[0001] 临时专利申请之权益

[0002] 本发明要求我们于2007年5月25日所申请美国临时专利60/924,675之权益。发明领域

[0003] 本发明与调节植物代谢的转录因子相关，亦与编码这些转录因子的核酸分子相关。除与其它事项相关外，该发明亦与编码这些转录因子的核酸序列相关，这些转录因子调
节烟草植物生物碱的生成，尤其是，但不完全是，烟草植物烟碱的生成，该发明亦与生产生
物碱含量已改变的植物和细胞相关。

[0004] 发明背景资料

[0005] 多种植物天然产物因其拥有生物学活性而被用作药物，这些植物也因此具有价值，尤其是生物碱这一类天然产物，其作为药物的用途已被证实。具有生物学活性的生物碱
的例子包括吗啡，东茛菪碱，喜树碱，古柯碱及烟碱。这些化合物均从植物提取而用作药物。
烟碱，吗啡(及相关的阿片类药物)及古柯碱是成瘾类药物，在全世界导致严重的健康和社
会问题。

[0006] 烟碱是具有一系列生物学活性的吡咯烷类生物碱，这些活性包括强烈的毒性作用以及神经系统刺激作用。烟碱在 烟草 和 本塞姆氏烟草 以及若干其它物种的根部合成，
而后被运送至叶部，似乎在那里起防御作用。一类具有挥发性叫做茉莉的植物激素可以诱
导烟碱以及许多其它植物代谢物的合成(Gundlach等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：
2389-2393(1992))。虽然通过植物损伤或使用茉莉可以增加烟碱的含量，调节诱导现象的
实际成分仍有待发现。

[0007] 植物天然产物的生物合成主要受转录调控，植物可以通过这种机制以发育和应激特异的方式调节代谢。已在植物中发现若干调节次级代谢途径的转录因子。一组相互作用
的MYB蛋白(例如，玉蜀黍C1及拟南芥PAP1/PAP2)和碱性螺旋-环-螺旋蛋白(例如，玉
蜀黍R及矮牵牛AN1)控制花青素的生物合成(文献回顾见Vom Endt等，Phytochemistry
61：107-114(2002))。调节植物代谢过程的其它转录因子包括可能控制棉花表皮毛倍半萜
合酶转录的WRKY类型的转录因子(Xu等，植物Physiol.135：507-515(2004))以及拟南芥
中上调植物蜡生物合成的AP2/ERF类转录因子WIN1(Broun等，Curr.Opin.植物Biol.7：
202-209(2004))。

[0008] 在长春花细胞悬液超表达CA3可增加长春花萜类吲哚生物碱代谢途径中部分酶基因的转录水平，但是只有在该细胞悬液中加入一种萜类前驱物马钱苷时才会观察到生物
碱的聚集(van der Fits及Memelink，Science 289：295-297(2000))。超表达Nt或C1以
及NtJAP1两个转录因子可以在细胞悬液中增加与N-甲基腐胺氧化酶(PMT)启动子联锁的
标记基因的瞬时表达(De Sutter等，Plant J.44：1065-76(2005))。
发明概要

[0009] 在一方面，本发明提供一个分离的核酸分子，其核苷酸序列由下列组成：(a)序列1(SEQ ID NO：1)，序列2(SEQ ID NO：2)，序列4(SEQ ID NO：4)，序列5(SEQ ID NO：5)，序列
6(SEQ ID NO：6)，序列8(SEQ ID NO：8)，序列9(SEQ ID NO：9)，序列11(SEQ ID NO：11)，序
列12(SEQ ID NO：12)，序列14(SEQ ID NO：14)或序列15(SEQ ID NO：15)所含核苷酸序列；
(b)本核苷酸序列编码多肽分子，其氨基酸序列包含在序列3(SEQ ID NO：3)，序列7(SEQID
NO：7)，序列10(SEQ ID NO：10)，序列13(SEQ ID NO：13)或序列16(SEQ ID NO：16)；(c)本
核苷酸序列与(a)或(b)所含核苷酸序列至少90％相同，并编码调节生物碱生物合成的转
录因子；(d)本核苷酸序列与(a)，(b)或(c)所含核苷酸序列在严格条件下杂交，并编码调
节生物碱生物合成的转录因子。

[0010] 在一个涵义上，经遗传工程生成植物细胞，该细胞含有由至少21个连续核苷酸组成的核酸序列，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列。在深一层涵义上，植物由植物细
胞构成。在另一涵义上，组织培养由组织细胞组成，所说的组织培养生成或分泌至少一种生
物碱，生物碱前驱物，或生物碱类似物的能力增加。在深一层涵义上，有方法从组织培养生
成生物碱，生物碱前驱物，或生物碱类似物，该方法包括从组织培养分离所说的生物碱，生
物碱前驱物，或生物碱类似物。在更深一层涵义上，组织培养由菸草植物细胞组成，例如，烟
草。

[0011] 在另一方面，本发明提供调节生物碱合成的重组转录因子，其氨基酸序列由下列序列组成：(a)序列3，7，10，13，或16所编码的氨基酸序列；及(b)(a)中编码的氨基酸序
列之变异序列。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物
碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另
一涵义上，该方法提供生物碱含量降低的植物。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来
自于生物碱含量减少的植物。在另一方面，这里提供一种减少植物中生物碱含量的方法，该
方法包括下调正性调节生物碱合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式下调转
录因子：(a)在该植物中引入由至少21个连续核苷酸组成的核酸序列，该序列从序列1，5，
8或11中选出，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列；(b)与相似条件下生长的对照植
物相比，在所说的核苷序列减少植物转录因子的条件下生长该植物。在一个涵义上，该生物
碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于
烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法减少植物中生物碱含
量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植物。

[0012] 在另一方面，本发明提供减少植物群体生物碱含量的方法，包括(a)提供含有异变的植物群体；(b)在所述植物群体中检测含有定向异变的植物，与对照植物相比，所说的
含有定向异变的植物其正性调节生物碱合成的转录因子表达下降；(c)与相似条件下生长
的对照植物相比，选择性培育有定向异变的植物以生成正性调节生物碱合成转录因子表达
下降的植物。在一个涵义上，所述检测方法利用根据序列1，5，8或11设计的引物从异变植
物中放大该转录因子基因区，并通过与野生型植物基因相应区域比较，在含有异变的植物
中确定导致正性调节生物碱合成的转录因子表达下降的基因错配区域，并确定含有基因错
配的植物。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是
烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵
义上，该方法减少植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物
碱含量减少的植物。

[0013] 在另一方面，本发明提供减少植物中生物碱含量的方法，包括上调负性调节生物碱合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式上调转录因子：(a)在该植物中引入
一表达载体，后者含有从序列4，14，或15中选出的核苷序列，所说的连续核苷酸以正义或
反义方向排列；(b)与相似条件下生长的对照植物相比，在所说的表达载体增加该转录因
子水平的条件下生长该植物。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，
该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物
是烟草。在另一涵义上，该方法减少植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少
的产物来自于生物碱含量减少的植物。

[0014] 在另一方面，本发明提供减少植物中烟碱类生物碱含量的方法，该方法包括下调正性调节生物碱合成的转录因子及下调下列至少其中之一，NBB1，A622，QPT，PMT，及MPO。
在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另
一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方
法减少植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减
少的植物。

[0015] 在另一方面，本发明提供减少植物中烟碱类生物碱含量的方法，包括上调负性调节生物碱合成的转录因子及下调下列至少其中之一，NBB1，A622，QPT，PMT，及MPO。在一个
涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义
上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法减少
植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植
物。

[0016] 在另一方面，本发明提供增加植物中生物碱含量的方法，该方法包括下调负性调节生物碱生物合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式下调转录因子：在该植物
中引入核苷序列，该序列是(a)由至少21个连续核苷酸组成的核酸序列，该序列从序列4
及14中选出，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列；(b)与相似条件下生长的对照植
物相比，在所说的核苷序列减少植物转录因子的条件下生长该植物。在一个涵义上，该生物
碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于
烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法减少植物中生物碱含
量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植物。

[0017] 在另一方面，本发明提供增加植物群体生物碱含量的方法，包括(a)提供含有异变的植物群体；(b)在所述植物群体中检测含有定向异变的植物，与对照植物相比，所说的
含有定向异变的植物其负性调节生物碱合成的转录因子表达下降；(c)选择性培育含有定
向异变的植物以生成，与相似条件下生长的对照植物相比，负性调节生物碱合成的转录因
子表达下降的植物。在一个涵义上，所述检测方法利用根据序列4或14设计的引物从异变
植物中放大该转录因子基因区，并通过与野生型植物基因相应区域比较，在含有异变的植
物中确定导致负性调节生物碱合成的转录因子表达下降的基因错配区域，并确定含有基因
错配的植物。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属
植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法产生生物碱含量增多的植物。
在深一层涵义上，含量增加的生物碱来自于该植物。在更深一层涵义上，含量增加的生物碱
是烟碱。

[0018] 在另一方面，本发明提供增加植物中生物碱含量的方法，该方法包括上调正性调节生物碱合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式上调转录因子：(a)在该植物
中引入表达载体，后者含有从序列2，6，9，12或15中选出的核苷序列；(b)与相似条件下生
长的对照植物相比，在所说的表达载体增加该转录因子水平的条件下生长该植物。在一个
涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义
上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法产生生物碱含量增多的植物。在深一层涵义上，
含量增加的生物碱来自于该植物。在更深一层涵义上，含量增加的生物碱是烟碱。

