[0001] 本发明涉及天然药物领域，尤其涉及莽草酸在制备胰脂肪酶抑制剂中的应用，以及在制备治疗和/或预防肥胖的药物和/或食品中的应用。

[0002] 肥胖，是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的体内能量代谢紊乱，身体脂肪含量的一种慢性疾病。由多种因素引起，如遗传、饮食、生活习惯和环境因素等。肥胖已经成为威胁人类健康的全球性流行病，超过10亿的成年人有肥胖症，其中至少3亿人是疾病性肥胖，而且越来越多国家的肥胖症病人从中年人向青少年儿童倾斜。肥胖不仅影响人们的生活质量，同时会引发相关的并发症，例如胰岛素抵抗症、Ⅱ型糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病等，随时危害人体的健康。

[0003] 肥胖产生的根本原因与脂肪组织脂解作用的增加有关，食物在人体内消化是由脂肪酶酶解脂肪得到甘油二酯、甘油单酯、甘油和游离的脂肪酸，然后被小肠吸收利用。这一过程中，胰脂肪酶起着关键性的作用，控制胰脂肪酶的活性，能够减少对脂肪的分解，有利于控制和治疗肥胖症。

[0004] 瑞士罗氏公司半合成的胰脂肪酶抑制剂类药物奥利司他虽然已作为减肥药物广泛应用于临床，但长期服用该药会出现腹泻、脂肪性大便、胃肠胀气等副作用，给患者带来困扰，长期服用对人的身体造成伤害。植物来源的天然化合物具有结构多样性、毒性较低、来源广泛等特点，因此，从植物中筛选新的副作用更小的胰脂肪酶抑制剂依然是目前研究的热点。

[0005] 莽草酸，是从中药八角茴香中提取的一种单体化合物，结构如式I所示：

[0006]

[0007] 莽草酸存在于木兰科植物八角(Illicium verum Hook.f.)的干燥成熟果实，除了植物，莽草酸还广泛存在于微生物中，通过微生物发酵也能提取莽草酸。

[0008] 莽草酸具有广泛的药理活性，如莽草酸通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，并具有有抗炎、镇痛作用，还可作为抗病毒和抗癌药物中间体，但是对莽草酸的减肥活性未见报道。

[0009] 有鉴于此，本发明提供了莽草酸的新应用，即在制备胰脂肪酶抑制剂中的应用，以及在制备治疗和/或预防肥胖的药物和/或食品中的应用。

[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0011] 莽草酸在制备胰脂肪酶抑制剂中的应用。

[0012] 莽草酸存在于木兰科植物八角(Illicium verum Hook.f.)的干燥成熟果实，除了植物，莽草酸还广泛存在于微生物中，通过微生物发酵也能提取莽草酸。经实验证实，莽草酸可有效抑制胰脂肪酶的活性，酶动力学方法研究结果表明，莽草酸对胰脂肪酶的抑制类型为混合型抑制，IC50值为3.16mg/L。以上结果表明，莽草酸对胰脂肪酶具有显著的抑制作用，可用于制备胰脂肪酶抑制剂。

[0013] 作为优选，莽草酸的给药浓度为0.5～5mg/mL。

[0014] 本发明经研究发现，随着莽草酸给药浓度的增加，对胰脂肪酶的抑制作用增大，在0.5～5mg/mL范围内，抑制率随着莽草酸浓度的增加而迅速增大，其后趋于平缓。

[0015] 本发明还提供了莽草酸在制备治疗和/或预防肥胖的药物和/或食品中的应用。

[0016] 通常，食物脂肪不能被肠道直接吸收，必须经脂肪酶水解生成单酰甘油和游离脂肪酸后才能被吸收。胰脂肪酶是水解膳食脂肪最重要的酶，可水解50％～70％的食物脂肪，因此，通过抑制胰脂肪酶的活性可以控制高脂饮食引起的肥胖。目前常用做胰脂肪酶抑制剂的药物通常会引起诸多副作用，而莽草酸由于具有广泛的生理活性，在用作胰脂肪酶抑制剂时，可避免副作用的产生，达到更好的效果。

