Microscopic system

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、顕微鏡システムに関するものである。 さらに詳しくは、この出願の発明は、染色された試料を複数の波長の光により照明することで、高い空間分解能の高画質画像を得ることができる、高性能、且つ高機能な、新しい顕微鏡システムに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、光学顕微鏡は、様々なタイプのものが開発されており、近年のレーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩にともない、その高機能化が盛んに行われている。 このような高機能光学顕微鏡の一つとして、複数波長の光で試料を照明することによって発する二重共鳴吸収過程を用い、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にする顕微鏡が提案されている（特願平６−３２９１６
５）。

【０００３】この光学顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測することができる。 まず、図１に例示した基底状態の分子がもつ価電子軌道２の電子を、図２に例示したように光照射により空軌道である価電子軌道３
に励起させる。 この状態が第一励起状態である。 次に、
図３に例示したように、別な波長の光を照射することにより価電子軌道１の電子を、価電子軌道２に生成された空孔に励起させる。 この状態が第二励起状態である。 分子は、この第二励起状態から、図４に例示したように蛍光あるいは燐光を発光したりして基底状態に戻る。 そして、図２の吸収過程や図４の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。

【０００４】最初にレーザ光などにより共鳴波長λ１の光で試料を構成する分子を第一励起状態に励起させる際、単位体積内における第一励起状態の分子数は、照射する光の強度が増加するにしたがって増加する。 線吸収係数は、分子一個あたりの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図３のような励起過程においては続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は最初に照射したλ１の光の強度に依存する。

【０００５】すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は波長λ１の光の強度で制御できる。 このことは、波長λ
１および波長λ２の二波長の光で試料を照射し、波長λ
２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光量で完全に制御できることを示している。
また、図３の第二励起状態よりの蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度は第一励起状態にある分子数に比例する。 従って、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。

【０００６】また、この従来の光学顕微鏡は、コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。 図１における最外殻価電子軌道は各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なる。 同時に波長λ２も分子固有のものとなる。 よって、波長λ
１および波長λ２の二波長により吸収あるいは発光する分子を限定することができるので、正確な試料の化学組成の同定が可能となる。

【０００７】さらには、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定も行うことができる。 最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能を持つ蛍光顕微鏡も提案されている（特願平８−３０２２３
２）。

【０００８】図５は、分子における二重共鳴吸収過程を例示した概念図であり、基底状態の分子が、波長λ１の光で第一励起状態に励起され、さらにλ２の光で第二励起状態に励起されており、この第二励起状態からの蛍光が、ある種の分子では極めて弱いことを示している。 このような光学的性質を持つ分子では、極めて興味深い現象が起きる。 図６は、横軸にＸ軸を設けて二重共鳴吸収過程における空間的距離の広がりを例示したものである。 この図６においては、波長λ２の光が照射された空間領域Ａ１と、波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ
０とが示されており、この空間領域Ａ０ではλ１光励起により第一励起状態の分子が多数生成される。 このとき、空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。 しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため第一励起状態のほとんどの分子が即座に高位の第二励起状態に励起され、第一励起状態の分子は存在しなくなる。 このため、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかも、第二励起状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制されることとなる。 従って、蛍光があるのは空間領域Ａ０のみであることがわかる。

【０００９】この結果は、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持つ。 すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡などでは、レーザ光を集光し、マイクロビームを形成して観察試料上を走査する。 この時、マイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界で決まり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。 しかし、図６によれば、λ２の照射で蛍光領域が抑制されているので、λ１とλ２の二種類の波長を空間的に上手に重ね合わせることで、たとえばλ１の照射領域に着目すると、蛍光領域は集光レンズの開口数と波長とで決まるサイズよりも狭くなっており、
実質的に空間分解能の向上が図られている。 したがって、この原理を用いれば、回折限界を超える蛍光顕微鏡が可能となる。 これが二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡である。

【００１０】さらに、この顕微鏡の超解像性をさらに高めるために、新たな提案もされている（特願平９−２５
５４４４）。 すなわち、少なくとも基底状態を含め３つの量子状態を有し、且つ第一励起状態を除く高位の励起状態から基底状態へ脱励起するときの遷移において蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程の方が支配的である各種分子を蛍光ラベラー分子として用い、この蛍光ラベラー分子と生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学結合させてなる試料に波長λ１の光を照射して、蛍光ラベラー分子を第一励起状態に励起させ、続いて即座に波長λ２の光により高位な量子準位に励起させることで、
第二励起状態からの蛍光を抑制して、空間的な蛍光領域の人為的な抑制を行い、空間分解能の向上を図る。

【００１１】このような分子の光学的な性質は量子化学的な立場から以下のように説明することができる。 一般に、分子は、それを構成する各原子がσまたはπ結合によって結ばれている。 言い換えると、量子化学によれば、分子の分子軌道はσ分子軌道またはπ分子軌道を持っていて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担っている。 そのうちでも、σ分子軌道の電子は、各原子を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を決める。 それに対して、π分子軌道の電子は、各原子の結合にほとんど寄与しないで、
むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛される。

【００１２】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解離を含む大きな構造変化が起きる。 その結果として、原子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に与えたエネルギーのほとんどが、熱エネルギーに形を変える。 したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態で消費されない。 また、分子の構造変化は極めて高速に、たとえばピコ秒より短い、起こるので、その過程で仮に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。 しかし、それに対し、π分子軌道の電子が励起しても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒オーダーで蛍光を放出して脱励起する性質を持つ。

【００１３】量子化学によれば、分子がπ分子軌道を持つことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選定することが必要条件となる。 そして、二重結合を持つ分子でもベンゼンやピラジンなどの６員環分子においては、第二励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられている（たとえば、M.Fujii et.a. Chem.Phys.Let
t. 171(1990)341）。 したがって、ベンゼンやピラジンなどの６員環を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれば、第一励起状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起により第一励起状態から第二励起状態に励起させることで分子から蛍光を容易に抑制できるので、顕微鏡の超解像性を効果的に利用することができる。

【００１４】すなわち、これら蛍光ラベラー分子により試料を染色して観察を行えば、高空間分解能で試料の蛍光像を観察することができるだけでなく、その蛍光ラベラー分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料の特定の化学基のみを選択的に染色でき、よって、詳細な試料の化学組成までも分析可能となる。 一般に、二重共鳴吸収過程は、二つの光波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起こるので、これを用いることで非常に詳細な分子の構造を知ることができる。 すなわち、光の偏光面と分子の配向方向とは強い相関関係があり、二つの波長の光のそれぞれの偏光面と分子の配向方向とが特定の角度を成すときに、二重共鳴吸収過程が強く起こる。 したがって、二つの波長の光を試料面に同時照射して、それぞれの偏光面を回転させることにより、
蛍光の消失の程度が変化するようになるので、その様子から観測しようとする組織の空間配向の情報も得られる。 さらに、二つの波長の光を調整させることでもこのことが可能である。

【００１５】以上説明したように、二重共鳴吸収過程を用いた従来の光学顕微鏡では、超解像性とともに、高い分析能力も有していることがわかる。 また、この二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡において、蛍光抑制をより効果的に起こすことができる蛍光ラベラー分子や適正な光の照射タイミングについても提案されている。

【００１６】図７は、波長λ１と波長λ２の二種類の光を試料に照射するタイミングを例示したものである。 この図７に例示したように、蛍光ラベラー分子が蛍光を発する時間、すなわち第一励起状態の寿命τより短いパルス光を用い、まず時間ｔだけ波長λ１の光を照射し、引き続き波長λ２の光を照射している。 定性的に述べると、まず、蛍光ラベラー分子の第一励起状態の寿命より十分短い波長λ１のパルス光を時間ｔの間照射し、観察領域に第一励起状態の分子を生成させる。 その直後に、
観察に必要としない領域に同じく第一励起状態の寿命より十分短い波長λ２のパルス光を照射し、第一励起状態にある分子を第二励起状態に励起させて、蛍光を抑制する。

【００１７】この過程は、さらに以下のように定量的に説明できる。 一般に、基底状態の分子を波長λ１の光で第一励起状態に励起する場合、その励起過程は下記のレート方程式により記述できる。 すなわち、試料に染色した分子の単位体積当たりの分子数をＮ ₀とし、波長λ１
の光のフォトンフラックスをＩ ₀ 、波長λ１の光照射より時間ｔ後の基底状態の分子数をＮとする。 そして、第一励起状態の寿命をτとし、波長λ１の光により基底状態から第一励起状態に遷移する時の吸収断面積をσ ₀₁とすると、レート方程式は次式のようになる。

【００１８】

【数１】

【００１９】この式を具体的に解けば、光照射より時間ｔ後の単位体積当たりの第一励起状態の分子数ｎを求めることができる。 つまり、

【００２０】

【数２】

【００２１】となる。 この数２によれば、下記の数３の条件を満たすように強くない光量で波長λ１の光を照射することにより、数２は数４とすることができる。

【００２２】

【数３】

【００２３】

【数４】

【００２４】すなわち、数３によれば、波長λ１の光の照射時間を分子の第一励起状態の寿命より短くし、しかも、波長λ１の光のフォトンフラックスが小さいときは、ｎは照射時間ｔにほぼ比例する。 次に、波長λ１の光の照射が終了し、その直後に波長λ２の光を時間Ｔ照射したときの第一励起状態にある分子を第二励起状態に励起する場合を考える。

