【0002】在生产期间或结束时，生物产品经常存在于稀释的混合 物或溶液中。因此，将它们纯化至可用程度的成本经常是某种方法是 否商业上可用的主要因素。目前使用的一些收集和纯化方法涉及不环 保(environmentally unfriendly)的溶剂和试剂。除了其它的优势之外， 相对于其全部或部分依赖于不环保的溶剂或试剂的方法而言，本发明 提供了环保(environmentally friendly)的可选方法。
【0003】泡沫分馏对于蛋白质浓缩和分离是有前景的工程工具， 因为它简单、廉价、环保，而且可易于从实验室规模放大到中试工厂 设备的规模。除了其它事项，它涉及将气体吹到产品培养液里，因此 形成泡沫。当气泡上升时，它们将具有表面活性的试剂——即表面活 性剂，浓缩到气泡表面上。在液体表面上方，表面活性剂稳定的气泡 变成泡沫。当泡沫层继续上升至分馏柱中时，泡沫上的液体渗流出， 这是由重力和复杂泡沫界面上的毛细管力，即普拉特奥边界(plateau border)导致的。这样的渗流(drainage)导致泡沫表面活性剂的进一 步浓缩。然后该泡沫可被收集和破裂，必要的话使用机械搅拌器，得 到具有比原培养液更高的表面活性剂浓度的液体泡载(foamate)。在一 些实例中，表面活性剂的浓度可提高40至100倍。
【0004】泡沫分馏不但更划算而且具有很低的环境影响。泡沫分 馏一般不涉及产品污染，因为主要的添加剂，及在一些实例中唯一的 添加剂，为空气或另一惰性气体。其它的纯化/浓缩方法，其全部或部 分依赖于盐沉淀，是不利的，因为蛋白质的盐沉淀(盐析)可能通过 所述盐中存在的痕量重金属引入污染，导致沉淀完成(几乎完成)后 可能的酶失活及昂贵的去除盐分的必要性。此外，这种方法所需的盐 量一般是巨大的，从而使得该方法的费用增加，这归因于同大量高纯 度盐使用相关的成本。作为选择，溶剂沉淀，作为纯化/浓缩生物产品， 特别是基于蛋白质/含有蛋白质的生物产品的工具，经常使得蛋白质活 性的衰减加大。
【0005】与脂肪酶回收的传统方法(溶剂/盐沉淀和层析)的比较 概括在下面。
表1
    标准     沉淀     层析     泡沫分馏     纯化因素-a     2.4     4     1.5     富集因素-b     10     40     80     处理时间     12小时     -     数分钟     操作费用     低     高     低     投资成本     中等     高     低     运行成本     高     中等     低     环境污染     高     中等-高     低
a)(U/mg蛋白质)/(U/mg蛋白质)0
b)(U/mL)/(U/mL)0
其中U代表酶活性单位，及上标“0”指的是回收操作前的活性。
【0006】以前对泡沫分馏的研究得出这样的观点：纤维素酶主要 负责发泡，因为发泡的增加似乎与纤维素酶产量的分布(profile)大约 成正比。然而，发明人进一步的研究已经证实这是不正确的。特别地， 当采用泡沫分馏从发酵培养液中分离纤维素酶时，发现纤维素酶具有 表面活性但不是该培养液中表面活性最高的组分。因此，我们不能选 择性地发泡分离出纤维素酶组分。在收集的泡载中，单个纤维素酶组 分(即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶)没有一个显示出 比在原培养液中略微高的活性。
【0007】尽管具有有前途的潜力，但是由于对该方法缺乏理解， 泡沫分馏还未得到很大发展。另外，发明者已经发现，在含有产品的 培养液中存在的所有物质当中，感兴趣的产品不具有最高的分配活性 (partition activity)。基于这一点，文献中提到的简单泡沫分馏工艺/方法 无法得到可接受的结果。因此本领域需要能得到改进的纯化/浓缩结果 的泡沫分馏方法，甚至当感兴趣的产品，在含有产品的培养液中存在 的所有物质当中，不具有最高的分配活性的时候。
发明概述
【0008】本发明总体上涉及从或在溶液和/或混合物中纯化和/或浓 缩化合物的方法。在另一个实施方式中，本发明涉及从溶液或混合物 中纯化和/或浓缩化合物的方法。在另一实施方式中，本发明涉及从溶 液或混合物中纯化和/或浓缩化合物的方法，其全部或部分地利用了泡 沫纯化和/或浓缩。在还有另一实施方式中，本发明可用于分离、浓缩 和/或纯化任何物质，包括生物产品和/或生物材料，其能选择性地结合 到接合剂上，因此产生复合物，所述复合物将会很容易分配到泡沫的 气泡表面。
【0009】本发明总体上涉及用泡沫分馏纯化生物产品的方法。更 特别地，本发明涉及亲合泡沫分馏，其中通过以提供对泡沫具有增强 的亲合力的生物产品的方式修饰生物产品，所述方法从混合物中分离 生物产品的能力得到提高。该方法适用于宽范围的各种各样的生物产 品，唯一的要求是，目的生物产品必须能以增强其对泡沫的亲合力的 方式被衍生化。
【0010】在还有另一实施方式中，本发明可用于分离、浓缩和/或 纯化任何物质，包括生物产品/生物材料，其能选择性地结合到接合剂 上，从而产生复合物，所述复合物将会很容易分配到泡沫的气泡表面 上。
【0011】本发明也涉及用泡沫从溶液或混合物中分离、浓缩和/或 纯化物质的方法，所述方法包括这些步骤：修饰待被分离、浓缩和/或 纯化的组合物以增强该物质对泡沫的亲合力；从含有所述修饰组合物 的溶液中形成泡沫；以及从所述泡沫中分离、浓缩和/或纯化所述组合 物。
【0012】本发明也涉及泡沫分馏化学化合物的方法，所述方法包 括：提供用于容纳包括待被分馏的一种或多种化学化合物的液体的容 器，其中该容器包括内含用于使液体发泡的装置；提供置于容器中的 液体，且该液体含有待被分馏的一种或多种化学化合物，其中所述一 种或多种化学化合物用亲合力-发泡剂(affinity-foaming agent)修饰， 使得它们倾向于优先分离到泡沫上，而不是所述液体中；激活所述装 置进行发泡，从而从所述液体形成所述泡沫；并收集所述泡沫。
