[0001] 本申请是申请号为200680010544.X（国际申请号为PCT/IB2006/001741）、申请日为2006年02月28日、发明名称为“植物中烟碱生物碱的水平的降低”的发明申请的分案申请。

[0002] 临时申请的权益

[0003] 本申请要求2005年2月28日提交的美国临时申请号60/656,636的优先权，其内容在此整体引用参考。

[0004] 本发明涉及分子生物学和生物碱合成的减量调节（down-regulation）领域。具体而言，本发明涉及降低植物中尤其是但不限于烟草植物中烟碱生物碱（nicotinic alkaloids）的方法和构建体。

[0005] 目前，存在几种方法用于降低植物中诸如尼古丁的烟碱生物碱。例如，低尼古丁烟草株系已被用作低尼古丁栽培品种的培育原种（breeding stock）。Legg等，Crop Sci10:212（1970）。遗传工程的方法也能用于降低尼古丁水平。例如，美国专利第5,369,023号和第
5,260,205号讨论了通过内源腐胺甲基转移酶（PMT）序列的反义靶来降低尼古丁水平。
Voelckel等Chemoecology 11:121-126（2001）。烟草醌醇酯（quinolate）转磷酸核糖基酶（QPT）基因已得到克隆，Sinclair等，Plant MoI.Biol.44:603-617（2000），并且在转基因烟草植物中它的反义抑制提供了尼古丁的显著减少。Xie等，烟草科学进展（Recent Advances in Tobacco Science）30:17-37（2004）。也参见美国专利第6,586,661号和第6,423,520号。

[0006] 已知几个尼古丁生物合成酶。例如，参见Hashimoto等，Plant MoI.Biol.37:25-37（1998）；Reichers和Timko,Plant MoI.Biol.41:387-401（1999）；Imanishi等，Plant MoI.Biol.38:1101-1111（1998）。仍然继续需要有另外的遗传工程方法来更进一步降低烟碱生物碱。例如，当在烟草仅仅减量调节PMT时，尼古丁降低了但新烟草碱提高了大约2-6倍。Chintapakorn和Hamill,Plant MoI.Biol53:87-105（2003）；Steppuhn等，PLoSBiol2（8）:e217:1074-1080（2004）。当仅仅减量调节QPT时，仍有大量的生物碱。参见美国植物品种证书第200100039号。

[0007] 降低烟草中总生物碱含量将提高烟草作为生物质资源的价值。当在诸如高密度和多次收割（multiple cuttings）的最大量生物质的条件下生长时，与其他用作生物质的农作物相比，烟草每英亩可多产8吨干重。然而，常规烟草生物质的大规模种植和加工有几个缺点。例如，由于常规的烟草生物质取决于品种含有大约1%至大约5%的生物碱，要花费显著的时间和能量提取，分离，并处理烟草生物碱。以每英亩计，常规的烟草生物质含有多至大约800磅的生物碱。同时，操作烟草的人可能因过于暴露于尼古丁而患病，通常称作“绿烟草病（green tobacco disease）”。

[0008] 生物碱降低的烟草更应服从于非常规的目的，如生物质和衍生产品（derived product）。例如，使用生物碱降低的烟草生产乙醇和蛋白副产物（co-product）具有优势。美国公开申请第2002/0197688号。另外，不含生物碱的烟草或其成分可以用作饲料作物、动物饲料，或者人类营养源。Id.

[0009] 伴随尼古丁降低除了有这些好处外，需要更成功的方法帮助吸烟者戒烟。尼古丁代替疗法（NRT）作为戒烟疗法不很有效，因为在尼古丁代替期结束后的6至12个月，它的成功率低于20%。Bohadana等,Arch Intern.Med.160:3128-3134（2000）；Croghan等，,尼古丁烟草研究（Nicotine Tobacco Res.）5:181-187（2003）；Stapleton等,成瘾性（Addiction）90:31-42（1995）。尼古丁降低或不含尼古丁的香烟已帮助吸烟者成功地戒烟，使吸烟者戒断尼古丁但允许吸烟者有吸烟的习惯。另外，除尼古丁的香烟减轻烟瘾及其他吸烟戒除症状。参见Rose,心理药理学（Psychopharmacology）184:274-285（2006）和Rose等Nicotine Tobacco Res.8:89-101（2006）。

[0010] 因此，持续需要鉴定其他基因，能够作用所述基因表达以降低烟碱生物碱含量。

[0011] 可以作用A622和NBBl两个基因，实现植物中烟碱生物碱水平的降低。特别地，抑制A622和NBBl之一个或两者可以用于降低烟草植物中的尼古丁。

[0012] 因此，一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，该分子包括选自以下的核苷酸序列∶（a）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；（b）编码具有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和（c）由于遗传密码的简并性而不同于（a）或（b）的核苷酸序列、并且编码具有NBBl表达的多肽的核苷酸序列。

[0013] 另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，该分子包括选自以下的核苷酸序列∶（a）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列（；b）编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和（c）由于遗传密码的简并性而不同于（a）或（b）的核苷酸序列、并且编码具有A622表达的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与一异源启动子启动子可操作性地连接。

[0014] 另一方面，本发明提供了一种降低植物中生物碱的方法，该方法包括降低NBBl和A622表达。

[0015] 另一方面，本发明提供了一种降低了A622表达和生物碱含量的转基因植物，也提供了一种降低了NBBl表达和生物碱含量的烟草植物。本发明还提供了一种具有降低的尼古丁和新烟草碱含量的遗传工程植物。

[0016] 另一方面，本发明提供一种用具有降低A622或NBBl表达的烟草植物制造的尼古丁降低的烟制品。附图说明

[0017] 图1描述了尼古丁生物合成途径。缩写为:AO=天冬氨酸氧化酶，QS=喹啉酸合酶，QPT=喹啉酸磷酸核糖酰转移酶，ODC=鸟氨酸脱羧酶，PMT=腐胺N-甲基转移酶，和DAO=二胺氧化酶；

[0018] 图2A示意性地说明pHANNIBAL；

[0019] 图2B示意性地说明pHANNIBAL-X，其中的多连接子（multilinker)位点已经得到修饰，即其中具有改进的多连接位点的pHANNIBAL-X；

[0020] 图3描述了利用修饰的pHANNIBAL-X作为中间质粒制备植物RNAi双元载体的策略；

[0021] 图4描述了pRNAi-A622的T-DNA区域；

[0022] 图5描述了BY-2细胞、A662沉默的BY-2细胞和NBBl沉默的BY-2细胞中烟碱生物碱的积累，其中，BY-2细胞中的烟碱生物碱；WT-野生型，非转化细胞；vector-只用标记转化的细胞；A3、A21、A33、A43-由用于抑制A622的构建体转化的细胞；N37、N40由用于抑制NBB1的构建体转化的细胞；

[0023] 图6描述了A622、NBBl和尼古丁生物合成途径中已知酶的基因在野生型BY-2细胞、A622沉默的BY-2细胞和NBBl沉默的BY-2细胞中的表达，其中，在A622和NBB1沉默的BY-2系内尼古丁生物合成途径中A622，NBB1和其它已知酶的基因的表达；A3、A21、A33和A43是A622沉默的系；N37和N40是NBB1沉默的系；WT是非转化的对照；N是阴性对照；

[0024] 图7描述了诱导型A622表达载体pXVE-A622RNAi的T-DNA区域；

[0025] 图8A描述了经雌二醇诱导抑制后，用诱导型A622抑制构建体转化了的毛状根品系中A622的特异抑制；

[0026] 图8B说明了经雌二醇诱导抑制后，用诱导型A622抑制构建体转化了的毛状根品系中降低的尼古丁含量；其通过RT-PCR检测的A622PMT和微管蛋白的表达（图8A）和烟草毛状根品系中尼古丁的含量（图8B）；烟草毛状根品系在含有（+）或不含有（-）外加雌二醇的液体培养培养基上培养4天，然后收获根并分析；WT-非转化的野生型品系；XVE-A622RNAi#8和XVE-A622RNAi#10是诱导型RNAi品系。

[0027] 图9描述了野生型烟草以及nicl、nic2和niclnic2突变体的根和叶组织中NBBl表达和PMT表达的RNA印迹分析；

[0028] 图10描述了NBB1与花凌草（Eschscholzia californica）小蘖碱桥联酶（bridge enzyme）（EcBBE）的比对；

[0029] 图11描述了利用NBB1和植物BBE样（BBE-like）蛋白序列构建的系统树；

[0030] 图12描述了NBBl抑制载体pHANNIBAL-NBBl 3'的T-DNA区域；

[0031] 图13描述了在NBBl抑制的烟草毛状根中烟碱生物碱合成的降低，其中，烟草毛状根系的烟碱生物碱的产量。野生型-用野生型发根农杆菌转化产生的毛状根品系；载体1和载体2-用没有NBB1序列的载体转化产生的毛状根品系；HN6、HN19、HN20、HN29-用NBB1抑制载体pRNAi-NBB13’转化产生的毛状根品系；

[0032] 图14描述了在NBB1沉默的毛状根品系和对照的毛状根品系中NBB1、A622和尼古丁生物合成有关已知酶的表达：N6、N19、N20、N29载体对照VC；

[0033] 图15描述了NBB1抑制载体pANDA-NBB1全长的T-DNA区域；

[0034] 图16描述了来自于用NBBl抑制载体pANDA-NBB1全长转化的品系的烟草（Nicotiana tabacum）植物叶片中尼古丁的水平。

[0035] 本发明的发明人鉴定了两个基因——A622和NBBl，可以作用所述基因实现包括但不限于烟草的植物中烟碱生物碱水平的降低。虽然A622先前已被Hibi等植物细胞（Plant Cell）6:723-735（1994）鉴定，但是本发明人发现了A622以前未知的作用，在本文中的降低尼古丁生物合成。在本发明人发现之前，本领域完全不知NBBl；根据本发明，本发明的发明人还阐明了NBBl在用于降低植物中烟碱生物碱含量的途径中的作用。

[0036] 因此，本发明包括了通过抑制A622或NBBl表达来降低植物中烟碱生物碱含量的方法和构建体。也就是说，通过抑制A622和NBBl之一或两者能降低烟碱生物碱水平。依据本发明的这方面，用一种核苷酸序列转化植物或植物的任何部分，所述核苷酸序列的表达抑制了A622和NBB1至少之一，并且降低了烟碱生物碱含量。

[0037] 本发明的另一方面，通过同时抑制诸如QPT或PMT的尼古丁生物合成途径的任何已知酶以及A622和NBB1二者至少之一的表达，尼古丁能够在植物中得到更进一步抑制。例如，除了降低尼古丁外，本发明提供了同时降低新烟草碱的途径。因此，通过抑制诸如QPT的尼古丁生物合成基因以及A622与NBBl二者至少之一，能够降低新烟草碱水平。

[0038] 与本发明相一致，通过影响A622和/或NBBl表达的方法，直至最后降低植物中烟碱生物碱的含量，可以获得许多生物碱降低的植物和副产品。例如，已抑制A622或NBBl表达的烟草植物可以用于生产尼古丁减少的香烟，其可以用作戒烟产品。同样地，尼古丁减少的烟草可以用作饲料作物、动物饲料，或者人类营养源。

[0039] 通过以下的详细说明，本发明的其他目的、特征和优势将是明显的。然而应当理解，该详细说明和具体实施例显示了本发明的优选实施方式，仅以说明的方式给出，本领域技术人员根据该详细的说明，在本发明的精神和范围内对本发明的改变和改进显而易见。

[0040] 定义

[0041] 本说明书所用技术术语常用于生物化学、分子生物学和农业；因此，它们可以被本发明所属领域的技术人员理解。那些技术术语可以在例如以下文献中找到：分子克隆：实验指南（MOLECULAR CLONING∶ALABORATORY MANUAL），第三版，1－3卷，Sambrook和Russel主编，冷泉港实验室出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press），冷泉港（Cold Spring Harbor），N.Y.，2001；分子生物学现有实验设计（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY），Ausubel等主编，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York,1988（定期更新）；分子生物学简短实验设计：分子生物学现有实验设计方法概要（SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY∶ACOMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）,第5版，1-2卷，Ausubel等主编，John Wiley & Sons,Inc.，2002；基因组分析：实验指南（GENOME ANALYSIS:A LABORATORY MANUAL），1-2卷，Green等主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.,1997。

