[0001] 本发明提供新的佐剂，其用于改变、调节或增强人或动物受试者中的免疫反应。本发明还提供包含所述佐剂的组合物和疫苗。

[0002] 发明背景

[0003] 疫苗被认为是预防传染病中的最终免疫学工具，其是通过以良好的抗体反应提供长效保护性免疫[1；2]。佐剂的作用是加强免疫系统对通过抗原递呈细胞的活化供给的最小量抗原的特异性反应[3]。理想的佐剂自身将不具有抗原性并且将促进免疫反应同时不诱发免疫系统的过度反应，免疫系统的过度反应可能伤害患者(如诱发过度局部炎症、过敏或迟发型超敏反应)。

[0004] 出于安全性考虑，得到许可的佐剂非常有限，并且注射位点处的疼痛和炎症是在临床疫苗中使用佐剂的常见副作用。在人疫苗中被最广泛使用的佐剂是含有铝的[4]，如明矾、无机盐，其通常由Al(OH)3或Al(PO)4组成。明矾佐剂因此是金属氧化物颗粒。

[0005] 在小鼠中，含铝佐剂诱发体液免疫，主要是通过促进Th2型反应，同时刺激依赖Th1的抗体的能力较弱。此类型的佐剂通常不会诱发强的细胞介导的免疫反应，尤其是具有细胞毒性的T细胞反应[4]，虽然据报道其在额外的脂质佐剂的存在下引发细胞毒性的CD8反应[5]。因此，含明矾的佐剂适合于针对蛋白质抗原或失活有机体的反应，但是对于诱发对胞内病原体的反应来说不是最佳的[1-4]。

[0006] 纳米粒(NP)已经被扩展至各种各样的生物医学用途，这归因于与大体积的化学品相比其独特的理化性质[6]。例如，NP具有更大的表面积并且通过静电相互作用而具有高的蛋白质结合亲和力[7]。NP还能够渗入到组织深部并且加强细胞摄取以及避开溶酶体腔室[7-9]。这些独特的性质导致NP被认为是潜在的佐剂[10；11]。NP的大小表现出影响佐剂能力，并且较小的NP已被证明产生更大的抗体和细胞免疫反应[12]。然而，用于疫苗佐剂的NP候选物中的大多数是有机物质[13]。

[0007] 据报道，在鼠的哮喘模型中，多壁碳纳米管[14]、柴油机尾气颗粒[15]和纳米尺寸的超细炭黑[16]通过类似佐剂的机制增加血清IgE水平。与使用含明矾佐剂报道的数据[17；18]比较，纳米尺寸的炭黑显示与IgG1类似的佐剂作用，并且IgE增加[16]。

[0008] 已经证明，氧化镍NP(NiONP)和氧化钴NP(Co3O4NP)能够在雌性Wistar大鼠的肺中诱发Th1相关性细胞因子反应[19]。

[0009] 本发明试图消除与现有技术相关的一种或多种问题并且提供另外的佐剂，所述佐剂适合于与疫苗一起使用以针对细胞介导的免疫反应对于预防或治愈来说是重要的疾病。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明是基于对无机(金属/金属氧化物)纳米粒的佐剂性质的鉴定。

[0012] 在第一方面，本发明提供包含无机纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。

[0013] 在一个实施方案中，所述佐剂可以不包含明矾。

[0014] 本发明提供的佐剂的无机纳米粒可以包括金属纳米粒。例如，所述金属纳米粒可以包括金属氧化物纳米粒。

[0015] 有利地，本发明的佐剂可以包括一种或多种类型的金属纳米粒。例如，本文中所述的佐剂可以包括不同类型的无机(金属氧化物)纳米粒的混合物(cocktails  or mixtures)。在一个实施方案中，本文中所述的佐剂还可以包含一些基于明矾的佐剂。

[0016] 如此，本发明的一个实施方案提供包含金属和/或金属氧化物纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。

[0017] 本发明的佐剂可以包含钴纳米粒、由其组成或基本由其组成。在一个实施方案中，钴纳米粒包含钴氧化物。适合用作本发明的佐剂的钴氧化物纳米粒可以包括，例如，钴(II,III)氧化物(Co3O4)纳米粒。

[0018] 鉴于以上，本发明提供包含钴和/或钴(II,III)氧化物(Co3O4))纳米粒、由其组成或基本由其组成的佐剂。

[0019] 技术人员将理解，存在其他形式的钴氧化物，并且这些可以具有作为佐剂的类似用途–因此，本文中所述的佐剂还可以包含氧化钴(钴(II)氧化物:CoO)和/或氧化高钴(钴(III)氧化物:Co2O3)或可以由其组成或基本由其组成。

[0020] 本发明人发现包含无机纳米粒的佐剂，尤其是包含金属纳米粒如钴纳米粒的那些佐剂，当在体内施用时，诱发平衡的Th1和Th2型反应。这与其他佐剂(包括，例如，包含明矾的那些)形成对比，后者仅诱发Th1反应或Th2反应。技术人员将理解，虽然Th1反应可以有效地帮助清除胞内病原体，但是大部分佐剂引发Th2反应，其在清除胞外病原体方面更有效。如此，本发明的无机或钴纳米粒佐剂可以与各种各样的疫苗一起使用，并且尤其适合于与针对这样的疾病的疫苗一起使用，在所述疾病中体液和/或细胞介导的免疫反应对于预防或治愈是重要的。

