2：鲍曼不动杆菌荚膜多糖浓度检测（1）建立标准曲线：精确称取105℃烘干至恒重的分析纯葡萄糖200 g，三蒸水定容至 500 mL，分别吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL和 1.8mL，各加适量三蒸水补足体积至2.0 mL，以三蒸水为空白对照，各管中再加入6%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，充分摇匀后置于室温下反应40 min。反应结束后通过722型分光光度计检测各管490nm处吸光度，以各管中葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 [0025] （2）检测样本吸光度：吸取所提取的鲍曼不动杆菌荚膜多糖溶液1.0 mL，并以适量三蒸水补足体积至2.0 mL，再加入6%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，以2.0 mL三蒸水做空白对照，整个检测重复3管。上述各管在室温中反应40 min后，通过722分光光度计检测各管490nm处吸光度为1.123。根据已建立的标准曲线获得类似葡萄糖浓度为 140.92mg/mL（图1），再根据葡萄糖-多糖换算公式计算所提取的鲍曼不动杆菌荚膜多糖含量为449.5 mg/mL。 [0026] 图 1为葡萄糖反应标准曲线图：y=0.009542x-0.2217。 [0027] 葡萄糖-多糖换算公式：多糖浓度（mg/ml）=C×D×F公式中符号分别代表：C为样品溶液中葡萄糖的浓度；D为样品溶液中的稀释倍数；F为葡萄糖换算为荚膜多糖的换算因素（F=3.19） 实施例3：荚膜多糖内毒素检测 所提取鲍曼不动杆菌荚膜多糖内毒素含量通过内毒素检测仪（厦门鲎试剂实验厂有限公司产品）及其配套试剂进行检测。检测反应采用终点法，根据反应体系545nm处吸光度计算内毒素浓度。经多次检测所提纯荚膜多糖的内毒素含量均低于0.01EU/ mL，低于人体内注射液内毒素不高于0.03 EU/ mL的标准，完全可以直接用于人体内注射使用，如进一步偶联反向高效液相色谱法纯化，可提高反向高效液相色谱法纯化效率并极大地降低成本。 |
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