【００２５】波長λ２の光のフォトンフラックスをＩ ₁ 、波長λ１の光照射より時間Ｔ＋ｔ後の第一励起状態の分子数をｎとし、そして、波長λ２の光により第一励起状態から第二励起状態に遷移するときの吸収断面積をσ ₁₂とすると、ｎに関するレート方程式は、次式のようになる。

【００２６】

【数５】

【００２７】この式を解くことで、波長λ１の光を時間ｔだけ照射し、波長λ１の光の照射を止め、その直後に波長λ２の光を時間Ｔの間照射した場合の、ｎは、次式のよに具体的に求められる。

【００２８】

【数６】

【００２９】一方、この数６によれば、波長λ２の光の照射を全く行わない場合は、Ｉ ₁ ＝０とおいて、

【００３０】

【数７】

【００３１】となる。 実は、数６は、蛍光を抑制された領域における単位体積あたりの第一励起状態の分子を数を示し、数７は、蛍光を抑制されない領域における単位体積当たりの第一励起状態の分子数を示している。 分子の蛍光収率をΦとすると、蛍光を抑制され領域からの蛍光強度Ｆ１と、蛍光を抑制されない領域からの蛍光強度Ｆ２とは、それぞれ、以下の数８および数９で与えられる。

【００３２】

【数８】

【００３３】

【数９】

【００３４】蛍光抑制比率（＝Ｆ１／Ｆ２）は、数８および数９より求めると、数１０となる。

【００３５】

【数１０】

【００３６】したがって、図７に例示したタイミングでλ１とλ２の二種類の光を照射すれば、数１０の比率で観察に必要としない領域からの蛍光を抑制できる。 数１
０によれば、Ｔ＜τの条件でＩ ₁とＴを調整することにより、任意の比率で蛍光を抑制できる。 図８は、観察領域から発光する蛍光の強度を測定するタイミングを例示したものである。 蛍光強度を測定するタイミングは、基本的には、波長λ２の光の照射が終了した後に、観察領域から発光する蛍光の強度を十分に時間をかけて測定することになる。 このような測定タイミングによって、抑制された領域からの蛍光がほとんどない状態で、非常にＳ／Ｎ良く観察領域からの蛍光を計測できる。

【００３７】図９および図１０は、それぞれ、波長λ１
と波長λ２の二種類の光の試料への照射タイミングと観察領域からの蛍光強度の測定タイミングとの一例を示したものである。 これら図９および図１０に例示した各タイミングによっても、効果的に超解像顕微鏡を実現することができる。 しかし、これら図８〜図１０のタイミングのいずれの場合も、ｔおよびＴはτより短い（ｔ，Ｔ
＜τ）必要がある。 それは、逆にｔ，Ｔ＞τであると、
λ１とλ２の二種類の光を照射中に第一励起状態の分子が基底状態に脱励起してしまい、観察領域からの蛍光自体が無くなってしまうためである。 仮に、ｔ，Ｔ＜τの場合に対応するために、図１１に例示したように、λ１
とλ２の二種類の光を同時に照射して、同時に観察領域から発光する蛍光の強度を測定することも可能であるが、その場合には、蛍光測定時にλ１とλ２の二種類の強い励起光が検出器に混入してしまう可能性がある。

【００３８】したがって、ｔ，Ｔ＜τの条件のもとで、
図８〜図１０に例示したようなタイミングでλ１とλ２
の二種類の光を試料に照射するのが望ましいとされている。 また、多少、Ｓ／Ｎは劣化するが、λ１光とλ２光を全く同じタイミングで照射することもできる。 また、
上述のような条件およびタイミングでλ１とλ２の二種類の光を試料に照射する場合では、照射終了直後から、
観察領域より発光する蛍光を検出器で計測する必要があり、その際には、汎用市販のロジック回路によりゲート信号を作成し、検出器からの出力電気信号をパーソナルコンピュータのメモリに取り込む作業がある。 基本的には、図７〜図１０のタイムチャートに示したように、染色する分子の蛍光寿命が光源のパルス幅より長いことで効果が大きくなる。 しかし、現在の汎用市販のロジック回路では、そのスイッチング速度が１ｎｓｅｃ程度であるために、τ自体が１ｎｓｅｃ以上であることが望まれる。 すなわち、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ以上でないと、検出器および計測回路がアクティブになる前に、観察領域からの蛍光現象が終了して、計測することができなくなってしまう。 このように、試料を染色する蛍光ラベラー分子は１ｎｓｅｃ以上の蛍光寿命を持つことが必要となる。

【００３９】一方、信号を取り出す有効蛍光領域に着目すると、確かに蛍光抑制領域では蛍光強度が弱い方が望ましいが、Ｓ／Ｎ比の向上という観点からは、有効蛍光領域の発光強度が強い方が望まれている。 すなわち、λ
１の光で励起された直後の第一励起状態の分子数が十分にある時刻からの蛍光強度を測定する。 上記の数９によれば、励起分子の数は、その励起寿命で決まる時定数により指数関数的に減衰する。 ところで、指数関数の性質として、光のパルス幅ｔおよびＴが第一励起状態の分子寿命τよりも十分に短ければ、λ１の光で励起された直後の第一励起状態の分子から十分強い強度の蛍光、すなわち有効信号強度を測定できる。 特に、ｔおよびＴが第一励起状態の分子寿命τの１０分の１程度であれば、第一励起状態の分子数はλ１の光で励起された直後の分子数の９０％もあり、有効蛍光領域からの十分な信号強度が得られる。

【００４０】

【発明が解決しようとする課題】上述した通りの従来の光学顕微鏡は、その超解像性と分析能力において、際立った有用性と技術的優位性を有している。 しかしながら、これら従来の光学顕微鏡では、第一励起状態から第二励起状態へ励起させて、第一励起状態からの蛍光を抑制するための十分な強度を有する波長λ２光（以下、この光をイレース光と呼び、また、基底状態から第一励起状態へ励起させる波長λ１の光をポンプ光と呼ぶこととする）が必要であり、このイレース光は、現在実用化されている非共鳴二光子吸収過程を用いたレーザ走査型の蛍光顕微鏡における数ＴＷ／ｃｍ ²という高強度レーザ光よりも僅かに少ない強度ではあるものの、非常に強力なものであるため、生体試料への影響が問題となっていた。

【００４１】このような高強度レーザは、試料の生体細胞にとっては強すぎる光であり、特に、長時間の測定を要する場合には、サンプルの蓄熱や多光子吸収等の影響が著しく、このような影響を極力低減する必要がある。
また、ポンプ光およびイレース光の波長が、生体細胞のもつ吸収波長帯域から外れていることも必要である。

【００４２】さらにまた、理論予測通りの解像度を実現するためには、試料面上に集光したイレース光のビームが、中央部がゼロである強度分布を有し、且つ軸対称である形状を有するビームである必要がある（このようなビームを、以下、中空ビームと呼ぶこととする）。 これは、強度分布の乱れがそのまま顕微鏡の解像度の劣化につながるためである。

【００４３】イレース光の光源としてはレーザーを用いる場合が多いが、上記のような理論通りの形状のビームとするには、その大前提として、レーザーのビームプロファイルが良くなくてはならない。 すなわち、ビームの強度分布が光軸軸対称であることが望ましい。 たとえば、従来より光源として用いられる色素レーザーは、そのビーム形状が三角形に近く、その強度分布も一様でない。 したがって、試料面で集光したビーム形状が、期待する中空ビームではなく、崩れたビームパターンとなるため、顕微鏡画像の解像度の劣化や画質低下が生じてしまう。 加えて、微小な輪帯アパーチャーを設け、その縮小像を中空ビームとして用いることも提案されてはいるが、このような輪帯アパーチャーを利用すると、光軸合わせや、焦点合わせ等が難しく、良好な画像を得るまでの調整時間が非常に長くなり、且つそのための熟達技能も必要となる。

【００４４】したがって、超解像顕微鏡の機能を十分に引出すためには、これらの問題点を解決する光学技術が必要とされている。 また、実用面から考えると、操作性のよさも重要な要素である。 従来の顕微鏡技術は、色素レーザーやオプティカルパラメトリックオシレータ（Ｏ
ＰＯ）によって、蛍光ラベラー分子のポンプ光やイレース光の共鳴波長に光源の光を同調させることで、多くの蛍光ラベラー分子に対して適用可能である。

【００４５】しかしながら、色素レーザーにおいては色素の劣化による光量の低下、および頻繁で煩雑な色素交換が伴うといった問題がある。 ＯＰＯは、便利ではあるが、非常に高価である。 さらに、非常に精密な光学システムであり、湿度や温度の管理が厳しく、しかも使用する非線形光学結晶の寿命が短く、そして、これは高価であるので、ユーザにとっては保守管理の負担の大きい光源である。