[0019] 在另一方面，本发明提供增加植物中烟碱类生物碱含量的方法，该方法包括下调负性调节生物碱生物合成的转录因子及上调下列至少其中之一，NBB1，A622，QPT，PMT，及
MPO。在一个涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵
义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在另一涵义上，该方法产生生物碱含量增多的植物。在深
一层涵义上，含量增加的生物碱来自于该植物。在更深一层涵义上，含量增加的生物碱是烟
碱。

[0020] 在另一方面，本发明提供增加植物中烟碱类生物碱含量的方法，该方法包括上调正性调节生物碱合成的转录因子及上调下列至少其中之一，NBB1，A622，QPT，PMT，及MPO。
在一个涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，
该生物碱是烟碱类生物碱。在另一涵义上，该方法产生生物碱含量增多的植物。在深一层
涵义上，含量增加的生物碱来自于该植物。在更深一层涵义上，含量增加的生物碱是烟碱。

[0021] 图例简述

[0022] 图1描述 本塞姆氏烟草 叶部对照组和VIGS沉默组的烟碱水平。

[0023] 图2描述转染有NbTF1超表达或低表达载体的 本塞姆氏烟草 叶部的烟碱水平。

[0024] 图3描述转染有NbTF4超表达或低表达载体的 本塞姆氏烟草 叶部的烟碱水平。

[0025] 图4描述转染有NbTF5超表达或低表达载体的 本塞姆氏烟草 叶部的烟碱水平。

[0026] 发明详述

[0027] 本发明发现6个编码转录因子的基因，这些转录因子调节烟碱类生物碱合成。这些基因的核酸序列已经确定。序列1为NbTF1基因的完整序列。序列2列出序列1中的开
放读码区(或ORF)，其编码序列3中的多肽序列。序列4列出NbTF3基因的部分序列，该部
分包括用于VIGS的基因片断。序列5列出NbTF4基因的完整序列，其包括转录起始部位上
游的部分序列。序列6列出序列5的ORF，该ORF编码序列7列出的多肽序列。序列8列出
NbTF5基因的完整序列，序列9列出序列8的ORF，其编码序列10列出的多肽序列。序列11
列出NbTF6基因的完整序列，序列12列出序列11的ORF，其编码序列13列出的多肽序列。
序列14列出NbTF7基因的完整序列，序列15列出序列14的ORF，其编码序列16列出的多
肽序列。

[0028] NbTF1，NbTF4，NbTF5及NbTF6正调节生物碱合成。NbTF3及NbTF7负调节生物碱合成。这些转录因子属于植物中不同类别的转录因子：NbTF1，NbTF3及NbTF5为Myc，碱性
螺旋-环-螺旋蛋白类转录因子；NbTF4为同源域亮氨酸拉链类转录因子；NbTF6为AP2乙
烯反应因子；NbTF7为B3功能区，是茁长素反应因子。

[0029] 在天然产生这些生物碱的植物中，这些转录因子基因或其基因片段可以用来抑制生物碱的合成(例如，烟碱类生物碱)。例如，烟草 属植物(例如，烟草，黄花烟草 和 本
塞姆氏烟草)天然合成烟碱类生物碱。烟草 为高产农作物，其在生物科技中的应用日益增
加。通过转录因子表达的基因工程降低烟碱生物合成，这可以用来生产不含烟碱或低烟碱
含量的烟草植物，这些植物可用于作为低毒性产品平台以生产由植物生成的药物，即所谓
产于植物的药物(plant-madepharmaceuticals，PMPs)(例如，重组蛋白和抗体)，或将其用
于作为工业产品，食品或生物量农作物。转录因子基因或其片段可以用于增加植物或植物
细胞中可以用于治疗目的的生物碱及其相关化合物的合成(例如，烟碱类生物碱)。

[0030] 定义

[0031] 本专利申请所用所有技术术语在生物化学，分子生物学和农业通常使用；因此，本发明所属领域的技术人员通晓这些术语。这些技术术语可以在下列出版物中
查找到，例如在：MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL 3rd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook and Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York，1988(includingperiodic updates)；SHORT PROTOCOLS
IN MOLECULAR BIOLOGY：A COMPENDIUM OFMETHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 5th ed.，vol.1-2，ed.Ausubel et al.，John Wiley & Sons，Inc.，2002；GENOME ANALYSIS：A LABORATORYMANUAL，vol.1-2，ed.Green et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，
1997。植物生物学技术方法在本处描述和在下列文献中详细阐述，例如METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY：A LABORATORY COURSEMANUAL，ed.Maliga et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1995。

[0032] 我们在这里所说的“分离的核酸分子”是指从天然环境分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在DNA载体中的重组DNA分子在本发明中被认为是分离的核酸分子。其它
分离的DNA分子的例子包括外源宿主细胞中的重组DNA分子，或在溶液中部分或大部分纯
化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明中DNA分子体外转录的RNA。根据本发明，分离
的核酸分子也包括合成产生的分子。

[0033] “嵌合核酸”包括编码序列或片段，其连接到与细胞中天然核苷酸编码序列不同的核苷酸序列。

[0034] “异源性核酸”指导入细胞(或祖先细胞)中的核酸，DNA或RNA，该异源性核酸不是所导入细胞中天然核酸序列的拷贝。该异源性核酸可以包含其导入细胞中天然核酸序列
的部分拷贝，或包含其部分片段。

[0035] “内源性核酸”或“内源性序列”指尚未经遗传工程改变的植物或生物中“天然的，”即固有的核酸序列。它指尚未经遗传工程改变的植物或生物之基因组中存在的多核苷酸，
DNA，RNA，mRNA，或cDNA分子。

[0036] “外源性核酸”指导入细胞(或祖先细胞)中的核酸，DNA或RNA，该外源性核酸不是所导入细胞中天然核酸序列的拷贝。该外源性核酸片段可以是其导入细胞中天然核酸序
列的部分拷贝或是天然核酸序列的部分片段。

[0037] 术语“编码(encoding和coding)”指细胞根据某一特定基因所提供的信息，通过转录和翻译从一系列氨基酸合成特定的氨基酸序列，并将之装配成活性酶的过程。由于遗
传密码的简约性，序列中某些碱基变化并不改变蛋白质的氨基酸序列。

[0038] 在有两个多核苷酸(核酸)或多肽序列的情况下，“序列同源性”或“同源性”指在某一特定区域最大的相应部位对齐时两个序列中相同的残基。当序列同源性百分比指
蛋白质时，残基位置的不同源，通常由于保守氨基酸替代的不同造成，既氨基酸残基被具有
相似化学特性(例如，电荷及疏水性)的其它氨基酸残基代替，而该分子的功能特性不改
变。序列由于保守性替代的不同而不同时，可以上调序列同源性百分比以纠正替代的保守
特性。由于保守性替代不同的序列可以说具有“序列相似性”或“相似性。”调整序列同源
性百分比的方法为本领域的技术人员所熟知。这典型地涉及给保守性替代作为部分而不
是完全错配评分，从而增加同源性百分比，例如，一个同源氨基酸给1分，非保守性替代给0
分，保守性替代则介乎于0到1分。例如，保守性替代评分通过，例如根据装载在程序PC/
GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)的Meyers& Miller算法进行计
算，Meyers & Miller，Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(1988)。

[0039] 本说明书中所使用的序列同源性百分比是指通过在某一比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的数值，在比较窗口内的多核苷酸序列部分与参照序列(其不含加入或
删除)比较可能含有加入或删除(即空位)的核苷酸作为两个序列的最佳对齐。序列同源
性百分比的计算是通过确定两个序列中产生同源核酸碱基或氨基酸残基以产生匹配位置
数量的位置数量，匹配位置数量再除以比较窗口内全部位置数量，其结果再乘以100以产
生序列同源性百分比。

[0040] “变异序列”指与标准或某一给定特定的基因或多肽的核苷酸或氨基酸序列有差异的核苷酸或氨基酸序列。术语″同种异形″，″同种异体″和″类似物″亦指核苷酸或
氨基酸序列的“变异序列”。变化包括加入，删除，或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，
或发生改变的核苷酸序列，可以被认为是“变异序列”。“多肽变异序列”也可以是″保守
性″改变，即一个氨基酸被结构或化学特性类似的氨基酸所替代，例如，异亮氨酸替代亮氨
酸。“多肽变异序列”也可能是由于″非保守性″改变，例如，色氨酸替代苷氨酸。类似次要
序列变异也可包括删除和/或插入氨基酸。我们可以利用该行业所熟知的计算机程序所提
供的指南，如Vector NTI Suite(InforMax，MD)软件，来确定哪些氨基酸残基可以被替代，
插入或删除。“变异序列”也可指如Maxygen公司专利中所描述的那些″重排基因”(例如，
美国专利6,602,986号)。

[0041] “遗传工程”包括将核酸或特定突变导入生物宿主的任何方法。例如，植物遗传工程包括在植物中转染能抑制某一靶基因表达的多聚核苷酸序列，以达到和对照植物相比降
低该靶基因表达的目的。植物遗传工程也包括在植物中导入多聚核苷酸序列以表达某一新
基因，或增加植物中天然存在基因产物的含量。在本发明文件中，“遗传工程”包括转基因
植物和植物细胞，以及通过定向诱变生成的植物和植物细胞，例如，通过使用嵌合RNA/DNA
寡核苷酸，描述见Beetham etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778(1999)和Zhu
et al.，Proc Natl AcadSci USA.96：8768-8773(1999)，或所谓的“重组诱导寡聚核碱基，”
描述见PCT申请WO 2003/013226。类似地，植物遗传工程也包括在植物或植物细胞导入修
饰过的病毒，后者导致宿主遗传改变，正如这里所描述的那样，产生类似于转基因植物的结
果。见，例如，美国专利号4,407,956。此外，也可以通过简单的(即不涉及外源核苷酸序
列)方法导入仅从宿主同类植物或性匹配植物获得的核酸序列，生成经遗传工程改变的植
物或植物细胞。例如，见美国公开专利申请号2004/0107455。