[0021] 此外，本发明人观察到，与基于明矾的佐剂(其主要包含微粒明矾(即0.1μm至100μm的明矾颗粒)或由其组成)形成对比的是，本发明的无机(基于钴的)纳米粒佐剂诱发的免疫反应包含少得多的‘变应性’IgE免疫球蛋白同种型。这是重要的，因为其在佐剂施用后减少超敏反应。

[0022] 作为另外的优点，本发明人发现，基于无机纳米粒的佐剂–如，例如，本文中所述的钴纳米粒佐剂，在敏化和攻击位点诱发较少的炎症。这具有优点，即减轻可以通常在佐剂如明矾的施用后的疼痛肿胀。

[0023] 鉴于以上，并且不希望受制于理论，作为诱发平衡的TH1和TH2免疫反应的结果，与基于明矾的佐剂相比减小的毒性以及变应性副作用的相对缺少，无机纳米粒(例如，包含钴和/或钴氧化物(具体地Co3O4)的金属纳米粒)，代表了适合于与疫苗一起使用的通用佐剂，其中需要Th1或Th2反应或Th1和Th2反应两者来清除病原体。

[0024] 术语纳米粒涵盖直径为约1nm至约100nm的颗粒。例如，纳米粒可以为约(或者其平均直径为)1nm，5nm，10nm，15nm，20nm，25nm，30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，95nm或99nm。在一个实施方案中，本发明提供的佐剂组合物的纳米粒的平均直径可以为约15nm，16nm，17nm，18nm，19nm或20nm。当纳米粒包含钴时，其直径(或平均直径)可以为约17nm，
17.5nm，18nm，18.1nm，18.2nm，18.3nm，18.4nm，18.5nm，18.6nm，18.7nm，18.8nm，18.9nm，
19nm，19.5nm或20nm。

[0025] 在一个实施方案中，本文中所述的佐剂的钴纳米粒(包括钴(II,III)氧化物纳米粒)的平均直径为约18.4±5.0nm。

[0026] 在第二方面，本发明提供本文所述的无机金属纳米粒(包括钴/钴氧化物)纳米粒作为佐剂的用途。在其他实施方案中，本发明提供用作佐剂的本文所述的无机金属纳米粒(包括钴/钴氧化物)纳米粒。例如，本发明可以提供Co3O4纳米粒作为佐剂的用途和用作佐剂的Co3O4纳米粒。

[0027] 在第三方面，本发明提供的佐剂可以被提供作为组合物。在一个实施方案中，本发明的佐剂组合物可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种组分：

[0028] (i)一种或多种类型的无机金属纳米粒；

[0029] (ii)另外的佐剂组分(例如基于明矾的佐剂)；和

[0030] (iii)药学上可接受的或生理学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂。

[0031] 合适的赋形剂可以包括，例如油，并且技术人员将理解，术语“油”可以包括链烷烃，烯烃，炔烃，及其相应的酸和醇，其醚和酯，及它们的混合物。油的具体化合物有轻质烃化合物，即，此种组分具有6至30个碳原子。所述油可以合成制备或自石油产品纯化。所述“油”可以具有直链或支链结构。其可以是完全饱和的或具有一个或多个双键或三键。用于本发明的一些非可代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷烃。

[0032] 术语油也意在包括“轻质矿物油”，即这样的油，其通过蒸馏矿脂类似地获得，但是具有比石蜡油稍微低的比重。用作赋形剂的其他“油”可以包括可代谢(无毒性)油。此类油可以包括，例如植物油，鱼油，动物油或可以被将被施用以所述佐剂的受试者(人或动物)的身体代谢并且没有毒性的合成制备的油。植物油的来源包括坚果，种子和谷物。

[0033] 技术人员将理解，本文所述的任何油赋形剂可以作为水包油、油包水或水包油包水乳液形式被提供。

[0034] 本发明提供的水包油乳液由AMPHIGEN(R)制剂组成。此制剂包含水成组分，卵磷脂，矿物油，和表面活性剂。描述所述制剂的组分的专利包括US 5,084,269和US 6,572,861。典型地，本发明的油组分以按体积计1％至50％的量；或10％至45％的量；或20％至
40％的量存在。

[0035] 本文所述的佐剂组合物的其他组分可以包括药学上可接受的赋形剂，如载体、溶剂、和稀释剂、等张剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、血管收缩剂、抗细菌剂、抗真菌剂等。典型的载体、溶剂和稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、油等。代表性的等张剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。有用的稳定剂包括明胶、清蛋白等。

