一种丹参种子EMS突变库建立方法 |
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| 申请号 | CN201710683279.1 | 申请日 | 2017-08-11 | 公开(公告)号 | CN107439369A | 公开(公告)日 | 2017-12-08 |
| 申请人 | 浙江理工大学; | 发明人 | 郭万里; 梁宗锁; 叶益丰; 杨宗岐; 杨佳瑶; 向倩倩; | ||||
| 摘要 | 本 申请 涉及一种丹参 种子 EMS突变库建立方法，属于以 植物 生长调节剂 对植物组织培养技术领域。取适量丹参种子，将其浸泡在EMS溶液或者EMS与GA两种溶液中处理一段时间后，取出种子进行育种；所述的GA溶液中GA浓度为0-100mg/L；EMS溶液中EMS浓度为0.3-0.7%。将本申请应用于丹参种子培育，具有萌芽率高、萌芽一致性好等优点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种丹参种子EMS突变库建立方法，其特征在于：取适量丹参种子，将其浸泡在EMS溶液或者EMS与GA两种溶液中处理一段时间后，取出种子进行育种；所述的GA溶液中GA浓度为 |
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| 说明书全文 | 一种丹参种子EMS突变库建立方法技术领域背景技术[0002] 丹参研究已经成为中药领域的热点，成为了中草药的模式植物，然而其化学突变群体库的建设还未见报道。丹参具有极大的药用价值，对心脑血管系统疾病具有显著疗效。还能活血化瘀，改善微循环，增强血液流通性。在自然状态下，外界环境的改变以及生物体遗传结构的不稳定性会导致植物自身发生频率很低的突变，但不同植物间突变频率差异大。丹参的自然生长缓慢，又由于自然条件的变化导致产量低，质量不均等问题。 [0003] 丹参常用的栽培方法有种子育苗移栽，分根繁殖，扦插繁殖等。用丹参种子繁殖比分根繁殖的方法更为优越，因其成活率高，长势良好。但是由于丹参种子成熟不一致，花期较长，发芽率低，贮藏时间短等原因，对丹参的栽培和种质资源的稳定性造成了很大的影响。丹参在我国的种植面积广，但是各个地区的环境条件以及栽培条件的迥异，导致丹参种子质量的不均，药材的稳定性不一致。所以丹参批量的稳定性药材的种植关键在于种质资源。近年来，国内应用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变白菜、黄瓜、小麦、水稻、大麦、油菜、花生、玉米等植物都取得了显著的成效。而关于中药材的种子萌发实验条件以及操作流程还没有统一的方法，关于丹参的EMS突变体的研究还未见报道。 [0004] 基于此，做出本申请。发明内容 [0006] 为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种丹参种子EMS突变库建立方法，取适量丹参种子，将其浸泡在EMS溶液或者EMS与GA两种溶液中处理一段时间后，取出种子进行育种；所述的GA溶液中GA浓度为0-100mg/L；EMS溶液中EMS浓度为0.3-0.7%。 [0007] 进一步的，作为优选：所述的GA溶液为GA水溶液或者GA磷酸溶液，GA浓度为5-50mg/L，处理时长为6-48h，并优选为12-24h。 [0008] 所述的EMS溶液为EMS水溶液或者EMS磷酸溶液。 [0009] 所述的两种溶液一起处理时，GA溶液先添加，EMS溶液后添加，两者可以同时添加，也可以按照不同时间阶段进行GA溶液和EMS溶液的分别添加，更优选的，所述的EMS溶液在GA溶液添加后12小时加入。 [0010] 所述的丹参种子浸泡前，先以清水浸泡1-3h，更优选的，清水浸泡前，先对种子进行搓洗至脱除其表面薄膜。 [0011] EMS是一种烷化剂，通常有一个或者多个能够转移到其他分子密度高的分子上的活性烷基。使得氢键的能力由于碱基的位置上多了烷基而发生变化。EMS的诱变主要有两个过程，首先是G（鸟嘌呤）上的氧原子发生烷基化，产生一个带正电的季铵基团，然后这个基团导致碱基的替换，使得烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，发生G:C-A:T的替换。此外，EMS还可与核苷结构的磷酸形成酯类物质而切断糖分子与磷酸的连接，使染色体缺失。附图说明 [0012] 图1为磷酸盐和水对丹参种子萌发率的影响；图2为不同浓度GA对丹参种子萌发率的影响； 图3为25mg/L GA处理丹参种子不同时间后的发芽率； 图4为EMS组丹参种子发芽率与显著性分析柱状图； 图5为第二批丹参种子发芽率及显著性分析柱状图； 图6为最佳EMS处理时间的筛选状态对照图； 图7为EMS诱变白化苗状态对照图。 