【００４６】したがって、使用する光源は、波長固定であって、その構成が簡単で廉価であることが好ましい。
ところで、近年では、顕微鏡観察下においてレーザ光を用いることにより微小粒子を捕獲および移動することのできるマイクロマニュピュレータ技術が開発されており、超解像顕微鏡にもその機能を付加し、操作性と機能性の高い顕微鏡システムの実現が強く望まれている。

【００４７】このマイクロマニュピュレータ技術は、たとえばポリエチレン粒子の誘電体粒子に高強度のレーザー光を集光させることにより、分極を生じさせて、その粒子を電場が一番強い領域に引きつけることにより、捕獲および移動を行うものである。 また、この技術においては、限られた特定の粒子を安定的に捕獲し、できるだけ色々な方向からレーザー光を粒子に当てることが良いことが知られている。

【００４８】しかしながら、様々な方向からのレーザー光照射のためには、多数のレーザー光源や複雑なミラー光学系が必要となるので、一空間に捕獲することは可能であっても、移動操作が極めて困難なものとなっていた。 また、１００ＭＷ／ｃｍ ²以上の強いレーザー集光ビームを一方向から照射することにより、特定粒子を一空間にトラップさせ、ビーム走査により空間移動させることは可能であるものの、試料が高強度のレーザー光を浴び続けることになるので、試料へのダメージが深刻なものとなっていた。 その結果として、生体細胞が感光死したり、分子自身の解離または光化学反応による化学変化が引き起こされるといった問題があった。

【００４９】この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態へ励起させるイレース光を、簡単でコンパクトな光学系を用いて、優れたビームプロファイルで集光させることができ、安定性および操作性が高く、優れた超解像性を有する、新しい顕微鏡システムを提供することを目的としている。 また、試料へダメージを与えることなく、中空ビームであるイレース光を用いて試料粒子の捕獲および移動を行うことのできる、マイクロマニュピュレータ機能を有する、新しい顕微鏡システムも提供する。

【００５０】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、調整された試料と顕微鏡本体とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有し、その第一電子励起状態から第二電子励起状態への励起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域と重複している分子により染色されたものであり、顕微鏡本体は、分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光の光源と、波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光させる集光光学系と、調整された試料上における波長λ１光の照射領域および波長λ２光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段と、励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出する発光検出器とを備え、重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射することにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱励起する際の発光の領域を抑制するものであることを特徴とする光学顕微鏡システム（請求項１）、調整された試料と顕微鏡本体とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有する分子により染色されたものであり、顕微鏡本体は、分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光の光源と、波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光させる集光光学系と、調整された試料上における波長λ１光の照射領域および波長λ２光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段と、励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出する発光検出器とを備え、重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射することにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱励起する際の発光の領域を抑制するものであり、波長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれた位相分布を有していることを特徴とする顕微鏡システム（請求項２）、および調整された試料と顕微鏡本体とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有し、その第一電子励起状態から第二電子励起状態への励起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域に重複している分子により染色されたものであり、顕微鏡本体は、分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光の光源と、波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光させる集光光学系と、調整された試料上における波長λ１光の照射領域および波長λ２光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段と、励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出する発光検出器とを備え、重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射することにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱励起する際の発光の領域を抑制するものであり、波長λ２
光を集光して得られるビームが、その光軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれる位相分布を有していることを特徴とする顕微鏡システム（請求項３）を提供する。