[0036] 表面活性剂用于帮助稳定被选择充当佐剂和抗原的载体的乳液。适用于本发明的表面活性剂包括天然生物相容性表面活性剂和非天然合成表面活性剂。生物相容性表面活性剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂有磷脂酰胆碱(卵磷脂)，如大豆或蛋卵磷脂。卵磷脂可以通过以下方法作为磷脂和甘油三酯的混合物获得：水洗未加工的植物油，并且分离和干燥所得的水合胶。精制的产物可以通过以下方法获得：对通过丙酮洗涤除去甘油三酯和植物油后剩余的丙酮不溶性磷脂和糖脂的混合物进行分馏。备选地，卵磷脂可以获得自多个商业来源。其他合适的磷脂包括磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylsehne)，磷脂酸，心磷脂，和磷脂酰乙醇胺。磷脂可以分离自天然来源或可以是常规合成的。适用于本发明的非天然、合成表面活性剂包括脱水山梨醇系非离子表面活性剂，例如脂肪酸取代的脱水山梨醇表面活性剂(以商品名SPAN(R)或ARLACEL(R)市售的)，聚乙氧基化的山梨醇的脂肪酸酯(TWEEN(R))，来自来源如蓖麻油的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR(R))；聚乙氧基化的脂肪酸(例如，可以商品名SIMULSOL M-53(R)获得的硬脂酸)，聚乙氧基化的异辛基苯酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL(R))，脂肪醇聚氧乙烯醚(BRIJ(R))；壬基酚聚氧乙烯醚(TRITON(R)N)，异辛基苯基聚氧乙烯醚(TRITON(R)X)。一般而言，表面活性剂或表面活性剂的组合(如果使用两种以上表面活性剂)以按体积计0.01％至10％、优选地0.1％至6.0％、更优选地0.2％至5.0％的量存在于乳液中。

[0037] 当在本文中使用时，“药学上可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂等。载体应当在与组合物的其他组分相容并且对受试者无害的意义上是“可用的”。典型地，载体将是无菌且无热原的，并且基于要使用的施用模式进行选择。本领域技术人员公知的是，药学上可接受的载体的某些制剂包含在由美国(US)农业部或美国食品和药品管理局(或非美国国家中的同等的政府机构)颁布的可适用的规定中批准的那些载体。因此，用于组合物的商业制备的药学上可接受的载体可以是已经或将被美国或外国的适当的政府机构批准的载体。

[0038] 所述组合物可以任选地包含相容的药学上可接受的(即，无菌或无毒性)液体、半固体或固体稀释剂，其充当药物载体、赋形剂或介质。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等等。稳定剂包括清蛋白，等等。

[0039] 所述组合物还可以含有抗生素或其他防腐剂，包括，例如，庆大霉素、硫柳汞(merthiolate)或氯甲酚。可选择的多种类型的抗生素或防腐剂是技术人员熟知的。

[0040] 在一个实施方案中，本发明的佐剂组合物可以包含一种或多种另外的佐剂组分。例如，佐剂组合物除了本文所述的无机(钴)纳米粒以外还可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种佐剂：明矾(包含氢氧化铝/磷酸铝)；油系佐剂和有机佐剂(例如角鲨烯)。

[0041] 在一个实施方案中，本文所述的佐剂和/或佐剂组合物可以以冻干形式或作为冻干组合物被提供。技术人员将理解，本发明的冻干佐剂/佐剂组合物可以使用本文所述的任何药学上可接受的载体/稀释剂和/或赋形剂重建。

[0042] 有利地，本文所述的佐剂和佐剂组合物还可以包含一种或多种保存剂–包括，例如，防冻剂。

[0043] 佐剂经常被用作疫苗组合物的组分–尤其是当疫苗的抗原的免疫原性弱时。技术人员将理解，佐剂可以用于改变、调节、修改或增大疫苗的效果从而刺激合适或适当的免疫反应–所述免疫反应有助于从人或动物宿主中清除病原体。如此，在另一方面，本发明扩展至用于人或动物使用的疫苗，其中所述疫苗包含本文所述的佐剂或利用其配制。

[0044] 在另一个实施方案中，本发明提供用于加强人或动物受试者中的免疫反应的本发明的佐剂(即，钴系佐剂)。在一个实施方案中，本发明的佐剂与疫苗一起或同时施用。典型地，将佐剂与疫苗配制在一起以用于施用于人或动物受试者。在其他实施方案中，使用的佐剂可以被配制成单独的组合物(与合适的药物载体、稀释剂和/或赋形剂一起)以在施用疫苗之前或之后向人或动物受试者施用。

[0045] 技术人员将理解，对本文中使用的“疫苗”的指代可以涵盖用于产生(raise)人或动物宿主中的免疫反应的任何抗原制剂。目前使用的有很多不同类型的疫苗并且这些中的很多使用佐剂配制/与佐剂结合或与佐剂一起施用(同时地或分开地)以提高、增加或改变产生的免疫反应的性质。在一些情况中，佐剂被用作提高人或动物宿主中的免疫反应的手段。例如，佐剂可以用于提高由低(亚最优)剂量的抗原引起的免疫反应。在这点上，本发明的佐剂/佐剂组合物可以与亚最优剂量的疫苗或抗原组合–所述疫苗或抗原用来增加由亚最优剂量引起的免疫反应。当与本发明的佐剂或佐剂组合物一起施用时，由亚最优疫苗/抗原剂量产生的免疫反应，可以比得上单独(即，没有佐剂)施用最优剂量的疫苗/抗原产生的免疫反应。

[0046] 在一个实施方案中，病毒和/或细菌抗原疫苗可以与本文所述的佐剂/佐剂组合物组合或一起施用(同时地或分开地)。例如，针对例如‘流感’、白喉、百日咳、麻疹、腮腺炎、风疹、小儿麻痹症、结核病、脑膜炎、破伤风、黄热病、狂犬病的形式的疫苗可以与本文所述的佐剂组合或一起施用。

[0047] 在另一方面，本发明提供(i)产生免疫反应的方法和/或(ii)加强、调节或增强人或动物受试者中的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向有此需要的人或动物受试者施用本发明的第一方面提供的疫苗和佐剂。