[0042] “启动子”指转录起始点上游参与识别和结合RNA聚合酶及其它蛋白质以启动转录的DNA区域。“组成型启动子”指在植物中终生活跃和在绝大多数环境条件下活跃的启动
子。组织特异的，组织优先的，细胞类型特异的和可诱导启动子构成所谓的“非组成型启动
子。”“操纵联结”指启动子与第二个序列在功能上联结，启动子序列启动和介导第二个DNA
序列的转录。通常，“操纵联结”意味着联结的核酸序列是连续的。

[0043] 正如这里所使用，“表达(expression)”指通过基因转录生成RNA产物，或经由核苷酸序列编码产生蛋白。“超表达(overexpression)”或“上调(up-regulation)”是指相
对对照细胞或植物，在细胞或植物其及衍生后代植物通过遗传工程增加某一基因序列或其
变异的表达(例如，“NbTF1超表达”)。

[0044] 术语″抑制(抑制)″或″下调(down-regulation)″同义，表示相对对照细胞或植物，在细胞或植物及其衍生后代植物通过遗传工程降低某一基因序列或其变异的表达
(例如，“NbTF1下调”)。

[0045] “转录因子”是利用其DNA结合区与DNA区域相结合的蛋白质，其典型地结合于启动子区域，并增加或减少特定基因的转录。如果转录因子表达可以增加一个或多个编码生
物碱生物合成酶基因的转录，并增加生物碱的生成，转录因子“正调节”生物碱的生物合成。
如果转录因子表达可以减少一个或多个编码生物碱生物合成酶基因的转录，并减少生物碱
的生成，转录因子“负调节”生物碱的生物合成。转录因子根据其DNA结合区的相似性分类
(见，例如Stegmaier等，Genome Inform.15(2)：276-86((2004))。植物转录因子类别包括
Myc碱性螺旋-环-螺旋蛋白类转录因子，同源域亮氨酸拉链转录因子，AP2乙烯反应因子
转录因子以及B3区域，茁长素反应因子转录因子。

[0046] “生物碱(alkaloid)”指植物中次级代谢生成的含氮碱性化合物。“吡咯烷类生物碱(pyrrolidine alkaloid)”指分子结构中含有吡咯烷环的生物碱，例如，烟碱。烟碱和相
关生物碱在发表文献中亦指吡啶烷类生物碱。“吡啶烷类生物碱(pyridine alkaloid)”指
分子结构中含有吡啶烷环的生物碱，例如，烟碱。“托烷类生物碱(tropane alkaloid)”指分
子结构中含有双环托烷环的生物碱，例如，东茛菪碱和古柯碱。″烟碱类生物碱(nicotinic
alkaloid)″指烟碱或结构上与烟碱相关的生物碱，或指烟碱合成途径中生成的生物碱。具
有代表性的烟碱类生物碱包括，但不局限于，烟碱，去甲烟碱，去氢新烟碱，消旋毒藜碱，新
烟草灵[顺-2，4娣(3-吡啶基)哌啶]，N-甲基去氢新烟碱，N-甲基消旋毒藜碱，麦斯明，
假木贼因，甲酸基去甲烟碱，二烯烟碱及古丁尼。亦有报道烟草叶中含有其它非常次要的烟
碱类生物碱，例如，Hecht，S.S.et al.，Accounts of Chemical Research 12：92-98(1979)；
Tso，T.C.，Production，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant.Ideals Inc.，
Beltsville，MD(1990)。

[0047] 正如这里所使用，“生物碱含量(alkaloid含量)”指植物中生物碱总量，例如，表达为Pg/g干重(DW)或ng/mg鲜重(FW)。“烟碱含量(nicotine含量)”指植物中烟碱总
量，例如，表达为mg/g DW或FW。

[0048] “植物”一词包括整个植物，植物器官(例如，根，茎，叶等)，种子，分化或未分化植物细胞及其子代。植物物质不受限地包括种子，悬浮培养物，胚胎，分生组织，愈伤组织，叶，
根，茎，芽，果，配子体，孢子体，花粉及小孢子。

[0049] “烟草″或“烟草植物”指 烟草 属中任何产生烟碱的物种，包括但不局限于如下成员：丛生烟草(Nicotiana acaulis)，渐尖叶烟草(Nicotiana acuminata)，渐尖
叶烟草(Nicotiana acuminata var.multzjlora)，非洲烟草(Nicotiana africana)，
花烟草(Nicotiana alata)，抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)，，阿伦特氏烟
草(Nicotianaarentsii)，渐狭叶烟草(Nicotiana attenuate)，贝纳米特氏烟草
(Nicotianabenavidesii)，本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)，毕基劳氏烟草
(Nicotianabigelovii)，博内里烟草(Nicotiana bonariensis)，洞生烟草(Nicotiana
cavicola)，克 利 夫 兰 式 烟 草(Nicotiana clevelandii)，心 叶 烟 草 (Nicotiana
cordifolia)，伞状烟草(Nicotiana corymbosa)，迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)，
高烟草(Nicotiana excelsior)，福尔吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)，香烟草
(Nicotiana fragrans)，粉蓝烟草(Nicotiana glauca)，粘烟草(Nicotiana glutinosa)，
古特斯皮德氏姆草(Nicotiana goodspeedii)，哥西氏烟草(Nicotiana gossei)，混合
烟草(Nicotiana hybrid)，因古儿巴烟草(Nicotiana ingulba)，川上烟草(Nicotiana
kawakamii)，奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)，蓝格斯多夫烟草(Nicotiana
langsdorfi)，狭叶烟草(Nicotiana linearis)，长花烟草(Nicotianalongiflora)，海滨
烟草(Nicotiana maritima)，拟似烟草(Nicotiana megalosiphon)，摩西烟草(Nicotiana
miersii)，夜花烟草(Nicotiana noctiflora)，裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)，耳
状烟草(Nicotiana obtusifolia)，西方烟草(Nicotianaoccidentalis)，西方subsp.
Hesperis烟 草(Nicotiana occidentalis subsp.Hesperis)，耳 状 烟 草 (Nicotiana
otophora)，圆锥烟草(Nicotiana paniculata)，少花烟草(Nicotiana pauczjlora)，碧东
烟草(Nicotiana petunioides)，蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)，四科烟草
(Nicotiana quadrivalvis)，雷蒙德氏烟草(Nicotiana raimondii)，残波烟草(Nicotiana
repanda)，莲座叶烟草(Nicotianarosulata)，莲座叶subsp.Ingulba烟草(Nicotiana
rosulata subsp.Ingulba)，圆叶烟草(Nicotiana rotundifolia)，黄花烟草(Nicotiana
rustica)，赛特式烟草(Nicotiana setchellii)，特大管烟草(Nicotiana simulans)，茄
叶烟草(Nicotianasolanifolia)，斯佩格茨烟草(Nicotiana spegauinii)，斯托克通氏
烟草(Nicotianastocktonii)，香甜烟草(Nicotiana suaveolens)，林烟草(Nicotiana
sylvestris)，普通烟草(Nicotiana tabacum)，蓝烟草(Nicotiana thyrsiflora)，绒毛
烟草(Nicotianatomentosa)，绒毛状烟草(Nicotiana tomentosifomis)，三角叶烟草
(Nicotianatrigonophylla)，阴生烟草(Nicotiana umbratica)，波叶烟草(Nicotiana
undulata)，颤毛烟草(Nicotiana velutina)，芹烟草(Nicotiana wigandioides)，以及上
述物种间的杂交植物。

[0050] “烟草产品”指含有 烟草 植物物质的产品，包括例如用于戒烟的尼古丁胶姆糖和尼古丁贴片，卷烟烟叶，膨化烟叶和再造烟叶，雪茄烟叶，烟斗烟，卷烟，雪茄，和所有类型的
无烟烟叶如嚼烟，鼻烟叶，唇齿烟和尼古丁含片。

[0051] “烟碱含量减少的烟草植物(decreased nicotine tobacco plant)”或“烟碱含量下降的烟草植物”包括经遗传工程改良烟碱含量减少50％以上的烟草植物，最好烟碱含量
是同种植物的10％，5％或1％以下。

[0052] “烟碱含量增加的烟草植物(increased nicotine tobacco plant)”包括经遗传工程改良烟碱含量多于同种植物10％，最好烟碱含量是同种或同品种植物的50％，100％
或200％以上。

[0053] I.减少植物中生物碱生成

[0054] A.通过抑制正调节生物碱生成的转录因子以减少生物碱生成

[0055] 可以利用本发明中转录因子基因序列，以若干已知技术抑制编码正调节生物碱生成转录因子的内源性基因来减少生物碱(例如，烟碱)的生成，已知的技术包括例如，RNA
干扰(RNAi)技术，人工微小RNA技术，病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术，反义技术，有义协
同抑制技术和定向突变技术。因此，本发明提供方法和载体，通过抑制编码正调节生物碱生
成转录因子的基因来减少植物中生物碱，这些转录因子包括，例如，NbTF1，NbTF4，NbTF5，及
NbTF6。抑制一个以上的编码正性调节生物碱生成转录因子的基因可以进一步减少植物中
生物碱的水平。