【0013】本发明仍进一步涉及通过前述方法纯化得到的产品。
附图简述
【0014】图1是显示通过水解将纤维素分解成葡萄糖的方法的流 程图；
【0015】图2是对于三种无细胞体系在不同纤维素水解产物 (cellulose hydrolysate，CH)百分比下纤维素酶活性(cellulase activity， FPU)的富集率(Enrichment Ratios，ER)图，所述的三种无细胞体系 为：体系I-基于水解产物的培养液+未高温灭菌的CH，体系II-基 于水解产物的培养液+高温灭菌的CH，体系III-基于葡萄糖和纤维素 的培养液+高温灭菌的CH；
【0016】图3是对于三种无细胞体系在不同纤维素水解产物百分 比下E/P值的图示(如图1所述)；
【0017】图4是对于体系II在不同纤维素水解产物百分比下FPU 和单个纤维素酶组分——即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷 酶，的富集率(ER)图；
【0018】图5是如此图，其比较了羧甲基纤维素 (carboxymethylcellulose，CMC)和纤维素水解产物(CH)的加入对 泡沫分馏的影响，该比较基于FPU、细胞外蛋白质和还原糖的富集率 (Enrichment Ratios，ER)。对照没有加入CMC或CH；
【0019】图6是如此图，其比较了不同类型的CMC对FPU的富 集率的影响。DS指的是取代程度(Degree of Substitution)(在70％、 90％和120％)，MW指的是分子量(L-低，M-中，和H-高)；
【0020】图7是一对图，其比较了(a)木聚糖水解产物(xylan hydrolysate，XH)的加入和(b)纤维素水解产物(CH)的加入对FPU 和单个纤维素酶组分的泡沫分馏的影响，所述单个纤维素酶组分即内 切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶，其来自无细胞的、基于乳 糖的培养液上清液；
【0021】图8是一系列显示当向培养液中加入PMMA/MAA共聚 物时对纤维素酶富集率的影响图；和
【0022】图9是一系列显示当向培养液中加入PMMA/MAA共聚 物-纤维二糖时对纤维素酶富集率的影响图。
发明详述
【0023】本发明总体上涉及从或在溶液和/或混合物中纯化和/或浓 缩化合物的方法。在另一个实施方式中，本发明涉及从溶液或混合物 中纯化和/或浓缩化合物的方法。在另一实施方式中，本发明涉及从溶 液或混合物中纯化和/或浓缩化合物的方法，其全部或部分地利用了泡 沫纯化和/或浓缩。在还有另一实施方式中，本发明可用于分离、浓缩 和/或纯化任何物质，包括生物产品和/或生物材料，其能选择性地结合 到接合剂上，因此产生复合物，所述复合物将会很容易分配到泡沫的 气泡表面。
【0024】本文具体定义了如下术语。滤纸单位(Filter paper unit， FPU)包括在50℃和pH4.8下1h内引起了2.0mg的还原糖当量的释 放所需的酶数量。富集率(Enrichment Ratios，ER)包括泡载中的酶活 性(FPU)除以生成泡沫的残余液体——即残余物——的酶活性所得的 比率。当ER以这种方式计算时，本文将其称为FPU ER。可选择地， 富集率也可以按照泡载中的细胞外蛋白质浓度除以残余物中的细胞外 蛋白质浓度来计算。当ER以这种方式计算时，其被称为Extra-PER。 正如本文所使用，术语亲合-发泡剂包括任何化合物，该化合物与意欲 被纯化的靶化合物相结合，并且当靶化合物的溶液进行泡沫分馏时， 增加靶化合物分离到泡沫表面的倾向。一些代表性的亲合-发泡剂包括， 但不限制于槐糖苷、鼠李糖脂、PMMA-co-PMAA-纤维二糖，或其任 何组合。
【0025】本发明总体上涉及用泡沫分馏纯化生物产品的方法。更 特别地，本发明涉及亲合泡沫分馏，其中通过以提供对泡沫具有增强 的亲合力的生物产品的方式修饰生物产品，所述方法从混合物中分离 生物产品的能力得到提高。该方法适用于宽范围的各种各样的生物产 品，唯一需要的是，目的生物产品必须能以增强其对泡沫亲合力的方 式被衍生化。在一些实施方式中，本发明可用于分离、浓缩和/或纯化 各种物质，包括生物产品/生物材料，其能被选择性地结合到接合剂上， 从而产生复合物，所述复合物将会很容易分配到泡沫的气泡表面。
【0026】正如上面所注意到的，许多生物产品具有表面活性但在 发酵培养液中活性不是很大。因此，采用常规的非亲合泡沫分馏方法， 这些生物产品不能被选择性地发泡分离。为了增强泡沫分馏的选择性， 已经研发出新的技术/工艺/方法。本发明的工艺在下文中将被称为亲合 泡沫分馏(affinity foam fractionation，AFF)。
【0027】在一些实施方式中，本发明的工艺/方法涉及使用纤维素 水解产物，及类似物，例如羧甲基纤维素(CMCs)。该水解产物具有 多种分子量(MW)和取代程度(DS)。它们被加入到含有要选择性地 结合到其上的靶化合物的混合物中，且形成容易分配到气泡表面上的 疏水性复合物。在另一个实施方式中，纤维二糖和/或相关的化合物被 用于衍生所述靶化合物。在还有另一实施方式中，纤维二糖被连接到 能增强其泡沫亲合力的疏水性聚合物上。
