一种从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法 |
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| 申请号 | CN201710768321.X | 申请日 | 2017-08-31 | 公开(公告)号 | CN107522796A | 公开(公告)日 | 2017-12-29 |
| 申请人 | 浙江工业大学; | 发明人 | 应国清; 易喻; 徐骏; 梅建凤; 陈建澍; 张彦璐; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法，所述方法为：将金枪鱼眼粉末加入去离子 水 中浸提完全，离心，获得上清液；向上清液中加入胰蛋白酶，在20～45℃、pH为7.0～8.5的条件下反应60～180min，反应完全后，获得透明质酸粗品；将透明质酸粗品用去离子水配制成 质量 浓度1-5％透明质 酸溶液 ，加入终浓度0.1～0.3mol/L 氯化钠 ，制成母液；向母液中加入质量浓度1～10％十六烷基氯化吡啶水溶液，30℃下搅拌反应完全，获得透明质酸；金枪鱼所提取的透明质酸分子量较小，为0.470MDa，工艺路线简单易行，所得透明质酸纯度较高，且工艺流程中透明质酸损失较小。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法，其特征在于所述方法为：(1)将经清洗除杂干燥后的金枪鱼眼粉末加入去离子水中，室温搅拌浸提完全，离心，获得上清液；(2)向步骤(1)的上清液中加入胰蛋白酶，在20～45℃、pH为7.0～8.5的条件下反应60～180min，反应完全后，将反应液加热灭活后离心，取上清液加入体积比4:1的氯仿和正丁醇进行萃取分离，取上层液加入体积浓度95％乙醇水溶液搅拌沉淀后离心，取沉淀干燥，获得透明质酸粗品；所述胰蛋白酶加入量以步骤(1)加入金枪鱼眼粉末的量计为200～1000U/g；(3)将步骤(2)透明质酸粗品用去离子水配制成质量浓度1-5％透明质酸溶液，加入终浓度0.1～ |
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| 说明书全文 | 一种从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法(一)技术领域 [0001] 本发明涉及一种金枪鱼眼来源生产医用透明质酸其提取工艺及产品纯化方法。(二)背景技术 [0002] 透明质酸(hyaluronic acid，HA)，是一种阴离子酸性粘多糖，由β-(1→3)-D-N乙酰氨基葡萄糖与β-(1→4)-D-葡萄糖醛酸双糖单位重复连接而成。透明质酸具有独特的保湿性和生物亲和性，在机体内通过其黏弹性(大分子网状结构)及高度水合性等物理作用的物理学功能以及与HA受体作用的生理学功能来发挥其重要作用，目前这两种功能被广泛应用于化妆品，医药行业。目前透明质酸的生产工艺主要有生物组织提取法和链球菌发酵法。研究表明，几乎所有动物组织均含有HA，但考虑到原料成本，HA含量，易于取得程度等因素，目前生物提取透明质酸的主要生产原料为雄鸡冠，人类脐带和动物玻璃体。以鸡冠和人类脐带等陆生动物所提取的透明质酸存在禽流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒等生物污染风险。 而金枪鱼眼来源的透明质酸因种属差异，具有更高生物安全性。目前有许多对金枪鱼废弃内脏，鱼骨综合利用的研究，但是金枪鱼头因无法利用造成大量浪费和污染。因此以金枪鱼眼作为原料提取透明质酸，降低了透明质酸的提取成本，可以为我国低附加值的金枪鱼产业提供更多的选择。 [0003] 透明质酸在国内外市场上的需求量非常大，但受原材料价格和发酵技术的限制致使透明质酸的价格居高不下，进而限制了其在医药、化妆品和保健食品等方面的应用。因此如何获取廉价、安全的透明质酸成为新的研究方向。本发明使用酶法提取金枪鱼眼透明质酸，并使用季铵盐络合法纯化透明质酸，为透明质酸的生产提供新的途径。(三)发明内容 [0004] 本发明涉及一种金枪鱼眼来源生产医用透明质酸其提取及纯化方法，使用酶法提取鱼眼透明质酸，并使用季铵盐络合法纯化透明质酸产品。