[0056] B.通过抑制正调节生物碱生成的转录因子及至少一个生物碱生物合成基因来减少生物碱生成

[0057] 以往报告显示，在烟草中抑制生物碱合成基因可以减少烟碱类生物碱含量。例如，抑制QPT减少烟碱含量(见美国专利号6,586,661)。抑制A622或NBB1亦减少烟碱水
平(见国际专利出版物WO 2006/109197)，抑制PMT(见Chintapakorn及Hamill。Plant
Mol.Biol.53：87-105(2003))或MPO(见国际专利出版物WO2008/020333及2008/008844；
Katoh等，Plant Cell Physiol.48(3)：550-4(2007))亦可取到同样效果。.因此，本发明
考虑通过抑制A622，NBB1，QPT，PMT及MPO中一个或多个以及抑制正调节生物碱生成转录
因子来进一步减少烟碱类生物碱含量。为了实现本发明这一目的，我们在细胞或植物中导
入含有NbTF1，NbTF4，NbTF5，及NbTF6中至少一个或多个片段的核酸载体，以及导入含有
A622，NBB1，QBT，PMT及MPO中一个或多个片段的核酸载体。一个有说明性的核酸载体可以
由NbTF1和QPT片段组成。

[0058] C.通过超表达对生物碱生成有负调节作用的转录因子来减少生物碱 生成可以利用本发明中转录因子基因序列，以若干已知方式通过超表达编码负调节生物碱生成的转录
因子基因来减少生物碱(例如，烟碱)的生成。因此，本发明提供方法和载体，通过超表达编
码负调节生物碱生成的转录因子基因来减少植物中生物碱含量，这些转录因子包括，例如，
NbTF3或NbTF7。超表达一个以上的编码负调节生物碱生成转录因子的基因可以进一步减
少植物中生物碱水平。

[0059] D.通过超表达负调节生物碱生成的转录因子及抑制至少一个生物碱生物合成基因来减少生物碱含量

[0060] 如上在(I)(B)诉述，已知可以通过抑制生物碱生物合成基因来降低烟碱类生物碱含量。因此，本发明考虑进一步通过抑制A622，NBB1，QPT，PMT及MPO中一个或多个以及
超表达对生物碱生成有负调节作用的转录因子来减少烟碱类生物碱。为了实现本发明这
一目的，导入细胞或植物的核酸载体由下列之一或更多组成，NbTF3或NbTF7，或其ORF，以
及A622，NBB1，QPT，PMT，及MPO中至少一个或多个片段。一个有说明性的核酸载体可以由
NbTF3 ORF和QPT至少一个片段组成。

[0061] E.通过抑制负调节生物碱生成的转录因子及超表达正性调节生物碱生成的转录因子来降低生物碱含量

[0062] 本发明进一步考虑通过抑制一个或多个NbTF1，NbTF4，NbTF5，及NbTF6和超表达一个或多个NbTF3或NbTF7来减少烟碱类生物碱含量。

[0063] II.增加生物碱生成

[0064] A.通过超表达正调节生物碱生成的转录因子来增加生物碱含量

[0065] 本发明也与通过超表达对生物碱生成有正调节作用的转录因子在植物中增加生物碱相关。NbTF1，NbTF4，NbTF5，及NbTF6基因中一个或多个，或其开放读码区可以用来增
加生物碱的生成，例如，植物或植物细胞中的烟碱类生物碱(例如，烟碱)。

[0066] B.通过超表达正调节生物碱生成的转录因子及至少一个生物碱生物合成基因来增加生物碱含量

[0067] 可以通过超表达编码生物碱生物合成途径酶的一个或多个基因来增加生物碱如烟碱的含量。例如，见Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(1)：367-72(2001)。单独超
表达PMT虽然在根部增加PMT转录文本水平4至8倍，但叶部的烟碱含量仅增加40％，这提
示生物碱合成途径其它步骤限制烟碱含量进一步增加。因此，本发明考虑超表达对生物碱
生成有正性调节作用的转录因子，以及超表达至少一个生物碱生物合成基因，如PMT基因，
这会比单独上调生物碱生物合成基因更能增多生物碱的生成。

[0068] 为了实现本发明这一目的，在植物细胞导入含有一个或多个NbTF1，NbTF4，NbTF5和NbTF6基因，或其开放读码区，以及A622，NBB1，QPT，PMT，及MPO中至少一个基因的核酸
载体。一个有说明性的核酸载体比如可以由NbTF1及PMT组成。类似地，例如，可以通过将
超表达NbTF1转基因植物与超表达PMT转基因植物进行杂交这一遗传工程方式来产生超表
达NbTF1和PMT的植物。连续杂交和选择可生成超表达NbTF1和PMT的植物。

[0069] C.通过抑制负调节生物碱生成的转录因子增加生物碱含量

[0070] 可以利用本发明中转录因子基因序列，以若干已知方式通过抑制编码负性调节生物碱生成的转录因子基因来增加生物碱(例如，烟碱)的生成。因此，本发明提供方法和载
体，通过抑制编码负调节生物碱生成的转录因子基因来增加植物中生物碱的含量，这些转
录因子包括，例如，NbTF3或NbTF7。抑制一个以上的编码负调节生物碱生成的转录因子的
基因可以进一步增加植物中生物碱的水平。

[0071] D.通过抑制负调节生物碱生成的转录因子以及超表达至少一个生物碱生物合成基因来增加生物碱含量

[0072] 如上在(II)(B)诉述，已知可以通过超表达生物碱生物合成基因来增加烟碱类生物碱含量。因此，本发明考虑进一步通过超表达A622，NBB1，QPT，PMT及MPO中一个或多个
以及抑制对生物碱生成有负调节作用的转录因子来增加烟碱类生物碱含量。为了实现本发
明这一目的，导入细胞或植物的核酸载体由下列之一或更多片段组成，NbTF3或NbTF7，以
及A622，NBB1，QPT，PMT，和MPO中至少一个或多个片段。一个有说明性的核酸载体可以由
NbTF3和QPT片段组成。

[0073] E.通过超表达正调节生物碱生成的转录因子以及抑制负调节生物碱生成的转录因子增加生物碱含量

[0074] 本发明进一步考虑通过超表达NbTF1，NbTF4，NbTF5，和NbTF6中一个或多个基因，以及抑制NbTF3或NbTF7中一个或多个基因来增加烟碱类生物碱含量。

[0075] III.改变次级生物碱，生物碱前驱物及其相关 化合物含量

[0076] 已知抑制生物碱生物合成基因可以增加前驱物化合物的聚集，或增加次级生物碱的相对含量。例如，抑制 烟草 中的PMT基因增加去氢新烟碱的含量(Chintapakorn和
Hamill.Plant Mol.Biol.53：87-105(2003))。抑制 莨菪叶 中参与托烷类生物碱生物合成
的细胞色素P450[利陀菪碱(littorine)歧/羟化酶]导致被阻断步骤前的代谢中间产物
利陀菪碱的聚集(Li等，Chem.Biol.13：513-20(2006))。通过超表达正调节生物碱生成的
转录因子，或抑制负调节生物碱生成的转录因子，从而上调生物碱途径，同时抑制生物碱生
物合成基因可进一步增加次级生物碱，生物碱前驱物，或相关化合物的含量。为了实现本发
明这一目的，导入植物细胞的核酸载体由下列之一或更多片段组成，NbTF1，NbTF4，NbTF5，
及NbTF6，或其开放读码区，以及A622，NBB1，QPT，PMT，和MPO中至少一个或多个片段。可
选地，导入细胞或植物的核酸载体由下列之一或更多片段组成，NbTF3或NbTF7以及A622，
NBB1，QPT，PMT，和MPO中至少一个或多个片段。一个有说明性的核酸载体可以由NbTF3片
段和PMT片段组成。

[0077] IV.利用调节生物碱生成的转录因子序列对植物及细胞进行遗传工程改变转录因子序列

[0078] 已在若干植物中发现转录因子基因，例如烟草属植物。因此，本发明包含从植物基因组中分离出的或合成的任何编码调节生物碱合成转录因子的核酸，基因，多聚核苷酸，
DNA，RNA，mRNA，或cDNA分子。该DNA或RNA可以是双链或单链。单链DNA可以是编码链，
亦称为有义链，它也可以是非编码链，亦称为反义链。

[0079] 本领域的普通技术人员明白本发明中的转录因子基因包括SEQ ID NO：1，SEQIDNO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：14及SEQID NO：15所含序列，其中包括含至少21个连续核苷酸的片段，该片段长度足以有效沉默植物中基因(Hamilton
和Baulcombe，Science 286，950-952(1999))。

[0080] 本发明同样包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：14，and SEQ ID NO：15序列中核酸分子的各种“变异序列，”包括在序列中删除，替代，插入或加入一个或多个碱基，而该“变异序列”编码具有调节生物碱合成活
性的多肽。因此，“删除，替代，插入或加入一个或多个碱基”的序列仍保持生理活性，即使被
编码的氨基酸序列有一个或多个氨基酸被删除，替代，插入或加入。此外，转录因子NbTF1，
NbTF3，NbTF4，NbTF5，NbTF6及NbTF7可以多种形式存在，这可能是由于基因产物翻译后修
饰，或转录因子基因能以多种形式存在。本发明包括含有这样修饰且能编码调节生物碱合
成的转录因子的核苷酸序列。

[0081] 例如，删除多聚腺苷酸尾链，删除5′-或3′-端，删除非翻译区和删除碱基导致删除氨基酸。只要不导致移码突变，碱基也可以被替代。也可以通过“加入”碱基从而加
入氨基酸。但任何改变不应导致调节生物碱合成的转录因子活性的丢失。在这个意义上，
可以通过改变本发明中DNA碱基序列来修饰DNA以达到在被编码的多肽的特定位点替代，
删除，插入或加入氨基酸，或通过定向突变加入氨基酸，见Zoller & Smith，Nucleic Acid
Res.10：6487-500(1982)。