【0028】纤维素浓度(浓度是按照滤纸单位或FPU表示的)、水解 产物/类似物相对于FPU的比率、水解产物/类似物的种类以及细胞存 在的影响被测定，以确定上述工艺/方法提高泡沫分馏效率的能力。所 测的起泡性能包括起泡速度、泡沫的稳定性和干度、泡载体积和FPU、 以及FPU和单个纤维素组分的富集。在某些情况下，泡载FPU可能为 培养液中的FPU的5倍那么高。在纤维素组分中，外切葡聚糖酶被富 集得最多(3倍)，内切葡聚糖酶其次(2.3倍)，以及β-葡糖苷酶最少 (1.4倍)。一般地，在CMC的情况下，那些含有低的DS和高的MW 的CMC性能最好。
期望的生物产品的选择性地结合
【0029】一种或多种期望的生物产品的选择性地结合可涉及期望 的生物产品与配体之间的各种相互作用，例如氢键、离子键和疏水相 互作用。最普通的实例一般可被分成六种类型的相互作用：
(1)酶-底物相互作用——酶是基于蛋白质的催化剂，其对特 定的底物具有高的亲合力。底物类似物和竞争性抑制物也可能参 与同所述酶的亲合力结合。
(2)抗体-抗原相互作用——抗体是由脊椎动物的免疫系统 产生的免疫球蛋白蛋白质。实例包括但不限于，IgM、IgG、IgD、 IgA和IgE。这些蛋白质含有超变的结构域，被称为互补决定区， 其能识别并结合外来底物(抗原)上的特定区域(表位)。
(3)DNA-蛋白质相互作用——被称为转录因子的蛋白质一 般通过与基因的调控区域相结合来调节基因表达。这些区域通常 形成DNA双螺旋的大沟。这些用于结合蛋白质的DNA结构域(基 序)包括，但不限于，螺旋-转角-螺旋、亮氨酸链、β-带、TATA 盒、和锌指蛋白质结构域。
(4)细胞受体-配体(ligand)相互作用——细胞或者通过直 接接触通信，或者通过分泌能被靶细胞中的受体识别的化学物质 来通信。在后一种情况，受体可出现在细胞表面或细胞内部。细 胞外受体包括离子通道受体、G-蛋白质偶联受体和酶连接的受体。
(5)生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白作用——借助 固定化抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，生物素标记的生物分 子可被几乎不可逆地分离。
(6)凝集素-碳水化合物相互作用——凝集素是一种含有至 少两个特定碳水化合物结合位点的蛋白质。结合单糖的凝集素不 但对糖具有特异性，而且对特殊的异构体也具有特异性。与单糖 相比，某些凝集素对寡糖证实有更高的亲合力。
【0030】很明显地，上面所列的不是穷尽性的，而且对于许多主 要种类的生物产品(或生物材料-例如蛋白质/酶、聚核苷酸或低聚核 苷酸、碳水化合物和甚至细胞)存在其它的选择性结合机理。鉴于这 一事实，任何允许选择性地结合期望的生物产品的机理可被结合到本 发明的亲合泡沫分馏技术中，用于选择性地分离和纯化期望的生物产 品(生物材料)。这包括，但不限于，目前最重要的工业和医疗生物产 品/生物材料：许多蛋白质、酶、单克隆抗体和多核苷酸/寡核苷酸。
亲合泡沫分馏
【0031】下面实例中的一些涉及从真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的发酵培养液中分离纤维素酶。然而，应当注意，本发明不限 于此。相反，本发明可用于分离、浓缩和/或纯化任何物质，包括生物 产品/生物材料，其能选择性地被结合到结合剂，因此产生复合物，所 述复合物将会很容易分配到泡沫的气泡表面。其它能用于纤维素酶生 产的细胞包括，但不限于，热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、白 色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、链霉菌属(Streptomyces)、高温放 线菌属(Thermoactinomyces)、弯曲热单孢菌(Thermomonospora curvata)、纤维素水解顶头孢菌(Acremonium cellulolyticus)、Aspergillus acculeatus、熏烟色曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、 Penicillium funmiculosum、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、白绢菌(Sclerotium rolfsii)、胞核侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、爱默森尼黄蓝菌 (Talaromyces emersonii)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、康 氏木酶(Trichoderma koningii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色 木霉(Trichoderma viride)、或其任何组合。//note：或者埃默森篮状菌 (Talaromyces emersonii)、嗜纤维素侧孢菌(Spofotrichum cellulophilum)
【0032】关于下面的实施例和从真菌里氏木霉(Trichoderma reesei， T.reesei)的发酵培养液中分离的纤维素酶，所述方法受到复杂的代谢 调节：诱导和葡萄糖阻遏。纤维素酶是一类酶，其通过协同作用将纤 维素水解成葡萄糖。需要三种截然不同的酶活性：1)具有内纤维素酶 活性的β-1，4-葡聚糖多糖水解酶(β-1，4-glucan glycoanohydrolyase)，2) 具有内纤维素酶活性的β-1，4-葡聚糖纤维二糖水解酶(β-1，4-glucan cellobiohydrolyase)，3)将纤维二糖断裂为葡萄糖的β-葡糖苷酶。该酶 的活性与目前情况相关的方面包括以下几方面。水解开始于内纤维素 酶的随机内部攻击，断裂交联部分并形成新的聚合物末端，其易于接 近外切纤维素酶。通过将链内的氢键还原，水解也可溶解底物。该纤 维二糖水解酶攻击纤维素的非还原端，产生纤维二糖与一些较大的寡 糖。最后，β-葡糖苷酶通过从纤维二糖产生葡萄糖完成了所述分解过程。 图1以流程图的形式阐明了上述过程。带有文字的粗箭头表明酶通常 进入该过程的时间点。细线显示了反馈效应，其中一种酶的产物是另 一酶的底物。如图显示，降解过程终止于葡萄糖的产生。