[0017] 本发明还提供一种治疗和/或预防肥胖的药物，包括莽草酸以及药学上可接受的辅料。

[0018] 作为优选，治疗和/或预防肥胖的药物为口服制剂。优选地，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂。

[0019] 另外，本发明还提供了一种治疗和/或预防肥胖的食品，该食品包括莽草酸和食品上可接受的配料。

[0020] 本发明提供了莽草酸在胰脂肪酶抑制剂中的应用及其在制备治疗或预防肥胖的药物和/或食品中的应用。本发明通过实验发现，莽草酸具有显著的抑制胰脂肪酶活性的功能，从而可以抑制体内脂肪的积累避免肥胖的产生，同时可以避免传统减肥类产品对人体引起的副作用。附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0022] 图1示不同浓度莽草酸对胰脂肪酶的抑制作用；

[0023] 图2示莽草酸对胰脂肪酶最适温度的影响；

[0024] 图3示不同温度下莽草酸对胰脂肪酶的抑制作用；

[0025] 图4示莽草酸对不同酶浓度下酶促反应速率的影响；

[0026] 图5示莽草酸对胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk图；

[0027] 图6示莽草酸对胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk二次作图。

[0028] 本发明提供了一种莽草酸在制备胰脂肪酶抑制剂中的应用，以及在制备治疗和/或预防肥胖的药物和/或食品中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0029] 本发明提供的莽草酸在制备胰脂肪酶抑制剂中的应用及其在制备治疗或预防肥胖的药物和/或食品中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

[0030] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0031] 实施例1莽草酸对胰脂肪酶的抑制活性检测

[0032] 试剂配制：(1)0.025mol/LpH7.5的磷酸缓冲液的配制：称取8.9535g的十二水磷酸氢二钠，并加入一定量的蒸馏水溶解，最后定容至1000mL配成A液，称取3.4023g的磷酸二氢钾，并加入一定量的蒸馏水溶解，最后定容至1000mL配成B液，按照比例A:B＝10:1的混合两种溶液即得。

[0033] (2)1mg/mL胰脂肪酶液的配制：精确称取0.1000g的酶粉，加100mLpH＝7.5的磷酸盐缓冲液配制成浓度为1mg/mL的酶液置于4℃的冰箱中保存备用。

[0034] (3)4％PVA配制：称取8.0000gPVA，加入pH＝7.5的磷酸盐缓冲液180mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，应慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至200mL，用双层纱布过滤后备用。

[0035] (4)橄榄油PVA底物乳化液的配制：按质量比m(4％PVA)：m(橄榄油)＝3：1混合，用高速匀浆机处理，6000r/min，分两次处理，每次3分钟，间隔10min，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。

[0036] (5)1％酚酞：称取1.0000g的酚酞，溶于100mL95％的乙醇。

[0037] (6)0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的配制：称取2.0000g的氢氧化钠，加入1000mL蒸馏水溶解，最后定容至1000ml，并用邻苯二甲酸氢钾进行标定。

[0038] (7)用0.025mol/LpH7.5的磷酸缓冲液配制不同浓度的莽草酸溶液(0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10mg/mL)。

[0039] 检测方法参照脂肪酶活性测定的标准(郭勇.酶工程[M].北京：中国轻工业出版社，2004：317-319.)，本发明在此基础上稍作更改，具体实验方法为：在150mL锥形瓶中加入4g橄榄油PVA底物乳化液和4mL0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液，置于37℃水浴保温10min，上述浓度的莽草酸和酶液的混合液(V:V＝1:1)2mL，酶液浓度为1mg/mL，准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。空白对照组采用1mLpH7.5的磷酸盐缓冲溶液，以及1mL的上述浓度的莽草酸溶液。对照组添加
1mL浓度为1mg/mL的酶液、1mLpH7.5的磷酸盐缓冲溶液。三个处理组分别重复3次。通过比较有无莽草酸加入情况下胰脂肪酶活力的差异，得到莽草酸对胰脂肪酶的抑制率。根据以下公式计算酶活力和抑制率：