[0082] 也可以用适当的碱基合成转录因子序列，例如，引用我们在这里披露的蛋白质序列来制造DNA分子，虽然不同于天然DNA序列，合成的DNA分子可以编码产生具有相同或相
似氨基酸序列的蛋白质。

[0083] 除非另外标明，这里所有核苷酸序列均用DNA自动测序仪(例如Model3730xl，Applied Biosystems，Inc.)通过对DNA分子的测序测定。因此，正如本领域所知，使用这
种自动测序方式确定的任何DNA序列可能含有差错，这里确定的任何核苷酸序列也可能含
有差错。自动测定的核苷酸序列典型地与所测序的DNA分子实际序列至少95％同序，更典
型地至少与所测序的DNA分子实际序列96％到99.9％同序。DNA分子实际序列可以通过其
它方式更为准确地确定，例如，通过本领域普通技术人说所知的人工DNA测序。也正如本领
域普通技术人说所知，与实际序列相比，在被测定的核苷酸序列单个碱基插入或删除，在翻
译该核苷酸序列时会导致移码；因此，根据被测定核苷酸序列预测的氨基酸序列，其可能与
被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列从插入或删除点起开始完全不同。

[0084] 为本发明起见，两个序列在严格条件下杂交形成双链复合物，杂交液含有6XSSC，0.5％ SDS，5X Denhardt氏溶液和100μg非特异性载体DNA。见Ausubel等上述，及部分
2.9，补充27(1994)。序列在“中杂交严格度”杂交，中杂交严格度指在温度60℃使用上述杂
交液进行杂交。在“高杂交严格度”杂交，温度升至68℃。在中杂交严格度下杂交反应后，
在室温下用2X SSC加0.05％ SDS溶液清洗核苷酸5次，而后在60℃用0.1X SSC加0.1％
SDS溶液清洗核苷酸1小时。高杂交严格度杂交反应后，清洗核苷酸在68℃条件下进行。为
本发明起见，杂交核苷酸是指用1ng，比放射性为10,000cpm/ng的放射标记探针能检测到
的杂交核苷酸，即在-70℃ X-射线胶片曝光不超过72小时杂交核苷酸清晰可见。

[0085] 本发明中的核酸序列应与序列1-2的核酸序列至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同源，最好应与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：
2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，及SEQ ID NO：15序列的核酸序列至少95％，96％，97％，
98％，99％或100％同源。两个核酸序列间的差异可以发生在参照核苷酸序列5’或3’末端
部位，或两末端间的任何部位，或单独分散在参照序列的核苷酸中，或在参照序列中分散成
一个或多个连续的组。

[0086] 从实用方面讲，任何特定的核酸分子与参照核苷酸序列是否至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源是通过使用本领域所熟知的标准算法比较两个分子而
确定，并通常可以利用公开的计算机程序如BLASTN程序来确定。见Altschul等，Nucleic
Acids Res.25：3389-402(1997)。

[0087] 本发明进一步提供含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，及SEQ ID NO：15序列中核苷酸序列的核酸分子，其编码转录因子多肽，该多肽具有相对于
SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQID NO：13，或SEQ ID NO：16序列的氨基酸
序列，并且本发明中的多肽包括氨基酸被替代，加入和删除，但转录因子多肽功能并未因此
而改变。

[0088] 抑制调节生物碱生成转录因子的方法

[0089] 在一方面，本发明提供方法和载体来抑制调节生物碱生成的转录因子，从而实现改变生物碱水平，以及生产生物碱水平改变的植物。虽然其它方法也可以用来抑制调节生
物碱生成的转录因子，本发明主要应用反义技术，有义协同抑制技术，RNA干扰(RNAi)技
术，人工微小RNA技术，病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术和定向突变技术。

[0090] RNAi技术利用RNAi质粒载体进行稳定转染(Helliwell and Waterhouse，MethodsEnzymol.392：24-35(2005))。该质粒由反向重复结构中要被沉默的靶基因片段组成。DNA
间区，通常是内含子，隔离反向重复结构。由适当启动子驱动的RNAi载体，例如，花椰菜镶
嵌(花叶)病毒(CaMV)35S启动子，其整合在植物基因组中，驱动转基因转录合成RNA分子，
后者通过碱基配对形成双链发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)。植物识别该双链RNA结
构，并将其切为小片段RNAs(长约21个核苷酸)，即小片段干扰RNAs(siRNAs)。siRNAs与
蛋白质复合物RISC相结合，RISC直接引导降解靶基因mRNA。人工微小RNA(amiRNA)技术
利用可以沉默植物和其它真核细胞内源性基因的微小RNA(miRNA)途径(Schwab et al.，
Plant Cell 18：1121-33(2006)；Alvarezet al，Plant Cell 18：1134-51(2006))。该方法
使用大约由21个核苷酸组成的沉默基因片段，将其导入先质miRNA基因以形成先质amiRNA
载体。后者通过本行业所熟知的转染方法转移至植物基因组，转录后经加工生成可以沉默
与该amiRNA序列同序的靶基因。

[0091] 两个因素影响RNAi沉默技术所用片段的长度。片段越短，基因沉默成功的可能性越小，但是发夹结构很长会增加其在细菌宿主细胞重组的机会。沉默的有效性似乎也依赖
于靶基因，这可能反映靶mRNA的可接近度，或在该基因活跃的细胞中靶mRNA和hpRNA的相
对多寡。人们通常使用长度为100到800的碱基对片段，最好是300和600碱基对之间，以
最大程度增加沉默的有效性。另外一个考虑是靶基因所在部位，在5’-非翻译区，编码区和
3’-非翻译区沉默基因均取得良好效果。由于沉默的机制取决于序列同源性，有可能交叉沉
默相关mRNA序列。如果不想这样，应选择与其它序列同源性低的区域，例如，5’-或3’-非
翻译区。避免交叉沉默同源性序列的一条规则是在核酸载体和非靶基因序列间的同源性少
于20个碱基。这些原则大部分也适用于设计amiRNAs时靶区域的挑选。病毒诱导的基因
沉默(VIGS)技术利用植物天然抗病毒机制，其类似于RNAi技术。VIGS重组病毒含有宿主
DNA片段，感染植物后导致靶基因转录后基因沉默。在一个含义上，可以使用基于烟草脆裂
病毒(TRV)的VIGS系统。有关该系统的描述参见如下文献，Baulcombe D.C.，Curr.Opin.
PlantBiol.2：109-113(1999)；Lu R，et al.，Methods 30：296-303(2003)；Ratcliff F.et
al.，The Plant Journal 25：237-245(2001)；及美国专利7,229,829。

[0092] 反义技术将能与靶基因mRNA结合的反义寡核苷酸导入植物。该“反义”寡核苷酸的碱基序列与靶基因mRNA的序列，即″有义″序列，互补。反义mRNA片段阻止有义mRNA
片段的活性，从而有效地灭活该基因的表达。有关应用反义技术沉默植物基因更详尽的描
述参见Stam et al.，Plant J.21：27-42(2000)。

[0093] 有义协同抑制技术将高度表达的有义转基因导入植物，造成该转基因及内源性基因表达的下降(Depicker and van Montagu，Curr Opin Cell Biol 9：373-82(1997))。其
效果取决于转基因与内源性基因之间的序列同源性。

[0094] 可以利用诸如TILLING及快速中子撞击“删除基因”等定向突变技术敲除植物基因(Henikoff，et al.，Plant Physiol 135：630-6(2004)；Li et al.Plant J.27：
235-242(2001))。TILLING使用诱变剂处理种子或个别细胞以引发点突变，检测单个核苷酸
突变的敏感方法可以发现靶基因中的点突变。可以用诸如PCR方法检测所需突变(例如，
导致靶基因产物灭活的突变)。例如，根据靶基因设计的寡核苷酸引物可以通过PCR在诱变
植物群体放大靶基因区域。经放大的诱变基因与野生基因退火，从而可以发现诱变基因与
野生基因间的错配。检测到的基因序列差异可以溯源于含有诱变基因的植物，从而显露哪
些突变植物会有所需的表达(例如，靶基因的沉默)。这些植物可以通过选择育种来产生具
备所需表达的植物群体。TILLING可以提供包括错义和敲除突变等使靶基因表达下降的等
位基因系列，它被视为是一种不需要导入转基因就可能敲除基因的方法，更可能被消费者
所接受。快速中子撞击在植物基因组引发突变，即基因删除，这可以通过与TILLING相似的
方式用PCR检测到。

[0095] 核酸载体

[0096] 根据本发明，在某一方面，抑制调节生物碱合成转录因子的序列被加入适合导入植物或细胞内的核酸载体。因此，该类核酸载体可以用于在植物或细胞中抑制NbTF1，NbTF3
NbTF4，NbTF5，NbTF6及NbTF7中至少之一，及选择性地抑制至少下列其中之一，A622，NBB1，
PMT，QPT，及MPO。

[0097] 在本发明的另一方面，增加调节生物碱生物合成转录因子活性的序列被加入适合导入植物或细胞内的核酸载体。因此，该类核酸载体可以用于在植物或细胞中超表达
NbTF1，NbTF3，NbTF4，NbTF5，NbTF6及NbTF7，及选择性地超表达至少下列其中之一，A622，
NBB1，PMT，QPT，及MPO。

[0098] 可以利用标准技术构建重组核酸载体。例如，可以用限制性内切酶切割载体中含有供转录用DNA序列的相关片段。供转录用DNA序列也可以通过退火和连接人工寡核苷酸，
或经聚合酶链反应(PCR)利用人工寡核苷酸在DNA末端生成适当的内切酶切割位点。然后，
将该DNA序列克隆入含有适当调控元素例如上游启动子和下游终止子的载体。