[0042] 在此描述了涉及植物生物学技术的方法，并且所述方法被详细描写在如植物分子生物学方法：实验过程指南（METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY:A LABORATORY COURSE MANUAL）（Maliga等主编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.,1995）的方法策略部分。使用PCR的各种技术，例如，在Innis等主编的PCR实验设计方法和应用导则（PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS）（Academic Press San Diego,1990）以及Dieffenbach和Dveksler主编的PCR引物：实验指南（PCR PRIMER:ALABORATORY MANUAL）（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2003）中均有描述。PCR引物对可通过已知技术如使用用于该目的的计算机程序（例如Primer,Version0.5,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge）取自已知序列，用于核酸化学合成的MA.方法例如在Beaucage和Caruthers,Tetra.Letts.22:1859-1862（1981）以及Matteucci和Caruthers,
J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）中有讨论。

[0043] 限制性内切酶消化、磷酸化作用、连接和转化按照在分子克隆实验指南（MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL）（Sambrook等，第二版（1989），Cold Spring Harbor Laboratory Press）中的描述完成。除非另作说明，用于细菌细胞生长与维持的所有试剂和材料可从Aldrich Chemicals（Milwaukee Wis.)、DIFCO Laboratories（Detroit,Mich.)、Invitrogen（Gaithersburg,Md.)，或者Sigma Chemical Company（St.Louis,Mo.)获得。

[0044] A622表达受位于烟草植物中的NIC1和NIC2基因控制，Hibi等，植物细胞（The Plant Cell），6:723-735（1994）。已报道，A622表达方式与PMT相同。Shoi，T.等，植物细胞生理（Plant Cell Physiol），41:9:1072-1076（2000a）；Shoji T.等，Plant MoI Biol，50:427-440（2002）。A622和PMT均在根中特异性表达，特别是在根和根毛尖端部分（apical parts）的皮层和内皮层中表达，Shoji等（2002）。而且，A622和PMT对NIC调控和茉莉酮酸甲酯（methyl-jasmonate）刺激的应答有相同的表达方式。作为对气生组织的创伤应答，A622在烟草（Nicotiana tabacum）的根中得到诱导。Cane等，功能植物生物学（Functional Plant Biology），32,305-320（2005）。在导致QPT诱导的条件下，A622在粉蓝烟草（N.glauca）的受伤叶片中被诱导。Sinclair等，Func.PlantBiol.,31:721-9（2004）。

[0045] A662的核酸序列（SEQ ID NO:1）已经确定。Hibi等（1994），见上文。该核酸序列编码的蛋白质（SEQ ID NO:2）与异黄酮还原酶（IFR）相似并且包含NADPH-结合基序（motif）。A622表现出与TP7有同源性，所述TP7为一种与木质素生物合成相关的苯基香豆满苄基醚还原酶（phenylcoumaran benzylic ether reductase，PCBER）。Shoji et al.(2002),见上文。然而A622在大肠杆菌中用两种不同的底物进行表达分析时，没有观察到PCBER活性。

[0046] 基于A622和PMT的共调控以及A622与IFR的相似性，提出了A622在烟碱生物碱合成的最后步骤中起还原酶的作用。Hibi等（1994）；Shoji等（2000a）。然而，当该蛋白质在细菌（id.）中被表达时，没有观察到IFR活性。以前A622的功能是未知的，而且在此之前并不知道A622在尼古丁合成中起作用。

[0047] A622表达是指由SEQ ID NO:1编码的基因产物的生物合成。A622抑制是指A622表达的减少。A622抑制具有减量调节植物或植物细胞中烟碱生物碱含量的能力。

[0048] 生物碱是一种在植物中发现的含氮碱性化合物并且由次级代谢产生。烟碱生物碱是尼古丁或者在结构上与尼古丁相关并且合成自尼古丁生物合成途径所产生的化合物的一种生物碱。就烟草而言，烟碱生物碱含量和总的生物碱含量被同义地使用。

[0049] 示例性的烟草生物碱包括但是不局限于尼古丁、去甲基烟碱、新烟草碱、毒藜碱、新烟草灵（anatalline）、N-甲基安那他品、N-甲基毒藜碱、麦斯明烟草碱、假木贼因（anabaseine）、N'-甲酰去甲基烟碱（N′-formylnornicotine）、二烯烟碱，以及可铁宁。在烟叶中的其他非常少的生物碱报道于例如Hecht,S.S.等，化学研究报告（Accounts of Chemical Research）12:92-98（1979）；Tso,T.C.,烟草植物的生产、生理学和生物化学（Production,Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant）.Ideals Inc.,Beltsville,MD（1990）。几个生物碱的化学结构描述于例如Felpin等，J.Org.Chem.66:
6305-6312（2001）。

[0050] 尼古丁是烟草（N.tabacum）中的主要生物碱，也是烟草属中50-60%的其他种中的主要生物碱。基于叶中的生物碱积累，去甲基烟碱、新烟草碱、毒藜碱是烟草（N.tabacum）中另外最重要的生物碱。在任何种中，新烟草碱通常不是主要的生物碱但是在3个种中确实积累至相对较高的量；毒藜碱是在4个种中是主要的生物碱。去甲基烟碱是烟草属中30－40%种的主要生物碱。取决于品种，烟草中全部生物碱的大约85%至大约95%是尼古丁。Bush,L.P.,烟草产物、化学和技术（Tobacco Production,Chemistry and Technology），Coresta285-291（1999）；Hoffmann等毒理学和环境健康杂志（Journal of Toxicology and Environmental Health），41:1-52（, 1994）。

[0051] 在本发明中，通过减量调节A622和NBB1的至少之一能够降低遗传工程植物中烟碱生物碱含量。另外，通过减量调节诸如QPT或PMT的尼古丁生物合成酶之一以及A622与NBB1二者至少之一能够降低烟碱生物碱含量。

[0052] 新烟草碱是一种烟碱生物碱。先前的研究已经证明了PMT抑制降低了尼古丁含量但是提高了腐胺和新烟草碱水平。Chintapakorn和Hamill,Plant MoI.Biol.53:87-105（2003）；Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,367-372（. 2001）；Steppuhn,A.等，PLoS Biol2（8）∶e217:1074-1080（2004）。为了本发明的目的，通过减量调节A622和NBBl的至少之一能够降低遗传工程植物中新烟草碱含量。通过减量调节诸如QPT的尼古丁生物合成酶之一以及A622与NBBl二者的至少一个可更进一步降低新烟草碱水平。

[0053] BY－2烟草细胞是日本烟草有限公司于二十世纪60年代建立的一株细胞系，来自于烟草品种亮黄-2）（Bright Yellow-2）。由于这株细胞系在组织培养过程中生长很快，因此它很容易大量繁殖并用于遗传操作。BY－2烟草细胞被广泛地用作基础研究的模式植物细胞系。当在标准的培养基中培养时，BY-2烟草细胞并不产生烟碱生物碱。在培养基中加入茉莉酮酸酯会诱导烟碱生物碱的生成。

[0054] 互补DNA（cDNA）是一种单链DNA分子，该DNA分子以mRNA为模板通过酶反转录形成。本领域技术人员也用“cDNA”来表示双链DNA分子，该DNA分子包括所述一条单链的DNA分子和它的互补DNA链。通常与mRNA部分互补的引物用于起始产生cDNA的反转录过程。

[0055] 表达是指基因产物的生物合成。就结构基因而言，例如，表达涉及结构基因转录成mRNA和mRNA翻译成一种或多种多肽。

[0056] 基因是指多核苷酸序列，其包括生产一种多肽或前体所需的调控序列和编码序列。多肽能被全长编码序列或编码序列的任何部分编码。基因可以由一个不间断的编码序列构成或者它也可以包括一个或多个内含子，通过适当的剪接点结合。而且，基因可以在编码区或者非翻译区包含一个或多个修饰，其可能影响生物活性或表达产物的化学结构、表达的速率，或者表达调控的方式。这样修饰包括但是不局限于一个或更多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。关于这一点，所述修饰基因可被称作“天然”基因的“变体”。

[0057] 遗传工程(GE)包括将核酸或特异性突变导入宿主有机体的任何方法。例如，当用多核苷酸序列转化烟草植物时，该多核苷酸序列抑制如A622或NBBl基因的表达，并且因此降低了尼古丁水平，则该烟草植物得到了遗传工程。相比之下，没有用抑制靶基因表达的多核苷酸序列转化的烟草植物是对照植物，被称为“非转化”植物。

[0058] 在本文中，“遗传工程”范畴包括“转基因”植物和植物细胞（参见定义，下同），以及通过靶向诱变作用产生的植物和植物细胞，例如，通过使用嵌合的RNA/DNA寡聚核苷酸，如在Beetham等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 96:8774-8778（1999）和Zhu等，loc.cit.8768–8773所述，或者所谓的“重组基因寡聚核苷酸库（recombinagenic olionucleobases）”，如PCT申请WO 03/013226所述。同样地，遗传工程植物或植物细胞可通过导入修饰后的病毒产生，进而在宿主内引起遗传修饰，结果与如此处所述转基因植物内产生的遗传修饰相似，在此参见例如美国专利第4,407,956号的描述。另外，遗传工程植物或植物细胞可以是任何天然途径的产物（即，没有涉及外源核苷酸序列），通过导入仅仅来源于该宿主植物种或来源于性别适合的植物种的核酸序列来实现。例如参见美国公开申请第2004/0107455号。

[0059] 基因组文库是包含基因组中的主要单个DNA序列至少一个拷贝的克隆集合。

[0060] NBBl序列通过按照Katoh等的方案（Proc.Japan Acad.,79（Ser.B）:151-154（2003））由林烟草（Nicotiana sylvestris）cDNA文库制备的cDNA芯片鉴定得到。NBBl也被尼古丁生物合成调控位点——NICl和NIC2调控。在烟草植物中NBBl和PMT具有相同的表达方式。NBB1涉及尼古丁生物合成通过以下事实得到证实，像PMT和A622一样，NBB1是在NIC基因调控下并且显示相似的表达方式。

[0061] NBB1表达是指SEQ ID NO:3编码的基因产物的生物合成。NBBl抑制是指NBB1表达的降低。NBB1抑制具有减量调节烟碱生物碱含量的能力。

[0062] NIC1和NIC2位点是烟草（N.tabacum）中两个独立的基因位点，以前称作A和B。突变体nic1和nic2降低了尼古丁生物合成酶的表达水平和尼古丁含量，通常尼古丁的含量野生型>纯合的nic2>纯合的nic1>纯合的nic1和纯合的nic2植物。Legg和Collins,Can.J.Cyto.13:287（1971）；Hibi等，Plant Cell6:723-735（1994）；Reed和Jelesko,植物科学（Plant Science）167:1123（2004）。

[0063] 尼古丁是烟草和烟草属其他种中主要的生物碱。其他的植物具有尼古丁生产能力，例如包括茄科中的澳茄属（Duboisia），Anthocericis属，和Salpiglessis属，以及菊科（Compositae）中的墨旱莲属（Eclipta）和百日草属（Zinnia）。

[0064] 植物是一个包括整个植物、植物器官（例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的后代的术语。植物材料包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生区、愈伤组织、叶、根和幼苗、配子体、孢子体、花粉，以及小孢子。用于本发明的植物种类通常与能够适应于转化技术的高等植物的种类一样的广泛，包括单子叶植物和双子叶植物。优选的植物为茄科中的烟草属、澳茄属、Anthocericis属和Salpiglessis属，或者菊科中的墨旱莲属和百日草属的具有尼古丁生产能力的植物。特别优选的植物是烟草（Nicotiana tabacum）。