具体实施方式[0013] 丹参种子培育的重点、难点：目前重点要解决的问题是丹参种子发芽率不高，因此加入GA促进种子萌发。对实验材料的处理要充分，EMS具有毒性，实验需要在通风橱中进行，并注意防护。需要设计不同的药物处理浓度和时间取材梯度，筛选出最佳的取材时间和药物处理的浓度。 [0014] 丹参种子培育的关键问题：丹参种子的萌发一致性问题，以及对照组50%萌发率标准的确定。找出最适的药物处理浓度和取材梯度。EMS诱导突变的方向具有不确定性，要筛选出优良性状的突变体。 [0016] 器材：烧杯（beaker）、玻璃棒（glass rod）、滤纸（filter paper）、磁力搅拌器（magnetic stirrer）、电子天平（electronic balance）、称量纸（weighing paper）、培养皿（culture dish）、纱网（gauze）、剪刀（scissors）、育种盘（breeding tray）、相机（camera）、细绳（string）、通风橱（ventilation cabinet）。 [0017] 试剂配制1）1mg/mL赤霉素（GA）：称取0.1g赤霉素，加入少量的无水乙醇溶解，定容至100ml配成 1mg/mL的溶液。赤霉素难溶于水，因此需要先用少量无水乙醇溶解，然后加水稀释到所需的浓度。 [0018] 2）0.7% EMS溶液：EMS (Sigma: M0880) 在20℃时密度为1.206g/mL,在700mL溶液中则加入4.063mL EMS。 [0019] 3）5%硫代硫酸钠溶液：用电子天平称取35g硫代硫酸钠，用少量水溶解，然后加入到700mL的EMS溶液中中和，隔天将废液倒入废液缸中。 [0020] 丹参种子的准备1.2.1 磷酸盐和水溶液的比较 1）随机数出200粒种子，并且放于电子天平上称重，重复5次，分别为0.2565g，0.2821g， 0.2903g，0.3030g，0.3002g，均重为0.2864g。 [0021] 2）称取4组丹参种子，每组0.2864g，用纱网包裹。4个500mL烧杯中分别为GA的水溶液，GA+EMS的水溶液，GA的磷酸溶液，GA+EMS的磷酸溶液，每个烧杯中加入一包用纱网包裹的种子。GA浓度为25mg/L，EMS浓度为0.3%。 [0022] 3）24h后取出种子，种入育种盘中，并贴上相应的标签。 [0023] 4）观察并统计0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d后种子的萌发情况。分析磷酸盐对GA处理丹参种子的影响。 [0024] 最佳GA浓度的筛选1）称取6组丹参种子，每组200粒即0.2864g。 [0025] 2）分别用纱网包裹，放在6个500mL烧杯中。按顺序加入已配置好的GA溶液，使得各组浓度分别为0mg/L，5mg/L，10mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L。 [0026] 3）24h后取出所有种子，分别种入育种盘中并作上标记。将废液倒入废液缸中。 [0027] 4）每2d统计一次种子的萌发情况，10d后统计种子萌发率并分析。 [0028] 最佳GA处理时间的筛选1）取适量丹参种子，挑出杂质后，用纱网将种子包裹，在清水冲洗下进行搓洗，直至种子表面的薄膜掉落。 [0029] 2）将洗好的种子放入盛有清水的烧杯中，浸泡2h左右。再将种子放入提前配置好的25mg/L赤霉素溶液中，分别静置0h，24h，48h，60h。 [0030] 3）每个时间段取出适量的种子，用蒸馏水冲洗3-4次，将残留的赤霉素溶液尽可能的去除。然后用升汞作消毒处理15min，保持振摇的状态。 [0031] 4）升汞处理的种子取出后，反复用清水洗涤3-4次，每次3min，保持振摇的状态以确保种子表面的残留尽可能的去除，并将第一次洗涤的废液进行集中处理，以免污染地下水。 [0032] 5）取出种子并用消毒后的镊子将种子夹到培养皿中的滤纸上。 [0033] 6）在准备好的培养皿中铺上两层滤纸，用水浸湿，每个培养皿中点20粒种子，这个数量既容易计数，也能减少偶然性。 [0034] 7）将点完种子的培养皿放在黑暗条件下培养，每2d记录一次种子发芽数，定期浇水。 [0035] 8）最后，将各时间段的实验数据进行比较，并绘制折线图。 [0036] 丹参的EMS诱变1.3.1 丹参EMS处理最佳时间的筛选一 1）称取12组种子，每组1000粒即1.4320g。