[0099] 本发明的一个重要方面是利用核酸载体将生物碱合成酶编码序列与一个或多个调控序列操纵联结，在不影响正常发育或生理的情况下，这些调控序列驱动生物碱合成酶
编码序列在某些细胞类型，器官或组织的表达。

[0100] 组成型启动子有助于导入细胞中的核酸序列的表达，以减少或增加调节生物碱生物合成转录因子的表达，例如，香石竹(康乃馨)蚀环病毒(CERV)启动子，花椰菜镶嵌(花
叶)病毒(CaMV)35S启动子，或更特别的双重增强的CaMV启动子，其由两个CaMV 35S启动
子串联排列组成(称为″双35S″启动子)。组织特异的，组织优先的，细胞类型特异的和
可诱导启动子可能适用于某些情况。例如，在不影响在其它组织表达的情况下，组织特异的
启动子允许上述蛋白质在某些组织中超表达。

[0101] 组织优先的启动子包括在根部组织活跃的启动子，例如，烟草RB7启动子(Hsuetal.Pestic.Sci.44：9-19(1995)；美国专利号5,459,252)，玉米CRWAQ81启动子(美国
公开专利申请20050097633)；拟南芥ARSK1启动子(Hwang andGoodman，Plant J 8：
37-43(1995))，玉米MR7启动子(美国专利号5,837,848)，玉米ZRP2启动子(美国专利
号5,633,363)，玉米MTL启动子(美国专利号5,466,785和6,018,099)，玉米MRS1，MRS2，
MRS3，和MRS4启动子(美国专利申请20050010974)，拟南芥隐蔽性启动子(美国专利申请
20030106105)和在导致烟碱生物合成酶表达升高的条件下激活的启动子，例如，烟草RD2
启动子(美国专利号5,837,876)，PMT启动子(Shoji T.et al.，Plant Cell Physiol.41：
831-39(2000b)，WO 2002/038588)；或A622启动子(Shoji T.et al.，Plant MolBiol.50：
427-40(2002))。

[0102] 本发明中的载体也可以含有终止序列，其位于本发明涵盖的核酸分子的下游，终止mRNA转录，导致聚腺苷酸序列的加入。此类终止子的例子包括 根癌农杆菌 胭脂碱合酶
终止子(Tnos)，根癌农杆菌 甘露碱合酶终止子(Tmas)和CaMV 35S终止子(T35S)。根据
本发明，尤为优先使用的终止区域包括豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基终止区(TrbcS)或
Tnos终止区。表达载体也可以含有增强子，起始密码子，剪接信号序列及靶序列。

[0103] 本发明中的载体也可以含有选择标记，以便于识别培养细胞中被转化细胞。该选择标记可以和外源核酸分子结合，即该基因与启动子操纵联结。正如在此所使用的，“标记”
指基因编码的某一特征或表型，其允许选择或筛选含有该标记的植物或细胞。例如，植物中
编码对抗菌素或除草剂有抗性的标记基因，其允许选择被转化细胞。

[0104] 合适的选择性标记包括腺苷脱氨酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素磷酸转移酶，胸苷激酶，黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，草甘膦和草铵膦抗性及氨基糖苷3’-O-磷酸转移酶
(卡那霉素，新霉素和G418抗性)。这些标记可以包括对G418，潮霉素，博来霉素，卡那霉素
和庆大霉素抗性。核酸载体也可以含有选择性标记基因Bar，其提供对除草剂草丁膦类似物
如草铵膦的抗性。Thompson et al.，EMBO J.9：2519-23(1987)。亦有其它合适的选择性标
记。

[0105] 也可以使用可视标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。亦有描述根据控制细胞分裂来确定或选择转化植物的方法。见WO 2000/052168和WO 2001/059086。

[0106] 也可以包括源于细菌或病毒的复制序列，以便在细菌或噬菌体宿主克隆载体。最好使用宿主范围广来自原核细胞的复制起点。可以在细菌中放入合适的选择性标记，以选
择含有所需核酸载体的细菌细胞。合适的原核细胞选择性标记也包括抗菌素如卡那霉素或
四环素抗性。

[0107] 正如本行业所知，载体也可含有编码其它功能的核酸序列。例如，根癌农杆菌 为宿主时，可以加入T-DNA序列以易化随后向植物染色体的转移和整合。

[0108] 该类基因载体活性的筛选可以通过 根癌农杆菌 转染宿主植物及筛选改变的生物碱水平。

[0109] 可以适当地从GenbankTM核苷酸数据库获取基因核苷酸序列，并寻找核酸内切酶不能切割的位点。可以通过常规方法给这些基因加入上述位点，如用PCR引物或通过亚克
隆加入上述位点。

[0110] 最好，核酸建构物包含在载体内，最为合适的是，其包含在能在合适宿主(植物)细胞内表达的载体内。任一能够产生含有导入DNA序列植物的载体均可达到这一目的。

[0111] 这些合适的载体为本行业人员所熟知，并在普通技术参考书中有描述，如Pouwelset al.，Cloning Vectors.A Laboratory Manual，Elsevier，Amsterdam(1986)。尤为合适
的载体包括Ti质粒载体。

[0112] 宿主植物及细胞

[0113] 本发明包括通过导入编码生物碱合成酶的多聚核苷酸序列来遗传操纵植物或细胞，以达到调控生物碱合成的目的。因此，本发明提供在植物中减少或增加生物碱合成的方
法和核酸载体。此外，本发明提供在宿主细胞如细菌，酵母，丝状真菌，藻类，绿色植物及哺
乳动物细胞生产生物碱及其关联化合物的方法。

[0114] A.植物

[0115] 可以在本发明中应用的植物种类通常与可以接受遗传工程技术改变的高等植物的范围一样广，包括单子叶植物和双子叶植物以及裸子植物。生产烟碱较好的植物包括 茄
科 中的 烟草属，澳茄属，茄属，花烛属，和 蛾蝶花属 或 菊科 中的鳢肠属 和百日菊属。

[0116] 正如本行业所知，有若干种方式可以将基因和基因载体导入植物，植物转染和组织培养技术的结合已成功地成为创造转基因植物有效策略不可缺少的一部分。本发明中可
使用的这些方法已在它处描述(Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42：
205-225(1991)；Vasil，Plant Mol.Biol.5：925-937(1994)；Walden and Wingender，
Trends Biotechnol.13：324-331(1995)；Songstad et al.，PlantCell，Tissue and Organ
Culture 40：1-15(1995))，并为本行业人员所熟知。例如，本行业技术人员知道，通过真
空浸渗(Bechtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，316：1194-1199(1993))或
有伤接种(Katavic et al.，Mol.Gen.Genet.245：363-370(1994))根癌农杆菌 能够介
导 拟南芥 的转染；此外，利用 根癌农杆菌Ti-质粒同样可以介导其它植物或作物的转
染(例如，下胚轴(DeBlocket al.，Plant Physiol.91：694-701(1989))或子叶柄伤口感
染(Moloney et al.，PlantCell Rep.8：238-242(1989))，亦可以利用颗粒撞击/生物弹
道法(Sanford et al.，J.Part.Sci.Technol.5：27-37(1987)；Nehra.et al.，Plant J.5：
285-297(1994)；Becker etal.，Plant J.5：299-307(1994))或聚乙烯乙二醇辅助的原生
质体转染方法(Rhodeset al.，Science 240：204-207(1988)；Shimamoto et al.，Nature
335：274-276(1989))。发根农杆菌 可以用于生产转基因植物发根培养物，包括烟草，正如
所描述的那样，例如，Guillon et al.，Curr.Opin.Plant Biol.9：341-6(2006)。“烟草发
根”指烟草根部含有来自 发根农杆菌Ri质粒并整合到基因组的T-DNA，其在不补充茁长素
和其它植物激素情况下能培养生长。烟草发根和完整烟草植物根部一样能够生产烟碱。

[0117] 此外，可以用 根瘤菌属，中华根瘤菌属，或中慢生根瘤菌 属转染植物(Broothaerts et al.，Nature 433：629-633(2005))。

[0118] 通过本发明实现的生物碱成分改良可以和其它令人感兴趣的性状相结合，如疾病抗性，害虫抗性，高产量，或其它性状。例如，遗传工程生成的稳定转染植物，其含有适当的
转基因可以改良生物碱成分，我们可以将这一性状渗入到一个商业上可以接受的遗传背景
中，从而获得既含有改良生物碱成分又具有所需遗传背景的品种。例如，遗传工程生成的烟
碱含量减少的烟草植物，其基因可以渗入到具有抗病性如TMV，烟草黑胫病菌，或青霉抗性
的烟草品种中。此外，可以将能够赋予其它所需性状的核酸建构物转染至本发明中含有改
良生物碱成分植物的细胞中。

[0119] B.细胞

[0120] 本发明考虑用编码调节生物碱合成的转录因子的核酸序列来经由遗传工程生成细胞。例举的细胞包括，但不局限于，例如，烟草，颠茄，莨菪叶细胞。

[0121] 此外，可以给表达生物碱合成酶基因的细胞提供前驱物质以增加烟碱合成底物的可利用度。也可以给细胞提供前驱物质类似物，后者可以参合到天然烟碱类生物碱的类似
物中。

[0122] 根据本发明，可以利用适当的技术将核酸载体导入任何植物细胞，这些技术包括根癌农杆菌 介导的植物细胞转染，颗粒撞击，电穿孔和聚乙烯乙二醇融合，或阳离子脂质
介导的转染。