[0065] 蛋白质是指氨基酸残基的多聚体。

[0066] 尼古丁降低的植物包括遗传工程植物，其尼古丁含量少于相同类型的非转基因对照植物的一半，优选的少于25%，并且更优选的少于20%或少于10%。尼古丁降低的植物还包括遗传工程植物，其全部的生物碱少于对照植物。

[0067] 结构基因是指一种DNA序列，该DNA被转录成信使RNA（mRNA），所述信使RNA随后被翻译成以氨基酸序列表征的具体多肽。“信使RNA（mRNA）”表示一种RNA分子，该RNA分子含有蛋白质的氨基酸序列编码信息。

[0068] 本文中两个核酸或多肽序列的序列同一性或“同一性”包括参考两个序列中指定区域的相同残基比对时的最大一致性。当序列同一性的百分数用于蛋白质的参考时，已经认识到没有同一性的残基位置经常因保守氨基酸取代而不同，在该位置的氨基酸残基用具有类似化学性质（如电荷和疏水性）的其他氨基酸残基取代，因此不会改变该分子的官能性。其中在保守置换方面存在差异的序列，序列同一性百分比可能因取代的保守属性而向高值修正。由于保守置换而有差异的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。这种修正的手段是本领域技术人员熟知的。典型地，这涉及到保守置换作为一部分而不是完全错配进行记分，因此提高序列同一性百分比。因此，例如，一个同一性氨基酸被记作1分和一个无保守置换被记作零分，保守置换被记作零和1分之间。例如，根据Meyers和Miller的算法计算保守置换的分值。Computer ApplicBiol.Sci.4:11-17（1988），用PC/GENE程序同样实现（Intelligenetics,Mountain View，California,USA）。

[0069] 用于本说明书的序列同一性百分数表示一个特征值（在一个比较窗口中进行两个序列的最佳比对确定的），其中对比窗口中的多核苷酸序列部分可以包括插入或删除（即，缺口）与参考序列（其不包括插入或缺失）比较，其目的是为了这两个序列的最佳比对。百分比是通过以下计算的：确定两个序列中同一的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生可匹配的位置数目，用匹配的位置数除以对比窗口中位置总数，用100乘以该结果得到序列同一性百分比。

[0070] 序列同一性有本领域认可的意思并且可用公开技术计算得到。参见COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk主编（Oxford University Press，1988），BiocoMPUTiNG:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS，Smith主编（Academic Press,1993）COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,I部分,Griffin和Griffin主编（，Humana Press,
1994），SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，Von Heinje主编,Academic Press（1987），SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,Gribskov和Devereux主编,（Macmillan Stockton Press,1991）,和Carillo和Lipton,SIAMJ.Applied Math.48:1073（1988）。通常用于确定两序列间的同一性或相似性的方法包括但是不局限于GUIDE To HUGE COMPUTERS（Bishop主编,Academic Press，1994）公开的那些方法和上文所述的Carillo和Lipton。确定同一性和相似性的方法被写成计算机程序。确定两序列间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但是不局限于GCG程序包（Devereux等，Nucleic Acids Research 12:387（1984）），BLASTP，BLASTN,FASTA（Atschul等，J.MoL Biol.215:403（1990）），和FASTDB（Brutlag等，Comp.App.Biosci.6:237（1990））。

[0071] 烟草是指烟草属中产生烟碱生物碱的任何植物。烟草也包括通过烟草属植物生产的物质产品，例如包括香烟，雪茄，嚼用烟草，鼻吸药和用遗传工程低尼古丁烟草生产的用于戒烟的香烟。烟草属种的实施例包括但是不局限于花烟草(N.alata)、光烟草（N.gauca）、长花烟草（N.longiflora）、N.persica、黄花烟草（N.rustica）、林烟草（N.sylvestris）和烟草（N.tabacum）。

[0072] 烟草特有亚硝胺（TSNAs）是在烟草的烘烤，加工和吸烟期间显著地形成的一种致癌物质。Hoffman,D.,等，J.Natl Cancer Inst.58,1841-4（1977）;WiernikA等，Recent Adv.Tob.Sci（,1995）,21:39-80。TSNAs，例如4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N'-亚硝基去甲烟碱（NNN）、N'-亚硝基新烟草碱（NAT）和N'-亚硝基假木贼碱（NAB），通过尼古丁和其他少量的烟草生物碱（如去甲基烟碱、新烟草碱和毒藜碱）的N-亚硝化作用形成。烟碱生物碱含量的下降降低了烟草和烟草制品中的TSNAs水平。

[0073] 烟草毛状根是指那些具有T-DNA（来自于发根土壤杆菌Ri质粒并已整合到烟草基因组中）的烟草根并且在没有补加生长素和其他激素原条件下培养生长。烟草毛状根如烟草植物根一样产生烟碱生物碱。

[0074] 转基因植物是指包含一核酸序列（它是以另一生物体或种中的本来形态存在或者由于宿主的密码子用法而对来自于另一生物体或种核酸序列进行了优化）的植物。

[0075] 转基因植物可通过任何遗传转化方法产生。例如适合的转化方法包括土壤杆菌介导转化、粒子轰击、电穿孔法、聚乙二醇融合、转位子标签和定点诱变。转基因植物的鉴定和选择是众所周知的技术，其详细技术在这里不必重复。

[0076] 变体是一核苷酸或氨基酸序列，其区别于一个具体基因或蛋白质的核苷酸或氨基酸序列的标准序列或既定序列。术语“同工型(isoform)”、“同种型(isotype)”和"类似物(analog）"也是指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸所改变的氨基酸序列，或者改变的是核苷酸序列，均可以认为是一个“变体”序列。该变体可以有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有类似结构或化学性质，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。变体也可有“非保守的”改变，例如用色氨酸替换甘氨酸。同功的少量变体也可以包括氨基酸缺失或插入，或者二者均有。已发现，用本领域熟知的计算机程序如Vector NTI Suite（InforMax,MD）软件能够指导确定哪些氨基酸残基可以被取代，插入，或缺失。“变体”也可以指“改组基因（shuffled gene）”如Maxygen已转让的专利中所描述的。

[0077] 本发明不局限于这里所描述的具体方法、规程、载体和试剂，等等。这些可以修改。此外，本说明书所涉及的上述术语只是为了描述具体实施方式，并不限制本发明的范围。

[0078] 单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的情况，除非是在文中清楚说明的除外。因此，参数“一个基因”是一个或多个基因并包括技术人员已知的等同量，等等。

[0079] 多核苷酸序列

[0080] 烟碱生物碱生物合成基因已在几个植物种中被鉴定，例如烟草属植物。相应地，本发明包含分离于植物种的基因组并减量调节烟碱生物碱生物合成的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。

[0081] 例如，抑制A622和NBBl中的至少一个，可减量调节植物中的尼古丁含量。另外，通过抑制尼古丁生物合成基因的表达能够更进一步降低烟碱生物碱水平，如QPT和PMT中的至少一个，以及A622和NBBl中的至少一个。多基因被抑制的植物可以通过来自于多基因被抑制的遗传工程植物细胞的植物再生获得或者通过一个尼古丁生物合成基因被抑制的遗传工程第一植物与A622和NBBl中至少一个被抑制的遗传工程第二植物杂交获得。

[0082] 一方面，本发明提供分离的核酸分子包括SEQ ID NO:1；编码多肽SEQ IDNO:2的多核苷酸序列；与SEQ ID NO:1杂交并且编码A622多肽的多核苷酸序列；和由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。本发明更进一步的方面为SEQ ID NO:1编码的肽和所述的SEQ ID NO:2。

[0083] 另一方面，本发明提供分离的核酸分子包括SEQ ID NO:3；编码多肽SEQ ID NO:4的多核苷酸序列；与SEQ ID NO:3杂交并且编码NBB1多肽的多核苷酸序列；和由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。本发明更进一步的方面为SEQ ID NO:3编码的肽和所述的SEQ ID NO:4。

[0084] 本发明更进一步提供核酸，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互补，也提供一核酸，包含至少15个相连碱基，在如下所述的中等或高严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3杂交。为了本说明书的目的，与SEQ ID NO:3杂交的核酸范畴排除具有国际申请WO03/097790所公开的SEQ ID NO:559序列的核酸。

[0085] 在更进一步的具体实施方式中，本发明的siRNA分子包括抑制SEQ ID NO.1或3中任一表达的多核苷酸，尽管SEQ ID NO 1或SEQ ID NO.3序列没有限制。本发明的siRNA分子可能包括任何与A622或NBBl相连的序列，例如大约15至大约25或更多，或大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25，或者更多相连的核苷酸。在本文中，siRNA分子的范畴也不包括具有上述WO 03/097790中所述的核苷酸序列SEQ ID NO:559的分子，而且是其任何片段。

[0086] "分离的"核酸分子是目的的核酸分子，DNA或RNA，其已从内源环境中移开。例如，为了本发明的目的，包含于DNA构建体内的重组DNA分子被认为是分离的。分离DNA分子的更进一步实施例包括保持在异种的宿主细胞内的重组DNA分子或溶液内已纯化、部分或基本上纯化的DNA分子。分离RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录物。根据本发明，分离的核酸分子更进一步包括合成产生的分子。

[0087] 本发明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA,或者是DNA的形式，例如包括通过克隆或合成产生的cDNA和基因组DNA。DNA或RNA可以是双链的或单链的。单链DNA可以是编码链，亦称作有义链，或者是非编码链，也称作反义链。

[0088] 除非另有陈述，在此通过对DNA分子测序测定的所有核苷酸序列是用自动DNA序列测定仪（如Applied Biosystems,Inc,的373型)进行测定的。因此，如本领域已知的一样，通过这样的自动方法测定任何DNA序列，在此测定的任何核苷酸序列可能含有一些误差。典型地，通过自动化测定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列相比至少大约95%是同一的，更典型地至少大约96%到至少大约99.9%是同一的。实际序列能够通过其他的途径更准确地测定，包括本领域熟知的手工DNA测序方法。如本领域熟知的，与核苷酸实际序列相比在测定的核苷酸序列内单个插入或缺失将导致核苷酸序列翻译的移码突变（frame shift）以致于测定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列，从插入或缺失的位点开始。

[0089] 另一方面，本发明提供一分离核酸分子包括如上所述的在严格杂交条件下与本发明的核酸分子中的部分多核苷酸杂交的多核苷酸。与多核苷酸的"部分"杂交的多核苷酸意指这样的多核苷酸，DNA或者RNA，至少与基准多核苷酸的大约15个核苷酸杂交，并更优选的至少大约20个核苷酸，仍然更优选的至少大约30个核苷酸，并且更优选的超过30个核苷酸[0090] 为了本发明的目的，当两个序列在杂交液（6X SSC、0.5%SDS、5X Denhardt溶液和100μg非特异的载体DNA）中形成双链配合物时，二者就为杂交。参见上述的Ausubel等，在
2.9部分，附录27（1994）。序列可以在“中等严格”条件下杂交，所述的“中等严格”条件为：在
60℃下，6X SSC、0.5%SDS、5X Denhardt溶液和100μg非特异的载体DNA组成的杂交液。对于“高严格”条件下的杂交，温度提高到68℃。中等严格条件下杂交反应后，核苷酸用2X SSC加上0.05%SDS的溶液在室温下洗涤5次，随后用0.1X SSC加上0.1%SDS的溶液在60℃洗涤1小时。对于高严格条件，洗涤温度提高到68℃。为了本发明的目的，杂交核苷酸是用1ng的具有
10,000cpm/ng放射性比度的放射性标记探针检测到的那些核苷酸，该杂交核苷酸在70℃下暴露于X-射线最多72小时后肉眼可以清楚地看见。

[0091] 本申请所指的这样的核酸分子，其与所述的核酸序列SEQ ID NO:1或3至少有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。优选的核酸分子与所示的核酸序列SEQ ID NO:1或3至少有95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。两个核酸序列的差别之处可以在基准核苷酸序列的5'或3'端位置或者在两个末端位置间的任何位置，或者单独分散于参考序列内的核苷酸之间或者分散于参考序列内的一个或更多的相连基团内。