【0033】在一些实施方式中，衍生可如下发生。酶结合到底物上， 其对泡沫具有亲合力。该酶与该底物保持结合足够长的时间，以经受 泡沫分馏，并且被收集。
【0034】正如在先所述，这些酶对其底物、底物类似物、或含有 所述底物或类似物的结构域/部分的化合物具有选择性的结合亲合力。 具有蛋白质活性位点的这些试剂的亲合结合也有助于保护酶，以防止 在起泡过程中被变性。由于界面张力和/或含水培养液与气泡/泡沫表面 之间疏水性的显著差别引起的水力剪切的缘故，发泡导致的气-水界面 上的蛋白质变性可以/可能发生。
【0035】在以下所述的一些实施例中，阐明了底物添加剂对亲合 泡沫分馏的影响。该底物可包括硬木水解产物，羧甲基纤维素(CMC)， 和/或木聚糖水解产物。正如本领域普通技术人员所知，纤维素酶水解 CMC和木聚糖，表明纤维素酶对这些物质存在某种结合亲合力。因此， CMC和木聚糖被包括在下面的一些实施例中。下面的实施例仅具有例 证性，并且没有以任何方式限定本发明。只有权利要求将会对本发明 的范围进行限定。
材料和方法：
a)发酵：
【0036】里氏木霉Rut-30(NRRL 11460)从美国国家农业部(United States Department of Agriculture)(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Peoria，Illinois)得到。该微生物在4℃下被保存在马 铃薯葡萄糖琼脂(Sigma；推荐39g/L)斜面上，每隔三至四周进行定 期的接种(sub-culturing)。
【0037】为了制备用于每个发酵实验的接种体，将三环细胞从琼 脂斜面转移到250-ml的含有50ml马铃薯葡萄糖培养基(Sigma)的预 培养瓶中。在室温和250rpm下培养两天之后，该培养液被加入到2-L 的烧瓶中，该烧瓶含有500mL从Mandels和Weber使用的培养基改进 得到的成分明确培养基。对于纤维素酶生产来说，成分明确培养基不 但需要碳-底物作为细胞生长和维持所需的物质和能量的来源，而且需 要诱导剂以活化所有纤维素成分的表达。在本研究中，比较了三种培 养基体系的纤维素酶合成能力以及更重要的起泡性能。第一培养基包 括5g/L的葡萄糖作为碳-底物，和5g/L的纯纤维素作为诱导剂和碳源 (经过对细胞产生的纤维素酶的水解)。第二培养基含有硬木水解酶 (含有12g/L的还原糖，制备方法从Lee，Patrick和Moore，Millicent 的论文：Abstracts of Papers(2002)，223rd ACS National Meeting，Orlando， FL，USA改进而得)作为碳-底物和诱导剂。
【0038】上述两培养基被用在分批发酵方法中，产生起泡研究中 使用的培养液。用于当前起泡研究用的培养液一般是在第十五天时获 得，此时纤维素酶的活性(以FPU进行测定，即滤纸单位)达到最高 水平。
【0039】第三培养基是基于乳糖的，即用乳糖作为碳底物和诱导 剂。用该培养基的发酵以分批-然后-连续(batch-then-continuous)的模 式进行。初始培养基含有10g/L的乳糖；连续培养用的原料含有20g/L 的乳糖。该培养生长到指数生长晚期，然后被转换成连续培养，其进 料速度是根据基于pH的算法由计算机控制的(详细情况在Lo， Chi-Ming；Zhang，Qin；and Lu-Kwang，Ju：Submitted to the 27th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals(2005)中有所描 述)。起泡研究中使用的培养液是在进入连续培养大约一周之后收集 的。
【0040】为避免起泡，其将另外必须加入一种或多种抗发泡剂， 以1VVM(气体体积/液体体积/分钟)的速率进行表面通风，以向培养 液里供应氧气，所述培养液以大约250rpm的速率进行磁力搅拌。发酵 保持在大约室温下(本文限定为大约24℃±1℃)。每天进行取样。无 细胞培养液被用在所进行的大部分起泡实验中。在这种情况下，收获 的发酵培养液在大约8,000rpm下进行离心大约10min(9,300g，Sorvall RC 5C Plus Super-speed Centrifuge，Sorvall，Newtown，CT)，以除去生物 质。收集上清液用于随后的亲合起泡研究。
b)亲和泡沫研究：
【0041】亲合泡沫研究在250-mL的量筒中进行。所用的液体样品 的体积为40mL。放在量筒底部的空气扩散器(空气石)被用于起泡 研究用的精细气泡。起泡前的总体积，包括液体样品和空气石在内， 为50mL。通过使用具有三通阀(three-way valve)的流量计，将空气鼓 泡的速率保持在1VVM(即40ml/min)。一旦起泡，泡沫就在5min 内达到最高水平的顶端。记录总的发泡的体积。于是停止起泡，使得 泡沫破裂。也记录破裂的速率，作为泡沫稳定性的表征。然后重新开 始空气起泡。在泡沫维持在最高水平时，收集底部留下的液体培养基 (残余物)并且其体积(Vr)用50-mL的量筒进行测量。发泡量筒里 的泡沫被破裂(必要的话，在泡沫表面吹入空气流)，并且筒壁和空气 石用已知体积的去离子水(Vw)进行淋洗。收集稀释的泡载用于进行 分析。“实际”泡载体积(Vf)是通过从初始样品体积(40mL)中减 去Vr而得到。稀释因子(1+Vw/Vf)被用于调整总的分析浓度，其用 稀释的泡载得到。