[0123] 在不使用选择性或可视标记的情况下，可以使用本发明中的核酸载体对该类细胞施行遗传工程，所生成的转基因生物可以通过检测导入的核酸载体来识别。例如，可以测量
一个特定细胞中的蛋白，多肽或核酸来确定一个细胞是否被成功转染。正如在本行业常规
进行的，例如，可以通过PCR或其它适当方法检测特定核酸序列或多肽序列以确定导入的
核酸建构物的存在。此外，可以通过与在相似条件下生长的非转化细胞对比来识别生长率
的差异或形态学特征上的差异，以确定经遗传工程改良的细胞。见WO 2004/076625。

[0124] IV.定量生物碱含量

[0125] A.生物碱含量下降

[0126] 在本发明的一个方面，遗传工程生成的植物和细胞以生物碱含量下降为特征。有若干方法可以定量检测生物碱水平的减少，例如根据气液色谱法，高效液相色谱法，放射免
疫法及酶联免疫法定量测量生物碱水平。本发明使用Waters公司的2695型分离模块进行
高效液相色谱分析测量生物碱水平，该分离模块在色谱柱温度60℃条件下装备有Waters
X-Terra RP185μm 4.6×150mm预柱。等度洗脱系统由80％ A：20％B组成，溶剂A成份
为50mM柠檬酸，10mM辛基磺酸(pH 3.0)(pH由三乙胺调节)及5％ MeOH；溶剂B成份为甲
醇；流速为1ml/分钟，共15分钟。注射容积为20μl。用光电二极管阵列检测法在261nm
检测烟碱。

[0127] 在描述本发明中植物时，“生物碱含量减少的植物”或“生物碱含量下降的植物”一语包括生物碱含量是对照植物的50％以下，最好是对照植物的10％，5％或1％以下的植
物。

[0128] B.生物碱含量增加

[0129] 在本发明的一个方面，遗传工程生成的植物和细胞以生物碱含量增加为特征。类似地，遗传工程生成的细胞以生物碱含量增加为特征。

[0130] 在描述本发明中植物时，“生物碱含量增加的植物”一语包括生物碱含量是对照植物的10％以上，最好是同种或同品种对照植物的50％，100％或200％以上的植物。

[0131] 遗传工程生成的细胞以烟碱类生物碱合成增加为特征。例如，遗传工程发明的细胞比对照细胞能生产更多的烟碱。

[0132] 有若干方法可以定量检测生物碱水平的增加，例如根据气液色谱法，高效液相色谱法，放射免疫法及酶联免疫法定量测量生物碱水平。本发明使用装备有上述逆相色谱柱
和光电二极管阵列检测仪的高效液相色谱法检测生物碱水平。

[0133] 产物

[0134] 编码调节生物碱合成的转录因子多聚核苷酸序列可以用来生成生物碱含量改变的植物。这些植物会具有有益的特征，例如，在生物碱含量增加的植物增强对害虫的抵抗
力。或在生物碱含量减少的植物毒性降低及适口性增加。

[0135] 本发明中的植物有助于从这些植物中生产产品。例如，生物碱含量减少的烟草植物有助于生产用于戒烟的低烟碱香烟。生物碱含量增加的烟草植物有助于生产改良的烟草
产品。

[0136] 此外，本发明中的植物及细胞有助于生成生物碱或生物碱类似物包括烟碱类似物，它们可以用作治疗剂，杀虫剂或合成的中间产物。为此目的，可以用若干方法大规模或
以商业化数量生产生物碱及相关化合物，包括从基因工程生成的植物，细胞或培养系统提
取化合物，这包括，但不局限于，发根培养物，悬浮培养物，愈伤组织物及芽培养物。

[0137] ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

[0138] ＊＊＊＊

[0139] 下列例子利用功能基因组学阐释六个基因，NbTF1，NbTF2，NbTF4，NbTF5，NbTF6及NbTF7，这些基因在 本塞姆氏烟草 编码调节生物碱聚集的转录因子。在 本塞姆氏烟草 利
用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默上述6个基因的任何一个，都会导致生物碱水平的
改变。在4种情况下，生物碱水平下降，在2种情况下，生物碱水平增加。我们已获得NbTF1，
NbTF2，NbTF4，NbTF5，NbTF6及NbTF7 cDNA克隆。亦制备了超表达转录因子的载体并将其
导入植物细胞。我们的试验数据表明转录因子核酸序列有助于生成生物碱水平改变的植物
及植物细胞，尤其是烟碱类生物碱水平改变的植物和植物细胞。

[0140] 下述这些例子只是说明而已，不应解读为限制本发明。

[0141] 例1.从 本塞姆氏烟草 根部建立消减cDNA文库，EST序列测定和转录因子基因的选择。

[0142] 烟碱生物合成发生在烟草属植物根部(Dawson，Science 94：396-397(1941))，昆虫伤害，创伤和施用茉莉可诱导烟碱生物合成(Winz及Baldwin，Plant Physiol.125：
2189-2202(2001))。为了识别编码控制烟碱生物合成的转录因子的基因，采用MeJa诱导的
本塞姆氏烟草 根部ESTs序列测定与利用VIGS功能分析相结合的方法(Liu及Page，Plant
Methods 4：5(2008))。

[0143] 本塞姆氏烟草的无基质栽培

[0144] 本塞姆氏烟草(茄科)秧苗在无基质栽培条件下生长，营养液为0.25x Hoagland氏溶液，其配有螯合铁溶剂，并用起泡器加入氧气。在3周大的植物根部加入11μM MeJa，
分别在处理前(t＝0)和处理后1，4，和7小时取样分析。利用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen)
分离全部RNA，即从未处理的叶和根部，各450mg，分离RNA，再从MeJa处理1，4，和7小时的
根部，各150mg，分别分离RNA，并将其合并。我们构建了三个不同的消减cDNA文库：NBREL2，
用合并的MeJa处理的根部mRNA做检测子和未处理的根部mRNA做驱赶子；NBLEL3，用合并
的MeJa处理的根部mRNA做检测子和未处理的叶部mRNA做驱赶子；及NBREL4，用合并的
MeJa处理的根部mRNA做检测子和驱赶子。

[0145] I.A.1.1消减VIGS-cDNA文库的建立

[0146] 利用PCR选择消减cDNA文库试剂盒(Clontech)进行cDNA合成，并作出部分改良。简单地，约250μg全体RNA与300μl Oligo(dT)25 Dynabeads(Dynal Biotech)在结
合液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1M LiCl，2mM EDTA)中混合。孵育10分钟后，用洗液B(10mM
Tris-HCl pH 7.5，0.15M LiCl，1mMEDTA)洗涤微球3次，再用一链缓冲液洗2次。洗涤后含
有mRNA的微球悬浮于40μl cDNA合成液(8μl 5X一链缓冲液，4μl 10mM dNTPs，24μl
不含RNA酶的水和4μl(8U)AMV反转录酶)，并在42℃孵育1.5小时。加入120μl二链合
成液(32μl 5X次链缓冲液，3.2μl 10mM dNTPs，8μl20X混合酶和77μl不含RNA酶的
水)进行二链合成，并在16℃孵育2小时，而后加入4μl(12U)T4 DNA聚合酶，孵育30分
钟。加入20μl 0.5MEDTA终止反应。磁性分离微球，除去上清液，将微球悬浮于500μl洗
液(5mM Tris-HCl pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，1％SDS和10μg/ml糖原)，在75℃加热
15分钟。用洗液(5mM Tris-HCl pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl和200μg/ml BSA)洗涤微
球3次，再用RsaI液洗涤2次。将微球悬浮于84μl H2O，10μl 10x RsaI液，3μl(30U)
RsaI，在37℃过夜孵育。通过磁性分离微球来分离未结合的cDNA，并根据厂家的说明，将
cDNA用于适配器连接，杂交和初次PCR。第2次PCR使用的引物为5’-CGGGATCCTCGAGCGGC
CGCCCGGGCAGGT-3’(BamH1位点底部划有横线)和5’-CGGAATTCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’(
EcoR1位点底部划有横线)。用EcoRI和BamHI消化PCR选择放大的cDNA片段(700ng)和
TRV-RNA2载体pYL156，将消化产物连接(Liu Y，et al.，Plant J.30：415-429，2002)。将
联结产物经电穿孔导入DH10B大肠杆菌以生成初级文库。将其在琼脂平板放大，分离质粒
DNA，经电穿孔将质粒DNA导入C58根癌农杆菌。连接效率经菌落PCR确定为98％。

[0147] I.A.1.2消减VIGS-cDNA文库EST测序和确定转录因子候选基因

[0148] 用 如 下 载 体 引 物 5’-GTTACTCAAGGAAGCACGATGAG-3’ 和5’-CAGTCGAGAATGTCAATCTCGTAG-3’进行PCR来放大cDNA以用于序列测定，并随机选择
根癌农杆菌 菌落作为模版。生成的PCR产物用BigDyeTerminators测序试剂盒和引物
5’-GTTACTCAAGGAAGCACGATGAG-3’直接进行测序。分别从NBREL2，NBLEL3和NBREL4测定了
2016，1920和1920个ESTs序列。去除质量不良的序列后，把3个数据集合并后共获得3480
个特异转录体，包括606邻接片段和2874单例片段。全部VIGS-EST数据集通过经BLASTX
与NCBI非冗赘数据库比较来注解。

[0149] 利用主题词查找BLASTX结果及对转录因子进行blast分析，我们确定108个独特的编码转录因子的转录文本。这包括24个邻接片段和84个单例片段。

[0150] 例2.利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术筛选转录因子对叶部烟碱聚集的影响