[0092] 作为一种特殊的情况，任何具体的核酸分子是否与基准核苷酸序列有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性是指用本领域熟知的标准算法进行比对并且通常能用公知的计算机程序如BLASTN算法确定。参见Altschul等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402（1997）。

[0093] 为了产生一个与整个A622或NBBl mRNA序列或者它们的一部分互补的RNA产物，本发明的反义方法可以选用异源序列。该序列可以与天然的信使RNA的任何相连序列互补,也就是说,它可以与最接近5'端或帽位点（capping site）、帽位点的下游、帽位点与起始密码子之间的内源mRNA序列互补，并且可以覆盖非编码区的全部或仅仅一部分，可以连接非编码区和编码区，与编码区的全部或部分互补，与编码区3'端互补，或者与mRNA的3'-非翻译区互补。

[0094] 适合的反义序列可以是至少大约13至大约15个核苷酸，至少大约16到大约21个核苷酸，至少大约20个核苷酸，至少大约30个核苷酸，至少大约50个核苷酸，至少大约75个核苷酸，至少大约100个核苷酸，至少大约125个核苷酸，至少大约150个核苷酸，至少大约200个核苷酸，或更多。此外，该序列可以延长或缩短其3'或5'端。

[0095] 具体的反义序列和反义序列的长度可以改变，例如取决于抑制的期望程度和反义序列的稳定性。本说明书提供的一般可用技术和信息能够引导选择合适的A622或NBBl反义序列。在此，关于SEQ ID NO:1或3，本发明的寡聚核苷酸可以是A622或NBBl cDNA序列反义方向的连续片段，其长度为当转化入受体植物细胞内足以实现预期效果的任何长度。

[0096] 本发明可以预料A622和NBBl中的一个或二个有义共抑制。当在植物细胞内表达时，实施本发明所用的有义多核苷酸具有的长度足以抑制该植物细胞内的植物A622或NBBl蛋白质的自然表达。这样的有义多核苷酸可以是编码A622或NBBl酶的整个基因组核酸或互补核酸，或者是其片段，这样的片段长度典型地是至少15个核苷酸。可用于确定有义DNA（其抑制细胞内内源基因的表达）长度的技术是普通的。

[0097] 在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码酶RNA分子（“核酶”）的多核苷酸片段的核酸构建体转化植物细胞，该酶RNA分子直接破坏（即，分解）编码A622或NBB1的DNA的mRNA转录物，如在此所述的一样。核酶包含有底物结合区，其与靶mRNA的可进入区域结合，并且该结合区催化核糖核酸的分解，阻止翻译和蛋白质产生。该结合区域可以包括与靶mRNA序列互补的反义序列；该催化位点可以是锤形位点或其他位点，如发夹序列位点。

[0098] RNA靶内的核酶切割位点最初可以通过扫描该靶分子鉴定出核酶切割位点（例如，GUA、GUU或GUC序列）。一旦被鉴定，靶基因（包含该切割位点）的相应区域的15，20，30，或更多个核糖核苷酸的短RNA序列可被评价用于预测结构特点。

[0099] 候选靶的适合与否也可以通过测试它们与互补寡聚核苷酸杂交的可及性（accessibility）进行评价，用本领域已知的核糖核酸酶保护分析方法（ribonuclease protection assays）。编码酶核糖核酸分子的DNA可以根据已知技术产生。例如，参见Cecil等，美国专利第4,987,071号；Keene等，美国专利号5,559,021；Donson等，美国专利第5,
589,367号;Torrence等，美国专利第5,583,032号；Joyce，美国专利第5,580,967号；Gold等，美国专利第5,595,877号；Wagner等，美国专利第5,591,601号；以及美国专利第5,622,
854号。

[0100] 在植物细胞中这样的酶核糖核酸分子的产生和A622或NBB1蛋白质产物的裂解降低了植物细胞中的蛋白质活性，本质上与一个反义的RNA分子的产生方式一样；也就是说，通过干扰细胞中产生该酶的mRNA的翻译。术语“核酶”描述为一个含RNA的核酸，其起到酶的作用，如核糖核酸内切酶，并且使用时可以用"酶RNA分子"互换。

[0101] 本发明更进一步包括编码核酶的核酸，编码核酶的核酸并且已经插入到表达载体中，宿主细胞含有这样的载体，以及在植物中使用核酶降低A622和NBBl表达的方法。

[0102] 在一个具体实施方式中，本发明提供了介导RNA干预基因沉默（mediate RNA interference gene silencing）的双链核酸分子。在另一具体实施方式中，本发明的siRNA分子由双链的核酸分子组成，寡聚核苷酸之间包含大约15至大约30个碱基对，寡聚核苷酸包含大约15至大约30（例如，大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸。还在另一具体实施方式中，本发明的siNA分子包括具有大约1至大约32（例如，大约1、2或3）个核苷酸突出末端（overhanging ends）的双链核酸分子，例如，大约21个核苷酸的双链具有大约19个碱基对和3'端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出（overhangs）。还在另一具体实施方式中，本发明的siNA分子包括具有平端（blunt ends）的双链核酸分子，其中两头是平的，或者两个未端的一端选择是平的。

[0103] 本发明的siNA分子可以包括被修饰的核苷酸，其仍保持介导RNAi的能力。被修饰的核苷酸可用于改善在体内或体外的特性如稳定性，活性，和/或生物有效性。例如，本发明的siNA分子可能包含的被修饰核苷酸数以siNA分子中核苷酸总量的百分数表示。同样地，本发明的siNA分子通常可能包括大约5%至大约100%的被修饰核苷酸（例如，大约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的被修饰核苷酸）。例如，给定的siNA分子中被修饰的核苷酸的实际百分数取决于siNA中核苷酸的总数量。如果该siNA分子是单链的，修饰的百分数可能根据单链的siNA分子中核苷酸的总数目。同样地，如果该siNA分子是双链的，修饰的百分数可能根据有义链、反义链，或者是有义链和反义链的核苷酸总数。

[0104] 例如，A622和NBBl的表达可以通过本领域熟知的遗传工程方法来降低。可以通过导入能够引起RNA（包含编码A622或NBBl的部分序列）表达的核酸构建体来减少表达。该部分序列可以是正义方向或反义方向。该部分序列可以存在于能够形成双链RNA区域的反向重复序列中。可以通过导入一个编码酶RNA分子（即，"核酶"）的核酸构建体来降低表达，酶RNA分子直接破坏（即，分解）编码A622或NBBl的DNA的niRNA转录物。可以通过导入含有A622或NBBl部分序列的核酸来降低表达，该部分序列引起内源基因靶向原位突变（targeted in situ mutagenesis），导致它的失活。

[0105] 序列分析

[0106] 序列比对的计算方法是本领域熟知的。序列比对的最佳算法可以按照Smith和Waterman的局部同源性算法进行。,Adv.Appl.Math.2:482（1981）；通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法进行，J.MoI.Biol.48:443（1970）；通过Pearson和Lipman的相似性检索的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444（1988）；通过这些算法的电脑化来实现，包括但不限于∶PC/基因程序中的CLUSTAL，Intelligenetics,Mountain View，California;Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group（GCG），575Science Dr.,Madison,Wisconsin,USA;CLUSTAL程序被详细描述在：
Higgins和Sharp，Gene73:237-244（1988）；Higgins和Sharp，CABIOS5:151-153（1989）；
Corpet等，Nucleic Acids Research,16:10881-90（1988）；Huang等，Computer 
Applications in the Biosciences8:155-65（1992），和Pearson等，Methods inMolecular Biology 24:307-331（1994)。

[0107] 可用于数据库相似性检索的BLAST程序的家族包括∶BLASTN用于核苷酸查询序列与核苷酸数据库序列的比对；BLASTX用于核苷酸查询序列与蛋白质数据库序列的比对；BLASTP用于蛋白质查询序列与蛋白质数据库序列的比对；TBLASTN用于蛋白质查询序列与核苷酸数据库序列的比对；和TBLASTX用于核苷酸查询序列与核苷酸数据库序列的比对。参见，Current Protocols in Molecular Biology，19章，Ausubel等主编，Greene 
Publishing和Wiley-Interscience,New York（1995）；Altschul等，MoI.Biol.215:403-410（1990）；和，Altschul等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402（1997）。

[0108] 进行BLAST分析的软件是公用的，例如，通过生物技术信息国家中心（the National Center for Biotechnology Information）。这些算法通过鉴定查询序列中的长度W的短字节来首次鉴定高分值的序列对（HSPs），当与数据库序列中同样长度的字节一致时，其或者匹配或者满足某些正值阈值T。T指相邻字节的阈值。这些初始的相邻字节采样数作为种子启动检索，寻找包含它们的更长HSPs。该字节采样数沿每个序列的双向进行延长，为了能使渐增的比对分值尽量地提高。核苷酸序列的渐增的分值是用参数M（匹配的残基对的正向赋值；总是>0）和N（失配残基的负向赋值；总是<0）计算得到的。对于氨基酸序列，记分矩阵被用来计算该渐增的分值。每个方向上的字节采样数的延伸在如下情况时停止：渐增的比对分值以数量X从它达到的最大值回落时；由于一个或更多个负记分的残基比对累积，渐增的分值回到0或低于0时；或者达到序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（用于核苷酸序列）的字节长度（W）的缺省值为11，期望值（E）为10，cutoff为100，M=5,N=-4,和两个链对比。用于氨基酸序列的BLASTP程序的字节长度（W）的缺省值为3，期望值（E）为10，和BLOSUM62记分矩阵。参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.ScI USA 89:10915（1998）。

[0109] 除了计算序列同一性百分数外，BLAST算法也进行两个序列相似性的统计分析（参见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877（1993））。BLAST算法提供的相似性的衡量是最小的总量概率（P(N）），其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间的匹配偶然发生的概率表示。

[0110] 序列多重对比可用CLUSTAL比对方法（Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153（1989））来完成，其缺省参数GAP PENALTY=1O，GAP LENGTH PENALTY=1O）。用CLUSTAL方法成对比对的缺省参数是KTUPLE1，GAPPENALTY=3,WINDOW=5和DIAGONALS SAVED=5。

[0111] 以下工作参数对于使用BLASTN确定比对和相似性是优选的，它有助于多核苷酸序列的同一性百分数和E值∶Unix运行命令∶blastall-p blastn-dembldb-e10-G0-EO-r1-v30-b30-i queryseq-o results;参数是∶-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；-e期望值（E）[实数]；-G开放缺口值（缺省为0）[整数]；-r核苷酸匹配的正向赋值（唯独blastn）[整数]；-v一个品系的说明代码（V）[整数]；-b比对的显示代码（B）[整数]；-i查询文件[进入文件]；和-o随意输出BLAST报告文件[文件退出]。

[0112] "采样数"通过查询序列由BLASTN，FASTA BLASTP或类似算法产生的一个或多个数据库序列，比对和鉴定序列的类似部分。采样数是以相似度和序列覆盖长度的顺序整理的。对于一个数据库序列的采样数通常表示仅仅覆盖该查询序列长度的一部分。

[0113] BLASTN、FASTA和BLASTP算法也产生比对的"期望"值。该期望值（E）显示采样数目，当一个人检索一定规模的数据库时能够"期望"有机会看见一定数量的连续序列。该期望值用作确定显著的阈值，其确定对于一个数据库的采样是否显示了真正的相似性，如优选的EMBL数据库。例如，多核苷酸采样时E值确定为0.1，解释为意指在EMBL数据库那样规模的数据库里，仅用简单的类似记分法，一个人可以期望有机会看见该序列比对部分的0.1匹配。利用该指标，多核苷酸序列的比对和匹配部分是相同的概率则是90%。使用BLASTN或FASTA算法，对于E值为0.01或更少的序列的比对和匹配部分，在EMBL数据库中有机会找到一个匹配的概率为1%或更少。

[0114] 根据一个具体实施方式，关于本发明的每一多核苷酸，"变体"多核苷酸优选的包括具有本发明的每一多核苷酸数目相同或较少的核酸并且与本发明的多核苷酸相比显示的E值为0.01或更少的序列。也就是说，变体多核苷酸是与本发明的多核苷酸相同的概率为至少99%的任何序列，以如上所述的设置参数使用BLASTN、FASTA，或BLASTP算法衡量0.01的E值或更少。另外地，本发明的变体多核苷酸在严格条件下与多核苷酸序列SEQ ID NO:1或3，或互补、反向序列，或者那些序列的反向互补序列杂交。