【００５１】また、この出願の発明は、上記の顕微鏡システムにおいて、第一電子励起状態から第二電子励起状態への励起波長帯域と基底状態から第一電子励起状態への励起波長帯域とが異なること（請求項４）、分子が、
六員環を一つまたは複数含む分子であること（請求項５）、六員環が、ベンゼン環またはプリン塩基であること（請求項６）、分子が、六員環誘導体を一つまたは複数含む分子であること（請求項７）、六員環誘導体が、
ベンゼン誘導体またはプリン誘導体であること（請求項８）、分子が、キサンチン系分子、ローダミン系分子、
オキサンジン系分子、シアニン系分子、クマリン系分子、オキサーゾール系分子、オキサジアゾール系分子、
スチルペン系分子のいずれかであること（請求項９）、
分子が、2,2''-Dimethyl-p-terphenyl: P-terphenyl(PT
P): 3,3',2'',3'''-Tetramethyl-P-quaterphenyl: 2,
2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl: 2-Methyl-5-t-butyl-p
-quaterphenyl: 2-(4-Biphenylyl)-5-(4-t-butylpheny
l)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365): 2-(4-Biphenylyl)-pheny
l-1,3,4-oxadiazol: 2,5,2'''',5''''-Tetramethyl-pq
uinquephenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-t-butyl-p-quin
quephenyl: 2,5-Diphenyloxazol: 2,5-Diphenylfuran:
PQP(p-Quanterphenyl): 2,5-Bis-(4-biphenylyl)-1,3,
4-oxadiazol: p-Quaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid
Disodiumsalt: p-Quaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid
Dipotassiumsalt: 4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-pq
uanterphenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-butyl-p-sexiph
enyl: 2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol: 2-(4-Biphenyl
yl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassium S
alt: 2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3: 4,4'
-Diphenylstilbene: [1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic aci
d,4,4''-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt: 2,5-
Bis-(4-biphenylyl)-oxazol: 2,2'-([1,1'-Biphenyl]-
4,4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic ac
id Disodium Salt: 7-Amino-4-methylcarbostyryl: 1,4
-Di[2-(5-phenyloxazoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methyl
coumarin: p-Bis(o-methylstyryl)-benzene: Benzofura
n,2,2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic
-acid: 7-Dimethylamino-4-methylquinolom-2: 7-Amino
-4-methylcoumarin: 2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyrid
ylmethyl Iodide: 7-Diethylaminocoumarun: 7-Diethyl
amino-4-methylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8
-methylqinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Diethyla
mino-4-trifluormethylcoumarin: 7-Dimethylamino-4-t
rifluormethylcoumarin: 7-Amino-4-trifluormethylcou
marin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1
-gh]-coumarin: 7-Ethylamino-6-methyl-4-trifluormet
hylcoumarin: 7-Ethylamino-4-trifluormethylcoumari
n: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-carboethoxyquinolizi
no-[9,9a,1-gh]coumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9
-(3-pyridyl)-quinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin: 3-
(2'-N-Methylbenzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoum
arin: 2,3,5,6,-1H,4H-Tetrahydro-9-acetylquinolizin
o-[9,9a,1-gh]coumarin: N-Metyl-4-trifluormethylpip
eridino-[3,2-g]-coumarin: 2-(p-Dimethylaminostyry
l)-benzothiazolylethyl Iodide: 3-(2'-Benzimidazoly
l)-7-N,N-diethylaminocoumarin: Brillantsulfaflavi
n: 3-(2'-Benzothiazolyl)-7-diethytaminocoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-trifluormethylquinolizi
no-[9,9a,1-gh]coumarin: 3,3'-Diethyloxacarbocyanin
e Iodide: 3,3'-Dimethyl-9-ethylthiacarbocyanine Io
dide: Disodium Fluorescein(Uranin): 9-(o-Carboxyp
henyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on2,7-D
ichlorofluorescien・Fluorescein 548: Fluorol 555(F
luorol 7GA): o-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)-b
enzonic acid(Rhodamine 560): Benzoic Acid,2-[6-(et
hylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3H-xanthen9-
yl],perchlorate(Rhodamine 575): Benzonic Acid,2-[6
-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3X-xanth
en-9-yl],ethyl ester,monohydrochloride(Rhodamine 5
90): 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxacarbocyanine Iod
ide: 1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine Iodid: 2-[6-(D
iethylamino)-3-(ethylamino)-3H-xanthen-9-yl]benzon
ic acid(Rhodamine 610):Ethanaminium,N-[(6-diethyla
mino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xanthen-3-ylidene]-
N-ethylhydroxid,inner salt,sodium salt: Malachit G
reen: 3,3'-Diethylthiacarbocyanine Iodide: 1,3'-Di
ethyl-4,2'-quinolythiacarbocyanine Iodide: 8-(2-Ca
rboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,1
0H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]xanthyl
ium Perchlorate(Rhodamine 640): 4-Dicyanmethylene-
2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran: 3,3'-
Diethyloxadicarbocyanine Iodide: 8-(2,4-Disulfophe
nyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-d
iquinolizino[9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthene(Sulforhoda
mine 640): 5,9-Diaminobenzo[a]phenoxazonium Percro
rate: 9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazin-5-one:
5-Amino-9-diethylimino[a]phenoxazonium Perchlorat
e: 3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethylphenoxazi
n-5-ium Perchorate: 8-(Trifluoromethyl)-2,3,5,6,1
1,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino
[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xantbylium Perchlorate: 1-Et
hyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-p
yridinium Perchlorate: Carbazine 122: 9-Ethylamino
-5-ethylimino-10-methyl-5H-benzo(a)phenoxazonium P
erchlorate: 3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxazo
nium Perchlorate: 3-Diethylthiadicarbocyanine Iodi
de: Oxazine 750: 1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophen
yl)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate: 1,1',
3,3,3',3'-Hexamethylindodicarcyanine Iodide: 1,1'-
Diethyl-4,4'-carbocyanine Iodide: 2-(4-(p-Dimethyl
aminophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-in
dolium Perchlorate: 2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-
1,3-butadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorat
e: 1,1'-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide: 1-Ethy
l-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chi
nolinozinium))-1,3-butadienyl)-pyridinium Perchlor
ate: 3,3'-Dimethyloxatricarbocyanine Iodide: 1-Eth
yl-4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-qu
inolinium Perchlorate: 8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15
-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a1-bc:9
a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rhodamine 800): 2-
(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)
-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: 1,1',3,3,3',
3'-Hexamethylindotricarbocyanine Iodide: IR125: 3,
3'-Diethylthiatricarbocyanine Iodide: IR144: 2-(6-
(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizin
ium))-2,4-neopentylene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyl
lbenzothiazolium Perchlorate: 3,3'-Diethyl-9,11-ne
opentylenethiatricarbocyanine Iodide: 1,1',3,3,3'
3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarboc
yanine Iodide:3,3'-Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatr
icarbocyamine Iodide: 1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocya
nine Iodide: IR140: 2-(8-(4-p-Dimethylaminophenyl)
-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylb
enzothiazolium Perchlorate: IR132: 2-(8-(9-(2,3,6,
7-Tetrahydro-1H,5H,benzo(i,j)chinolizinium))-2,4-n
eopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzoth
iazolium Perchlorate: IR26: IR5 のいずれかであること（請求項１０）、波長λ１光を集光して得られるビームの光軸と波長λ２光を集光して得られるビームの光軸とが同軸であること（請求項１１）、波長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直交する面内において、光軸の周りを１回転したときに０から２πまで連続的に変化する位相分布を有していること（請求項１
２）、波長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直交する面内において、該光軸の周りを１回転したときに０から２πまで不連続的に変化する位相分布を有していること（請求項１３）、波長λ２光を集光して得られるビームがベッセルビームであること（請求項１
４）、ベッセルビームが一次のベッセルビームであること（請求項１５）、波長λ２光を集光して得られるビームが、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型のいずれかの発振モードを持つレーザービームであること（請求項１６）、波長λ１光の光源として、気体レーザー、
固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかが備えられていること（請求項１７）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長が、波長λ１であること（請求項１８）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長の高調波が、波長λ１であること（請求項１９）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長とその高調波との和周波または差周波が、波長λ１であること（請求項２０）、波長λ２光の光源として、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかが備えられていること（請求項２１）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長が、波長λ２であること（請求項２
２）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長の高調波または差周波が、波長λ２であること（請求項２３）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長とその高調波との和周波または差周波が、波長λ２であること（請求項２４）、気体レーザーが、エキシマレーザー、銅蒸気レーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、ＣＯ ₂レーザー、Ｈｅ−Ｃｄレーザーまたは窒素レーザーのいずれかであること（請求項２５）、気体レーザーが、モードロック型であること（請求項２
６）、固体レーザーが、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、Ｔｉサファイヤレーザー、ＹＬＦレーザーまたはルビーレーザーのいずれかであること（請求項２７）固体レーザーが半導体レーザー励起型であること（請求項２８）、 固体レーザーがモードロック型であること（請求項２
９）、顕微鏡本体が、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーからのレーザー光の波長変換を行うための非線形媒質または波長変調素子を一つまたは複数有していること（請求項３０）、非線形媒質または波長変調素子が非線形結晶であること（請求項３１）、非線形媒質または波長変調素子がラマンシフターであること（請求項３２）、波長λ１光が、気体レーザーまたは固定レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子で波長変調したものであること（請求項３３）、波長λ１
光が、気体レーザーまたは固定レーザーの高調波を非線形媒質または波長変調素子で波長変調したものであること（請求項３４）、波長λ２光が、気体レーザーまたは固体レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子で波長変調したものであること（請求項３５）、波長λ
２光が、気体レーザーまたは固体レーザーの高調波を非線形媒質または波長変調素子で波長変調したものであること（請求項３６）、波長λ２光の集光光学系が、波長λ２光を集光して得られるビームにその光軸に対して直交する平面内で位相差分布を与える屈折率分布または光路差分布を有する位相板を備えていること（請求項３
７）、波長λ２光の集光光学系が輪帯光学系を備えていること（請求項３８）、波長λ２光の集光光学系が回折光学系を備えていること（請求項３９）、波長λ２光の集光光学系がアキシコンを備えていること（請求項４
０）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーの共振器内に、リング状の輪帯ミラー、輪帯回折格子、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャー、または光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電場の互いにπだけずれた位相差を与える位相板のいずれかが、少なくとも一つ備えられていること（請求項４
１）、顕微鏡本体が、分子からの発光を発光検出器に集光する発光集光光学系を有していること（請求項４
２）、発光集光光学系がシャープカットフィルタを備えていること（請求項４３）、発光集光光学系がノッチフィルターを備えていること（請求項４４）、発光集光光学系がパンドパスフィルターを備えていること（請求項４５）、パンドパスフィルターが、波長λ１光および波長λ２光を透過させず、分子からの発光を透過させるものであること（請求項４６）、調整された試料が、波長λ１光および波長λ２光が透過する物質からなる封入手段により封入されていること（請求項４７）、調整された試料が、波長λ１光および波長λ２光が透過する物質からなるカバー手段によりカバーされていること（請求項４８）、前記物質が、合成石英ＳｉＯ ₂ 、ＣａＦ ₂ 、
ＮａＦ、Ｎａ ₃ ＡｌＦ ₆ 、ＬｉＦ、ＭｇＦ ₂ 、Ｓｉ
Ｏ ₂ 、ＬａＦ ₃ 、ＮｄＦ ₃ 、Ａｌ ₂ Ｏ ₃ 、ＣｅＦ ₃ 、Ｐ
ｂＦ ₂ 、ＭｇＯ、ＴｂＯ ₂ 、ＳｎＯ ₂ 、Ｌａ ₂ Ｏ ₃ 、またはＳｉＯであること（請求項４９）、顕微鏡本体は、
波長λ１光と波長λ２光の光源とは別に、連続発振レーザーを備えており、この連続発振レーザーを調整された試料上に集光して得られるビームが、その光軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれる位相分布を有していること（請求項５０）、顕微鏡本体は、連続発振レーザーを調整された試料上に集光して得られるビームを、波長λ１光を集光して得られるビームおよび波長λ２光を集光して得られるビームとは独立して、調整された試料上を相対的に走査するための手段を有していること（請求項５１）などもその態様として提供する。

【００５２】

【発明の実施の形態】この出願の発明の顕微鏡システムにおいては、調整された試料が、少なくとも基底状態を含め三つの電子状態を有し、その第一電子励起状態から第二電子励起状態への励起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域と重複している分子により染色されたものである。

【００５３】ここで、この分子、いわゆる蛍光ラベラー分子について、その高い電子励起状態からの脱励起過程を考察することにより、詳しく説明する。 図１２は、分子の脱励起過程を概念的に例示したものである。 一般に、分子が基底状態であるＳ０から最低（＝第一）励起状態であるＳ１に励起すると、π電子を持つ分子は多いものでは数１０％の収率で蛍光を発して、Ｓ０に脱励起をする。 これが蛍光過程である。 それ以外は、振動緩和、つまり内部転換により、直接、Ｓ０に無放射失活するが、一部はスピン多重度が異なる寿命が極めて長い状態であるＴ１に至り、つまり系間交差をして、さらにそのＴ１から燐光を発してＳ０に戻る。 通常の蛍光顕微鏡では、蛍光収率の高い分子で試料を染色し、光照射でこの分子をＳ１に励起させ、そのＳ１からの蛍光を観察して映像化する。

【００５４】また、Ｓ１よりさらに高い第二励起状態であるＳ２に分子が励起すると、図１にも例示したように非常に複雑な緩和過程により基底状態Ｓ０に脱励起する。 すなわち、たとえば、一部のＳ２の励起分子は内部転換や系間交差によりＳ０またはＴ１状態に脱励起する。 また、その他の励起分子はＳ１の高い振動準位に内部転換した後、Ｓ１の最も低い振動準位に至る。 その後は、上述したＳ１からの緩和過程を経て、Ｓ０に戻る。

【００５５】ここで、注目すべきことは、Ｓ２より高位の励起状態からの蛍光発光収率が極めて低いことである。 これは、Ｓ２の分子の多くが直接Ｓ０の無放射失活したり、Ｓ１に内部転換した後、かなりの割合でＳ０に無放射失活するためである。 また、Ｔ１に至った分子も蛍光過程に寄与しないので、結局Ｓ１に至った一部の分子のみが蛍光を発する。 これはＫｒａｓｈの法則と呼ばれるものである。 特に、気相のベンゼン誘導体分子ではＳ２からの蛍光がほとんど観測されない。