[0151] 我们利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术(Baulcombe，Curr.Opin.PlantBiol.2：109-113(1999)；Lu等，Methods 30：296-303(2003))来检测沉默候选转录因子基
因对烟碱生物合成的影响。

[0152] I.A.1.3 VIGS沉默转录 因子

[0153] 测试代表不同转录因子的VIGS载体在叶部应用MeJa前后改变叶部烟碱水平的能力。本塞姆氏烟草 植物在可控环境箱生长，白天23℃，16小时；黑夜，20℃，8小时；光强度
2
约为100μmol/m/s。含有TRV-RNA1质粒或TRV-RNA2建构物(pYL156)(Liu et al，2002)的
C58根癌农杆菌培养物在28℃过夜生长。离心后，将细菌悬浮于含有1mM MES(pH 5)，10mM
MgCl2和100μM乙酰丁香酮的渗透液，OD600＝1，在渗透前置于室温3-6小时。TRV-RNA1和
TRV-RNA2载体悬液1∶1混合，并用1ml注射器将其渗透至年龄为3-4周植物上方叶子的
底部。用缓冲液或含无功能的绿色荧光蛋白(GFP)TRV-RNA2建构物渗透阴性对照植物。在
本塞姆氏烟草 感染及生长3周后在应用0.1％ Meja(混于0.1％Tween-20溶液并在叶部
表面涂抹)前及5天后用离子对-HPLC法测定叶子中烟碱含量。用已知的编码烟碱合成酶
(N-甲基腐胺氧化酶，PMT)的基因作为VIGS沉默烟碱生物合成的阳性对照。

[0154] I.A.1.4离子对HPLC法分析烟碱

[0155] 从各植物切割年幼(～3-5cm)叶子的一半作为样品。测定样品鲜重后，加入200μl锆微球和300μl 50mM柠檬酸缓冲液(pH 3)∶甲醇(70∶30)。用Beadbeater使样
品均质，超声水浴10分钟。所产生的提取液在4℃过夜孵育，离心和过滤(0.45μm，Spin-X)
以澄清提取液。使用Waters公司的2695型分离模块进行离子对-HPLC，该分离模块在色
谱柱温度60℃条件下装备有Waters X-Terra RP185μm 4.6×150mm预柱。等度洗脱系统
由80％ A∶20％B组成，溶剂A成份为50mM柠檬酸，10mM辛基磺酸pH 3.0(pH由三乙胺
调节)及5％MeOH，溶剂B成份为甲醇，流速为1ml/分钟，共15分钟。注射容积为20μl。
用光电二极管阵列检测法在261nm检测烟碱。标准曲线(r20.999)通过注入1040μg/ml
到10.4μg/ml烟碱获得，通过与该标准曲线比较，利用峰区面积进行烟碱定量。

[0156] 在所测试的108个转录因子中，VIGS沉默4个基因导致烟碱水平下降(NbTF1，NbTF4，NbTF5，NbTF6)，VIGS沉默2个基因增加烟碱水平(NbTF7)或在应用MeJa后烟碱水
平增加(NbTF3)(图1)。缓冲液及TRV-GFP对照植物烟碱 水平类似，表明TRV感染对烟碱
生物合成没有多少影响。正如所预料的，沉默烟碱途径的一个主要酶甲基腐胺氧化酶显著
减少叶部 烟碱水平。

[0157] 例2.克隆影响叶部烟碱聚集转录因子的全长cDNA

[0158] I.A.1.5 利用末端快速放大(RACE)PCR获取全长cDNA

[0159] I.A.1.6 NbTF1

[0160] I.A.1.7 利用5’及3’RACE PCR获取NbTF1全长cDNA序列。全长NbTF1转录文本长度为2313碱基对，开放编码区(ORF)长度为2040碱基对。序列1给出 本塞姆氏烟草
NbTF1基因序列。序列2给出NbTF1开放编码区(ORF)的序列。序列3给出 本塞姆氏烟草
NbTF1预测的氨基酸序列。

[0161] I.A.1.8 NbTF3

[0162] I.A.1.9 EST测序确定的NbTF3序列为295碱基对的单例片段，通过染色体步移技术(Genome Walker试剂盒，Clontech)产生626碱基对片段。尽管使用了5’及3’RACE
PCR及进一步使用染色体步移，我们没有得到更多的NbTF3序列信息。序列4给出 本塞姆
氏烟草NbTF3基因部分序列。

[0163] I.A.1.10 NbTF4

[0164] I.A.1.11 使用染色体步移技术获得NbTF4全长cDNA序列。NbTF4的开放读码区(ORF)长度为759碱基对。序列5给出NbTF4基因序列。序列6给出NBTF4 ORF序列。序
列7给出推测的 本塞姆氏烟草NbTF4氨基酸序列。

[0165] I.A.1.12 NbTF5

[0166] I.A.1.13 通过Blast搜寻常规 本塞姆氏烟草 根部cDNA库获得NbTF5全长cDNA克隆。全长NbTF5基因长度为2401碱基对，编码1971碱基对长的开放读码区(ORF)。序列
8给出 本塞姆氏烟草 NbTF5基因序列。序列9给出NbTF5 ORF序列。序列10给出推测的
本塞姆氏烟草NbTF5氨基酸序列。

[0167] I.A.1.14 NbTF6

[0168] I.A.1.15 利用5’及3’RACE PCR获取NbTF6全长cDNA序列。全长NbTF6基因长度为958个碱基对，开放读码区(ORF)长度为669个碱基对。序列11给出 本塞姆氏烟草
NbTF6基因序列。序列12给出NbTF6开放编码区(ORF)的序列。序列13给出预测的 本塞
姆氏烟草 NbTF1氨基酸序列。

[0169] I.A.1.16 NbTF7

[0170] I.A.1.17 利用5’及3’RACE PCR及染色体步移技术获得NbTF7全长序列。NbTF7基因全长299个碱基对，编码一个2667个碱基对大小的开放读码区。序列14给出 本塞姆
氏烟草 NbTF7基因序列。序列15给出NbTF7 ORF序列。序列16给出推测的 本塞姆氏烟
草NbTF7氨基酸序列。

[0171] 六个转录因子代表不同类型的转录因子。这些分类及其结合的相关顺式DNA序列在表1列出。

[0172] 表1 本塞姆氏烟草转录因子分类

[0173]名称 转录因子类型 相关顺式序列
NbTF1 Myc，碱性螺旋-环-螺旋蛋白 G-box CACGTG
(bHLH)
NbTF3 Myc，碱性螺旋-环-螺旋蛋白 G-box CACGTG
(bHLH)
NbTF4 同源域亮氨酸拉链
NbTF5 Myc，碱性螺旋-环-螺旋蛋白 G-box CACGTG
(bHLH)
NbTF6 AP2，乙烯反应因子 GCC-box AGCCGCC
NbTF7 B3功能区，茁长素反应因子 CACCTG

[0174] 例3.在转基因植物改良生物碱生物合成

[0175] 我们对 本塞姆氏烟草 进行稳定转染，利用有义超表达载体及RNA干扰(RNAi)载体导入6个转录因子基因(NbTF1，NbTF4，NbTF5，NbTF6，NbTF7)。利用PCR放大开放读
码区(用于超表达)及cDNA片段(用于RNAi)，将生成的PCR产物克隆至pCR8/GW/TOPO
或pENTR-D/TOPO载体(Invitrogen)以生成Gateway入门载体。利用LR克隆酶将超表
达载体与 植物转染载体pK7WG2进行重组。类似地，RNAi载体与 RNAi
载体pK7GW1WG2(I)重组。所有克隆步骤在大肠杆菌中进行，最后将序列已经证实的载体
转染至 根癌农杆菌(C58)。用改良自Draper等的叶碟法转染植物，(见Plant Genetic
Transformation and Gene Expression：A Laboratory Manual，pp.97-144.Draper，J.，
Scott，R.，等(编辑)，Blackwell Scientific Publications(1988))。简单地，从成熟 本
塞姆氏烟草 切除叶碟，表面消毒后与含有感兴趣载体的 发根农杆菌 共同孵育，将其放在
琼脂平板2至4天。将叶碟转移至含有300μg/ml特美汀和100μgml卡纳霉素的芽再生
琼脂培养液。4至6周后，切除在愈伤组织形成的植物芽并转移至MS+特美汀+卡纳霉素琼
脂平板。在芽发育后，将植物苗转移至适合T0植物生长的土壤。

[0176] 从每一T0植物分离基因组DNA，利用PCR确定转基因的存在与否，设计与转染载体及转录因子载体退火的引物。通过PCR证实T0植物含有转基因，并利用离子对HPLC分
析确定叶部烟碱水平。在含有3个叶碟(～50mg FW)的样品测定烟碱含量并转换成鲜重。
不同批的野生型植物由于生长条件的差异会有所差别。

[0177] 与有义超表达及野生植物相比，通过RNAi载体沉默NbTF1会在若干转基因株系的叶部导致烟碱水平下降(图2)。在NbTF1超表达株系6有义超表达NbTF1会增加叶部的烟
碱水平。

[0178] 与野生植物相比，超表达NbTF4可以增加叶部烟碱含量，而在另一方面，使用RNAi沉默NbTF4会减少烟碱的水平(图3)。

[0179] 超表达NbTF5可以大量增加叶部烟碱含量，而在另一方面，使用RNAi沉默该基因几乎会完全阻止烟碱的聚集(图4)。

[0180] 植物转染含有NbTF3，NbTF6或NbTF7重复结构的质粒pK7GW1WG2(I)会产生与用VIGS沉默同样这些基因相类似的表现型植物。这表明VIGS在合成烟碱的细胞沉默基因表
达更为有效。