[0048] 在一个实施方案中，佐剂可以与疫苗配制在一起以致所述佐剂与疫苗一起被施用至人或动物宿主。在其他实施方案中，佐剂被配制成单独的组合物，以致其可以与疫苗分开施用或与其同时施用。

[0049] 详述

[0050] 现在将参考以下附图详细地描述本发明，以下附图显示：

[0051] 图1：Co3O4NP(A)和I-明矾(B)的形状和尺寸。颗粒分散在蒸馏水中并且通过透射电子显微镜测量。

[0052] 图2：NP或I-明矾对RAW264.7细胞的细胞毒性。在存在或不存在1％OVA的情况下将颗粒(给出的浓度以μg/ml计)添加到RAW264.7细胞中达24h。对于细胞毒性，测量乳酸脱氢酶(LDH)的水平。注意到，与Co3O4NP相比，I-明矾显示约6倍更多的细胞毒性，并且OVA增加颗粒的毒性。数据为平均值±SEM(n＝4/组)。将用1％OVA或不用OVA处理的颗粒的细胞毒性数据与其各自对照相比。***P<0.001。

[0053] 图3：第二次皮下敏化后7天血清中的OVA特异性IgG1水平。其他免疫球蛋白(IgG2a、IgE、IgA和IgM)不显示增加(数据未显示)。数据是平均值±SEM(n＝5/组)。

[0054] 图4：使用卵清蛋白腹膜内攻击后7天存在于血清中的OVA特异性免疫球蛋白水平。测试的免疫球蛋白有(A)IgG1，(B)IgG2a，(C)IgE，(D)IgA，和(E)IgM。数据是平均值±SEM(代表数据，n＝5/组)。(F)使用OVA腹膜内攻击后7天的脾细胞的增殖。仅用培养基或在10μM OVA存在下培养的细胞的3H-胸腺嘧啶掺入。

[0055] 图5：使用卵清蛋白攻击后7天腹腔灌洗液中的OVA特异性IgG1水平。其他免疫球蛋白(IgG2a、IgE、IgA和IgM)不显示增加(数据未显示)。数据是平均值±SEM(n＝5/组)。

[0056] 图6：攻击后7天收集的腹腔灌洗液中的细胞因子的水平。(A)IFN-γ；(B)IL-1β。数据是平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.05，与PBS处理组相比。

[0057] 图7：攻击后7天收集的腹腔灌洗液的分类细胞计数。数据是平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.05，**P<0.01，并且***P<0.001，与PBS处理组相比。

[0058] 图8：攻击后7天注射位点的代表性组织学。A，PBS；B，NP-OVA；C，I-明矾-OVA；D，单独的NP。注意到，NP-OVA和单独的NP组显示轻微的炎症(箭头)以及NP的沉积(黑点)，同时I-明矾-OVA显示严重炎症和坏死(箭头)。

[0059] 图9：显示表达特定标志的树突细胞的数目的图表。

[0060] 图10：显示对钴氧化物纳米粒的细胞毒性反应的图表。

[0061] 图11：显示对Imject Alum的细胞毒性反应的图表。

[0062] 图12：显示响应于氧化钴NP±1％OVA的DC的细胞毒性的图表。

[0063] 图13：显示响应于Imject Alum±1％OVA的DC的细胞毒性的图表。

[0064] 图14：显示通过用氧化钴NP±1％OVA处理的DC的IL-1β产生。

[0065] 图15：显示通过用Imject Alum±1％OVA处理的DC的IL-1β产生。

[0066] 实施例1

[0067] 因为几乎没有佐剂能够诱发Th1反应，所以考虑NP可以用于提高针对模式抗原卵清蛋白(OVA)的Th1免疫性。

[0068] 我们选择Co3O4NP作为候选佐剂，因为Co3O4NP在不产生在NiONP的情况下见到的严重的延迟型超敏病理学[19]的情况下产生Th1反应。目的是确定Co3O4NP是否可以通过诱发针对经皮下施用至雌性C57BL/6小鼠的模式抗原OVA的平衡的Th1和Th2反应而适合用作佐剂。

[0069] 为此，我们将由Co3O4NP诱发的抗-OVA反应与由市售含铝佐剂诱发的那些相比。选择的佐剂是Imject Alum(I-明矾)，这是一种被广泛用于鼠类实验的金属颗粒佐剂，其含有氢氧化铝和氢氧化镁的50/50混合物以及无活性的稳定剂。除了卵清蛋白特异性反应以外，还在注射位点处评估毒性，并且使用小鼠巨噬细胞细胞系评估抗原递呈细胞的细胞毒性。

[0070] 材料和方法

[0071] 除非另外指出，所有化学品和试剂都购自Sigma-Aldrich(Poole，UK)。

[0072] 颗粒的表征和分散.