【００５６】一般に、二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡は、上記のようにＳ２以上の高位の電子励起状態からの分子の蛍光収率が極めて低いことを利用している。 ところで、一部の分子は、図１３のエネルギーダイヤグラムに例示したように、Ｓ１からＳｎ（ｎは２以上である）に遷移するときの波長帯域が、Ｓ１からＳ０の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光発光波長帯域と重複している構造を持つ。 このような電子構造をもつ分子では、実質的にイレース光による蛍光抑制効果が強まる現象が起こる。

【００５７】すなわち、波長λ１のポンプ光でＳ０の分子をＳ１に励起し、共鳴波長λ２のイレース光を照射すると、Ｓ１の分子は、Ｓｎに遷移すると同時に、かなりのものが誘導放出によってＳ０の高位の振動準位に脱励起する。 この時、Ｓｎに励起した分子は蛍光が抑制される。 一方、誘導放出した分子については、イレース光と同じ波長の光が発光するので、イレース光と同じ波長の光の強度は若干増加し、イレース光以外の波長で光る蛍光強度は減る。 したがって、イレース光以外の波長で光る蛍光発光をモニターしているかぎり、実質的に優れた蛍光抑制を行うことができる。

【００５８】このようにＳ１からＳｎに遷移するときの波長帯域がＳ１からの蛍光発光波長帯域と重複している分子を、この出願の発明の顕微鏡システムにおける試料を染色する分子とすることにより、上述した誘導放出が寄与する蛍光抑制効果が加わるので、顕微鏡本体の超解像性をさらに向上させることができる。 また、それと同時に、イレース光の強度が低くても蛍光抑制を容易に起こすことができ、観察試料のダメージを減少させることができる。

【００５９】上述したような光学的特性を有する分子としては、たとえば、キサンチン系に属するローダミン（Rhodamine ）系の分子がある。 図１４は、ローダミン系の分子の一つであるRhodamine6G の分子構造式、およびその光学特性としての各断面積と波長との関係を例示したものである（E.Sahar&D.Treves:IEEE J.Quantum El
ectron., QE-13,962(1977)）。 この図１４において、σ
_aはＳ０からＳ１への吸収断面積、σ _eはＳ１からＳ０
への誘導放出断面積、σ _a ^*はＳ１からＳｎへの吸収断面積、σ _TはＴ１からＴｎへの吸収断面積を表している。

【００６０】この図１４に例示したように、Ｓ０からＳ
１への共鳴波長は約５３０ｎｍの前後に広がっている（σ _a参照）が、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長は約５００
〜６００ｎｍの前後に広がっている（σ _a ^*参照）。 そして、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長領域と重複して、約５
３０〜６５０ｎｍの領域に蛍光発光帯域が広がっている（σ _e参照）。 さらに、約５３０〜６００ｎｍには特別な波長帯域が存在することがわかる。 すなわち、この波長帯域の光では、分子をＳ０からＳ１へ励起させることはできないが、Ｓ１からＳｎへの二重共鳴吸収過程と誘導放出が可能となる。

【００６１】一般に、このRhodamine6G を初め、ローダミン系の分子は、Ｓ１からＳｎに遷移するときの波長が、Ｓ１からＳ０の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域と重複している。 また、クマリン系の分子もＳ１からＳｎに遷移するときの波長帯域がＳ１
からの蛍光発光波長帯域と重複している。 たとえば、クマリン系分子であるCoumarin500 は、Ｓ０からＳ１への共鳴波長が２６０ｎｍの前後、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長が３５５ｎｍの前後、そして、蛍光発光領域が３２０
〜４６０ｎｍの領域に広がっている。

【００６２】基本的に、このような光学的性質をもつ分子は、上記のローダミン系分子やクマリン系分子でもそうであるように、ベンゼン環や窒素塩基（つまり、プリン塩基）などの六員環やベンゼン誘導体やプリン誘導体などの六員環誘導体を一つまたは複数含み、たとえば、
ローダミン系分子およびクマリン系分子の他に、キサンチン系分子、オキサンジン系分子、シアニン系分子、オキサーザール系分子、オキサジアゾール系分子、スチルベン系分子がある。

【００６３】これらの具体的な分子としては、以下のような分子を例として挙げることができる。 2,2''-Dimeth
yl-p-terphenyl: P-terphenyl(PTP): 3,3',2'',3'''-Te
tramethyl-P-quaterphenyl: 2,2'''-Dimethyl-P-quater
phenyl: 2-Methyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl: 2-(4-Bi
phenylyl)-5-(4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-3
65): 2-(4-Biphenylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol: 2,5,
2'''',5''''-Tetramethyl-p-quinquephenyl: 3,5,
3'''',5''''-Tetra-t-butyl-p-quinquephenyl: 2,5-Di
phenyloxazol: 2,5-Diphenylfuran: PQP(p-Quanterphen
yl): 2,5-Bis-(4-biphenylyl)-1,3,4-oxadiazol: p-Qua
terphenyl-4、4'''-disulfonicacid Disodiumsalt: pQ
uaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid Dipotassiumsalt:
4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-p-quanterphenyl: 3,
5,3'''',5''''-Tetra-butyl-p-sexiphenyl:2-(1-Naphth
yl)-5-phenyloxazol: 2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzo
xazotetrasulfonicacid Potassium Salt: 2-(4-Bipheny
lyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3: 4,4'-Diphenylstilben
e: [1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic acid,4,4''-1,2-ethen
e-diylbis-,dipotassium salt: 2,5-Bis-(4-biphenyly
l)-oxazol: 2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,4'-diyldi-2,1-e
thenediyl)-bis-benzenesulfonic acid Disodium Salt:
7-Amino-4-methylcarbostyryl: 1,4-Di[2-(5-phenyloxa
zoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methylcoumarin: p-Bis(o-
methylstyryl)-benzene: Benzofuran,2,2'-[1,1'-biphe
nyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-acid: 7-Dimethyla
mino-4-methylquinolom-2: 7-Amino-4-methylcoumarin:
2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethyl Iodide: 7
-Diethylaminocoumarun: 7-Diethylamino-4-methylcoum
arin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqinolizino-
[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Diethylamino-4-trifluormet
hylcoumarin: 7-Dimethylamino-4-trifluormethylcouma
rin:7-Amino-4-trifluormethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4
H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Et
hylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin: 7-Ethy
lamino-4-trifluormethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tet
rahydro-9-carboethoxyquinolizino-[9,9a,1-gh]coumar
in: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quinoli
zino-[9,9a,1-gh]coumarin: 3-(2'-N-Methylbenzimidaz
olyl)-7-N,N-diethylaminocoumarin: 2,3,5,6,-1H,4H-T
etrahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
N-Metyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumar
in: 2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl
Iodide: 3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminoco
umarin: Brillantsulfaflavin: 3-(2'-Benzothiazoly
l)-7-diethytaminocoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydr
o-8-trifluormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
3,3'-Diethyloxacarbocyanine Iodide: 3,3'-Dimethyl
-9-ethylthiacarbocyanine Iodide: Disodium Fluores
cein(Uranin): 9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-h
ydroxy-3H-xanthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien ・Fl
uorescein 548: Fluorol 555(Fluorol 7GA): o-(6-Amin
o-3-imino-3H-xanthen-9-yl)-benzonic acid(Rhodamine
560): Benzoic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimin
o)-2,7-dimethyl-3H-xanthen9-yl],perchlorate(Rhodam
ine 575): Benzonic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethyl
imino)-2,7-dimethyl-3X-xanthen-9-yl],ethyl ester,m
onohydrochloride(Rhodamine 590): 1,3'-Diethyl-4,2'
-quinolyloxacarbocyanine Iodide: 1,1'-Diethyl-2,2'
-carbocyanine Iodid: 2-[6-(Diethylamino)-3-(ethyla
mino)-3H-xanthen-9-yl]benzonic acid(Rhodamine 61
0): Ethanaminium,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulf
ophenyl)-3H-xanthen-3-ylidene]-N-ethylhydroxid,inn
er salt,sodium salt: Malachit Green: 3,3'-Diethylt
hiacarbocyanine Iodide: 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyt
hiacarbocyanine Iodide: 8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,
6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizin
o[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rho
damine640): 4-Dicyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimeth
ylaminostyryl)-4H-pyran: 3,3'-Diethyloxadicarbocya
nine Iodide: 8-(2,4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,1
4,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-
bc:9',1-hi]xanthene(Sulforhodamine 640): 5,9-Diami
nobenzo[a]phenoxazonium Percrorate: 9-Diethylamino
-5H-benzo(a)phenoxazin-5-one: 5-Amino-9-diethylimi
no[a]phenoxazonium Perchlorate: 3-Ethylamino-7-eth
ylimino-2,8-dimethylphenoxazin-5-iumPerchorate: 8-
(Trifluoromethyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1
H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xa
ntbylium Perchlorate: 1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylamin
ophenyl)-1,3-butadienyl)-pyridinium Perchlorate: C
arbazine 122: 9-Ethylamino-5-ethylimino-10-methyl-
5H-benzo(a)phenoxazoniumPerchlorate: 3-Diethylamin
o-7-diethyliminophenoxazonium Perchlorate: 3-Dieth
ylthiadicarbocyanine Iodide: Oxazine 750: 1-Ethyl-
4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-pyrid
ininum Perchlorate: 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindod
icarcyanine Iodide: 1,1'-Diethyl-4,4'-carbocyanine
Iodide: 2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadien
yl)-1,3,3-trimethyl-3H-indolium Perchlorate: 2-(4-
(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-3-ethylben
zothoazolium Perchlorate: 1,1'-Diethyl-2,2'-dicarb
ocyanine Iodide: 1-Ethyl-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahyd
ro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinozinium))-1,3-butadien
yl)-pyridinium Perchlorate: 3,3'-Dimethyloxatricar
bocyanine Iodide: 1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophe
nyl)-1,3-butadienyl)-quinolinium Perchlorate: 8-Cy
ano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-di
quinolizino[9,9a1-bc:9a',1-hi]xanthylium Perchlora
te(Rhodamine 800): 2-(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,
4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzothiazolium Perc
hlorate: 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyan
ine Iodide: IR125: 3,3'-Diethylthiatricarbocyanine
Iodide: IR144: 2-(6-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-
benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5-
hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium Perchlorate:
3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatricarbocyanine
Iodide: 1,1',3,3,3'3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenz
o-2,2'-indotricarbocyanine Iodide-3,3'-Diethyl-4,
4',5,5'-dibenzothiatricarbocyamine Iodide:1,2'-Die
thyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide: IR140: 2-(8-(4-p-
Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octa
tetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: IR
132: 2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H,benzo(i,j)c
hinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetrae
nyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: IR26: IR
5 。