[0115] 本发明也包括那些不同于已公开的多核苷酸，除非是遗传密码简并性的结果，其编码了与本发明的多核苷酸编码的相同的多肽。因此，多核苷酸包括不同于多核苷酸序列SEQ ID NO:1或3，其反向序列，或其反向互补序列的序列，保守取代的结果通过本发明是可以预料的并且包括在本发明内。另外，多核苷酸包括不同于所述的多核苷酸序列SEQ ID NO:1或3，其反向序列，或其反向互补序列的序列，缺失和/或插入总和少于序列总长度的10%的结果通过本发明是可以预料的并且包括在本发明内。

[0116] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的同一性百分数，变体多核苷酸优选的具有本发明的多核苷酸以外的结构和/或官能性。除了在一级结构上与本发明的多核苷酸具有高度的相似性，多核苷酸与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或者能够杂交，优选的至少具有以下一个特征∶（i）它们包含一个开放阅读框或部分开放阅读框，其编码的多肽具有与本发明的多核苷酸编码的多肽基本相同的官能性；或（ii）它们具有共同区域。例如，变体多核苷酸可以编码能够抑制A622或NBBl的多肽。

[0117] 核酸构建体

[0118] 根据本发明的一个方面，降低烟碱生物碱生物合成的序列被整合到适于植物转化的核酸构建体内。例如，在植物中这样的核酸构建体可用于降低A622或NBBl中至少一个的基因表达。另外，发明的核酸构建体可以降低A622和NBBl中的一个或两个的表达，而且多核苷酸序列编码尼古丁生物合成酶。

[0119] 相应地，所提供的核酸构建体包含一个减量调节烟碱生物碱生物合成的序列，在植物中的转录起始区域的可操作性调控下，以至于该构建体能够在宿主植物细胞中产生RNA。

[0120] 重组DNA构建体可以用标准技术制备。例如，用于转录的DNA序列的获得可以通过用限制性内切酶处理包含所述序列的载体来切下合适的片段。用于转录的DNA序列也可以通过退火和连接合成寡核苷酸来产生或者通过聚合酶链反应（PCR）使用合成寡核苷酸在每个末端产生合适的限制性位点。DNA序列随后被克隆到包含适合调控元件的载体内，如上游的起动子和下游的终止子序列。

[0121] 合适的调控元件

[0122] 启动子意指转录起始位点（其涉及到RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合来启动转录）的DNA上游区域。“组成型启动子”是在植物的整个生命体均有活性的启动子并且在多数环境条件下。组织特异性的，组织优先的，细胞特异性的，和诱导型启动子构成该类“非组成型启动子”。“可操作性连接”是指启动子与第二序列间的功能性连接，其中该启动子序列启动和介导相当于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，“可操作性连接”意指被连接的核酸序列是连续的。

[0123] 被引入细胞来降低A622或NBBl表达的核酸序列的表达所使用的启动子可以是组成型启动子或组织特异性的，组织优先的，细胞特异性的，和诱导型启动子。优先的启动子包括在根组织有活性的启动子，如烟草RB7启动子（Hsu等Pestic.Sci.44:9-19（1995）；美国专利第5,459,252号）和在能够产生尼古丁生物合成所涉及的酶的增强表达的条件下有活性的启动子如烟草RD2启动子（美国专利第5,837,876号），PMT启动子（Shoji等，Plant Cell Physiol,41:831-839（2000b）；WO2002/038588）或A622启动子（Shoji等，Plant MoI Biol,50:427-440（2002））。

[0124] 本发明的载体也可以包含终止序列，其位于本发明的核酸分子的下游位置，以致于终止mRNA的转录和polyA序列的增加。这样的示例性终止子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S终止子和胭脂碱合酶基因（Tnos）终止子。表达载体也可以包含增强子、起始密码子、剪接信号序列和靶序列。

[0125] 本发明的表达载体也可以包含选择标记（以此在培养过程中鉴定已被转化的植物细胞）。该标记可以与异源的核酸分子相连，即，该基因可操作性地与启动子连接。在此所使用的，术语“标记”是指编码一个性状或一个表型的一个基因，其允许对含有该标记的植物或植物细胞进行选择或筛选。通常，该标记基因编码抗生素或除草剂抗性。这允许从没被转化或转染的细胞中选择已被转化的细胞。

[0126] 合适的选择性标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸腺嘧啶核苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦和草丁膦抗性，以及氨基－糖苷3'-O-磷酸转移酶（卡那霉素、新霉素和G418抗性）。这些标记包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。该构建体也可以包含选择性标记基因Bar，其赋予对除草剂草丁膦类似物如ammonium gluphosinate的抗性。Thompson等，EMBO J.9:2519-2523（1987）。其他合适的选择标记是熟知的。

[0127] 肉眼可见的标记如绿色荧光蛋白（GFP）可被使用。基于细胞分裂的对照来鉴定选择被转化植物的方法也已被描述。参见WO2000/052168和WO2001/059086。

[0128] 也可以包括细菌源或病毒源的复制序列，允许该载体被克隆到细菌或噬菌体宿主内。优选的，使用宽寄主范围的原核源复制序列。用于细菌的选择性标记可以被包括，用于选择携带有期望构建体的细菌细胞。合适的原核的选择性标记也包括对抗生素如卡那霉素四环素的抗性。

[0129] 如本领域已知的，编码另外功能的其他DNA序列也可以存在于该载体中。例如，当土壤杆菌属是宿主时，可以包含T-DNA序列来促进随后的转入并且整合到植物染色体上。

[0130] 用于遗传工程的植物

[0131] 本发明包括植物的基因操作，通过导入一多核苷酸序列，减量调节一个基因（其调节烟碱生物碱的合成）如A622和NBBl的表达，抑制烟碱生物碱合成。结果是获得了具有降低的烟碱生物碱水平的植物。

[0132] 在本说明书中，“植物”表示可被遗传操作的含有烟碱生物碱的任何植物材料，包括但不限于分化的或未分化的植物细胞、基因主体、整株植物、植物组织或植物器官，或者植物的任何部分如叶片、茎、根、芽、块茎、果实、根茎或类似物。

[0133] 根据本发明,可被遗传工程的示例性植物包括但是不局限于烟草、马铃薯、番茄、茄子、青椒和颠茄。

[0134] 植物转化和选择

[0135] 根据本发明，使用合适的转化技术，构建体可用于转化任何植物细胞。单子叶的和双子叶的被子植物或裸子植物的植物细胞均可以用本领域已知的不同方式进行转化。例如，参见Klein等，Biotechnology 4:583-590（1993）；Bechtold等，C.R.Acad.ScL Paris 316:1194-1199（1993）；Bent等,MoI.Gen.Genet.204:383-396（1986）；Paszowski等，EMBO J.3:2717-2722（1984）；Sagi等，Plant Cell Rep.13:262-266（1994）。土壤农杆菌种如根癌农杆菌和发根农杆菌能被使用，例如根据Nagel等,Microbiol Lett 61:325（1990）。另外，植物可用发根农杆菌(Rhizobium)，根瘤菌(sinorhizobium)或根瘤菌（Mesorhizobium）进行转化。Broothaerts等，Nature 433:629-633（2005）。

[0136] 例如，可以用植物表达载体转化土壤农杆菌，例如通过电穿孔法，随后将土壤农杆菌导入植物细胞，例如通过熟知的叶盘法。实现该目的的其他方法包括，但是不局限于，用电穿孔法、基因枪轰击法、磷酸钙沉淀法和聚乙二醇融合法，转化萌发的花粉粒，直接进行转化（Lorz等，MoI.Genet.199:179-182（1985）），以及本领域已知的其他方法。如果使用选择标记，如卡那霉素抗性，使得确定哪个细胞已被成功地转化是容易的。

[0137] 已知上述讨论的土壤农杆菌转化方法对于转化双子叶植物是很有用的。另外，de Ia Pena等，Nature 325:274-276（1987），Rhodes等，Science 240:204-207（1988），和Shimamato等，Nature 328:274-276（1989）已经用土壤农杆菌转化了谷类单子叶植物。也参见Bechtold等，CR.Acad.Sci.Paris 316（1994），说明了真空渗透用于土壤农杆菌介导转化。

[0138] 为了本说明书的该目的，可以用包含一个或多个序列的质粒转化植物或植物细胞，每个序列可操作性的与启动子连接。例如，示例性的载体可以包含与启动子可操作性连接的QPT序列。同样地，该质粒可以包含与启动子可操作性连接的QPT序列和A622序列。另外地，植物或植物细胞可以用多于一个的质粒进行转化。例如，植物或植物细胞可以用包含与启动子可操作性连接的第一个质粒转化，该质粒不同于包含A622或NBBl序列的第二质粒。当然，第一个和第二个质粒或其部分被导入相同的植物细胞。

[0139] 本发明的遗传工程植物可以通过常规育种产生。例如，具有减量调节QPT和A622活性的遗传工程植物可以通过一个已降低QPT表达的转基因植物与一个已降低A622表达的转基因植物杂交产生。随后连续多轮杂交和选择，可以选择已减量调节QPT和A622活性的遗传工程植物。

[0140] 一个具体的细胞中，蛋白质、多肽，或核酸分子的存在可以被用来确定，例如，一个细胞是否已被成功地转化或转染。

[0141] 标记基因内可以包括数对能被特异的重组酶（如ere或flp）识别的重组位点，利于在选择后去除该标记。参见美国公开申请号2004/0143874。

[0142] 没有标记基因的转基因植物的产生可以使用包含了编码该标记的核酸的第二质粒，其不同于包含了A622或NBBl序列的第一质粒。第一个和第二个质粒或其部分被引入到相同的植物细胞，这样的选择性标记基因表达是短暂地，鉴定被转化的植物细胞，并且在获得的被转化植物中，A622或NBBl序列被稳定地整合到基因组中以及选择性标记基因没有被稳定地整合。参见美国公开申请号2003/0221213。包含A622或NBBl序列的第一个质粒可以随意是具有T-DNA区域的双元载体，其由野生型的非转基因烟草中或性别亲和的烟草属的种中的核酸序列组成。

[0143] 可以不使用选择标记或肉眼可见的标记，用本发明的核酸构建体转化植物细胞，可以用PCR或其他的特异核酸序列检测方法通过检测被导入的构建体存在与否来鉴定转基因的再生植物。在相似的培养条件下，通过识别所述转化植物细胞的生长率或形态特征与非转化植物细胞的生长率或形态特征的差异，简化被转化植物细胞的鉴定（参见WO2004/076625）。

[0144] 根据已知的方法，从一转化细胞或培养物再生转基因植物的方法因植物物种而异。例如，再生转基因烟草植物的方法是众所周知的。

[0145] 为了本说明书的该目的，选择具有减量调节A622和NBBl二者中的至少一个的表达的遗传工程植物。另外，本发明的遗传工程植物可以有尼古丁生物合成基因的减量调节表达，如QPT或PMT，以及A622和NBB1中的至少一个。

[0146] 尼古丁充当天然的杀虫剂，其帮助保护烟草植物免受虫害，常规育种或转基因的低尼古丁烟草对虫害的敏感性已被报道是提高了。Legg,P.D.,等，Can.J.Cyto.,13:287-291（1971）；Voelckel C，等Chemoecology 11:121-126（2001）；Steppuhn,A.,等，PLoSBiol,
2（8）∶e217:1074-1080（2004）。因此，期待用一转基因（其赋予另外的昆虫保护，如编码Bt杀虫蛋白、蛋白酶抑制因子、或维生素H结合蛋白的基因）另外转化本方法产生的低尼古丁植物。赋予另外昆虫保护的转基因的导入可以通过转基因的低尼古丁植物与含有编码昆虫抗性蛋白的基因的第二转基因植物杂交来实现。