[0073] 使用透射电子显微镜(JEM-1200EX II,JEOL,Tokyo,Japan)测量Co3O4NP(Nanostructural and Amorphous Materials,TX,USA)和Imject Alum(Thermo 
Scientific,Cramlington,UK)的尺寸。使用粒度分析仪(90Plus/BI-MAS；Brookhaven Instruments Corporation,New York,USA)，在不同浓度的分散介质存在下，测量颗粒的流体力学尺寸。对于体内研究，鸡蛋卵清蛋白(V级)被用作用于Co3O4NP+OVA(NP-OVA)和I-明矾+OVA(I-明矾-OVA)的分散介质，同时收集自健康的C57BL/6小鼠的热失活血清(终浓度：
5％)被用于NP-单独。使用Limulus Amebocyte Lysate测定(Cambrex，MD，USA)测量颗粒悬浮液中的内毒素水平。根据之前描述的方法[19]，在酸性人造溶酶体液(pH 5.5)或碱性人造间质液(pH 7.4)中，测试Co3O4NP和I-明矾的溶解度。

[0074] 剂量选择的理由.

[0075] 基于我们之前的研究，我们选择I-明矾的剂量为2.0mg/小鼠[17]。相对地，基于肺中的炎症原性(inflammogenicity)，Co3O4NP的剂量被选择为25μg/小鼠；灌注419μg/大鼠的Co3O4NP显示急性嗜中性细胞炎症和慢性淋巴细胞/嗜中性细胞炎症以及小泡脂蛋白累积病(alveolar lipoproteinosis)[19]。

[0076] 细胞毒性测定(LDH).

[0077] 将小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7在37℃，在5％CO2的情况下，在含有L-谷氨酰胺、抗生素(青霉素和链霉素)和10％热失活的胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中培养。使用accutase剥离细胞并且将其以5×105接种在12孔板(Corning，NY，USA)中以用于实验。使用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(Roche Applied Science，Sussex，UK)，根据手册说明，测量NP和明矾的细胞毒性作用。使用TiO2NP(30.5±
1.8nm)(Nanostructural and Amorphous Materials,TX,USA)作为基准颗粒。将含有或不含OVA(1％)的NP或I-明矾溶液供应至RAW264.7细胞达24h。以10、30、100和500μg/ml的浓度测试各NP，同时以80、240和800μg/ml的浓度测试I-明矾。在温育后，将无细胞的培养物上清在17000×g离心20min以除去颗粒。将细胞毒性计算为与阳性对照(0.1％Triton-X)相比的百分比。

[0078] 动物免疫.

[0079] 六周龄雌性C57BL/6小鼠获得自Harlan Laboratories(Hillcrest，UK)。所有动物都在由英国内政部向作者中的一位(SEMH)授权的、保证所有动物实验中的人道处理和减轻痛苦的特殊许可下维持和处理。在1周的驯化后，以2周的间隔将小鼠(5只小鼠/组)免疫两次。通过在尾部的底部皮下注射以含有25μl PBS、50μl(100μg)无内毒素的卵清蛋白(Worthington Biochemical Corporation，NJ，USA)和25μl的佐剂(I-明矾：2.0mg；Co3O4NP：25μg)的100μl剂量敏化每只小鼠。将PBS(100μl)和Co3O4NP(25μg，在含有5％小鼠血清的PBS中)用于阴性对照。然后，将在100μl的PBS中的50μg的OVA注射到腹膜中作为攻击。在第二次敏化后7天，从尾静脉收集血液。在攻击后7天，通过心脏穿刺收集血液并且使用2ml的0.9％盐水进行三次腹腔灌洗。保留第一次的灌洗液以用于免疫球蛋白和细胞因子ELISA，同时汇集来自三次灌洗的细胞以用于对细胞进行计数。注射位点也用10％中性缓冲的福尔马林固定以用于组织学分析。

[0080] 2.5.免疫球蛋白ELISA.对于OVA特异性免疫球蛋白IgA、IgE、IgG1、IgG2c(之前被称为IgG2ab)和IgM子类的存在，分析在免疫后1周和攻击后1周收集的血液样品。将血清和腹腔灌洗液样品适当地稀释在含有1％BSA的PBS中。如下地稀释生物素缀合的二抗：抗-IgA–1:1000；抗-IgG1–1:8000；抗-IgG2c–1:1000；抗-IgM–1:1000；抗-IgE–1:250。在测量IgE前，将血清与G蛋白偶联的小珠温育一小时以除去IgG[17；18]。

[0081] 细胞因子ELISA.

[0082] 为了评估细胞因子分布，在腹腔灌洗液中测试Th1型细胞因子(IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-10和IL-13)以及来源于巨噬细胞的促炎性细胞因子(IL-1β)。所有试剂盒都购自R&D Systems(Abingdon，UK)，并且根据生产商的说明测量细胞因子。

[0083] 腹腔灌洗液分类细胞计数.

[0084] 通过使用细胞核计数器(Chemometec，Surrey，UK)估计灌洗液中的细胞总数。使用甩片机将细胞涂片于载玻片(Thermo Scientific，Cramlington，UK)上，用甲醇固定并且用Diff-Quik(Raymond Lamb，Eastbourne，UK)染色。在光学显微镜下，根据其形态，每片约计数300-500个细胞。

[0085] 淋巴细胞增殖测定.

[0086] 将脾从小鼠中移除并且通过使其通过40μm滤器制备单细胞悬液。将细胞分层放置在lympholyte-MTM(Fisher Scientific，Loughborough，UK)密度梯度分离介质上并且在2000×g旋转15分钟以除去死细胞、红血球和粒细胞。移除界面处的单核细胞层，将其洗涤并重悬在组织培养基(补充有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和50μM 2-ME的RPMI 1640；Sigma，UK)中。对活细胞进行计数，并且将在200μl中含有4×105个细胞、不含有或含有10μM无内毒素的卵清蛋白的一式三份的培养物铺板于96孔板中。将培养物温育48小时并且向每孔中加入0.5μCi 3-H-胸腺嘧啶过夜。收获培养物并且在betaplate闪烁计数器(Wallac UK，Milton Keynes，UK)中对掺入的胸腺嘧啶进行计数。在
72小时时收获来自平行的未标记培养物的上清用于细胞因子分析。

[0087] 组织学.