[0040] 胰脂肪酶酶活力单位定义为：在温度为37℃，pH7.5的条件下，每1min释放出1μmol脂肪酸消耗的酶量定义为1个胰脂肪酶活力单位(U)。

[0041]

[0042] 式中：

[0043] V样——滴定样品时消耗氢氧化钠的体积，mL

[0044] V空——滴定空白时消耗氢氧化钠的体积，mL

[0045] c——氢氧化钠的浓度，mol/L

[0046] t——反应时间，min

[0047] w——胰脂肪酶的加入量，g

[0048] 抑制活性单位定义：在一定条件下，使一个酶活力单位失活为一个抑制剂活力单位。通过比较有无莽草酸加入情况下，胰脂肪酶活力的差异，得到莽草酸对胰脂肪酶的抑制率，计算公式如下：

[0049] 抑制率(％)＝(原胰脂肪酶活力-抑制后胰脂肪酶活力)/原胰脂肪酶活力×100％[0050] 检测结果见图1。

[0051] 由图1可知，莽草酸对胰脂肪酶有明显的抑制作用，随着莽草酸浓度的增加，胰脂肪酶的抑制作用增大，在0.5～5mg/mL范围内，抑制率随着莽草酸浓度的增加而迅速增大，其后趋于平缓。通过计算，莽草酸对胰脂肪酶的半抑制浓度IC50值为3.16mg/mL。

[0052] 以OTC减肥药奥利司他作为阳性对照，采用上述方法进行检测，得到奥利司他对胰脂肪酶的半抑制浓度IC50值为0.066mg/mL。

[0053] 实施例2不同温度下莽草酸对胰脂肪酶的抑制作用

[0054] 准确称取0.1500g的莽草酸，加入50mL0.025mol/LpH7.5的磷酸缓冲液配制成3mg/mL的莽草酸溶液备用。取6个150mL锥形瓶，分别加入4g橄榄油PVA底物乳化液和4mL0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液，置于不同的反应温度(25，29，33，37，41，45℃)下水浴保温10min，同时，取6支带塞试管中按照1：1的比例分别加入3mg/mL莽草酸溶液和1mg/mL酶液混合，分别在上述温度中保温10min，然后将莽草酸和酶液混合液全部移入相应温度的装有底物的锥形瓶中，准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用
0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。以不加莽草酸的胰脂肪酶测得的值为空白对照。按照下列公式计算反应速率和抑制率：

[0055]

[0056] 式中：

[0057] v——反应速率，mol/min

[0058] c——氢氧化钠的浓度，mol/L

[0059] V耗——滴定消耗氢氧化钠的体积，L

[0060] t——反应时间，min

[0061]

[0062] 式中：

[0063] V样——滴定样品时消耗氢氧化钠的体积，mL；

[0064] V空——滴定空白时消耗氢氧化钠的体积，mL；

[0065] c——氢氧化钠的浓度，mol/L；

[0066] t——反应时间，min；

[0067] w——胰脂肪酶的加入量，g；

[0068] 抑制率(％)＝(原胰脂肪酶活力-抑制后胰脂肪酶活力)/原胰脂肪酶活力×100％[0069] 结果如图2和图3所示。

[0070] 由图2可知，不添加莽草酸时，胰脂肪酶的最适反应温度为37℃。当加入莽草酸时，各温度下反应速度明显降低，在25～33℃之间，反应速度变化不大，当达到37℃时，反应速度继续增大，达到一个新的最适温度41℃。结果表明，莽草酸的加入，改变了原来酶分子的某些结构，使其热稳定性有所变化。由图3可知，41℃时莽草酸对胰脂肪酶的抑制率最低，结合图2的结果，可能的原因是，此温度下反应速度最大，对酶活产生抑制作用的同时也加快了反应速率，导致41℃时莽草酸对胰脂肪酶的抑制率低于其他温度下的抑制率。