[0147] 量化烟碱生物碱含量

[0148] 本发明的转基因植物的特征在于降低了烟碱生物碱含量。在遗传工程植物中，降低烟碱生物碱含量优选的是通过降低尼古丁生物合成途径基因的表达来实现的，如A622或NBBl。

[0149] 在本发明所述的植物中，短语“降低了尼古丁或烟碱生物碱的含量”是指当与非转化对照植物相比，植物中烟碱生物碱的含量呈数量性下降。烟碱生物碱水平的数量性下降能够通过几种方法分析，例如通过气液色谱法、高效液相色谱法、放射免疫测定法，以及酶联免疫吸附测定法进行量化。在本发明中，烟碱生物碱水平通过装备有毛细管柱和FID检测器的气液色谱法进行测量，如Hibi,N.等，Plant Physiology 100:826-835（1992）所描述的。

[0150] 降低的烟碱生物碱产品

[0151] 本发明提供一种已降低了烟碱生物碱水平的转基因植物。例如，目前的发明预料到通过抑制A622和NBBl中至少一个的表达来降低尼古丁水平。随后选择已经抑制了A622或NBBl的表达并且降低了尼古丁含量的转基因植物，用这样的植物可以制造各种产品。

[0152] 由于本发明提供了一种降低生物碱的方法，因为烟草中生物碱含量与TSNA积累是呈显著正相关的，TSNAs也可以被降低。例如，新烟草碱和NAT间的显著相关系数是0.76。Djordjevic等，J.Agric.Food Chem.,37:752-756（1989）。TSNAs是在烟草的烘烤，加工，和吸烟期间明显形成的致癌物质。然而，在生长的烟草植物或新收割的烟草中，TSNAs是少量存在的。Hecht和Hoffman,J.Natl.Cancer Inst.58,1841-4（1977）；Wiernik等,Recent Adv.Tob.Sci,21:39-80（1995）。通过亚硝基化剂可容易地将N=O官能团添加到二级或三级胺的一个氮上形成含有有机官能团N-N=O的亚硝胺。尽管它们可能潜在地发生在其他含尼古丁的产品中，这类特殊致癌物质仅在烟草中被发现。

[0153] 在香烟中，TSNAs被认为是最突出的致癌物质并且它们的致癌特性已被证明。参见Hecht,S.Mutat.Res.424:127-42（1999）；Hecht,S.Toxicol.11,559-603（1998）；Hecht,S.,等，Cancer Surv.8,273-294（1989）。TSNAs已被证明是口腔癌、食道癌、胰腺癌和肺癌的诱因（Hecht和Hoffman，IARC Sci.Pu U.5461（1991））。特别地，TSNAs已被证明是与吸烟相关的恶性腺瘤和肺癌急剧上升的致病因素。(Hoffmann等,Crit.Rev.Toxicol.26,199-211(1996))。

[0154] 根据曝露和致癌潜力被认为是最重要的并且可能对人类是致癌的四种TSNAs是N'-亚硝基去甲烟碱（NNN），4-(N-亚硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK），N'-亚硝基新烟草碱（NAT），和N'-亚硝基假木贼碱（NAB）。综述在IARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemical to humans。Lyon（法国）VoI 37,205-208页（1985）。这些TSNAs通过尼古丁和较少的烟草生物碱（包括去甲基烟碱、新烟草碱和毒藜碱）的亚硝化作用形成。

[0155] 已报道，无滤嘴香烟的主流香烟中生物碱化合物的水平如下（以μg/支香烟计）：尼古丁∶100-3000、去甲基烟碱:5-150、新烟草碱:5-15、毒藜碱∶5-12（Hoffmann等，Chem.Res Toxicol.14:7:767-790（2000））。美国的主流香烟（有或没有滤嘴）含有（以ng/支香烟计）∶9-180ng NNK，50-500ng NNN,3-25ng NAB和55-300ng NAT。Hoffmann，等，
Toxicol.Environ.Health 41:1-52（1994）。最重要的是，在非主流香烟中这些TSNAs的水平超过主流香烟中的5-10倍。Hoffmann，等（1994）。

[0156] Xie等（2004）报道，通过减量调节QPT降低了尼古丁含量的遗传工程烟草载体21-41，总生物碱水平大约为2300ppm，其少于野生型烟草的10%。与野生型烟草制造的标准全味香烟中的水平相比，载体21-41制造的主流香烟具有少于10%的NNN、NAT、NAB和NNK。

[0157] 通过降低相应的烟草生物碱前体来降低TSNAs的策略是当前农业烟草研究的热点。Siminszky等，Proc.Nat.Acad.Set USA 102（41）14919-14924（2005）。因此，为了减少总TSNAs的形成，急需通过遗传工程尽可能地减少前体烟碱生物碱。

[0158] 其中，美国专利第5,803,081号、第6,135,121号、第6,805,134号、第6,907,887号和第6,959,712号以及美国公开申请第2005/0034365号和第2005/0072047号讨论了减少烟草特异的亚硝胺（TSNAs）的方法。

[0159] 尼古丁降低的烟制品可以是整烟叶、烟丝、剪碎烟丝（shredded tobacco）、切碎烟丝（cut tobacco）和烟草馏份。尼古丁降低的烟制品可以包括卷烟用烟叶、雪茄用烟叶、鼻烟、嚼用烟草、烟斗丝和用于戒烟的由尼古丁降低的遗传工程烟草制造的香烟。

[0160] 尼古丁降低的烟草也可以用来生产复原烟叶（Recon）。Recon是用烟草梗和/或较小叶颗粒通过与典型的纸生产相像的工艺生产的。这些加工工艺需要对欲制成Recon的不同烟草部分进行加工，并且将该烟草切成与整烟叶制造的烟丝（rag tobacco）相似的大小和形状。这些切碎的recon与切碎的烟丝混合并且准备制造香烟。

[0161] 除了常规的烟制品，如香烟和雪茄用烟叶，尼古丁降低的烟草能被用作蛋白源、纤维源、乙醇源和动物饲料源。参见美国公开申请第2002/0197688号。例如，尼古丁降低的烟草可以用作Rubisco（二磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶或馏份1蛋白质）源，因为不像其他植物，烟草源的核酮糖能轻易地以结晶形态提取。除蛋氨酸的水平稍低外，必需氨基酸的核酮糖量等同于或超过FAO暂定的方案。Ershoff B.H.,等，Society for Experimental Biology and Medicine 157:626-630（1978）；Wildman S.G.Photosynthesis Research 73:243-250（2002））。

[0162] 为了生物燃料大量地替换世界上所依赖的非再生能源，副产品如核酮糖帮助支付生产这些再生能源的成本。Greene等Growing Energy.How Biofuels Can End America's Oil Dependence;National Resources Defense Counsel 2004）。因此，烟草中烟碱生物碱下降越多，得到成功的烟草生物资源系统的可能性就越大。

[0163] 为了鉴定编码尼古丁有关酶的序列，并且导入靶基因产生植物转化体，具体的实例描述在以下方法中。它们只是示例性的并不限制本发明。实施例1：通过减量调节A622表达降低生物碱含量的pRNAi-A622载体的制备

[0164] 如图2所示，修饰质粒pHANNIBAL（参见Wesley等，Plant J.27:581-590（2001））产生质粒pHANNIBAL-X。通过SacI酶切以及随后的DNA钝化及连接，去除氨苄青霉素抗性基因（Amp）与35S启动子间的SacI限制性位点。该多克隆位点（MCS）按如下进行修饰。通过在Xhol和EcoRI位点间插入接头（adaptor）（5'TCGAACGGGATCCCGCCGCTCGAGCGG），将Bam H I限制性位点添加到启动子与Pdk内含子间的MCS。通过在BamHI和Xbal位点间插入一个接头（5'GATCAGCTCTAGAGCCGAGCTCGC），从内含子和终止子间的MCS中去除Bam Hl位点并且插入Sac I位点。

[0165] 使用图3中所示的方案利用pHANNIBAL-X制备植物RNAi双元载体，其中通过向感兴趣基因片段的末端添加特异的限制性位点，首先获得分离特殊的“有义”和“反义”片段，然后将有义和反义片段以期望的方向插入到已被修饰的pHANNIBAL-X质粒中。

[0166] 用含有有义和反义片段以及插入的Pdk内含子的DNA片段替换pBI121（Wesley等，2001，）中的GUS编码区，产生一个RNAi双元载体。

[0167] A622cDNA的814bp-1160bp区域被用作dsRNA的形成区域（有义链，反义链）。以克隆到pcDNAII内的A622 cDNA为模板进行PCR并且引物具有编码限制性内切酶位点的额外碱基，以及收集靶DNA片段，克隆TA至pGEM-T载体。

[0168] 所使用的引物序列是∶

[0169] 有义链A622 F814-Xhol-A622 R1160-KpnI

[0170] A622 F814-Xhol 5'CCGCTCGAGCGGTCAGAGGAAGATATTCTCCA3'

[0171] A622 Rl160-KpnI 5'GGGGTACCCCTGGAATAAGACGAAAAATAG3'

[0172] 反义链A622 F814-Xbal-A622 R1160-ClaI

[0173] A622 F814-XbaI 5'GCTCTAGAGCTCAGAGGAAGATATTCTCCA3'

[0174] A622 R1160-ClaI 5'CCATCGATGGTGGAATAAGACGAAAAATAG3'

[0175] 进行对已修饰的pHANNIBAL-X的重组以有义链开始随后为反义链。TA克隆DNA片段用合适的限制性酶酶切、收集，以及连接至pHANNIBAL-X，该质粒已用相同的限制性酶酶切。得到的质粒含有用Pdk内含子分开的A622片段的反向重复DNA序列。

[0176] 用BamH I和Sac I处理，从含有有义和反义链的pHANNIBAL-X上切除RNAi区域，并且连接到用类似处理已将GUS编码区去除的pBI121上，产生用于植物转化的双元载体pRNAi-A622，其含有包含了nptll选择性标记盒和A622 RNAi盒的T-DNA片段（图4）。

[0177] 实施例2∶烟草BY-2细胞中的A622抑制

[0178] 虽然烟草BY-2细胞培养物通常不能合成烟碱生物碱，甲基茉莉酮酸酯处理能诱导基因表达产生尼古丁生物合成途径的已知酶，并引起烟碱生物碱的生成。

[0179] 为了推导A622的功能，制备RNAi株培养细胞，其中来自于pRNAi-A622的mRNA在培养的烟草BY-2细胞中表达以抑制A622。

[0180] 农杆菌转化(Agrotransformation）

[0181] 载体（pRNAi-A622）被转化入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105中,其用于转化烟草BY-2细胞。感染和选择烟草BY-2细胞的方法如下。

[0182] 已在100ml改进的LS培养基中培养了7天的4ml的BY-2细胞，参见Imanishi等，Plant Mol.Biol.,38:1101-1111（1998），传代至100ml改进的LS培养基中，培养4天。

[0183] 将已在YEB培养基中培养了1天的根癌农杆菌溶液100微升加入到已培养了4天的4ml细胞中，此二者在27℃下黑暗中一起共培养40小时。

[0184] 培养后，细胞用改进的LS培养基洗涤两次，除去农杆菌

[0185] 已冲洗的细胞分散于含卡那霉素（50mg/l）和羧苄青霉素（250mg/l）的改进LS选择培养基中，选择已被转化的细胞。

[0186] 在27℃下黑暗中培养大约2周后，已转化的细胞移入新鲜的改进LS选择培养基中，并在27℃下黑暗中培养1周。

[0187] 已被转化的细胞随后在30ml的液态改进LS培养基中在27℃下黑暗中悬浮培养1周。

[0188] 1ml的已培养转化细胞在100ml的改进LS培养基中传代培养。已转化的细胞与野生型细胞的培养方式一样，每7天传代培养一次。

[0189] 生物碱合成10ml每份已培养7天的已转化BY-2细胞以及作为对照的已用绿色荧光蛋白（GFP）表达载体转化的培养烟草细胞用改进的不含2,4-D的LS培养基洗涤两次，并且，添加不含2,4-D的改进LS培养基至总量为100ml后，在27℃下悬浮培养12小时。

