一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法 |
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| 申请号 | CN201710713149.8 | 申请日 | 2017-08-18 | 公开(公告)号 | CN107446128A | 公开(公告)日 | 2017-12-08 |
| 申请人 | 天津北洋百川生物技术有限公司; | 发明人 | 乔长晟; 桑娜; 孙雨; 李雪; 张卫; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及利用 超滤 技术对不同分子量的聚谷 氨 酸进行分级分离的方法，包括以下步骤，聚谷氨酸 发酵 液经除菌和脱色后，得到聚谷氨 酸溶液 ；调整聚谷氨酸溶液的浓度，用10kDa超滤膜进行超滤，操作压 力 为0.4-0.5MPa，加 水 洗脱次数为4-7次，将截留液A 冷冻干燥 ，得到γ-PGA-1；将透过液A稀释1-3倍，用5kDa超滤膜对透过液A进行超滤，操作压力为0.5-0.6MPa，加水洗脱次数为6-8次，将截留液B冷冻干燥，得到γ-PGA-2；将透过液冷冻干燥，得到γ-PGA-3。本发明利用超滤技术，通过控制超滤膜、超滤压力和洗脱次数对不同分子量的聚谷氨酸进行分级分离，避免了 有机 溶剂 的使用，提高提取效果。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法，其特征是，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法技术领域[0001] 本发明属于膜分离技术领域，具体涉及一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法。 背景技术[0002] γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid, γ-PGA）是一种生物高分子载体材料，以枯草芽孢杆菌通过发酵技术制备而成，其成品为一种白色无嗅味粉末状固体。随着科技的进步与工业的发展，随之而来的环境污染问题也日益增多，既要‘金山银山’又要‘绿水青山’已经是人们普遍的共识，因此各领域更倾向于发展和应用环境友好型材料。而γ-聚谷氨酸作为一种可生物降解的绿色高分子材料，越来越受到人们关注。因其有卓越的吸水特性，并且无论在人体内部，还是在外界环境中其最终的分解代谢产物均为谷氨酸，对人体无毒副作用，对环境不造成污染，因此γ-聚谷氨酸在许多领域都展现出优越性。它的分子链中有活性很强的-COOH基团，被发现有很多可利用的功能，如吸水性、保湿性及吸附重金属等，同时单体谷氨酸属于氨基酸，降解后不会造成任何污染，是环境友好型材料。聚谷氨酸由于含有较多的羧基和活性基团，故其具有较强的保水性和缓释性，这两方面的性质使其在农业上能够较好的发挥作用。研究表明，低分子的聚谷氨酸在农业应用上效果更为显著。 [0003] 膜分离技术是指包含不同粒径分子的混合样品在通过半透膜时，不同大小的粒径分子实现选择性的分离的技术，原理是通过压力、浓度、电位差等将要分离的液体进行选择性透过膜孔径，达到分离的目的，膜分离技术具有高效、无结构性变、低能耗及操作简单易于控制等优点，被广泛应用，如用于处理工业用水，食品、饮料用水净化、精制、纺织、制药、发酵等各个领域。 [0004] γ-聚谷氨酸由D-型谷氨酸单体和L-型谷氨酸单体缩合而成（单体之间以酰胺键连接），是一种线性分子。由于谷氨酸单体的聚合度不同，形成的γ-聚谷氨酸相对分子质量低至10万，高能达到200万，跨度非常大，其相对平均分子质量约为1.23×104。相对分子质量的大小与γ-聚谷氨酸的用途密切相关，相对分子质量特别小的（2万以下）最适合应用到农业中，而用在其他领域则效果不佳。而与之相反的是，用作污水处理方面的γ-聚谷氨酸要求相对分子质量特别大（150万以上)，否则絮凝杂质的效果会大打折扣。因此离开了相对分子质量讨论γ-聚谷氨酸的性质，几乎没有任何意义，所以如何有效分离不同相对分子质量γ-聚谷氨酸，控制其相对分子质量是目前需要解决的技术问题。 发明内容[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法。本发明利用超滤技术，通过控制不同的超滤膜以及不同的超滤压力和洗脱次数，完全采用去离子水对不同分子量的聚谷氨酸进行分级分离，避免了有机溶剂的使用，提高提取效果，节能降耗，利于工业化大生产的实现。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法，包括以下步骤： (1)聚谷氨酸发酵液经除菌和脱色后，得到聚谷氨酸溶液； (2)调整聚谷氨酸溶液的浓度为10-15 g/L，用10kDa超滤膜进行超滤，操作压力为0.4- 0.5MPa，加水洗脱次数为4-7次，能够将大分子聚谷氨酸和游离谷氨酸、色素等进行有效分离，分别保存截留液A和透过液A，将截留液A冷冻干燥，得到白色γ-PGA-1样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为1-2×103kDa； (3)将透过液A稀释1-3倍，继续用5kDa超滤膜对透过液A进行超滤，操作压力为0.5- 0.6MPa，加水洗脱次数为6-8次，能够对不同分子量级的聚谷氨酸和游离谷氨酸进行有效分离，分别保存截留液B和透过液B，将截留液B冷冻干燥，得到白色γ-PGA-2样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为100-120kDa；将透过液冷冻干燥，得到白色γ-PGA-3样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为30-40kDa。 [0007] 在进行超滤时，料液温度和操作压力均会对超滤膜的工作效率产生一定影响。随着压力的增加，一些大分子进入膜孔，加重膜的污染，膜通量降低。温度的升高可以使膜孔径增大，降低透过膜的阻力，但温度过高，会对膜有损坏。 [0008] 加水洗脱次数对聚谷氨酸纯度有较大影响，经多次加水洗脱才能够除去小分子杂质、糖和游离谷氨酸，经6次以上加水洗脱次数超滤后，洗出的色素、离子和总糖的检测指标变化不大，趋于稳定，说明超滤除杂已经完成。本实验目的在于最大限度分离提纯聚谷氨酸，除去小分子杂质、糖和游离谷氨酸，同时保证聚谷氨酸透过率。 [0009] 在不同分子量的聚谷氨酸分离分级的过程中，没有使用有机溶剂，利用膜分离法去除杂质，对聚谷氨酸进行截留，此方法具有成本低、工艺简单、分离效率高、节能、环保等特点，得到的产品纯度可达90%以上，且对产品的结构和功能特性的影响极小，有利于拓宽聚谷氨酸的应用范围，保证聚谷氨酸在化妆品、食品、农业应用等领域的安全和绿色使用。 [0010] 利用离子交换树脂等化学法脱色吸附色素和去除杂质，此方法适用于用量少，体系的粘度小且色素含量低的样品脱色，若样品粘度较大且色素含量较多，容易造成树脂污染，再生处理困难，且对聚谷氨酸的结构会有一定程度的破坏；超滤膜技术利用筛分原理，是指当样品流过膜表面时，由于压力的作用，溶液中粒径大于膜孔径的物质就会被截留，颗粒大小小于膜孔径时则会透过膜组件，从而达到分离的效果，透过去的液体是透过液，被截留的成为浓缩液。 [0011] 作为优选的技术方案：优选的，所述的聚谷氨酸溶液、透过液A进行超滤时的溶液温度为20-30℃。 [0012] 优选的，所述截留液A、截留液B和透过液B进行冷冻干燥时，所用的冷冻干燥时间均为18h。 [0013] 优选的，所述聚谷氨酸发酵液为对编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌发酵培养，得到的发酵液。 [0014] 优选的，所述聚谷氨酸发酵液的除菌方法为：(1)除菌体 将发酵液pH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入发酵液体积2％-3％的硅藻土，上述 2％-3％是指质量体积百分比；然后用800目滤布，板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速30～ 50mL/min； 优选的，所述聚谷氨酸发酵液的脱色方法为：加入1％～2％活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90～120min，抽滤，至液体基本澄清无色；按照上述脱色条件再进行一次脱色，得到澄清杂质较少的聚谷氨酸溶液。 [0015] 优选的，所述加水洗脱时采用水的为去离子水。 [0018] 三、发酵培养：将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，发酵罐为10L，装液量为60%，当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min。下罐γ-PGA产量为30g/L～45g/L。 [0019] 聚谷氨酸发酵液的制备中所采用的培养基配制：（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂 20，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0020] (2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O 0.5，MgSO4·6H2O 0.5，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0021] （3）发酵培养基：葡萄糖 80、味精 80、酵母膏20、NH4NO3 4.1、NaCl 10、MgSO4·6H2O 0.5、CaCl2·6H2O 1.0、FeCl3·6H2O 0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭菌 20min。 [0022] 流加培养基成分：葡萄糖900、NH4NO3 60、CaCl2·6H2O 20、FeCl3·7H2O 0.15，上述组分单位为g/L，PH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0023] 有益效果：本发明提供了一种利用膜分离技术采用去离子水对不同分子量的γ-聚谷氨酸进行有效分离，避免了有机溶剂的使用，提高提取效果，节能降耗，利于工业化大生产的实现。 具体实施方式[0024] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 [0025] 实施例1一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法，包括如下步骤： （1）聚谷氨酸发酵液经除菌和脱色后，得到聚谷氨酸溶液；聚谷氨酸发酵液的制备方法为： ①菌种活化： 将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。 [0026] ②种子培养：将活化后的斜面种子接入一环装有50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，37℃， 220rpm，培养16个小时到对数生长期。 [0027] ③发酵培养：将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，发酵罐为10L，装液量为60%，当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min。下罐γ-PGA产量为40g/L。 [0028] 聚谷氨酸发酵液的制备中所采用的培养基配制：斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂 20，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0029] 种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O 0.5，MgSO4·6H2O 0.5，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0030] 发酵培养基：葡萄糖 80、味精 80、酵母膏20、NH4NO3 4.1、NaCl 10、MgSO4·6H2O 0.5、CaCl2·6H2O 1.0、FeCl3·6H2O 0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭菌 20min。 [0031] 流加培养基成分：葡萄糖900、NH4NO3 60、CaCl2·6H2O 20、FeCl3·7H2O 0.15，上述组分单位为g/L，PH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0032] 聚谷氨酸发酵液的除菌方法为：将发酵液pH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入发酵液体积质量体积百分比2％的硅藻土，上述2％-3％是指；然后用800目滤布，板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速30mL/min； 聚谷氨酸发酵液的脱色方法为： 加入1％活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90min，抽滤，至液体基本澄清无色；然后将脱色液稀释2～3倍后过纳滤膜，制得聚谷氨酸溶液。 [0033] （2）调整聚谷氨酸溶液的浓度为10g/L，用10kDa超滤膜进行超滤，聚谷氨酸溶液的温度为25℃，操作压力为0.4MPa，加水洗脱次数为4次，分别保存截留液A和透过液A，将截留液A冷冻干燥18h，得到白色γ-PGA-1样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为1×103kDa；（3）将透过液A稀释1倍，继续用5kDa超滤膜对透过液A进行超滤，透过液A的温度为20℃操作压力为0.5MPa，加水洗脱次数为6次，分别保存截留液B和透过液B，将截留液B冷冻干燥 18h，得到白色γ-PGA-2样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为100kDa；将透过液冷冻干燥 18h，得到白色γ-PGA-3样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为30kDa。 [0034] 实施例2一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法，包括如下步骤： （1）聚谷氨酸发酵液经除菌和脱色后，得到聚谷氨酸溶液；聚谷氨酸发酵液的制备方法为： ①菌种活化： 将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。 [0035] ②种子培养：将活化后的斜面种子接入一环装有50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，37℃， 220rpm，培养16个小时到对数生长期。 [0036] ③发酵培养：将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，发酵罐为10L，装液量为60%，当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min。下罐γ-PGA产量为35g/L。 [0037] 聚谷氨酸发酵液的制备中所采用的培养基配制：斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂 20，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0038] 种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O 0.5，MgSO4·6H2O 0.5，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0039] 发酵培养基：葡萄糖 80、味精 80、酵母膏20、NH4NO3 4.1、NaCl 10、MgSO4·6H2O 0.5、CaCl2·6H2O 1.0、FeCl3·6H2O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭菌 20min。 [0040] 流加培养基成分：葡萄糖900、NH4NO3 60、CaCl2·6H2O 20、FeCl3·7H2O 0.15，上述组分单位为g/L，PH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0041] 聚谷氨酸发酵液的除菌方法为：将发酵液pH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入质量体积百分比为发酵液体积3％的硅藻土；然后用800目滤布，板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速50mL/min； 聚谷氨酸发酵液的脱色方法为： 加入2％活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色120min，抽滤，至液体基本澄清无色；然后将脱色液稀释3倍后过纳滤膜，制得聚谷氨酸溶液。 [0042] （2）调整聚谷氨酸溶液的浓度为12 g/L，用10kDa超滤膜进行超滤，聚谷氨酸溶液的温度为30℃，操作压力为0.5MPa，加水洗脱次数为6次，分别保存截留液A和透过液A，将截留液A冷冻干燥18h，得到白色γ-PGA-1样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为1-2×103kDa； （3）将透过液A稀释2倍，继续用5kDa超滤膜对透过液A进行超滤，透过液A的为30℃，操作压力为0.6MPa，加水洗脱次数为8次，分别保存截留液B和透过液B，将截留液B冷冻干燥 18h，得到白色γ-PGA-2样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为120kDa；将透过液冷冻干燥 18h，得到白色γ-PGA-3样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为35kDa。 [0043] 实施例3一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法，包括如下步骤： （1）聚谷氨酸发酵液经除菌和脱色后，得到聚谷氨酸溶液；聚谷氨酸发酵液的制备方法为： ①菌种活化： 将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。 [0044] ②种子培养：将活化后的斜面种子接入一环装有50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，37℃， 220rpm，培养16个小时到对数生长期。 [0045] ③发酵培养：将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，发酵罐为10L，装液量为60%，当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min。下罐γ-PGA产量为38g/L。 [0046] 聚谷氨酸发酵液的制备中所采用的培养基配制：斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂 20，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0047] 种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O 0.5，MgSO4·6H2O 0.5，上述组分单位为g/L，pH7.0±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0048] 发酵培养基：葡萄糖 80、味精 80、酵母膏20、NH4NO3 4.1、NaCl 10、MgSO4·6H2O 0.5、CaCl2·6H2O 1.0、FeCl3·6H2O0.01，上述组分单位为g/L，PH7.0。121℃高压蒸汽灭菌 20min。 [0049] 流加培养基成分：葡萄糖900、NH4NO3 60、CaCl2·6H2O 20、FeCl3·7H2O 0.15，上述组分单位为g/L，PH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。 [0050] 聚谷氨酸发酵液的除菌方法为：将发酵液pH调至3.0，粘度降低至原来的1/6，加入发酵液体积2.5％的硅藻土，上述 2％-3％是指质量体积百分比；然后用800目滤布，板框过滤除菌体，0.22MPa压力，流速30～ 50mL/min； 聚谷氨酸发酵液的脱色方法为： 加入1％～2％活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色100min，抽滤，至液体基本澄清无色；然后将脱色液稀释2.5倍后过纳滤膜，制得聚谷氨酸溶液。 [0051] （2）调整聚谷氨酸溶液的浓度为15 g/L，用10kDa超滤膜进行超滤，聚谷氨酸溶液的温度为25℃，操作压力为0.45MPa，加水洗脱次数为5次，分别保存截留液A和透过液A，将截留液A冷冻干燥18h，得到白色γ-PGA-1样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为1.3×103kDa； （3）将透过液A稀释3倍，继续用5kDa超滤膜对透过液A进行超滤，透过液A的温度为30℃，操作压力为0.55MPa，加水洗脱次数为7次，分别保存截留液B和透过液B，将截留液B冷冻干燥18h，得到白色γ-PGA-2样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为110kDa；将透过液冷冻干燥18h，得到白色γ-PGA-3样品，其对应的聚谷氨酸平均分子量为40kDa。 |
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