c)分析方法：
i)还原糖、固体和纤维素的浓度：
【0042】还原糖的浓度采用非特异性的二亚硝基水杨酸(DNS) 方法进行测定，这是根据还原糖存在下加热时形成的DNS试剂的颜色 进行的(更详细的情况，请参见，Miller，W.M.；Blanch，H.W.；and Wilke， C.R.：Biotech，and Bioeng.，Vol.32，pp.947-965(1988))。DNS试剂制备 方法如下：将10g的3，5-二亚硝基水杨酸溶解在400-mL蒸馏水中，加 入200mL 2M的NaOH，然后将此溶液用蒸馏水稀释到总体积1L。
【0043】对于固体的干重浓度，从发酵中取出10-mL的样品并在 8,000rpm下离心分离。收集的固体用蒸馏水洗涤两次，转移到铝制称 量盘上并且在烘箱中100℃下干燥24h。据此计算出固体浓度。纤维素 浓度很难直接测量。相反，因为固体包括细胞和纤维素，本文通过从 固体浓度中减去细胞干重浓度而得到纤维素浓度。如下所述，借助用 取自无纤维素的发酵——所述发酵以葡萄糖作为唯一碳源——的培养 液样品所建立的校准曲线，细胞干重浓度是从胞内蛋白质浓度转换而 来。
ii)细胞浓度：
【0044】由于纤维素的存在，细胞干重浓度不能直接测量。相反， 细胞内蛋白质浓度如下所述进行测量：通过离心分离，培养液样品中 的固体被收集并用蒸馏水洗涤两次。然后细胞在3 mL 0.2N的NaOH 中100℃下裂解20min。接着采用标准Lowery方法测定裂解物中的蛋 白质浓度。用紫外/可见(UV/VIS)分光光度计(Perkin-Elmer Lambda 3B)测定595nm处的吸光度。
【0045】为了建立细胞内蛋白质浓度与细胞干重浓度之间的关系， 用葡萄糖作为唯一碳源进行分批发酵。对不同发酵阶段上取的样品进 行分析，得到细胞干重浓度和胞内蛋白质浓度。关系被建立为：
细胞干重浓度(g/L)＝胞内蛋白质浓度(g/L)×8.0(±0.5)
iii)纤维素酶活性：
【0046】纤维素酶的总活性采用标准滤纸分析法(进一步的详细 情况，参见，Mandels，M.；Andreotti，R.；and Roche，C：Biotechnol.Bioeng. Symp.6，pp.21-33(1976))进行测量。对单个酶组分，即内切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶的分析简要描述如下：
【0047】内切葡聚糖酶：Berghem和Petterson的改进方法(进一 步的详细情况参见，Gunjikar，T.P.；Sawant，S.B.；and Joshi，J.B.： Biotechnol.Prog.，Vol.17，pp.1166-1168(2001)，和Berghem，L.E.R.and Petterson，L.G.：Eur.J.Bichem.，Vol.37，pp.21-30(1973))被使用。在0.05 M的醋酸钠缓冲液(pH5)中制备1％的羧甲基纤维素(CMC)溶液。 该CMC溶液在50℃下用0.28mL的测试酶溶液温育30min。加入3mL 1％的DNS试剂终止该反应。接着测量酶反应所产生的还原糖浓度， 并且根据下列方程式用所述还原糖浓度计算内切葡聚糖酶活性：
内切葡聚糖酶活性(U/mL)＝释放的还原糖(mg)×0.66
【0048】外切葡聚糖酶：Berghem和Petterson的改进方法被使用。 将1mL测试酶溶液加入到在0.05M的醋酸钠缓冲液(pH5)中制备 的1mL 2％的微晶纤维素(Avicel)悬浮液中。在40℃下温育30-min 后，加入3mL 1％的DNS试剂终止反应，并且测定得到的还原糖浓度。 根据下列方程式计算外切葡聚糖酶活性：
外切葡聚糖酶活性(U/mL)＝释放的还原糖(mg)×0.18
【0049】B-葡糖苷酶(纤维二糖)：三个试管被使用。纤维二糖空 白的试管含有1.0mL的15mM的纤维二糖溶液、柠檬酸盐缓冲液(pH 4.8)和水中的每一种。样品空白的第二试管含有1.0mL样品和2.0mL 水。测试样品的第三试管含有1.0mL的纤维二糖溶液、缓冲液和所述 测试样品中的每一种。所述试管被混合、将盖盖紧，并且在50℃下温 育30min。再加入3mLDNS试剂，并采用DNS方法测定得到还原糖 (葡萄糖)的浓度。样品的吸光度，减去样品空白的吸光度和纤维二 糖空白的吸光度，被用于测定还原糖的浓度。根据下列方程式测定β- 葡糖苷酶活性：
β-葡糖苷酶活性(U/mL)＝释放的还原糖(mg)×0.0926
【0050】请注意，根据加入的不同发泡剂，下列实施例含有六部 分，即，纤维素(硬木)水解产物(CH)、羧甲基纤维素(CMC)、木 聚糖水解产物(XH)、PMMA/MAA共聚物-纤维二糖、槐糖脂和鼠李 糖脂。
实施例1-加入纤维素水解产物的亲合泡沫分馏
【0051】实验结果概括在本文所附的表1和2中，显示了三种因 素对发泡行为的典型影响。所述因素为：(1)发泡培养液中细胞的存 在或不存在；(2)存在细胞的不同生长阶段；和(3)水解产物的加入。 含有细胞的体系中使用的细胞在基于葡萄糖的培养基中预生长(含有 10g/L的葡萄糖)。为了研究不同生长阶段的影响，细胞在指数生长晚 期(分批培养的第三天)或稳定生长期(第十五天)收获。培养液上 清液，其在所有体系中用作生产纤维素酶的基础培养基，是借助基于 水解产物的培养基，通过发酵制备的。该培养液在第十五天时被收获， 并且被离心以去除细胞。使用相同的基础培养液上清液有助于确保， 研究的不同体系只是在加入的细胞和/或CH上有所区别。含有细胞的 体系以相同的细胞浓度被加入，大约3g/L。含有CH的体系在起泡研 究前不久以5％CH的浓度被加入。加入的水解产物被制备成含有同样 的培养基组合物(忽略掉碳源)，使得水解产物的加入对其它的培养液 特性具有最小的影响。