【００６４】以上の分子のなかで、たとえばクマリン系分子である7-Ethylamino-4-trifluormethylcoumarin(C
₁₂ H ₁₀ NO ₂ F ₃ :Coumarin500)では、Ｓ０からＳ１への励起波長帯域が２６６ｎｍ前後、Ｓ１からＳ２への励起波長帯域が５３２ｎｍ付近、蛍光波長帯域が５３２ｎｍとなっている。 これらの２６６ｎｍおよび５３２ｎｍは、それぞれ、ＹＡＧレーザーの四倍波および二倍波に対応しているので、その基本波や高調波を、波長変換可能な非線形媒質または波長変調素子素子としてのＢＢＯ結晶やＫＴＰ結晶などの非線形結晶により波長変調することで容易に生成することができる。

【００６５】よって、この発明の顕微鏡システムにおいて、たとえば、試料染色分子がクマリン系分子であり、
顕微鏡本体におけるポンプ光の光源およびイレース光の光源としてＹＡＧレーザーを用いることで、優れた超解像性が得られるだけでなく、色素レーザーを用いた従来の顕微鏡と比べて、優れた作業性および光学性能を有することができる。

【００６６】すなわち、使用する波長を、基本的に非線形結晶の角度を初期設定するだけで決定することができるため、煩雑な波長調整作業をせずに、所望の励起波長の発生を容易に行うことができ、また、色素の劣化によるレーザーパワーの変動や低下が無く、発振効率も良いので、高出力なレーザーを用いる必要がなく、光源を小型で廉価なものとすることができるとともに、生体試料へのダメージをさらに低減させることができる。

【００６７】ＹＡＧレーザのビームプロファイルに関しては、位相面がそろった良好なガウシアンビームの発振技術が確立しているので、光軸対称で良質な中空ビーム型のイレース光を生成することができる。 このようなＹ
ＡＧレーザーとしては、たとえば、市販されているパルス幅２０ｐｓｅｃ以下で、繰り返し周波数１００ＭＨｚ
のモードロックＹＡＧレーザーを用いることができる。

【００６８】また、染色分子がキサンチン系またはローダミン系の分子である場合でも、同様にしてＹＡＧレーザと非線形結晶を用いてポンプ光およびイレース光を発生させることができる。 たとえば、Rhodamine6G では、
前述のようにＳ０からＳ１への共鳴波長は５３０ｎｍの前後に広がって、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長は５００〜
６００ｎｍの前後に広がっている。 ５３０ｎｍ前後のポンプ光は、ＹＡＧレーザーの二倍波で対応できる。 ５０
０〜６００ｎｍ前後のイレース光は、非線形結晶のラマン効果を用いて（いわゆるラマンシフター）簡単に発生できる。 たとえばＹＡＧレーザーの２倍波の５３２ｎｍ
の光をラマンシフターに通すことにより、変換効率２０
％程度で約長波長側に３０ｎｍ程度シフトした５６０ｎ
ｍ前後のレーザー光を生成することがきる。

【００６９】また、非線形結晶を用いて生成されるＹＡ
Ｇレーザーの基本波と高調波との和周波あるいは差周波を有するレーザー光を、ポンプ光またはイレース光とすることもできる。 もちろん、ＹＡＧレーザー以外にも、
上記した各分子に合わせて、波長固定の気体レーザー、
固体レーザーまたは半導体レーザーや、各種非線形媒質または波長変調素子を用いることができる。

【００７０】たとえば、気体レーザーとしては、エキシマレーザー、銅蒸気レーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ
−Ｎｅレーザー、ＣＯ ₂レーザー、Ｈｅ−Ｃｄレーザー、窒素レーザーなどを用いることができ、また、固体レーザーとしては、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、Ｔｉサファイヤレーザー、ＹＬＦレーザー、ルビーレーザーなどを用いることができる。

【００７１】これらの各レーザーのなかでも、モードロック型のレーザーは、繰り返し周波数が高く、パルス振幅が数１０ｐｓｅｃ以下であり、この発明の顕微鏡システムにける超解像の顕微鏡本体により適した光源である。 近年では、小型で、高輝度、短パルス、高繰り返しである、半導体レーザー励起で、且つモードロック型の固体レーザーも、廉価でメンテナンスフリーとして実現されており、この固体レーザーは、超解像の顕微鏡本体の機能を十分に活かす条件を全て有している。

【００７２】上述したような各気体レーザー、固定レーザーまたは半導体レーザーを波長λ１ポンプ光の光源および波長λ２光の光源として用いて、その発振波長や高調波、あるいは発振波長と高調波との和周波または差周波を波長λ１および波長λ２にして、ポンプ光およびイレース光を発生させる。 また、これら各種光源の基本波や高調波を非線形結晶などの各種非線形媒質または波長変調素子によって波長変調して、波長λ１ポンプ光および波長λ２イレース光を発生させることもできる。

【００７３】ところで、蛍光抑制効果を用いた超解像顕微鏡が理論通りの解像度を有するようになるには、前述したように、波長λ２光であるイレース光を試料面上に集光して得られるビームを、中央部の光強度がゼロとなる形状とし、照射領域の中央部に蛍光領域を残すようにする必要がある。 この発明では、イレース光を集光して得られるビームを、中央部の光強度がゼロとなる形状とするため、光軸と直交する面内で、光軸に関する対象位置においてπだけ位相がずれる位相分布を有するものとしている。

【００７４】このような位相分布を有するビームとしては、ベッセルビームが適している。 たとえば、図１５に例示したような座標系を仮定すると、ベッセルビームは次式のような形で表すことができる。

【００７５】

【数１１】

【００７６】この式において、Ｅ（ｘ，ｙ）は電場ベクトル、Ｅ０は電場ベクトルの振幅である。 ここで、ｍ＝
１とすると、上式は、一次のベッセルビームになる。 この一次のベッセルビームは、光軸上で電場強度がゼロとなる特異点をもち、実は、次式の電磁波の波動方程式を解くことで、得られる。

【００７７】

【数１２】

【００７８】ある軸について軸対称な境界条件を与えれば、数１２は（ｒ，φ，ｚ）円筒座標系で次式のように書き直すことができる。

【００７９】

【数１３】

【００８０】ここで、ｋは波数を示し、改めて図１５に例示した座標系を用いれば、ベッセル関数を重ね合わせで表現できる数１１の解が得られる。 図１６は、ｍ＝１
とした場合の一次ベッセルビームのビーム面、つまり瞳面の位相分布を例示したものである。 この図１６から明らかなように、一次ベッセルビームは、その光軸と直交する面内において、光軸の周りを一回転したときに０から２πまで連続的に変化する位相分布を有しており、軸対称にある電場の位相がお互いπだけずれているので、
電場が光軸上において完全に打ち消し合ってゼロとなるため、電場強度が光軸上でゼロとなる特異点を持つことがわかる。

【００８１】つまり、この発明の顕微鏡システムは、イレース光の集光ビームをたとえば集光光学系を用いてベッセルビーム、特に一次のベッセルビーム、とすることにより、照射領域の中央部に蛍光領域が残り、理論通りの解像度を有するようになる。 さらに、このベッセルビームは、図１７に例示した２次元強度分布であるプロファイルのように、見かけ上拡散しない疑似非回折ビームである。