[0071] 实施例3

[0072] 用0.025mol/LpH7.5的磷酸缓冲液配制不同的酶浓度(0.25，0.5，1，1.5mg/mL)于4℃下保存备用。

[0073] 取5个150mL锥形瓶中加入4g橄榄油PVA底物乳化液和4mL0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液，置于37℃水浴保温10min，同时，取5支带塞试管，按照体积比为1：1的比例分别加入3mg/mL莽草酸溶液和上述不同浓度的酶液，保温10min，然后将莽草酸和酶液混合液全部移入装有底物的锥形瓶中，准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用
0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。计算加入莽草酸后不同酶浓度下酶促反应速率。按照下列公式计算反应速率：

[0074]

[0075] 式中：

[0076] v——反应速率，mol/min

[0077] c——氢氧化钠的浓度，mol/L

[0078] V耗——滴定消耗氢氧化钠的体积，L

[0079] t——反应时间，min

[0080] 在不同的酶浓度(0.25，0.5，1，1.5mg/mL)下，以反应速度对酶浓度作图。结果如图4所示。

[0081] 当有可逆抑制剂存在时，得到一条通过原点但斜率较小的直线，当有不可逆抑制剂存在时，将得到一条不通过原点的平行线。结果显示，不加入莽草酸时，反应速率对酶浓度作图可以得到一条通过原点的直线。加入莽草酸的加入得到的是一条通过原点但斜率较小的直线，因此，可以判定莽草酸对胰脂肪酶的抑制是可逆抑制类型。

[0082] 实施例4

[0083] 取20个150mL锥形瓶，分成4组，每组5个，向每组锥形瓶中分别加入不同质量的橄榄油PVA底物乳化液作为底物(1g，2g，3g，4g，5g)，相应地，依次加入7mL,6mL,5mL,4mL,3mL0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液，置于37℃水浴保温10min。

[0084] (1)取1支带塞试管，加入5mL1mg/mL酶液，保温10min后分别取1mL加入到第一组装有底物的锥形瓶中，并补加1mL磷酸缓冲液到每个锥形瓶中。准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。计算不加入莽草酸的情况下，不同底物添加量下酶促反应速率。

[0085] (2)取5支带塞试管，按照体积比为1：1的比例分别加入2mg/mL莽草酸溶液和1mg/mL酶液，保温10min后分别加入到第二组装有底物的锥形瓶中。准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。计算加入2mg/mL莽草酸后不同底物添加量下酶促反应速率。

[0086] (3)取5支带塞试管，按照体积比为1：1的比例分别加入4mg/mL莽草酸溶液和1mg/mL酶液，保温10min后分别加入到第三组装有底物的锥形瓶中。准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。计算加入4mg/mL莽草酸后不同底物添加量下酶促反应速率。

[0087] (4)取5支带塞试管按照体积比为1：1的比例分别加入6mg/mL莽草酸溶液和1mg/mL酶液，保温10min后分别加入到第四组装有底物的锥形瓶中。准确反应15min后，加入95％乙醇15mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。计算加入6mg/mL莽草酸后不同底物添加量下酶促反应速率。

[0088] 采用Lineweaver-Burk双倒数作图法作图，以1/V对1/[S]作图，可得不同斜率的直线。根据不同直线的相交情况，判断抑制类型。由图5可以看出，4条线相交于第三象限，属于混合型抑制类型。为了求取抑制常数Ki和Ki’，需要对Lineweaver-Burk图进行二次作图，如图6。对图6直线进行拟合，可得出方程：y＝0.8996x+3.8706，R＝0.99994和y＝8.2326x+26.9939，R＝0.99997，求得Ki＝4.30mg/mL，Ki’＝3.28mg/mL。