[0088] 将石蜡包埋的福尔马林固定的来自注射位点的组织切割成3μm切片并且用苏木精和曙红染色。

[0089] 统计分析.

[0090] 利用GraphPad Prism Software(Version 5,GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)分析数据。为了比较处理组，应用单向方差分析以及事后Tukey成对比较。P<0.05被认为在统计上是显著的。

[0091] 结果

[0092] 颗粒的理化性质.

[0093] Co3O4NP显示为球形并且一级尺寸为18.4±5.0nm。I-明矾显示为更多样的形状并且平均尺寸为88.7±32.4nm(长度)和28.9±19.7nm(宽度)(图1)。两者颗粒的内毒素水平都低于检测极限(0.1EU/ml)。Co3O4NP在没有分散介质的情况下显示为大的团块而在卵清蛋白作为分散剂的情况下显示为小的团块(表1)。I-明矾即使在没有分散介质的情况下也显示为小的团块。大部分I-明矾在3天内溶解在酸性人造溶酶体液(pH 5.5)中，同时最低限度地溶解在人造间质液(pH 7.4)中(数据未显示)。Co3O4NP在两种条件下都显示最小溶解(数据未显示)。

[0094] 3.2.体外细胞毒性.I-明矾是到目前为止在小鼠巨噬细胞上测试的NP中毒性最大的(图2)。当利用OVA分散颗粒时，颗粒毒性更大。

[0095] 表1.分散后24小时颗粒的流体力学尺寸和多分散性(平均值±SD)。

[0096]

[0097] 体内免疫

[0098] 敏化后血清中的卵清蛋白特异性免疫球蛋白水平.

[0099] IgG1是在此阶段可测量的唯一的免疫球蛋白亚类。图3显示I-明矾-OVA和NP-OVA都诱发IgG1产生，而I-明矾-OVA比NP-OVA更有效。NP-单独诱发的OVA特异性免疫球蛋白的水平类似于载体对照(PBS)。

[0100] 攻击后血清中的卵清蛋白特异性免疫球蛋白水平.

[0101] 攻击后的免疫球蛋白水平表明了更宽范围的反应。NP-OVA和I-明矾-OVA两者都产生IgG1反应的增加，而I-明矾-OVA再一次显示比NP-OVA更高的反应(图4A)。NP-OVA和I-明矾-OVA组中的IgG1水平当与敏化后的那些水平相比时都显示明显增加。此外，NP-OVA的IgG2c水平增加(图4B)。I-明矾-OVA诱发比NP-OVA更高的IgE、IgM和IgA水平(图4C-4E)。

[0102] 攻击后的脾细胞增殖.

[0103] 在攻击后7天用OVA在体外攻击脾单核细胞。图4F显示来自I-明矾和NP-OVA攻击的小鼠的脾细胞增殖。

[0104] 攻击后腹腔灌洗液中的卵清蛋白特异性免疫球蛋白水平.

[0105] NP-OVA和I-明矾-OVA都显示IgG1水平的增加(图5)。I-明矾-OVA显示比NP-OVA更高的IgG1水平。其他免疫球蛋白(IgG2c、IgE、IgA和IgM)仅以与PBS组相似的极低浓度检测到(数据未显示)。

[0106] 腹腔灌洗液中的细胞因子表达.

[0107] 收集自小鼠的腹腔灌洗液也用于测量细胞因子表达。NP-OVA使IFN-γ的水平显著增加，同时其他组没有显示明显的反应(图6A)。仅I-明矾-OVA使IL-1β的水平显著增加(图6B)。与对照相比，IL-10和IL-13未显示明显改变(数据未显示)。

[0108] 腹腔灌洗液中的分类细胞计数.

[0109] NP-OVA和I-明矾-OVA使总细胞和淋巴细胞的数目显著增加，而NP-单独与载体对照相当(图7A和7B)。仅I-明矾-OVA使总粒细胞的数目显著增加(图7C)。

[0110] 注射位点处的炎症.

[0111] 攻击后7天取自注射位点的组织学样品提供测试的两种颗粒之间对比强烈的结果。I-明矾-OVA处理组显示明显的发炎和坏死而没有明显的颗粒沉积，同时NP-OVA和NP-单独组显示最小程度的发炎并具有在周围的颗粒沉积(图8)。

[0112] 实施例2

[0113] 目的

[0114] ·使用乳酸脱氢酶细胞毒性测定确定钴氧化物纳米粒和I-明矾对来源于PBMC的树突细胞的毒性

[0115] ·确定诱发IL-1β、IL-10和IL-12的良好的细胞因子反应而不在细胞中引起毒性所需的剂量

[0116] ·以最佳浓度的NP/I-明矾±Ag85处理来源于牛PBMC的树突细胞。Ag85是高度保守的，并且该蛋白质在导致人结核病(MTb)的生物和导致牛中的TB的相关生物(MB)中是相同的。这将允许我们通过ELISA确定由细胞产生的免疫调节细胞因子的分布(profile)并且通过流式细胞术分析评估细胞表面成熟标志和MHC 11类表达。