分别用纱网包裹并用细绳系紧。用剪刀将多余的细绳与纱网剪除，以便于后续的处理。 [0037] 2）设一组对照组，1000粒种子用纱网包裹浸入蒸馏水中48h，不作任何其他处理。 [0038] 3）将12组种子分别放入盛有700mL蒸馏水的两个1000mL大烧杯中浸泡2h。 [0040] 5）将6包种子放在一号大烧杯中记为CK组，另外6包放在二号大烧杯中作为实验组记为EMS组。将烧杯分别放在两个磁力搅拌器上并且调节转速为300rpm。实验前在通风橱桌面垫上报纸，以防实验过程中试剂的不慎洒落。 [0041] 6）采用GA浓度为25mg/L，EMS浓度为0.7%的实验条件。同时在两组中各加入1mg/mL GA溶液21mL，在EMS组中加入4.063mL的EMS。分别取12h、16h、20h、24h、36h、48h为时间梯度，每个时间梯度从两组中各取出一组种子，分别记为CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6和EMS1、EMS2、EMS3、EMS4、EMS5、EMS6。 [0042] 7）取出种子时，按取出顺序分别贴上标签后，放入水槽中冲洗，将细绳系于水管处，以免混淆。调节水量适中，冲洗24h。此时会发现CK组中溶液较为浑浊，而EMS组中溶液澄清，因为种子表面有许多微生物，而EMS具有很强的毒性，能杀死微生物。 [0043] 8）将取出的种子分别种入育种盘中。由于丹参种子吸水膨胀后表面具有一层粘稠的多糖物质，不易分离种植，因此将种子与一小撮蛭石混合后，均匀撒在育种盘表面可在一定程度上保证播撒的较分散。由于多孔育种盘孔洞较大且与底座空隙大，可先倒入500mL自来水，而后将蛭石倒入育种盘中，则可避免漏出，同时保证水分的充足。播种完后在表面撒一层薄薄的干土，将种子覆盖，保证黑暗的环境，利于种子的萌发。每一组种子种在一个育种盘中，同时在育种盘上贴上相应的标签。 [0044] 9）在EMS溶液中加入5%硫代硫酸钠35g中和，反应24h后会发现溶液出现白色浑浊，然后倒入废液缸中。由于EMS具有毒性，因此废液不能随意处理，实验过程中的通风橱的风扇也要保持开启，并用报纸盖住烧杯。 [0046] 丹参EMS处理最佳时间的筛选二1）称取10组种子，每组1000粒即1.4320g。分别用纱网包裹并用细绳系紧。用剪刀将多余的细绳与纱网剪除。 [0047] 2）准备两个磁力搅拌器，放于通风橱中并且开启风扇，调节空调温度保持室温25℃。准备两个便签贴在空调与通风橱上，以免实验条件受到影响。 [0048] 3）将2包种子放在一号大烧杯中记为CK组，另外8包放在二号大烧杯中作为实验组记为EMS组。将烧杯分别放在两个磁力搅拌器上并且调节转速为300rpm。实验前在通风橱桌面垫上报纸，以防实验过程中试剂的不慎洒落。 [0049] 4）采用GA浓度为25mg/L，EMS浓度为0.7%的实验条件。同时在两组中各加入700mL蒸馏水，1mg/mL GA溶液21mL，12h后在EMS组中加入4.063mL的EMS。根据经验，种子吸水膨胀后，发芽萌动时期处理效果最好。分别取12h、16h、20h、24h为时间梯度，每个时间梯度从EMS组中取出2组种子，分别记为EMS1、EMS2、EMS3、EMS4、EMS5、EMS6，EMS7、EMS8。32h后取出CK组中的种子记为CK1、CK2。 [0050] 5）后续的种植与EMS废液处理同上。 [0051] 结果与分析2.1不同GA浓度与不同处理时间对丹参种子发芽的影响 2.1.1磷酸盐和水的比较 通过GA的水溶液，GA+EMS的水溶液，GA的磷酸溶液，GA+EMS的磷酸溶液对丹参种子进行处理，得到如下结果，如图1。从图1中可以看到，GA的水溶液处理后的丹参种子萌发率为 92%，远高与GA的磷酸溶液处理后61%的种子萌发率；GA+EMS的水溶液处理丹参种子后萌发率为72%，远高于GA+EMS的磷酸溶液处理后40%的种子萌发率。所以磷酸溶液对丹参种子的萌发率具有一定的抑制作用，本实验后续采用水溶液而不用磷酸溶液。从图1中还可看出，EMS对丹参种子萌发率具有一定的消极影响，会减少萌发率。 [0052] 不同浓度GA对丹参种子萌发率的影响用浓度分别为0mg/L，5mg/L，10mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L的GA对160粒丹参种子进行处理后，得到以下结果，如图2。如图2所示，在一定范围内GA浓度越高，对丹参种子萌发的促进越快速，越明显；当GA浓度超过50mg/L后，则对种子萌发有抑制作用；GA浓度为25mg/L时对丹参种子萌发的促进作用相比于其他浓度最快速，最显著。 [0053] 不同GA处理时间对丹参种子萌发率的影响称取6组种子，每组160粒，采用25mg/L浓度的GA对丹参种子进行处理，选取时间梯度 0h，12h，24h，36h，48h，60h。统计种子的发芽情况，1d一次，持续10d，统计结果如图3。 [0054] 从图3中可以看到，用GA处理12h以上可以加快种子萌发速度，并且提高种子萌发率。GA处理48h丹参种子萌发速度最快，GA处理24h丹参种子萌发率最高达到70%。 [0055] 诱变不同时间对丹参种子的影响在GA浓度25mg/L，0.7%EMS条件下，将每个时间梯度的发芽率绘制成一个图表，如图4。 图4中可以看出，随着EMS处理时间的延长，丹参种子的萌率逐渐下降，36h后发芽率为零。没有GA处理的种子发芽率大约是GA处理的50%，说明GA处理在丹参EMS突变体群体构建中的重要性；从图中可看出EMS处理20h时，发芽率降低至50%，说明20h处理可能最佳。*表示p< 0.05，差异性显著；**表示p< 0.01，差异性极显著。说明用EMS处理12h与16h，20h与24h，p < 0.01 ，即都具有极显著差异。 [0056] 最佳浓度与时间诱变丹参种子后的结果在GA浓度25mg/L，0.7%EMS条件下，取时间梯度12h，16h，20h，24h取出种子，15d后统计发芽率，如图5。从图中可以看出，处理12h后种子萌发率最高，但是12h与16h的差别不大，而 20h这个时间梯度则与前后都有明显差别，并且萌发率为48.31%，所以20h确为最佳处理时间。根据p < 0.05 差异性显著；p < 0.01 差异性极显著。则用EMS处理12h与16h后的丹参种子p>0.05，无显著性差异；用EMS处理16h与20h后的丹参种子p< 0.05，具有显著性差异； EMS处理20h与24h后的丹参种子p < 0.01 具有极显著差异。 [0057] 突变植株如图6所示，显示了EMS处理不同时间后丹参种子的发芽情况，20h的一组接近半致死率。如图7所示，EMS处理的群体（400株）出现4株叶局部白化等体细胞变异现象，但在对照中没有发现类似的现象。 [0058] 种子诱变相对于其他器官组织诱变来说，具有操作简便，受外界影响小等优势，并且容易进行大批量处理。通过种子诱变后的繁殖仍属于完整的自然生长，其后代是通过杂交所获得，区别于其他组织培养而成的与亲本基因相同的丹参植株。EMS的诱变位点包括整个基因组，其诱变的频率与概率极高，效果显著，因此将EMS作为本次丹参突变体里建设研究的初步尝试。 [0059] 本申请所获得的EMS突变体发芽率相对于未处理的要低，并且发芽时间更长，幼苗中也出现了白化苗，矮化苗，叶片明显畸形的这些植株，证明EMS确实对丹参种子的基因组产生了影响，并且通过基因表征出来。而一些隐性基因的改变或许并没有表现出来，可以对其染色体进行分析或者基因组进行研究。 [0060] 最佳GA浓度的选择由于丹参种子的自然萌发率低，因此考虑加入赤霉素提高其发芽率，以方便实验统计。 参考一些资料中的GA处理条件，并且结合自己预实验的结果，初步确定了GA的浓度梯度，在此基础上进行最佳浓度的筛选。为的是保证在一定程度内丹参的种子能尽可能的萌发，提高实验的材料利用率与数据准确性。 [0061] 最佳EMS处理时间的选择本研究处理的丹参种子采用同一浓度，不同时间梯度的实验方法，以丹参种子萌发率为指标，取适当值（发芽率为对照组50%左右且与其他处理组有明显的区别）。对于构建一个突变体库而言，合理的EMS诱变浓度至关重要。此浓度若过低，则浪费实验成本，无法得到一个准确的数值，甚至无法区别于普通未经处理的种子；过高则容易因为EMS本身的毒性与诱变过度造成丹参种子的大量死亡，从而影响实验结果。不同植物的种子EMS诱变的浓度不尽相同，由于种子表面覆盖物、种皮的影响，EMS对其的渗透作用同样受到影响。而丹参种子吸水膨胀后种子表面包裹一层多糖物质，会对EMS的渗透起到一定的阻碍作用，因此相对于种皮阻碍少的植物如油菜、拟南芥等处理的时间要更长，浓度更大。因此本实验采用0.7%的EMS浓度。将20h作为最佳时间选择。 [0062] 在GA浓度25mg/L，0.7%EMS浓度的条件下，进行丹参小型EMS突变体库的构建较为合理。通过上述实验可以初步确定：促进紫花丹参种子萌发的赤霉素最佳浓度为25mg/L；0.7%EMS处理20h为最佳诱变处理条件。在上述条件下丹参种子的发芽率为48.31%，在400株幼苗中出现5株白化苗性状。 |
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