[0190] 添加已用DMSO稀释至50μM的甲基茉莉酮酸酯（MeJa）100μl后，细胞在27℃下被悬浮培养48小时。

[0191] 茉莉酮酸酯处理的细胞被过滤，收集，并且冷冻干燥。向50mg的冷冻干燥样品中加入3ml0.1N的硫酸。混合物被声处理15分钟，并过滤。向1ml的滤液中加入28%铵（ammonium）溶液，并且在15000rpm下离心10分钟。

[0192] 将1ml的上清液加入到Extrelut-1柱（Merck）中并静置5分钟。用6ml的氯仿洗脱。用蒸发器（Taitec Concentrator TC-8）在37℃的减压条件下干燥洗脱物。

[0193] 干燥后的样品溶于50μl的含0.1%十二烷的乙醇溶液中。用装有毛细管柱的气相色谱仪（GC-14B）和FID检测器分析样品。RESTEC Rtx-5Amine柱（Restec）用作该毛细管柱。柱温维持在100℃下10分钟，以25℃/分钟的速率提高至150℃，在150℃下保持1分钟，以1℃/分钟的速率提高至170℃，固定在170℃下保持2分钟，以30℃/分钟的速率提高至300℃，然后在300℃下保持10分钟。注入和检测温度是300℃。注入每份为1μl的样品，用内标法量化烟碱生物碱。

[0194] 如图5所示，与对照细胞系相比较，在其中A622基因表达被RNAi（A3、A21 A33和A43系）抑制的转基因BY-2系中，茉莉酮酸酯诱导不会产生高积累量的新烟草碱（所诱导的培养细胞中的主要生物碱）、新烟草灵、尼古丁、或毒藜碱。

[0195] RNA表达

[0196] 为了确定A622-RNAi系中生物碱积累的降低是否与A622表达的降低特别地相关，而不是间接影响尼古丁生物合成途径中的已知酶基因的表达，同时测量茉莉酮酸甲酯处理的品系、转基因的品系和对照系中A622和其他基因的表达的水平。

[0197] 从用50μM的MeJA处理48小时的野生型和转基因BY-2细胞系中分离总RNAs。用RT-PCR确定特异基因的RNA水平。根据制造商的建议，使用Rneasy植物迷你试剂盒（Rneasy Plant mini kit）（Qiagen）提取RNA。使用随机六聚体和Superscript第一链合成系统（Superscript First-Strand Synthesis System）合成cDNA用于RT-PCR（Invitrogen）。用5ng的cDNA作模板，使用TaKaRa Ex Taq酶在以下条件下进行RT-PCR∶为了检测A622、NBBl、AO、QS、QPT、ODC，94℃下30秒，57℃下30秒和72℃下30秒，共22个循环，为了检测PMT，94℃下
1分钟，52℃下30秒和72℃下1分钟，共24个循环。

[0198] A622引物：

[0199] A622-07F 5'ATGGTTGTATCAGAGAAAAG

[0200] A622-05R 5'CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG

[0201] NBBl引物：

[0202] NBBl-OlF 5'ATGTTTCCGCTC ATAATTCTG

[0203] NBBl-1365 5'TCTTCGCCCATGGCTTTTCGGTCT

[0204] AO引物：

[0205] AO ORT-1 5'CAAAACCAGATCGCTTGGTC

[0206] AO ORT-2 5'CACAGCACTTACACCACCTT

[0207] QS引物：

[0208] QSRT1 5'CGGTGGAGCAAAAGTAAGTG

[0209] QSRT-2 5'GAAACGGAACAATCAAAGCA

[0210] QPT引物：

[0211] QPTRT-1 5'TCACTGCTACAGTGCATCCT

[0212] QPTRT-2 5'TTAGAGCTTTGCCGACACCT

[0213] ODC引物：

[0214] ODC RT-1 5'CGTCTCATTCCACATCGGTAGC

[0215] ODC RT-2 5'GGTGAGTAACAATGGCGGAAGT

[0216] PMT引物：

[0217] PMT RT-1 5'GCCATGATAATGGCAACGAG

[0218] PMT RT-2 5'TTAGCAGCGAGATAAGGGAA

[0219] 如图6所示，在A622沉默品系中A622没有受诱导。尼古丁生物合成途径的已知酶的其他基因受到了诱导。这些结果提供了A622被归入烟碱生物碱生物合成途径的证据，并且证明了在具有尼古丁生产能力的植物细胞中烟碱生物碱含量特别是尼古丁含量可以通过减量调节A622的表达来降低。

[0220] 实施例3：诱导型A622 RNAi载体的结构

[0221] 在烟草的毛状根中对A622表达的组成型抑制显著地阻碍了根生长，妨碍了生物碱的分析。为了阻止这些的发生，制成了雌二醇诱导型基因表达系统（XVE系统）。该XVE系统产生RNAi发夹序列分子并且仅在培养基中加入了诱导物（β-雌二醇）后才抑制靶基因。

[0222] 用Xho I和Xba I从pHANNIBAL-X质粒上切除含有A622有义和反义DNA片段的RNAi区域，并且连接入已用Xho I和Xba I消化的pBluescript KS内。该RNAi区域然后用Xho I和Spe I切除，并且被亚克隆到XVE载体pER8的MCS内的Xhol和Spel位点间。（Zuo J.等，Plant J.,24:265-273（2000）），产生双元载体pXVE-A622RNAi。

[0223] pXVE-A622RNAi（参见图7）的T-DNA区域含有嵌合的转录因子XVE的雌二醇诱导表达盒，hpt选择标记盒（selectable marker cassette），以及在LexA-46启动子调控下的通过XVE激活的A622 RNAi表达盒。

[0224] 实施例4∶烟草毛状根中A622的抑制

[0225] 用电穿孔法将双元载体pXVE-A622RNAi导入发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株15834中。如Kanegae等，Plant Physiol.105（2）:483-90（.1994）所述，使用叶盘法用发根土壤杆菌转化烟草变种Petit Havana SR1植物。用潮霉素抗性（在B5培养基中为15mg/L）选择转化根。转基因毛状根在27℃下的黑暗中生长。

[0226] 携带了来自于pXVE-A622RNAi的T-DNA的转基因毛状根在B5培养基中生长10天，然后加入17-β-雌二醇（2μM）培养4天诱导基因沉默。RT-PCR分析表明，在用雌二醇诱导型抑制构建体转化的烟草毛状根品系A8和A10中，A622表达被有效地抑制。参见图8A。

[0227] 使用植物RNeasy迷你试剂盒（RNeasy Plant mini kit）（Qiagen）提取毛状根的总RNA。使用随机六聚体和Superscript第一链合成系统（Invitrogen）合成cDNA用于RT-PCR。用2.5ng的cDNA作模板，使用TaKaRa ExTaq酶(Takara Bio）在以下条件下进行RT-PCR∶为了检测A622，94℃下30秒，57℃下30秒和72℃下30秒，共22个循环，为了检测α-微管蛋白，94℃下1分钟，52℃下30秒和72℃下1分钟，共24个循环。

[0228] 用于A622检测的引物：

[0229] A622-07F 5'ATGGTTGTATC AGAGAAAAG

[0230] A622-05R 5'CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG

[0231] 用于α-微管蛋白检测的引物；

[0232] Tub RT-1 5'AGTTGGAGGAGGTGATGATG

[0233] Tub RT-2 5'TATGTGGGTCGCTCAATGTC

[0234] 用诱导型A622抑制构建体转化的毛状根品系中没有诱导的尼古丁含量为（-）和经雌二醇诱导抑制后的尼古丁含量为（+）。图8B中的RT-PCR图表表明在雌二醇诱导前A622表达已被部分抑制。这在#8系中是特别真实的。A622抑制品系间，尼古丁含量是变化的，但A622抑制品系中的尼古丁含量低于野生型毛状根的尼古丁含量。

[0235] 实施例5：NBBl作为NIC位点调节的基因的鉴定

[0236] 用来自于林烟草（Nicotiana sylvestris）的cDNA文库（Katoh等，Proc.Japan Acad.,Vol.79,Ser.B5 No.6,151-154页（2003））制备的cDNA芯片被用来搜索由尼古丁生物合成调控的NIC位点控制的新基因。

[0237] 用PCR扩增N.sylvestris cDNAs，并且使用Amersham Lucidea点样仪（Amersham Lucidea array spotter）将其点到镜化玻片（mirror-coated slides)（7星型（type 7 2
star），Amersham）上。用紫外交联（120mJ/m）将DNA固定在载玻片表面上。在Agripot容器（Kirin）中，烟草Burley21幼苗（WT和niclnic2）在补加1.5%（W/V）蔗糖和0.35%（W/V）结冷胶（gellan gum）（Wako）的半强度B5培养基上生长。

[0238] 采集八周龄的幼苗根，立即用液氮冷冻，并于-80℃下保存直至使用。使用植物RNeasy迷你试剂盒（Plant RNeasy Mini kit）（Qiagen）从冷冻根中分离总RNA，并且使用GenElute mRNA Miniprep试剂盒（GenElute mRNA Miniprep kit）（Sigma）纯化mRNA。在Cy3或Cy5-dCTP（Amersham）的存在下，使用LabelStar阵列试剂盒（LabelStar Array Kit）用0.4μg的已纯化mRNA来合成cDNA。使用Lucida Pro杂交设备（Lucida Pro hybrid-machine）（Amersham）进行cDNA与微点阵载玻片杂交以及杂交后的洗涤。使用FLA-8000扫描器（FLA-
8000scanner）（Fuifilm）扫描芯片。用ArrayGauge软件（ArrayGauge software）（（Fujifilm）根据信号强度量化获得的阵列图像。以正反配对的方式组合
（reciprocalpair-wise combinations），将来自于野生型和niclnic2烟草的cDNA探针用Cy3和Cy5标记。根据着色的总信号强度对杂交信号进行标准化。与niclnic2探针相比，已鉴定到与野生型探针杂交的cDNA克隆显著地超过了两倍，而且这些包括了NBBl。

[0239] 使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒（SMART RACE cDNA Amplification Kit）（Clontech）从烟草总RNA中通过5'-和3'-RACE获得全长NBBl cDNA。

[0240] 使用ABI 3100遗传分析器（Genetic Analyzer）（Applied Biosystems）和 终止子v3.1循环测序试剂盒（ Terminator v3.1Cycle Sequencing 
Kit）（Applied Biosystems）确定双链上NBBl cDNA插入的核苷酸序列。NBBl的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述蛋白序列包含FAD结合基序。公认的液泡信号肽（vacuolar signal peptide）位于N-末端。

[0241] 实施例6∶NBBl的表征

[0242] 用Northern印迹分析检测烟草植物中NBBl的表达。

[0243] 从已用茉莉酮酸甲酯蒸气处理的植物体中提取RNA，用烟草变种Burley21（Nicotiana tabacum cv.Burley21）（以下缩写为WT）和在Burley21背景中引入突变的突变体nicl，nic2和nicl nic2。栽培是在无菌的封闭环境中，在25℃、150μmole光子/m2的光照下，所述植物在1/2x B5培养基（3%蔗糖，0.3%结冷胶）上培养2个月。向含植物的Agripot容器（80m3的固体培养基容量和250m3的气体容量）（Kirin Tokyo）中添加0.5mL的100μM的茉莉酮酸甲酯，完成甲基茉莉酮酸酯的处理。处理时间是0h和24h。从植物体上收集根部分和叶部分（具有7－10片叶的植物体上的第2－第6片叶）并且立即用液氮冷冻贮存。

[0244] 根据厂家的规程，用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）提取RNA。仍然，向RLT中添加聚乙烯吡咯烷至浓度为1%。柱操作进行2次以提高RNA纯度。

[0245] 根据Sambrook和Russell（Sambrook,J.等，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory，7章（2001））给出的普通方法进行RNA印迹。

[0246] 从NBBl核苷酸序列（SEQ ID NO:3）的1278bp至其末端（1759bp）的序列片段用作探针模板。用以下引物通过PCR从cDNA克隆扩增制备模板：