[0117] 结果

[0118] 见图9-15和以下表2和3(a-f)。

[0119] 表2：流体力学尺寸和多分散性

[0120]  PBS      
  介质2％FBS   介质5％FBS  
  平均直径nm 多分散性 平均直径nm 多分散性
Imject-Alum        
Co3O4NP 1780 0.081 567 0.076
  MQ H20      
  介质2％FBS   介质5％FBS  
  平均直径nm 多分散性 平均直径nm 多分散性
Imject-Alum 337 0.138 193 0.28
Co3O4NP 66 0.187 136 0.005

[0121] 表3(a-f)：对钴氧化物纳米粒和Imject-Alum的细胞因子反应(n＝4).

[0122] 3A

[0123]NP 平均 SEM
介质 17.30 11.74
10μg/ml 36.42 34.80
30μg/ml 8.64 7.26
100μg/ml 140.71 121.57
500μg/ml 10.50 6.99

[0124] 3B

[0125]NP 平均 SEM
介质 0.19 0.05
10μg/ml 0.34 0.18
30μg/ml 0.27 0.23
100μg/ml 0.56 0.42
500μg/ml 0.26 0.12

[0126] 3C

[0127]NP 平均 SEM
介质 0.14 0.12
10μg/ml 0.09 0.08
30μg/ml 7.8 3.49
100μg/ml 0.06 0.05
500μg/ml 1.15 0.27

[0128] 3D

[0129]I-明矾 平均 SEM
介质 14.68 12.27
20μg/ml 19.75 9.36
80μg/ml 22.30 9.43

[0130]240μg/ml 52.76 20.05
800μg/ml 54.61 12.2

[0131] 3E

[0132]I-明矾 平均 SEM
介质 0.44 0.23
20μg/ml 0.08 0.05
80μg/ml 0.21 0.19
240μg/ml 0.19 0.15
800μg/ml 0.17 0.12

[0133] 3F

[0134]I-明矾 平均 SEM
介质 0.14 0.14
20μg/ml 0.21 0.18
80μg/ml 10.85 10.61
240μg/ml 0.2 0.12
800μg/ml 0.75 0.69

[0135] 概要

[0136] ·成功地确定了静息DCS的细胞表面标志特征。然后将此与用钴氧化物纳米粒和Imject Alum±Ag85处理的DCS相比以确定活化状态和MHC11类表达的变化

[0137] ·我们使用乳酸脱氢酶细胞毒性测定确定了针对增加剂量的钴氧化物纳米粒和Imject Alum的毒性水平。各自的浓度将是50μg/ml

[0138] ·通过ELISA检测由细胞产生的免疫调节细胞因子的特征。响应于更大剂量的Imject Alum，产生增加的IL-1β水平。

[0139] ·在用钴氧化物NP和I-明矾(±1％OVA)处理的树突细胞中的细胞毒性水平方面没有差异

[0140] ·在来自用钴氧化物NP和I-明矾处理的树突细胞的上清中的IL-1β水平比得上钴氧化物和Imject Alum处理的DCs

[0141] ·添加1％OVA导致产生的IL-1β水平增加，并且Imject Alum+1％OVA显示比钴氧化物NP+1％OVA更高的水平。

[0142] 讨论

[0143] 用于人的佐剂的安全性在其开发中是关键问题。目前的研究显示得到许可的佐剂活化人单核细胞和巨噬细胞[20]，这表明将被认为是毒性的可能是明矾佐剂发挥作用的机理的一部分。在此研究中，我们假设Co3O4NP可以以比明矾小的毒性产生平衡的Th1和Th2反应，表明它们可以是更安全的选项。

[0144] Co3O4NP显示相对均一的球形颗粒。有趣地，I-明矾更异质并且在两个尺寸上都小于100nm。异质的形状可能是由于包含氢氧化铝和氢氧化镁的混合物的I-明矾的组成。因此，Co3O4NP和I-明矾都在纳米粒的定义内并且都被归类为金属氧化物NP[21；22]。因为之前的研究已经显示尺寸在佐剂性方面有关系，所以NP的最佳分散可能是有利的[12]。OVA为两种颗粒充当极好的分散剂。在利用OVA分散时，Co3O4NP显示小团块，OVA形成蛋白质电晕(corona)，其提供颗粒之间的互斥力[23]。与Co3O4NP形成对比的，I-明矾在盐水中分散较好，这可能是由于制备期间添加的稳定剂。

[0145] 据信，佐剂通过活化抗原递呈细胞而起作用，但是关于其对此种细胞的毒性几乎没有任何信息。使用鼠巨噬细胞细胞系，LDH细胞毒性研究显示，I-明矾自身是等量的Co3O4NP的约6倍毒。分散在OVA中显示Co3O4NP和明矾两者毒性都增加，这可能是由于OVA自身的细胞毒性或是由于通过形成蛋白质冠冕(corona)而促进颗粒的识别和吞噬作用。