该方法所生产透明质酸产品具有廉价、安全，技术路线简单、便于操作等优点，解决了现有HA生产工艺成本高，原来稀缺，操作复杂等问题。 [0005] 本发明采用的技术方案为： [0006] 本发明提供一种从金枪鱼眼中提取透明质酸的方法，所述方法为：(1)将经清洗除杂干燥后的金枪鱼眼粉末加入去离子水中，室温搅拌浸提完全，离心，获得上清液；(2)向步骤(1)的上清液中加入胰蛋白酶，在20～45℃(优选40℃)、pH为7.0～8.5的条件下反应60～180min，反应完全后，将反应液加热灭活后(优选90℃水浴加热灭活)离心，取上清液加入体积比4:1的氯仿和正丁醇进行萃取分离，取上层液加入体积浓度95％乙醇水溶液搅拌沉淀后离心，取沉淀干燥，获得透明质酸粗品；所述胰蛋白酶加入量以步骤(1)加入金枪鱼眼粉末的量计为200～1000U/g(优选200-500U/g)；(3)将步骤(2)透明质酸粗品用去离子水配制成质量浓度1-5％(优选1-2％)透明质酸溶液，再加入终浓度0.1～0.3mol/L氯化钠，制成母液；向母液中加入质量浓度1～10％(优选1-5％)十六烷基氯化吡啶水溶液，30℃下搅拌反应完全，静置析出沉淀，去上清，向沉淀中加入0.4～1.0mol/L NaCl水溶液，在30℃搅拌解离1～2h，并使用0.45μm滤膜过滤，滤液使用体积浓度95％乙醇水溶液搅拌沉淀，所得沉淀使用无水乙醇反复冲洗2～3次后40-50℃真空烘干，获得透明质酸；所述十六烷基氯化吡啶水溶液体积用量以透明质酸粗品质量计为4～8mL/g。 [0007] 进一步，步骤(1)所述清洗除杂的方法为：取冷冻新鲜鱼眼，在常温解冻后，去除外壳及鱼肉组织、视神经，收集黑色鱼眼玻璃体(在操作过程中，玻璃体内液体易流出，应尽量回收)；将黑色玻璃体剪碎后加入3倍体积丙酮，室温搅拌6h，随后4℃条件下10000rpm离心，取沉淀物在30～45℃真空干燥6～10h，需不定时取出翻转产品，沉淀物烘干后粉碎，再次在30～45℃真空干燥6～10h，所得粉末即金枪鱼眼粉末。 [0008] 进一步，步骤(1)浸提时间为1-10h(优选4-6h)，所述去离子水的体积用量以金枪鱼眼粉末重量计为6～50mL/g(优选20-35mL/g)。 [0009] 进一步，步骤(2)所述胰蛋白酶加入量以步骤(1)加入金枪鱼眼粉末的量计为200～500U/g。 [0010] 进一步，步骤(3)所述透明质酸溶液质量浓度为1.0～2.0％。 [0011] 进一步，步骤(3)所述十六烷基氯化吡啶水溶液体积用量以透明质酸粗品质量计为4～6mL/g。 [0012] 本发明所述金枪鱼眼特征如下：鱼眼眼球突出，角膜透明，表面粘液清澈，无明显腐败气味。此为新鲜鱼眼，若鱼眼腐败，则所提取透明质酸产量、分子量明显下降。 [0013] 本发明所述酶法提取鱼眼透明质酸使用胰蛋白酶，购于生工生物工程(上海)股份有限公司，酶活2000U/g。 [0014] 本发明涉及使用的季铵盐为十六烷基氯化吡啶(cetylpyridinium chloride monohydrate，CPC)，购于BBI Life Scienses。 [0015] 与现有透明质酸生产方法比较，本发明的突出优点如下： [0016] (1)金枪鱼眼作为原料在我国有巨大的供应量，此发明还能解决大量的渔业废弃物污染；(2)金枪鱼眼来源的透明质酸具有更高的生物安全性；(3)鱼眼所提取的透明质酸分子量较小，为0.470MDa，在小分子类化妆品中有一定优势。(4)此工艺路线简单易行，所得透明质酸纯度较高，且工艺流程中透明质酸损失较小。使用废弃金枪鱼眼解决了原料稀缺，陆生动物组织可能存在的病原体污染问题，降低了生产成本。(四)附图说明 [0017] 图1金枪鱼眼透明质酸提取纯化路线。 [0018] 图2葡萄糖醛酸标准曲线。 [0019] 图3透明质酸样品浓度与粘度的回归方程。 [0020] 图4透明质酸标准品与鱼眼透明质酸红外图谱。(五)具体实施方式 [0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，以下所述仅是本发明的优选实施方式：本发明实施例所述室温是指25-30℃。 [0022] 实施例1：金枪鱼眼预处理制备鱼眼粉 [0023] 取冷冻新鲜鱼眼4314g，在常温解冻后，去除外壳及鱼肉组织、视神经等，保留黑色鱼眼玻璃体，其重量为1431g。