[0247] 引物1∶GGAAAACTAACAACGGAATCTCT

[0248] 引物2∶GATCAAGCTATTGCTTTCCCT

[0249] 根据厂家的建议，使用Bcabest标记试剂盒（Bcabest labeling kit）（Takara）用32
P标记该探针。根据厂家的规程使用ULTRAhyb（Ambion）作为缓冲液完成杂交。

[0250] 由已克隆入大肠杆菌中pcDNAII载体（Hibi等，1994）的PMT序列制备PMT探针。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）（Qiagen）从大肠杆菌中提取并纯化质粒，利用普通方法用限制性内切酶Xbal和HindIII处理，跑琼脂糖凝胶电泳，收集大约1.5kb DNA片段。QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）（Qiagen）用于收集。用与NBBl探针同样的方法，用32P标记收集的DNA片段，并且杂交。结果示于图9中。

[0251] 图9已清楚显示，在烟草植物中NBBl和PMT有相同的表达方式。NBB1涉及尼古丁生物合成的证据是，像PMT和A622一样，NBBl是在NIC基因调控下，并且它显示与PMT和A622相似的表达方式。

[0252] 实施例7∶NBBl的系统发生分析

[0253] NBBl多肽与花菱草小檗碱桥联酶（Eschscholzia californica berberine bridge enzyme）（BBE）具有25%同一性和60%同源性。（Dittrich H.等，Proc.Natl.Acad.ScI USA,Vol.889969-9973（1991））。NBBl多肽与EcBBE比对示于图10。

[0254] 使用NBB 1多肽序列和植物BBE类似多肽序列构建系统树（基于Carter 和Thornburg，PlantPysiol.134,460-469（2004））。用CLUSTAL W程序利用邻接方法（neighborjoining method）进行系统分析。数目显示了1,000个复制的bootstrap值。使用的序列是∶EcBBE，加州罂粟BBE（GenBank注册号AF005655）；PsBBE，罂粟（Papaver somniferum）可能的网状番荔枝碱氧化酶AF025430）；BsBBE，伏牛花（Berberis 
stolonifera）BBE（AF049347）；VuCPRD2，豇豆（Vigna unguiculata）干旱诱导蛋白（AB056448）；NspNEC5，烟草属种Nectarin V（AF503441/AF503442）；HaCHOX，向日葵（Helianthusannum）醣基氧化酶（carbohydrate oxidase）（AF472609）；LsCHOX，莴苣（Lactuca sativa）醣基氧化酶（AF472608）；以及27个拟南芥基因（Atlg01980、Atlg11770、Atlg26380、Atlg26390、Atlg26400、Atlg26410、Atlg26420、Atlg30700、Atlg30710、Atlg30720、Atlg30730、Atlg30740、Atlg30760、Atlg34575、At2g34790、At2g34810、At4g20800、At4g20820、At4g20830、At4g20840、At4g20860、At5g44360、At5g44380、At5g44390、At5g44400、At5g44410,和At5g44440）。

[0255] 结果示于图11。三个已知的BBEs形成了独立的进化枝和并且被强调并作为"真正的BBEs."指出。NBBl序列与任何BBE或BBE样蛋白质（BBE-like protein）没有高度相似性，并在树的基部与其他的序列分开。所描述的唯一其他BBE类似蛋白来自烟草属，nectarin V，被描述的蛋白存在于杂交装饰（hybrid ornamental）的烟草属花樟（langsdorffii X N.sanderae）的花蜜里，Carter和Thornburg（2004），与豇豆干旱诱导蛋白以及来自于拟南芥的几个被公认的BBE样蛋白质聚在一起。因为该装饰的烟草的花蜜缺乏生物碱和nectarin V具有葡萄糖氧化酶活性，可以推断nectarin V与花中的抗菌防卫有关并且可能与生物碱合成无关。Id.

[0256] 实施例8∶NBBl抑制构建体的制备

[0257] 用以下引物PCR扩增NBBl cDNA的342-bp DNA片段并且克隆入pGEM-T载体。

[0258] 反义链

[0259] NBBI-20F-EcoRI 5'CCGGAATTCGCACAGTGGAATGAAGAGGACG3'

[0260] NBBl-18R-XhoI 5'CCGCTCGAGGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG3'

[0261] 有义链

[0262] NBB1-16F-ClaI 5'CCATCGATGCACAGTGGAATGAAGAGGACG3'

[0263] NBB-19R-bal 5'GCTCTAGAGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG3'

[0264] 最终的PCR产物用EcoRI和Xhol消化用于反义插入，并且用CIaI和xbal消化用于有义链插入。有义DNA片段被亚克隆到pHANNIBAL-X中，随之插入反义片段。得到的质粒含有用Pdk内含子分开的NBBl片段的反向重复DNA序列。

[0265] 用BamH I和Sac I从pHANNIBAL-X切除RNAi区域，并且连接入pBI121以替换GUS编码区，产生双元载体pRNAi-NBB1。pHANNIBAL-NBBl3'的T-DNA区域（参见图12）含有nptII选择性标记盒和具有与NBBl3'片段相当的双链区域的发夹RNAi表达盒。

[0266] 实施例9：烟草BY-2细胞中的NBBl抑制

[0267] 烟草BY-2细胞的茉莉酮酸甲酯处理除了诱导NBBl表达外，还诱导尼古丁生物合成途径已知酶基因的表达。用BY-2细胞检测NBBl抑制的效果。

[0268] 载体pRNAi-NBB1被导入根癌农杆菌株EHAl05中，其用来转化烟草BY-2细胞。BY-2细胞培养于100ml改进的LS培养基中。将YEB培养基中的100μl根癌农杆菌细胞加入到4ml BY-2细胞中，并且在27℃下黑暗中培养40小时。经感染的烟草细胞用改良LS培养基洗涤两次，洗涤后的烟草细胞散播于含有卡那霉素（50mg/1）和羧苄青霉素（250mg/1）的改良LS琼脂培养基上。在27℃下经2周暗培养后，生长的烟草愈伤组织转入到具有相同抗生素的新鲜LS选择培养基，并且在27℃下再暗培养一周。生长的烟草细胞被转入到不含抗生素的改良LS培养基。转化的烟草细胞以7天的间隔进行亚培养。

[0269] 培养的烟草细胞用不含2,4-D的改良LS培养基，在27℃下培养12小时。向100mL烟草悬浮培养物中加入溶于DMSO的茉莉酮酸甲酯100μl，至终浓度为50μM，继续培养烟草细胞48小时。MeJA处理的细胞被过滤，收集，并且冷冻干燥。向100mg的冷冻干燥样品中加入
3ml0.1N的硫酸。混合物经超声处理15分钟，并过滤。向1ml的滤液中加入28%铵（ammonium）溶液，并且在15000rpm下离心10分钟。向Extrelut-1柱（Merck）中加入1ml的上清液并且用
6ml的氯仿洗脱。用蒸发器（Taitec Concentrator TC-8）在37℃的减压条件下干燥洗脱物。
干燥样品溶于50μl的含0.1%十二烷的乙醇溶液中。用装有毛细管柱的气相色谱仪（GC-14B）和FID检测器分析样品。RESTECRtx-5Amine柱（Restec）用作该毛细管柱。柱温维持在100℃下10分钟，以25℃/分钟的速率提高至150℃，,在150℃下维持1分钟，以1℃/分钟的速率提高至170℃，在170℃下维持2分钟，以30℃/分钟的速率提高至300℃，然后在300℃下维持10分钟。注入和检测温度均是300℃。注入每份样品注入1μl，用内标法量化烟碱生物碱。

[0270] 与野生型烟草细胞相比，NBBl抑制的BY-2细胞系（N37和N40）中茉莉酮酸甲酯诱导后的烟碱生物碱积累量大大降低了（参见图5）。

[0271] 为了确定NBB1-RNAi系中生物碱积累量的降低是否特别地与NBBl表达的降低有关，而不是间接影响尼古丁生物合成途径中的已知酶基因的表达，同时测量茉莉酮酸甲酯处理的品系、转基因的品系，以及对照系中NBBl和其他基因的表达水平。

[0272] 从野生型和已用50uM MeJA处理48h的转基因BY-2细胞系中分离总RNAs。用RT-PCR确定特异基因的RNA水平。结果示于图6中。

[0273] 在NBBl沉默系中没有观察到NBBl的诱导，但是尼古丁生物合成途径的已知基因的诱导仍然发生，如A622的诱导。也注意到，在A662抑制品系中NBBl没有受到影响。

[0274] 这些结果证明了NBB1还原酶被包括在烟碱生物碱生物合成途径，并且证明了在具有尼古丁生产能力的植物细胞中烟碱生物碱含量特别是尼古丁含量可以通过减量调节NBBl表达来降低。

[0275] 实施例10烟草毛状根中NBBl抑制

[0276] 烟草SR-1毛状根积累尼古丁作为主要生物碱。研究在毛状根中NBBl抑制对生物碱积累的效果。

[0277] 用电穿孔法将双元载体pRNAi-NBB1 3'导入发根农杆菌株15834中。通过叶盘法用发根农杆菌转化烟草变种Petit Havana SRl植物，如上述的烟草毛状根中A622的抑制。如上所述，选择毛状根并培养以及提取、纯化和分析生物碱。

[0278] 当用RNAi抑制NBBl表达时，与对照细胞系相比，转基因的根系（HN6、HNl9、HN20和HN29）含有非常低的尼古丁水平,也降低了新烟草碱的水平（参见图13）。

[0279] 携带pHANNIBAL-NBBl3'的转基因毛状根在B5培养基中培养两周，用RT-PCR分析基因表达。在四个转基因品系中NBB1表达被特别地抑制（参见图14）。尼古丁生物合成途径的其他酶基因的NBB1表达没有被影响。

[0280] 结果证明了尼古丁积累的降低源于NBBl表达的降低，不是源于缺少尼古丁生物合成途径的已知酶基因的表达。

[0281] 实施例11∶转基因烟草植物中NBBl抑制

[0282] 用一套引物NBB1-aatB1和attB1接头，和NBBl-attB2和attB2接头通过PCR从pGEM-T载体上的NBBlcDNA扩增得到两个attB-NBBl片段。

[0283] 基因特异引物∶

[0284] NBBl-attB1 5'AAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGTTCCGCTCATAATTCTGATCAGCTT[0285] NBBl-attB2 5'AGAAAGCTGGGTCTTCACTGCTATACTTGTGCTCTTGA

[0286] 接头引物∶

[0287] attBl接头5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCT

[0288] attB2接头5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT

[0289] 采用制造商建议的PCR条件。通过attB-NBBl PCR产物和pDONR221（Invitrogen）的BP重组反应产生了表达克隆pDONR221-NBBl-1。

[0290] 将NBBl开放阅读框（ORF）从pDONR221-NBBl-l载体转移到已被消化的GATEWAY双元载体pANDA35HK，通过LR反应在CaMV35S启动子下与GUS部分片段一起表达dsRNA（D r.Ko Shimamoto,NAIST）。得到的NBBlRNAi载体被称作pANDA–NBBl全长。

[0291] pANDA-NBB1全长的T-DNA（参见图15）含有nptll选择性标记盒、NBBlRNAi盒，其中NBBl的全长编码区以反向重复序列存在并用GUS连接子分开，以及hpt选择性标记盒。

[0292] 用电穿孔法将该双元载体pANDA-NBBl全长被导入根癌农杆菌株EHAl05。通过叶盘法用根癌农杆菌转化烟草变种Petit Havana SRl植物，基本上如Kanegae等，Plant Physiol.105,483-490（1994）所描述的。潮霉素抗性（MS培养基中30mg/L）用于选择。转基因植物再生自所述的叶盘并在27℃下连续光照培养在生长箱中。

[0293] 收集生长了36天的T0代植物的叶组织。如上所述，提取、纯化并分析生物碱。与野生型比较，在来自于已用NBBl抑制pANDA-NBBl全长转化的品系的植物叶片中尼古丁的水平降低了。转基因品系（#6、#14和#22）的叶片含有的尼古丁水平仅为野生型植物叶片水平的大约16%。