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一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法及其在重组烟叶中的应用
申请号	CN201611086848.6	申请日	2016-12-01	公开(公告)号	CN106520377A	公开(公告)日	2017-03-22
申请人	湖北中烟工业有限责任公司;			发明人	魏敏; 陈义坤; 罗诚浩; 李冉; 宋旭艳;
摘要	本发明公开了一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法及其在重组烟叶中的应用。该方法将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1～3混合，得到混合菌液；再将混合菌液按体积比0.5～2％接种到上述混合提取液中，发酵得到发酵液；过滤后减压浓缩至相对密度为1.0522～1.0833的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物。本发明以以烟叶提取液、灰树花提取液和荔枝核提取液组成的混合提取液作为碳源、氮源、以及底物，为卷烟本源物质，容易让微生物酶体系利用来发酵产烟香，本发明方法工艺过程简单，原料为卷烟产品本源烟叶，有工业化使用前景。
权利要求	1.一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，它包括以下步骤： 1)将烟叶粉碎至60～80目，再将烟末和水按质量比1∶30～50回流提取1～3h后过滤，重复1～3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； 2)按重量份数比称取40～80份的烟叶提取液、20～40份的灰树花提取液和5～20份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； 3)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4CCTCC NO: M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在25～38℃，静置培养24～72h后得到活化菌种，置于冰箱中； 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在25～38℃条件下，100～150r/min振荡培养24h～72h，连续转接1～3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液； 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4- 1CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72h； 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在25～35℃条件下，100～150rpm振荡培养24h～72h，连续转接1～4次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液； 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1～3混合，得到混合菌液； 8)发酵：将混合菌液按体积比0.5～2％接种到上述混合提取液中，接种后的混合提取液的装罐量为25～45％，pH5～8，温度30～40℃，转速100～200r/min，不避光条件下发酵3～7天，得到发酵液； 9)将发酵液和体积份数为80～90％乙醇按体积比1∶2～6，沉淀过夜，4000～10000r/min离心10～30min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0522～1.0833的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物。 2.根据权利要求1所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤 2)中，混合提取液由50～70份的烟叶提取液、25～35份的灰树花提取液和8～18份的荔枝核提取液组成，混合均匀，得到混合提取液。 3.根据权利要求2所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述混合提取液由60份的烟叶提取液、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液组成。 4.根据权利要求2或3所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。 5.根据权利要求2或3所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠： 5g/L。 6.根据权利要求2或3所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。 7.根据权利要求2或3所述降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。 8.一种根据权利要求1所得降低刺激的发酵烟叶提取物浸膏的应用，其特征在于：所述降低刺激的发酵烟叶提取物浸膏加入重组烟叶中，加入重组烟叶中烟用发酵烟叶提取物的质量比为0.08～0.12％。
说明书全文	一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法及其在重组烟叶中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及重组烟叶添加剂技术领域，具体是指一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法及其在重组烟叶中的应用。背景技术 [0002] 重组烟叶又称再造烟叶或均质烟叶，主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。国内现有的造纸法薄片生产工艺将烟叶和烟梗中的水溶性物质用水萃取，经固液分离后，固体部分经制浆后再制成纸基，而液体部分则浓缩后回涂到纸基上。这种生产工艺在很大程度上只是一个原材料的物理重组过程。就其化学组成而言，用该方法所得到的重组烟叶与作为原料的烟叶、烟梗差别不大。这样导致重组烟叶存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，影响了重组烟叶在卷烟产品中的使用效果和添加量。国内通常的做法是采用加料的办法来改善部分不足之处，其中也采用烟草类提取物作为添加剂对重组烟叶进行加香加料，但是这种传统的化学方法对重组烟叶质量的改善程度非常有限，难以解决重组烟叶质量的一些深层次的问题。针对这一现象，改善重组烟叶的质量和使用价值已经成为这一领域的重大课题之一。 [0003] 烟用较多的烟草类提取物一般采用传统方法制得，即采用单体烟叶或复配的叶组为原料通过水、醇提取或分子蒸馏得到，这样提取的烟草类提取物香气特征较弱，添加后对卷烟的改善有一定局限。采用微生物菌株发酵烟草提取物生产重组烟叶用天然生物香料，还未见报道。 [0004] 微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以烟叶为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分，对重组烟叶的烟香进行特征强化、改善口感。采用微生物发酵技术生产烟用香料，天然绿色环保无害，工艺过程简单易操作，不产生有毒副产品、无污染等。现有技术中，利用植生拉乌尔菌对刺激的烟叶提取物进行生物转化生产烟用香料的方法未见报道。发明内容 [0005] 本发明针对目前重组烟叶存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，提供了一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法及其在重组烟叶中的应用。本发明制成的由植生拉乌尔菌和食甲醇芽孢杆菌共同作用生物转化生成降低烟气刺激的发酵烟叶提取物，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷，能与其它烟用香精香料混合调配使用。 [0006] 本发明提供一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，它包括以下步骤： [0007] 1)将烟叶粉碎至60～80目，再将烟末和水按质量比1∶30～50回流提取1～3h后过滤，重复1～3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； [0008] 2)按重量份数比称取40～80份的烟叶提取液、20～40份的灰树花提取液和5～20份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； [0009] 3)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在25～38℃，静置培养24～72h后得到活化菌种，置于冰箱中； [0010] 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在25～38℃条件下，100～150r/min振荡培养24h～72h，连续转接1～3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液； [0011] 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72h； [0012] 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在25～35℃条件下，100～150rpm振荡培养24h～72h，连续转接1～4次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液； [0013] 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1～3混合，得到混合菌液； [0014] 8)发酵：将混合菌液按体积比0.5～2％接种到上述混合提取液中，接种后的混合提取液的装罐量为25～45％，pH5～8，温度30～40℃，转速100～200r/min，不避光条件下发酵3～7天，得到发酵液； [0015] 9)将发酵液和体积份数为80～90％乙醇按体积比1∶2～6，沉淀过夜，4000～10000r/min离心10～30min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0522～1.0833的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物。 [0016] 作为优选方案，所述混合提取液由50～70份的烟叶提取液、25～35份的灰树花提取液和8～18份的荔枝核提取液组成。 [0017] 作为优选方案，所述混合提取液由60份的烟叶提取液、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液组成。 [0018] 作为优选方案，所述步骤3)中，所述植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。 [0019] 作为优选方案，所述步骤4)中，所述植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L。 [0020] 作为优选方案，所述步骤5)中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L； [0021] 作为优选方案，所述步骤6)中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。 [0022] 本发明还提供了一种上述方法所得降低刺激的发酵烟叶提取物浸膏的应用，所述降低刺激的发酵烟叶提取物浸膏加入重组烟叶中，加入重组烟叶中烟用发酵烟叶提取物的质量比为0.08～0.12％。 [0023] 上述植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4CCTCC NO:M 2012005的生物学特征是：革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长， [0024] 植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为：其16SrRNA序列全长1408bp，16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563％。 [0025] 上述食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2012004，其生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10％NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillus methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100％。 [0026] 微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以烟叶提取物为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。 [0027] 本发明的优点是： [0028] 1、本发明以烟叶提取液、灰树花提取液和荔枝核提取液组成的混合提取液作为碳源、氮源、以及底物，为卷烟本源物质，容易让微生物酶体系利用来发酵产烟香，其发酵烟叶提取物具有天然环保无害优点。 [0029] 2、采用植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4CCTCC NO:M 2012005和食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1共同来发酵生产使重组烟叶烟气质有所提升，烟气更饱满，甜润感较好，降低烟气刺激的发酵烟叶提取物，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷，能与其它烟用香精香料混合调配使用。 [0030] 3、本发明方法工艺过程简单，原料为卷烟产品本源烟叶，有工业化使用前景。具体实施方式 [0031] 下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。 [0032] 下述植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2012005。 [0033] 下述食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2012004。 [0034] 实施例1 [0035] 一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，它包括以下步骤： [0036] 1)将烟叶粉碎至80目，再将烟末和水按质量比1∶50回流提取3h后过滤，重复1次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； [0037] 2)按重量份数比称取80份的烟叶提取液、20份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； [0038] 3)菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在38℃，静置培养24h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。 [0039] 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在25℃条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L。 [0040] 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH7条件下，静置培养48h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L； [0041] 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在30℃条件下，100rpm振荡培养48h，连续转接2次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L； [0042] 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1混合，得到混合菌液； [0043] 8)发酵：将混合菌液按体积比2％接种到上述混合提取液，接种后的混合提取液的装罐量为25％，pH5，温度40℃，转速100r/min，不避光条件下发酵7天，得到发酵液； [0044] 9)将发酵液和体积份数为90％乙醇按体积比1∶2，沉淀过夜，10000r/min离心10min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0633的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物1。 [0045] 实施例2 [0046] 一种降低刺激的发酵烟叶提取物2的制备方法，它包括以下步骤： [0047] 1)将烟叶粉碎至60目，再将烟末和水按质量比1∶40回流提取3h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； [0048] 2)按重量份数比称取60份的烟叶提取液、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； [0049] 3)菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在30℃，静置培养72h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L； [0050] 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在32℃条件下，100r/min振荡培养48h，连续转接3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L； [0051] 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25℃、pH9条件下，静置培养24h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L； [0052] 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在25℃条件下，100rpm振荡培养72h，连续转接4次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L； [0053] 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶3混合，得到混合菌液； [0054] 8)发酵：将混合菌液按体积比0.5％接种到上述混合提取液，接种后的混合提取液的装罐量为30％，pH7，温度36℃，转速100r/min，不避光条件下发酵7天，得到发酵液； [0055] 9)将发酵液和体积份数为80％乙醇按体积比1∶2，沉淀过夜，10000r/min离心10min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0722的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物2。 [0056] 实施例3 [0057] 一种降低刺激的发酵烟叶提取物3的制备方法，它包括以下步骤： [0058] 1)将烟叶粉碎至50目，再将烟末和水按质量比1∶20回流提取1h后过滤，重复1次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； [0059] 2)按重量份数比称取70份的烟叶提取液、35份的灰树花提取液和15份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； [0060] 3)菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC NO:M 2012005接种到斜面培养基上，在25℃，静置培养24h后得到活化菌种，置于冰箱中；其中，斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。 [0061] 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到种子培养基，在25℃条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接1次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L。 [0062] 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在35℃、pH5条件下，静置培养24h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L； [0063] 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在35℃条件下，150rpm振荡培养24h，连续转接2次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L； [0064] 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶2混合，得到混合菌液； [0065] 8)发酵：将种子培养液按体积比2％接种到上述混合提取液，接种后的混合提取液的装罐量为40％，pH8，温度30℃，转速100r/min，不避光条件下发酵3天，得到发酵液； [0066] 9)将发酵液和95％乙醇按体积比1∶6，沉淀过夜，4000r/min离心30min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0112的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物3。 [0067] 实施例4 [0068] 一种降低刺激的发酵烟叶提取物4的制备方法，它包括以下步骤： [0069] 1)将烟叶粉碎至50目，再将烟末和水按质量比1∶50回流提取2h后过滤，重复2次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶提取液，并灭菌； [0070] 2)按重量份数比称取50份的烟叶提取液、25份的灰树花提取液和18份的荔枝核提取液，混合均匀，得到混合提取液； [0071] 3)菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC NO:M 2012005接种到斜面培养基上，在30℃，静置培养48h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。 [0072] 4)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤3)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在38℃条件下，150r/min振荡培养72h，连续转接2次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L。 [0073] 5)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH6条件下，静置培养48h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L； [0074] 6)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在30℃条件下，120rpm振荡培养48h，连续转接3次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L； [0075] 7)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1混合，得到混合菌液； [0076] 8)发酵：将种子培养液按体积比15％接种到上述混合提取液，接种后的混合提取液的装罐量为20％，pH6，温度35℃，转速150r/min，不避光条件下发酵5天，得到发酵液； [0077] 9)将发酵液和95％乙醇按体积比1∶3，沉淀过夜，8000r/min离心20min，过滤后减压浓缩至相对密度为1.0522的浸膏，即得降低刺激的发酵烟叶提取物。 [0078] 实施例5 [0079] 烟叶发酵提取物的应用 [0080] 发明人将上述发酵烟叶提取物按重组烟叶量0.08％、0.10％、0.12％，分别添加到重组烟叶上。将重组烟叶装入密封袋中，放置烘箱中80℃恒温30min，至重组烟叶水分合适，卷制成烟支，放入22℃+1、相对湿度为60％+2％恒温恒湿箱内48h，请专家评吸小组评吸。对照为仅喷加相同量烟叶提取物的重组烟叶卷制的卷烟。经专家评吸小组反复评吸，认为：本发酵烟叶提取物，与重组烟叶量比例为0.08％、0.10％时，具有使重组烟叶烟气质提升，烟气更饱满，甜润感更好，降低烟气刺激的优点，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷。 [0081] 表1.发酵烟叶提取物添加到重组烟叶中的感官评吸 [0082] [0083] [0084] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

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