【００８２】従来の顕微鏡では、回折限界を小さくして解像度を高めるために開口数が大きい対物レンズを使用するので、焦点深度が極めて浅くなり、ピント合わせが困難であったが、この発明の顕微鏡システムでは、イレース光の集光ビームとしてのベッセルビームが疑似非回折ビームであるので、実質的に焦点深度が深くなり、ピント合わせの問題が軽減されることとなる。 さらに、顕微鏡本体においては、イレース光により解像度が支配されるので、解像度を低下させることなく、その操作性が高められる。

【００８３】上述のような光学的特性を有するベッセルビームを一例としたイレース光の集光ビーム、つまり、
光軸について軸対称な境界条件を持ち、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれた位相分布を有している集光ビームの形成は、既存の光学素子を用いた集光光学系によって簡単に行うことができる。 光軸について軸対称な境界条件を与えるために、集光光学系は、たとえば、輪体瞳を持つ反射型対物レンズなどの輪帯光学系、
つまり輪体開口を持つ光学系や、フレネルゾーンプレートなどの回折光学系や、アキシコンなどを備えていることが好ましい。

【００８４】また、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれた位相分布を与えるために、集光光学系は、光軸に対して直交する平面内で位相差分布を与えるような屈折率分布または光路差分布を有する位相板を備えていてもよい。 たとえば、完全な一次ベッセルビームのように、光軸と直交する面内において光軸の周りを一回転したときに０から２πまで連続的に変化する位相分布を有する集光ビームは、図１８に例示したように、ビームの光軸と直交する面内において、その光軸の周りを回転する方向に位相板が一回転したとき、その屈折率分布または光路差分布が０から２πまで連続的に変化して、形成される。

【００８５】なお、完全な一次ベッセルビームでなくても、光軸と直交する面内において光軸の周りを一回転したときに０から２πまで不連続的に変化する位相分布を有する集光ビームならば、屈折率分布または光路差分布が０から２πまで不連続的に変化しても、形成できる。
イレース光の光源には、このような集光ビームを形成する機能を持たせるようにしてもよい。

【００８６】また、イレース光光源としてのレーザーの共振器内に、透過型の輪帯型回折格子や、リング状の輪帯ミラー、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャー、光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電板の互いにπだけずれた位相差を与える位相板などを挿入して、上述した境界条件を与えて直接イレース光自体を一次ベッセルビームにしてしまうことも可能である。

【００８７】さらにまた、イレース光光源としてのレーザーの共振器の境界条件を調整して、ＴＥＭ１１等の光軸上において強度がゼロで軸対称のモードパターンを形成し、このモードパターンを上述した輪体開口を持つ回折光学系で集光することにより、たとえば、高次のモードパターンを持つ、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型のいずれかの発振モードのレーザービームを、イレース光の集光ビームとしてもよい。

【００８８】一方、この発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体においては、さらに、中空ビームで試料粒子を捕獲および移動することのできる、マイクロマニュピュレータ機能をも有することができる。 中空ビームを照射すると、試料粒子は、レーザー強度の強い領域に吸引されて、その安定点が中空ビームの集光点位置の中空部になって、中空ビーム内に完全に封印されて捕獲されるようになる。 この発明の顕微鏡本体では、捕獲対象の試料にはほとんどレーザー光が照射されないので、試料へのダメージを抑制することができる。 さらに、その空間移動は、通常のレーザービームのように、ガルバノミラー等の光学系によるビーム走査で実現できる。

【００８９】また、捕獲に適切なレーザー強度は、約数１０ＭＷ／ｃｍ ²であることが知られており、この強度は、この発明の顕微鏡システムにおける顕微鏡本体で用いられるイレース光の最大強度とほぼ等しいので、上述したイレース光の光源および集光光学系をそのまま利用できる。 従って、この発明の顕微鏡システムでは、中空ビームを用いることで、試料を、光照射によるダメージを与えることなく、捕獲および移動させることができ、
高度なマイクロマニュピュレータ機能を有することができる。

【００９０】以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。

【００９１】

【実施例】（実施例１）この発明の顕微鏡システムにおいて、調整された試料が、Rhodamine6G により染色されたものであり、顕微鏡本体が、ポンプ光（つまり、Rhod
amine6G を基底状態Ｓ０から第一電子励起状態Ｓ１へ励起させる波長λ１の光）の光源およびイレース光（つまり、第一電子励起状態Ｓ１のRhodamine6G を第二電子励起状態Ｓ２へ励起させる波長λ２の光）の光源としてＹ
ＡＧレーザーを備えているとする。 また、ＹＡＧレーザーの波長変調素子として、ラマンシフターも備えているとする。

【００９２】Rhodamine6G は、上述したように、二重共鳴吸収と誘導放出とによる優れた蛍光抑制を実現させることができ、そのＳ０からＳ１への励起波長λ１は５３
２ｎｍ、Ｓ１からＳ２への励起波長λ２は５６０ｎｍであるので、ＹＡＧレーザーの二倍高調波光（＝５３２ｎ
ｍ）をポンプ光とし、その二倍高調波をラマンシフターで５６０ｎｍに波長変調したものをイレース光とする。

【００９３】下記の表１は、５３２ｎｍおよび５６０ｎ
ｍにおけるRhodamine6G の光学パラメータを例示したものである。

【００９４】

【表１】

【００９５】さらに、顕微鏡本体に備えられた集光光学系によってイレース光を集光して得られるビームは、その光軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相がずれ、且つ光軸の周りを一回転したときに０から２πまで連続的に変化した位相分布を有しているとする。 そして、集光光学系は、このような位相分布をイレース光の集光ビームに与えることのできる、図１
８に例示したような屈折率分布または光路差分布を有する位相板を備えている。

【００９６】このようなこの発明の顕微鏡システムにおける顕微鏡本体の分解能の高さは、前記の一次ベッセルビームの一般式である数１１で表される。 この分解能の高さは、イレース光の集光光学系の開口数が、図１９のように具体的に与えられていると、次式のようなコンボリューション計算の形式で書き直すことができる。

【００９７】

【数１４】

【００９８】この式において、ＰＳＦ（ｘ，ｙ）は光学系の２次元点像分布関数、Φ（ｘ，ｙ）は位相分布、ａ
は積分領域の半径を示している。 また、集光光学系が輪帯光学系である場合には、ＰＳＦ（ｘ，ｙ）は、次式で与えられる。

【００９９】

【数１５】

【０１００】但し、ρ ₀は集光光学系の瞳の遮光率であり、ξは次式となる。

【０１０１】

【数１６】

【０１０２】但し、ＮＡは集光光学系の開口数、λはイレース光の波長を示している。 数１５において、ρ
₀は、０〜１の間で値を取り、０のときは、集光光学系が輪帯光学系ではない場合のＰＳＦ（ｘ，ｙ）を示す。
ここで、数１４で与えられるＩ（ｘ，ｙ）を前記の数８
に代入すれば、Ｓ１の分子が均一に分布した試料面にイレース光を照射したときの蛍光強度Ｆ１（ｘ，ｙ）を次式のように求めることができる。

【０１０３】

【数１７】

【０１０４】さらに、蛍光抑制に誘導放出が寄与する場合には、誘導放出断面積を６ｆとして、数１７は数１８
となる。

【０１０５】

【数１８】

【０１０６】したがって、蛍光ラベラー分子がRhodamin
e6G であり、イレース光の集光ビームが上述したような位相分布を有している場合では、この数１８を用いて、
Rhodamine6G が第一励起状態から基底状態へ脱励起する際に発光する蛍光を、どの程度の空間分解能で検出できるかを見積もることができる。 そこで、本実施例１におけるこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体が検出できる空間分解能を、数１８により求めた。

【０１０７】表２は、この際に用いた環境パラメータを例示したものである。

【０１０８】

【表２】

【０１０９】また、Rhodamin6Gの光学パラメータは上記表１の値を用いた。 なお、ポンプ光のフォトンフラックスは指定してないが、Rhodamin6Gの場合では、ＹＡＧレーザーの二倍高調波の波長帯域におけるσ ₁₂が十分な数のＳ１を生成できる大きな吸収断面積であるとして、特にＳ１の生成量と均一性の論議は無視している。

【０１１０】図２０は、算出されたイレース光強度Ｉ
（ｘ，ｙ）と蛍光強度Ｆ ₁ （ｘ，ｙ）とを例示したものである。 なお、各強度はそれぞれのピーク値で規格化している。 この図２０から明らかなように、イレース光強度はその中央部においてゼロとなっており、蛍光強度も中央部において高く、蛍光領域が中央部にのみ残っていることがわかる。 集光光学系のRayligh-limit は、４５
５ｎｍであるが、もし蛍光強度Ｆ ₁ （ｘ，ｙ）の半値幅をRhodamine6G を検出できる空間分解能と定義すると、
それは１００ｎｍとなり、集光光学系の回折限界を上回っている。 つまり、本実施例におけるこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体は、優れた超解像性を有していることがわかる。

