一种滴滴涕降解菌及其培养方法和应用 |
|||||||
| 申请号 | CN201610719479.3 | 申请日 | 2016-08-24 | 公开(公告)号 | CN106119175A | 公开(公告)日 | 2016-11-16 |
| 申请人 | 内蒙古自治区农牧业科学院; | 发明人 | 张福金; 杨永青; 张欣昕; 李国银; 狄彩霞; 张三粉; 李秀萍; 莎娜; 连海飞; 邵志壮; 王雪娇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种滴滴涕降解菌及其培养方法和应用，该降解菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，本发明所提供的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)具有对滴滴涕的降解功能，可用于 土壤 滴滴涕污染的修复。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种滴滴涕降解菌，其特征在于,为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种滴滴涕降解菌及其培养方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及菌株领域，具体涉及一种滴滴涕降解菌及其培养方法和应用。 背景技术[0002] DDE(化学式：1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene，2,2-双-(对氯苯基)-1,1-二氯乙烯)是有机氯农药滴滴涕的重要组分，是一种公认的环境优先控制污染物，也是典型的持久性污染物(POPs)，具有难以降解性、半挥发性、生物蓄积性和高毒性，对人类健康和环境的危害极大。我国已于1983年禁止了滴滴涕的生产和使用，但由于使用量大，在环境中降解缓慢、滞留时间长，使得此类农药仍然是在土壤、植物、水体、等环境介质中检出，并通过土壤和农作物的积累作用，导致我国人均体内滴滴涕的累积。据调查1988年呼和浩特市郊菜地土壤中滴滴涕浓度为5-852ng/g，平均192ng/g。2008年呼和浩特市城乡结合部典型农田土壤中滴滴涕残留(主要为DDE)浓度仍然保持在632±285ng/g；植物蔬菜中残留检出率为87％，个别超标严重，严重影响了农产品的质量。吉林省近期监测食品(蔬菜、水果、粮豆类、肉蛋奶类)中滴滴涕污染比较普遍，食品中滴滴涕总量中位数为7.2ng/g。上海市人奶中(以奶脂计)总滴滴涕的平均值为1594ng/g，高于德国20世纪90年代蓄积水平的6倍。及时对滴滴涕农药造成的污染土壤进行修复，对环境保护、生态恢复及农业发展和人类健康有者十分重要的意义。自然界滴滴涕农药残留的降解主要依靠土壤中微生物来完成，但自然降解十分缓慢。而生物修复技术因其高效、安全、廉价和无二次污染正越来越受到重视。因此，有针对性地筛选高效微生物菌株，研制微生物修复接种剂，通过人工接种加速土壤长残效滴滴涕农药的 消解进程、消除农田滴滴涕残留危害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。 发明内容[0003] 针对上述问题，本发明通过系统筛选获得一种滴滴涕降解菌，利用该菌可降解滴滴涕，从而进行土壤滴滴涕污染的修复。 [0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： [0005] 一种滴滴涕降解菌，为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。 [0006] 上述一种滴滴涕降解菌的培养方法，包括如下步骤： [0007] S1、称取粉碎后过1.0mm筛的长期受有机氯农药DDE污染的农田土壤样品10g，加入到100ml含20mg/L的缺碳富DDE培养基中，在36±1℃、150r/min条件下摇床培养48h，得培养液； [0008] S2、按3％接种量依次取所得培养液3ml传代至含有50mg/L、100mg/L、200mg/L的缺碳富DDE培养基中，在36±1℃、150r/min条件下摇床培养筛选48h； [0009] S3、完成缺碳富DDE培养筛选后，利用平板划线接种至营养琼脂培养基中，在36±1℃恒温培养20h，划线分离得单菌落，经检验为G+，菌落灰褐色，扁平大菌落，边缘整齐，显挑起，凸出，显微镜下可见芽孢。 [0010] 优选地，所述缺碳富DDE培养基通过以下步骤制备： [0011] 称取营养肉汤4份作为基础培养基，分别加入用过0.22μm无菌滤膜的丙酮与无菌吐温-80溶解的DDE纯品20mg、50mg、100mg和200mg，则制成的缺碳富DDE培养基中DDE终浓度分别为20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L. [0012] 优选地，所述营养肉汤由以下原料制备而成： [0014] 优选地，所述营养肉汤的pH为7.4，所述丙酮与无菌吐温-80的质量比为1:1。 [0015] 本发明的菌株在无机盐培养基中4天对20mg/LDDE的降解率达到45.2％。 [0016] 本发明的滴滴涕降解菌可用于修复土壤滴滴涕污染，具体的，可利用缺碳富滴滴涕培养基驯化液体培养，制成菌悬液；可使用草碳富集，用水控制湿度，适当增加溶解性有机质，制成粉状固体接种剂；可进行田间沟施，辅以须根植物促进土壤中滴滴涕降解。 [0017] 本发明具有以下有益效果： [0018] 本发明的蜡状芽孢杆菌(Baci l lus cereus)具有对滴滴涕的降解功能，可用于土壤滴滴涕污染的修复。 具体实施方式[0019] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0020] 实施例 [0021] DDE耐受菌驯化分离 [0022] 1.DDE耐受菌的筛选 [0023] 1)缺碳富DDE培养基：称取营养肉汤4份(组成公开：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL蒸馏水，pH7.4)作为基础培养基，分别加入用丙酮(过0.22μm无菌滤膜)与无菌吐温-80(1:1比例混合)溶解的DDE纯品20mg、50mg、100mg和200mg，则制成的缺碳富DDE培养基中DDE终浓度分别为20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L。 [0024] 2)称取粉碎后过1.0mm筛的长期受有机氯农药DDE污染的农田土壤样品10g，加入到100ml含20mg/L的DDE营养肉汤培养基中，在36±1℃、150r/min条件下摇床培养48h。再按3％接种量依次取上代培养液3ml传代至含有50mg/L、100mg/L、200mg/L的缺碳富DDE培养基中，培养条件同上。 [0025] 2、DDE耐受菌划线分离 [0026] 经过不同DDE浓度梯度的缺碳富DDE培养筛选后，利用平板划线接种至营养琼脂培养基中，在36±1℃恒温培养20h。划线分离得单菌落，经检验为G+，菌落灰褐色，扁平大菌落，边缘整齐，显挑起，凸出，显微镜下可见芽孢。 [0027] DDE降解菌筛选 [0028] 1.方法：利用不同浓度DDE作唯一碳源筛选DDE降解菌 [0029] 2.DDE降解菌的筛选过程： [0030] 1)将划线分离得到单菌落接种于DDE终浓度为100mg/L的细菌无机盐培养基中，于36±1℃、150r/min摇床培养4d后，培养基变浑浊的，说明培养菌能利用DDE作为碳源在细菌无机盐培养基中生长。 [0031] 2)细菌无机盐培养基的公开配方： [0032] 0.5g MgSO4·7H2O,1.0g(NH4)2SO4,0.5g KH2PO4,0.5g NaCl,0.05g酵母膏，1.5g K2HPO4,0.1g CaCl2,0.01g FeCl3,蒸馏水1L，pH7.0。 [0033] 3)将培养4d后的培养液划线接种至DDE终浓度100ppm的营养琼脂中培养，出现菌落降解圈，观察菌落形态均一，镜检结果与之前挑取的细菌形态一致，说明此细菌能够在细菌无机盐培养基中利用DDE为碳源生长，纯化效果较好。 [0034] DDE的细菌降解特性 [0035] 1.方法：在DDE浓度分别为100mg/L、20mg/L的细菌无机盐培养基中接种培养4d后，用气相色谱法测定DDE残留量并计算降解率。 [0036] 2.DDE降解特性试验过程： [0037] 1)选取具有降解特性的细菌作为菌源进行降解特性试验 [0038] 2)采用细菌无机盐培养基，同时做空白对照 [0039] 3)设置培养基中DDE终浓度分别为100mg/L、20mg/L [0040] 4)接种后于36±1℃、150r/min摇床恒温培养4d [0041] 5)萃取培养基中的DDE：取10ml充分混匀的培养液，加入90ml正己烷至250ml三角瓶中，涡旋振荡约2min，取3ml上层有机相于10ml离心管中，加 入0.5g无水硫酸钠，涡旋振荡后取0.1ml至含有1ml正己烷的上样小瓶中，供GC-ECD检测 [0042] 6)经过4d培养后，原20mg/L的培养基中的DDE的残留浓度为9.4mg/L，空白对照为18.5mg/L(理论为20mg/L)，检测结果证明DDE的细菌降解率为45.2％。原100mg/L的培养基中的DDE的残留浓度为79.2mg/L，空白对照为97.5mg/L，DDE的细菌降解率为18.1％。 [0043] 降解菌的理化试验结果如下表所示。 |
||||||