在操作过程中，玻璃体内液体易流出，应尽量回收。将黑色玻璃体剪碎后加入3倍体积丙酮，室温搅拌6h。随后4℃条件下10000rpm离心，取沉淀物在45℃真空烘箱干燥10h，需不定时取出翻转产品。沉淀物烘干后经粉碎再次在45℃真空烘箱干燥10h，所得粉末即鱼眼粉210g，可作为提取透明质酸原料，也可置于-20℃长期保存。 [0024] 实施例2：金枪鱼眼预处理制备鱼眼粉 [0025] 取冷冻新鲜鱼眼2932g，在常温解冻后，去除外壳及鱼肉组织、视神经等，保留黑色鱼眼玻璃体，其重量为941g。在操作过程中，玻璃体内液体易流出，应尽量回收。将黑色玻璃体剪碎后加入3倍体积丙酮，室温搅拌4h。随后4℃条件下10000rpm离心，取沉淀物在30℃真空烘箱干燥6h，需不定时取出翻转产品。沉淀物烘干后经粉碎再次在30℃真空烘箱干燥6h，所得粉末即鱼眼粉154g，可作为提取透明质酸原料，也可置于-20℃长期保存。 [0026] 实施例3：酶法提取鱼眼透明质酸 [0027] 按实施例1方法所得鱼眼粉为原料，酶解法提取透明质酸工艺如下 [0028] (1)称取25g鱼眼粉，并加入500mL去离子水，室温搅拌6h。 [0029] (2)将(1)反应液离心，取上清液加入500U胰蛋白酶/g鱼眼粉，在40℃，pH 8.5条件下反应120min。 [0030] (3)将(2)反应液在90℃水浴锅内灭活后，冷却。随后4℃条件下10000rpm离心，获得上清液。 [0031] (4)将(3)中上清液500mL加入分液漏斗，再加入200mL氯仿，50mL正丁醇后剧烈搅拌20min，在分液漏斗中静置分层(分成上、中和下三层)，放出下层氯仿和中间层蛋白，重复分层3次。 [0032] (5)在(4)中上层清液中加入3倍体积的体积浓度95％乙醇水溶液，搅拌4h后离心，将沉淀在45℃真空烘箱干燥至百色粉末状，即为透明质酸粗品0.117g，含透明质酸质量分数为83.1％，蛋白质量分数为2.1％。 [0033] 本发明所述金枪鱼眼为原料所提取的透明质酸含量采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测，蛋白采用考马斯亮蓝法检测，检测的方法为：采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测透明质酸，其原理是：透明质酸在沸水浴中被浓硫酸水解成葡萄糖醛酸(GA)，GA与咔唑反应呈现红紫色，在530nm处有最大吸收值，吸光度与GA的含量成正比。具体检测方法如下： [0034] 0.125％乙醇咔唑溶液的配置：精密称取0.125g咔唑，加入100mL无水乙醇超声溶解，置于4.0℃避光保存，有效期为15d。 [0035] 0.025mol/L四硼酸钠硫酸溶液的配置：精密称取4.77g四硼酸钠(Na2BO7·10H2O)，加入到500mL优级纯硫酸中，不定时反复震摇，直至完全溶解，室温避光保存，有效期为180d。 [0036] 葡萄糖醛酸标准品的配置：精密称取0.100g葡糖糖醛酸标准品，在105.0℃真空烘箱中烘至恒重，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中。充分溶解后取5.0mL，置于100mL容量瓶中用蒸馏水定容，葡萄糖醛酸浓度为50μg/mL，4.0℃保存。 [0037] 葡糖糖醛酸标准曲线的制定：将葡糖糖醛酸标准溶液按表1配制。. [0038] 表1葡糖糖醛酸标准溶液的配制 [0039] [0040] 将标准液系列各试管置于冰水混合物中冷却2h以上，向各试管贴壁缓缓加入5mL四硼酸钠硫酸溶液，边加边震荡，保持试管下端浸没于冰水浴，混匀后将各试管置于沸水浴中煮沸15min，取出后在冰水浴中冷却，再向各试管中加入0.2mL乙醇咔唑溶液并充分震摇，再次在沸水浴中煮沸15min，冷却至室温。以0号试管为对照，在紫外530nm处检测各试管吸光度。以葡萄糖醛酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，做线性回归，标准曲线见图2。 [0041] 实施例4：酶法提取鱼眼透明质酸 [0042] 按实施例2方法所得鱼眼粉为原料，酶解法提取透明质酸工艺如下 [0043] (1)称取15g鱼眼粉，并加入500mL去离子水，室温搅拌4h。 [0044] (2)将(1)反应液离心，取上清液加入200U胰蛋白酶/g鱼眼粉，在40℃，pH 8.0条件下反应120min。 [0045] (3)将(2)反应液在90℃水浴锅内灭活后，冷却。随后4℃条件下10000rpm离心，取上清液。 [0046] (4)将(3)中上清液500ml加入分液漏斗中，再加入200mL氯仿，50mL正丁醇后剧烈搅拌20min，在分液漏斗中静置分成上、中、下三层，放出下层氯仿和中间层蛋白，重复3次。 [0047] (5)在(4)中上层清液中加入3倍体积的体积浓度95％乙醇水溶液，室温搅拌4h后离心，将沉淀在45℃真空烘箱干燥至百色粉末状，即为透明质酸粗品0.071g，透明质酸质量分数为81.0％，蛋白质量分数为2.7％。 [0048] 实施例5：十六烷基氯化吡啶法纯化透明质酸的方法 [0049] 以实施例3酶解法提取的透明质酸粗品5.0g为原料用去离子水配制成质量浓度为1％的透明质酸溶液500mL，随后与CPC络合反应纯化透明质酸，具体步骤如下： [0050] (1)在质量浓度1.0％的透明质酸溶液500mL中加入5.84g氯化钠使其浓度为0.2mol/L作为反应母液。 [0051] (2)向步骤(1)加入30mL质量浓度1.0％CPC水溶液后，在30℃水浴下充分搅拌使其完全反应，沉淀完全后静置1h，虹吸上清液。 [0052] (3)将(2)中粘附在杯壁，杯底的络合物沉淀使用0.4mol/L的NaCl水溶液500mL在30℃搅拌解离2h，并使用0.45μm滤膜过滤。 [0053] (4)将滤液使用3倍体积的体积浓度95％乙醇水溶液搅拌沉淀，所得沉淀使用无水乙醇反复冲洗2～3次后45℃真空烘干，即得透明质酸产品4.56g，HA回收率91.3％，HA质量分数90.1％，蛋白质量分数为0.1％，透明质酸分子量为0.470MDa，最终产品经过红外图谱鉴定比较，产品纯度较高，红外图谱见图4。 [0054] 本发明所述金枪鱼眼为原料所提取的透明质酸分子量的测定方法为粘度法，具有操作简便，检测时间短，分子量检测范围宽等优点，具体操作如下：精密称取HA标准品0.1g，用0.2mol/L的NaCl水溶液定容至100mL。再分别取该溶液10、15、20和25mL配制成0、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6g/L的HA系列标准溶液。在25.0℃下使用数显粘度计检测样品黏度η，溶剂的黏度η0，按公式ηsp＝(η-η0)/η0计算增比粘度ηsp，以HA标准品的浓度(mg/100mL)为横坐标，增比浓度与浓度的比值为纵坐标作回归分析，计算相关系数和回归方程式，HA标准品的回归方程见图3。回归方程拟合的曲线在纵轴上的截距即为特性粘度[η]，按公式计算HA标准品的平均分子量(MDa)。 [0055] [η]＝3.6x10-4M0.78(M为平均分子量) [0056] 实施例6：十六烷基氯化吡啶法纯化透明质酸的方法 [0057] 以实施例3中酶解法提取的透明质酸粗品10.0g为原料用去离子水配制成质量浓度2％的透明质酸溶液500mL，随后与CPC络合反应纯化透明质酸，具体步骤如下： [0058] (1)在质量浓度2.0％的透明质酸溶液500mL中加入2.92g氯化钠使其浓度为0.1mol/L作为反应母液。 [0059] (2)向步骤(1)加入40mL质量浓度5.0％CPC水溶液后，在40℃水浴下充分搅拌使其完全反应，沉淀完全后静置2h，虹吸上清液。 [0060] (3)将(2)中粘附在杯壁，杯底的络合物沉淀使用0.6mol/L的NaCl水溶液500mL在40℃搅拌解离2h，并使用0.45μm滤膜过滤。 [0061] (4)将滤液使用3倍体积的体积浓度95％乙醇水溶液搅拌沉淀，所得沉淀使用无水乙醇反复冲洗2-3次后45℃真空烘干，即得透明质酸8.42g，HA回收率84.1％，HA质量分数82.6％，蛋白质量分数为0.2％。 [0062] 上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换，均在本发明的保护范围之内。 |
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