【0052】对发泡速度和泡沫稳定性的观测结果概括在表1中。正 如下面更详细描述的，基于水解产物的培养液易于发泡而且泡沫十分 稳定，比基于乳糖的培养液明显稳定的多。细胞的存在减慢了发泡速 度而且使得泡沫较为不稳定。CH的加入也减慢了无细胞体系中的发泡 速度，但是对含有细胞的体系的影响极小。
【0053】得到的细胞、还原糖、纤维素酶(FPU)活性和胞内蛋白 质的富集率(ER)汇总在表2中。细胞的富集率被定义为泡载中细胞 浓度与原培养液中的细胞浓度的比值。其它参数的富集率也类似地被 定义。表2中的结果表明了以下几点：
(1)CH的加入富集了所有体系中的纤维素酶。ER在无细胞 体系中更大。
(2)CH的加入明显降低了没有纤维酶活性的细胞外蛋白质 的分配，使得蛋白质的ER低许多。与纤维素酶增加的富集一起， 所述观测结果表明CH对纤维素酶具有明显的选择性。纤维素酶 与相关的CH成分(可能为纤维素寡聚物)之间形成的复合物在 向气泡/泡沫表面上的分配方面优于其它蛋白质；因此，使得蛋白 质的ER降低。
(3)CH的加入好像降低了还原糖的去除，尽管此影响只有在 无细胞体系中明显。在所有的体系中还原糖的ER小于1。
(4)细胞的存在基本上没有影响FPU、蛋白质和还原糖的 ER，但是细胞通过发泡被去除。CH的加入增加了细胞去除的程 度。在两个不同生长阶段收获的细胞在培养液发泡方面表现相似。
【0054】在用硬木水解产物作为亲合起泡剂进行的所有后来的发 泡实验中，上述观测结果可定量地重现。注意，水解产物大约含有12g/L 的还原糖。因此，在上述实验中使用的5％的加入对应于加入了大约0.6 g/L的还原糖。水解产物中极大部分还原糖为葡萄糖(40％)和木糖 (27％)。假定只有低聚物(低聚物，oligomer)对结合纤维素酶具有 高的亲合力并且形成了在泡沫表面上具有增强分配的疏水性更大的复 合物，引入的“实际”发泡剂的数量很低。一旦研发出生产具有更大 低聚物馏分的CH的方法，纤维素酶的亲合泡沫分馏效率可得到很大 提高。
【0055】在无细胞体系中进行进一步的实验，以测定将CH馏分 增加直到75％对泡沫分馏的影响。使用培养液上清液(来自基于水解 产物或基于葡萄糖和Avicel纤维素的发酵)与作为发泡剂的这种CH 的三种组合进行这些实验(经过或未经过121℃下高温灭菌15min)：
体系1-未高温灭菌的CH被加入到基于水解产物的培养液上清液 中；
体系2-高温灭菌的CH被加入到基于水解产物的培养液上清液 中；和
体系3-高温灭菌的CH被加入到基于纤维素的培养液上清液中。
【0056】在不同的CH馏分下，在这三种体系中得到的FPU的ER 被概括在图2中(参见I至III，其分别对应体系1至3)。发现CH的 加入对所有的这三种组合均有利，产生最大的ER为2.6-3.4。体系1 和2中25％CH处的急降的原因还不清楚，但是这种趋势在两个体系 中都可重现。除了在很高馏分(75％)时，高温灭菌的和未高温灭菌的 CH表现类似。
【0057】除了泡载中纤维素酶的浓度/富集之外，加入CH的亲合 泡沫分馏提高了纯度。这显示在图3中，对于三种体系，随着CH馏 分增加，泡载中的E/P(酶相对于蛋白质(Enzyme-to-Proteins)，通过 FPU除以胞外蛋白质的浓度来计算)值明显更高。
【0058】如上所述，纤维素酶包括三种成分：内切葡聚糖酶、外 切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。测定CH的加入对单种纤维素酶的泡沫分 馏的影响是重要的。对于体系2，不同CH馏分下纤维素酶成分的ER 显示在图4中。(对于体系1，分布基本上相同，但是体系3的分布还 没有被测定。)外切葡聚糖酶是富集的基本成分。其它两种成分的富集， 特别是内切葡聚糖酶，在5％的低CH馏分时也被观测到。在更高的 CH馏分时，该富集减少，并且，对于β-葡糖苷酶，它甚至在没有CH 加入时就下降到得到的水平之下。尽管不希望只受到下面理论的束缚， 然而内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的差的富集可被认为导致总FPU的 ER(2.0-2.5)比外切葡聚糖酶的FPU(3.0-3.6)低。
【0059】另外，尽管不希望只受到下面理论的束缚，但是纤维素 酶成分的不同影响可能与被不同成分优选作为底物的寡聚物的不同大 小相关。具有水解纤维二糖(二聚体)的主要功能，β-葡糖苷酶被期望 对较小寡聚物具有更高的亲合力，所述寡聚物具有很大的水溶性而且 不易分配到泡沫表面上。为了增强β-葡糖苷酶的富集将需要连接小的 寡聚物到另一疏水性实体上，使得结合的复合物将有效地分配到泡沫 表面上。另一方面，内切葡聚糖酶具有切割长的纤维素链的功能。可 能，它们将对更大的寡聚物具有更高的亲合力(因此比外切葡聚糖酶 要大，外切葡聚糖酶能结合到较短的链以发挥它们切割末端链的功 能)。观测到的内切葡聚糖酶差的富集可能是CH中存在的大寡聚物的 浓度极低的结果，所述CH被制备成主要含有葡萄糖。设计的在水解 产物中得到较长寡聚物的方法，对于最优化亲合起泡技术的效率来说 是可取的，而且在本发明的范围之内。
实施例2-加入CMC的亲合泡沫分馏：
【0060】CMCs是被修饰的，水溶性的，长链纤维素类似物。CMCs 对于纤维素酶的亲合泡沫分馏的潜在应用在下面被讨论。在从基于水 解产物的发酵中收集的无细胞的培养液上清液里进行实验。为得到比 较早的分批培养的FPU(大约0.3-0.4 FPU)更高的FPU(大约0.7)， 达到稳定态阶段后向发酵补充基于乳糖的连续进料。三种体系被比较： (a)培养液上清液(对照)；(b)加入了5％的5-g/L CMC溶液的上 清液；和(c)加入了5％的硬木CH(含有16g/L的还原糖)的上清液。 FPU、胞外蛋白质和还原糖的ER显示在图5中。发现CMC溶液在纤 维素酶富集方面的表现与CH一样好，即使不是更好。