[0146] 敏化后数据显示，I-明矾-OVA和NP-OVA两者都使血清OVA特异性IgG1水平(其是Th2反应的标志[3])增加，而其他免疫球蛋白不增加。然而，I-明矾-OVA产生IgG1的潜能是NP-OVA的约三倍高。攻击后数据显示，产生T细胞反应，这由在体外使用OVA培养的脾细胞的增殖确认。进一步增强的免疫球蛋白反应也见于用任一佐剂免疫的小鼠中。抗原特异性类别转换免疫球蛋白(IgG和IgE)在血清中的出现指示Th1和Th2OVA特异性CD4+T淋巴细胞已经被OVA在利用该抗原使用Co3O4NP作为佐剂敏化后激活。在血清中，I-明矾-OVA主要产生Th2型(IgG1)和变应性抗体反应(IgE)，而NP-OVA更多地产生平衡的Th1(IgG2c)和Th2(IgG1)型反应，其中IgE少得多。这表明作为佐剂的Co3O4NP也许更可能提供加强的‘全面的(all-round)’免疫性并且较不可能诱发不希望要的变应性/副作用。这进一步被攻击后的腹腔灌洗液分析所支持。NP-OVA和I-明矾-OVA使依赖于Th2的IgG1水平显著增加，其模式与血清中所见相同。腹腔灌洗液IFN-γTh1型细胞因子[24]，仅在NP-OVA免疫组中增加。腹腔灌洗液的分类细胞计数显示，NP-OVA和明矾-OVA都诱发对于佐剂性重要的淋巴细胞炎症[5]，而NP-OVA诱发少得多的粒细胞炎症。此通过I-明矾-OVA的粒细胞炎症与腹腔灌洗液中增加的IL-1β一致，IL-1β是一种来源于巨噬细胞的促炎性细胞因子。由I-明矾-OVA诱发的反应的模式与在其他研究[25；26]中见到的一致。

[0147] 在以所用的剂量攻击后7天，I-明矾在经注射的皮肤的皮下层和肌层中诱发长时间的严重炎症和坏死，而Co3O4NP显示轻微的炎症。I-明矾引起比Co3O4NP更严重的炎症与由I-明矾导致的增加的腹膜IL-1β分泌和募集至腹腔的粒细胞数目(其指示在敏化和攻击位点处的炎症反应)一致。此外，I-明矾诱发更加变应性的抗-OVA IgE血清抗体。这提供了关于Co3O4NP的结果，所述结果比之前的报道更完美(rounded)，在之前的报道中TiO2NP显示比Al(OH)3更高的IgE反应(虽然在所述情况下Al(OH)3产生更高的粒细胞募集，这与我们的数据一致)[27]。此外，即使施用的质量是I-明矾的80倍少，Co3O4NP仍显示更平衡的Th1和Th2反应。NP-OVA组在注射位点处未出现细胞死亡和炎症表明其将产生更少的局部疼痛。此外，从食用动物方面的兽医观点，注射位点处较少的细胞死亡和发炎意味着更少的和隐藏的肉酸败并且可以具有提高的经济效益。

[0148] 在温育的3天内，大部分I-明矾溶解在与小泡巨噬细胞的溶酶体液的pH[28]相同的酸性(pH 5.5)溶液中，而在碱性(pH 7.4)溶液中的溶解是最低限度的。然而，Co3O4NP在两种条件下都显示最低限度的溶解。对于高溶解度的NP如CuONP[29]和ZnONP[30]，在酸性溶酶体条件下释放的组成离子将可能在细胞死亡和发炎中起作用。因此，溶解在吞噬细胞的溶酶体中的Al3+可能通过Trojan-Horse类型机理[31]促进细胞死亡以及进一步的炎症。Co3O4NP的溶解度不改变，并且这与在注射位点处的持久性一致。这表明Co3O4NP溶解度非常低并且是稳定的。因为钴离子被非常缓慢地释放到细胞中并且其长期作用是未知的，所以对Co3O4NP的溶解度有担心[19]。钴中毒虽然不常见但还是可能会发生。有报道，髋关节置换(其含钴和铬)随时间腐蚀并且释放金属离子到身体中，从而导致严重疾病[32]。在此处，Co3O4NP由于其小的剂量和注射体积以及不溶的性质似乎不可能有此副作用。在我们之前的研究中，Co3O4NP在肺内部的沉积导致延迟型的超敏性和肺小泡脂蛋白累积病[19]。然而，考虑到肺具有比皮肤和肌肉活跃得多的免疫反应，皮下副作用可能是更有限的，并且实际上在两次注射后5周，在注射位点中仅产生轻微的炎症。然而，如果要施用多次重复的疫苗接种，则Co3O4NP的累积以及钴离子的释放可能导致健康问题。Co3O4NP在皮下层和肌层内的累积表明Co3O4NP可以提供解除吸附的抗原的持续来源，这是提出的明矾佐剂的一种作用模式[33]。

[0149] I-明矾和Co3O4NP之间的比较适用于测量小鼠中的反应。Imject Alum不被批准用于人并且具有与临床批准的产品不同的理化性质[33]。为了能够在长期研究中全面地评估作为有希望的人佐剂的Co3O4NP，需要进一步的研究，但是我们相信Co3O4NP在诱发Th1和Th2介导的反应方面是极有前途的。

[0150] 结论

[0151] 总而言之，与标准剂量的含明矾的佐剂Imject alum相比，Co3O4NP刺激更少的变应性抗体生产和体内炎症(在敏化和攻击位点)。连同其也产生较低的体外毒性同时刺激Th1和Th2两者体内抗体反应的证据，这表明Co3O4NP将适合用作疫苗佐剂。

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