【0061】几种不同分子量(MW)和取代度(DS，引入羧酸基团) 的CMC是商业上可得的。以上实验所用的CMC属于类型“7L”：“7” 代表70％的DS(即平均70％的葡萄糖单元含有结合的酸基团)，以及 “L”代表低的MW(大约90,000)。为了研究DS和MW对亲合起泡 性能的影响，对5个体系进行实验，每个加入了5％特定类型的CMC (10-g/L的溶液)-7L、7M、7H、9M8和12M8，其中M和H指的 是中等和高的MW(分别为大约250,000和700,000)，且9M8和12M8 分别指的是大约90％和120％的DS(并且“8”表明2％溶液的粘度大 约为800厘泊)。得到的FPU的ER显示在图6中。具有较低DS(为 70％)的CMC表现得比那些具有较高DS的CMC好很多，可能是因 为较高的DS降低了纤维素酶与修饰糖链之间的亲合力。增加MW也 会对纤维素酶的富集产生积极的影响。
实施例3-加入木聚糖水解产物的亲合泡沫分馏：
【0062】表3给出了实验结果，其比较了纤维素酶亲合泡沫分馏 中木聚糖水解产物(XH)和纤维素(硬木)水解产物(CH)的影响。 正如在材料和方法部分中所述，无细胞的培养液上清液是从基于乳糖 的发酵中收集的。基于乳糖的培养液，尽管其具有高很多的FPU(大 约0.9)，但是证明其起泡性能不是很好。不良的起泡与其浓度低很多 的胞外蛋白有关，这证实了早期的观测结果：与培养液中存在的某些 其它蛋白质相比，纤维素酶不能引起有效的起泡，并且通过泡沫分馏 进行的纤维素的选择性分离需要本工作中研发的亲合起泡。
【0063】XH具有比CH更强的起泡能力，表3中XH得到了比 CH基本上更大的泡沫体积表明了这一点。两种水解产物在还原糖的富 集方面表现相似。与CH相比，XH对于FPU和胞外蛋白质都具有低 一点的ER。基于乳糖的培养液上清液中的FPU富集不是很高，最高达 大约1.8，与之相比较的，基于水解产物的培养液上清液的FPU富集则 最高达3.5-4.5。然而，应当注意基于乳糖的上清液中富集和纯化的空 间更少，因为开始时它比基于水解产物的上清液(E/P大约1.1)含有 更多更纯的纤维素酶(E/P大约5.6)。尽管纯的纤维素酶的E/P值还有 待测定，在从基于乳糖的培养液上清液中产生的、分别含有75％XH 和CH的泡载中，该值高达大约18和9。两者都比从基于水解产物的 培养液上清液中得到的、含有75％CH的E/P值(高达大约6.5)高很 多(图3)。
【0064】不同馏分的XH和CH对单个纤维素酶成分的泡沫分馏的 影响显示在图7中。CH的促进行为在基于水解产物的培养液上清液(图 3)和基于乳糖的培养液上清液(图7b)中是相似的：ER对于外切葡 聚糖酶是最高的，而对于β-葡糖苷酶是最低的。XH也是从基于乳糖的 培养液上清液中富集了最多的外切葡聚糖酶(图7a)，但是似乎对于内 切葡聚糖酶具有最低的富集。最后，XH被制备，其含有比CH更高浓 度的寡聚物。然而，纤维素酶被期望对XH的亲合力要比对CH的低， 这样，通过CH可以在内切葡聚糖酶的富集较差情况下中发挥作用。
实施例4-加入PMMA/MAA共聚物-纤维二糖的亲合泡沫分馏：
【0065】本发明的另一实施例涉及使用一种或多种有机聚合物来 进一步增强泡沫亲合力。如下面的方案1所示，纤维二糖与氢溴酸反 应，因此形成溴化纤维二糖衍生物。然后溴化衍生物与含巯基的化合 物反应，所述含巯基的化合物充当连接体，将纤维二糖连接到有机聚 合物上。在这种情况下，所述含巯基的化合物是3-巯基苯酚。但是可 以预料宽范围的各种各样的连接体都充分发挥作用，这对于本领域普 通技术人员来说是显而易见的。因此，所有的这些连接体也在本发明 的范围内。
方案1

【0066】根据方案1，然后纤维二糖的巯基衍生物与有机聚合物反 应，例如聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)、聚甲 基丙烯酸(polymethacrylic acid，PMAA)和/或其任何共聚物。因此， 聚合物衍生的纤维二糖变得能更好地分配到气泡表面上，即通过泡沫 分馏被分离。因此，通过泡沫分馏，特异性地结合到纤维二糖上的纤 维素酶也更有效地通过泡沫分馏被纯化。在一些实施方式中，PMMA 和/或PMMA的平均分子量大约为5000g/mol。可以预料，宽范围的各 种各样的有机聚合物也会充分起作用，这对于本领域普通技术人员来 说是明显的。因此，所有的这些有机聚合物也在本发明的范围内。这 样的有机聚合物的一些实例无限制地包括，聚烯烃、聚对苯二甲酸二 乙酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多酚、聚噻吩、聚氰、聚酯、聚碳酸 酯、多肽、或其任何共聚物和/或组合。
【0067】单独聚合物对纤维素酶泡沫分馏效率的影响显示在下面 的表II中。第一行是表明分离纤维素酶的效率的对照，其中该体系没 有添加聚合物和纤维二糖。所述效率表达为FPU ER(1.69)和Extra-P ER(1.83)。此外，还显示了培养液的pH以及产生的泡沫体积。
表II
    FPU ER  Extra-P ER     pH   泡沫体积   (mL)   培养液泡载     1.69  1.83     5   60   泡载w/P   (0.128g/L)     2.56  3.1     4.95   120   泡载w/P   (0.064g/L)     3  3.2     4.96   130
【0068】第二行显示了加入浓度高达大约0.128g/L的 PMMA/MAA共聚物的影响。这使得富集率高很多(即2.56和3.1)。 第三行显示了加入相对于第二行大约一半数量的有机聚合物——即大 约0.064g/L——的影响。实验结果表明富集率得到进一步提高。既然 这些实施例没有纤维二糖，纤维素酶被非特异性地从培养液中起泡分 离出。这些数据可以从图8中的图表中看出。
【0069】在另外的实施方式中，聚合物，例如PMMA/MAA共聚 物，被结合到纤维二糖上，从而更特异性地从培养液中起泡分离出纤 维素酶。与这些实施方式相关的数据显示在表III中。在表III的第一行， 在无PMMA/MAA共聚物-纤维二糖的情况下，培养液对照被发泡。在 那种情况下，富集率为1.61和1.69，其与表II中的对照可比较的(正 如所预料的)。在表III的第2、3和4行，PMMA/MAA共聚物-纤维二 糖被添加，其浓度分别高达大约1.172g/L、0.293g/L和0.117g/L。在 这个实施方式中，富集率峰值超过那些没有纤维二糖的实施方式的峰 值。这些数据也可从图9的图表中看出。
表III
FPU ER  Extra-P ER  pH  泡沫体积  (mL) 培养液泡载 1.61  1.69  5.00  60.00 泡载w/Bio-P (1.172) 2.94  3.29  4.80  170.00 泡载w/Bio-P (0.293) 3.39  2.61  3.40  190.00 泡载w/Bio-P (0.117) 2.80  2.42  4.99  170.00
实施例5-加入鼠李糖脂的亲合泡沫分馏：
【0070】在其它的实施方式中，亲合起泡剂是一种或多种鼠李糖 脂，其结构与下面所示的结构相似。这样的鼠李糖脂是可从假单胞菌 中得到的生物表面活性剂。在一些实施方式中，其可能对于在像烃类 这样的疏水性底物上生长假单胞菌是有利的。它们一般含有连接到羟 基癸酸的羟基基团上的一个或两个鼠李糖部分。通常，该酸也用另一 脂肪酸进行酯化，其可以是或不是另一癸酸。

【0071】这种特殊的鼠李糖脂可从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)得到。该结构中的二鼠李糖部分是纤维素酶的高亲合底物 类似物，特别是β-葡糖苷酶。在一个实施方式中，这种鼠李糖脂可被 用于泡沫分馏一种或多种β-葡糖苷酶。另外，如下表IV所示，这种鼠 李糖脂能纯化β-葡糖苷酶22倍以上。
表IV
    活性     FPU-ER
 只含培养液的对  照  培养液泡载     0.0195     1.126  培养液残余物     0.0173  0.4g/L槐糖脂  (2)  S.L.+培养液泡  载     0.0345     0.949  S.L.+培养液残     余物     0.0364  0.4g/L鼠李糖脂  (1)纤维素酶  0.1g/L  R.L.+纯的纤维     素酶泡载     0.0232     22.174  R.L.+纯的纤维   素酶残余物     0.0010  0.4g/L脱乙酰化  的(3)槐糖脂  De.S.L.+培养液  泡载     0.0294     1.718  De.S.L.+培养液  残余物     0.0171
实施例6-加入槐糖脂的亲合泡沫分馏：

【0072】在其它的实施方式中，鼠李糖脂用一种或多种槐糖脂代 替。本发明范围内的槐糖脂的实施例没有限制地包括，结构2和3。与 鼠李糖脂实施方式相类似，二糖部分对β-葡糖苷酶和其它纤维素酶起 到如高亲合力底物或底物类似物的作用，而烃部分增加了该分子分配 到气泡，例如泡沫表面上的趋势。结构2的结果显示在第2行，并且 表明在0.4g/L时FPU-ER为0.949。结构3的结果显示在第4行，而且 表明在0.4g/L时FPU-ER为1.718。
【0073】结构2和3可从假丝酵母属(Candida)和/或球拟酵母属 (Torulopsis)的酵母中得到。能生产这些化合物的一个种是球拟假丝 酵母(Candida bombicola)。该特殊的种能大量生产前述化合物，例如 每升培养物大约300g。正如本领域普通技术人员所知的，通过适当调 节培养条件，可使酵母主要产生结构2或主要产生结构3。
【0074】本发明范围内的其它烃部分的例子无限制地包括，具有6 至20个碳的烷烃、具有6至20个碳的单烯、具有6至20个碳的饱和 脂肪酸、具有6至20个碳的单不饱和脂肪酸、含有6至20个碳的多 不饱和脂肪酸、和/或它们的任意组合。可以预料，宽范围的各种各样 的其它烃部分也将起到可接受的作用，而且这样的部分将容易被本领 域普通技术人员想到。因此，所有这些改变也在本发明范围内。
【0075】除了二鼠李糖和二槐糖，本发明范围内的其它二糖包括 那些含有己糖和/或己酮糖的二糖，例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘 露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、 塔格糖或其任意组合。另外，可以预料其它二糖也将起到可接受的作 用，而且将容易被本领域普通技术人员想到。因此，所有这些改变也 在本发明的范围内。
【0076】除了其它事项外，本发明的方法是环保的、经济上有效 的而且易于规模放大的。它适用于许多物质的收集和纯化，并且在一 个实施方式中适用于生物材料。
【0077】尽管本发明已经具体参考本文详述的某些实施方式进行 详细地描述，然而其它的实施方式可达到相同的结果。对本发明的变 化和改变对于本领域技术人员来说将是明显的，而且本发明期望将所 有这些改变和等同物覆盖在所附的权利要求中。