【０１１１】一方、ポンプ光およびイレース光の光源としているＹＡＧレーザーとしては、廉価で、安定性の高いモードロック型のものを用いることができ、たとえば、ポンプ光としての二倍高調波５２３ｎｍ光の一部をビームスプリッターで取り出し、これを、安全性のよいＢＢＯ結晶などの非線形結晶や、ラマンシフターなどの波長変調素子または非線形媒質で５６０ｎｍに波長変換して、イレース光とする。 このように光源の構成は極めて簡単なものとなる。

【０１１２】また、ＹＡＧレーザーが、モードロック型であり、且つ半導体レーザー励起型である場合には、繰り返しが高い１００ＭＨｚ、且つ数１０ｐｓｅｃの短パルス光を得ることができるとともに、光源を小型でソリッドステートのメンテナンスフリーであるものとすることができる。 さらには、照射光の強度が低くくて良く、
また、照射光波長が生体試料の光吸収帯域ではない５０
０ｎｍ近辺であるので、生体試料へのダメージを極めて少なくすることができる。

【０１１３】また、Rhodamine6G と同様に、たとえば、
7-Ethylamino-4-trifluormethycoumarin(C ₁₂ H ₁₀ NO ₂ F ₃ :C
oumarin500) は、前述したように、ポンプ光とイレース光が、ＹＡＧレーザーの二倍高調波と四倍高調波で対応することができ、イレース光の強度を１００ＭＷ／ｃｍ
²として、Rhodamine6G と同じ１００ｎｍ程度の空間分解能を得ることができる。

【０１１４】また、Rhodamine6G や7-Ethylamino-4-tri
fluormethycoumarinとは異なり、ＹＡＧレーザーの基本波とその高調波を簡単な非線形結晶で変調して生成できる波長ではない共鳴波長λ１およびλ２を有する分子の場合には、ＹＡＧレーザーの発振波長を、たとえば、オプティカルパラメトリックオシレータ（ＯＰＯ）などのような、非線形結晶を用いた光学システムで変調することにより、紫外から赤外までの範囲で走査することができる。

【０１１５】もちろん、ＹＡＧレーザーであるので、従来用いられてきた色素レーザーなどと比べ、色素の交換などを行う必要がなく、顕微鏡本体の操作性が向上される。 （実施例２）上述の実施例１では、イレース光の集光ビームを、光軸の周りを一回転したときに０から２πまで連続的に変化した位相分布を有したものとしているが、
本実施例２では、不連続的に変化した位相分布を有したものとする。

【０１１６】不連続的に変化した位相分布をイレース光の集光ビームに与えるには、たとえば、図２１に例示したように、光軸周りに不連続に変化する屈折率分布（ｎ
１〜ｎ８）を有する位相板を用いる。 ここで、たとえば、蛍光ラベラー分子をRhodamine6G とし、その光学パラメータおよび環境パラメータをそれぞれ表１および表２とした場合において、顕微鏡本体の集光光学系が、図２２に例示したように光軸周りを四分割し、０，π／
２，π，３π／４と、飛び飛びの不連続位相分布をイレース光の集光ビームに与える屈折率分布を有する位相板を備えているとして、イレース光の集光ビームの強度分布と、発光される蛍光の強度分布とを求めた。

【０１１７】図２３（ａ）（ｂ）は、各々、位相板の構造と光学パラメータを例示した平面図および側面図である。 この図２３（ａ）（ｂ）に例示した位相板は、ガラス基板（ＢＫ−７）上にフッ化マグネシューム膜がコートされて形成されている。 フッ化マグネシューム膜は、
波長５６０ｎｍにおいて屈折率が１．３８であるので、
膜厚３５０ｎｍでλ／４の位相差を与える。 よって、光軸周りを四分割した各領域において０，π／２，π，および（３π）／２の位相分布を与えることのできる各膜厚は、それぞれ、図２３（ａ）に例示したように、３５
０ｎｍ、７００ｎｍ、１０５０ｎｍ、および０ｎｍとなる。

【０１１８】また、このような屈折率分布を有するフッ化マグネシューム膜などの光学薄膜をコーティングする他にも、ガラス基板を直接エッチングすることにより、
各領域の位相を与える光路差を有するようにして位相板を形成してもよい。 なお、このように光学薄膜のガラス基板上へのコーティングまたはガラス基板のエッチングにより形成される位相板では、イレース光の位相面の乱れを防ぐために、ガラス基板自体の平行度や粗さがλ／
４の位相差を与える光路差より小さい必要がある。

【０１１９】つまり、フッ化マグネシューム膜を用いた位相板では、ガラス基板自体の平行度や粗さによる光路差の乱れが３５０ｎｍ以下としている。 図２４は、このような図２３の位相板を備えた集光光学系により集光されて得られたイレース光の集光ビームの強度と蛍光強度とを例示したものである。 この図２４から明らかなように、イレース光の集光ビーム強度は、実施例１における図２０に例示したイレース光集光ビーム強度とほぼ同じ形状となっており、中央部の光強度がゼロとなっていることがわかる。

【０１２０】つまり、イレース光の集光ビームが、光軸周りに不連続的に変化した位相分布を有している場合でも、優れた超解像性が実現される。 また、位相板の製作において、光軸周りに不連続的に変化した屈折率分布または光路差分布を有するように、たとえばフッ化マグネシューム膜を製膜することは、連続的に変化させるよりも、極めて簡単であり、製作コストの低減を図ることができる。

【０１２１】（実施例３）この発明の顕微鏡システムでは、波長λ２光であるイレース光を集光して得られるビームが、非回折ビームである一次ベッセルビームであることが最も望ましいが、顕微鏡本体を理論通りの超解像度を有するものとするには、前述したように、中央部の強度がゼロとなる形状を有していれば良い。

【０１２２】したがって、図１８または図２２に例示したような位相板で位相変調されたビームを、通常の集光光学系、つまり実施例１のように輪帯光学系を備えていない集光光学系によって、縮小結像するだけでよく、非回折性はなくなるが、優れた超解像性を実現することはできる。 図２５は、試料がRhodamine6G により染色されたものであり、瞳の遮光率をゼロとし、光学パラメータおよび環境パラメータを表１および表２の値とした場合で、算出したイレース光集光ビームの強度分布および蛍光強度分布を例示したものである。

【０１２３】この図２５から明らかなように、位相板を備えた通常の集光光学系によって集光されたビームは、
その中央部の強度がゼロとなる形状を有しており、中央部に蛍光領域が残っている。 集光光学系のRayleigh-lim
itは４５５ｎｍであるが、もし蛍光強度Ｆ ₁ （ｘ，ｙ）
の半値幅をRhodamine6G を検出できる空間分解能とすると、それは２００ｎｍとなり、集光光学系の回折限界を上回っている。 したがって、優れた超解像性が得られていることがわかる。

【０１２４】（実施例４）図２６は、超解像顕微機能を有するこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。 この図２６に例示した顕微鏡システムでは、蛍光ラベラー分子としてRhodamine6G を用いている。 つまり調整された試料（１００）を、Rhodamine6G
により染色したものである。

【０１２５】波長λ１光であるポンプ光および波長λ２
光であるイレース光の光源として、モードロック型のＮ
ｄ：ＹＡＧレーザー（１）が備えられ、その波長変換用の非線形媒質としての非線形結晶であるＢＢＯ結晶（２）が備えられており、このＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）の基本波をＢＢＯ結晶（２）により波長変換して、二倍高調波５３２ｎｍを発振させ、これをポンプ光としている。

【０１２６】このポンプ光の光路上にはハーフミラー（３）が備えられており、このハーフミラー（３）によって、二倍高調波の一部、つまりポンプ光の一部を取り出し、非線形結晶としてのＢａ（ＮＯ ₃ ） ₂結晶で構成されたラマンシフター（４）によって、５６３ｎｍに波長変換し、これをイレース光としている。 このイレース光は、ミラー（５）を介して、実施例２において例示した位相板（６）に照射されて、この位相板（６）によって中央部の電場強度がゼロとなる中空ビームに成形される。

【０１２７】この中空ビームとして成形されたイレース光とポンプ光は、ダイクロックミラー（７）により同じ光路を通るようにされ、そして、次のダイクロックミラー（８）および集光対物レンズ（９）を介して、図中の矢印方向に移動する二次元移動ステージ（１０）に設置されている、調整された試料（１００）上に集光される。

【０１２８】このようにして集光されたポンプ光およびイレース光の照射により、調整された試料（１００）から発光する蛍光は、ダイクロックミラー（８）により反射され、蛍光集光レンズ（１１）によって、シャープカットフィルター（１２）およびピンホール（１３）を介して、フォトマル（１４）の受光面に集光される。 ダイクロックミラー（８）は、ポンプ光およびイレース光を透過し、蛍光帯域で反射率をもつ干渉フィルターである。 このため、ポンプ光およびイレース光と、シグナル光である蛍光との分別が可能となっている。

【０１２９】また、ダイクロックミラー（８）とフォトマル（１４）との間に配設されているシャープカットフィルター（１２）は、ダイクロックミラー（８）などの表面散乱により混入したポンプ光およびイレース光をカットする帯域フィルターであり、ピンホール（１３）
は、同じく空間的に拡散した迷光をカットする空間フィルターとして機能するものである。 これらシャープカットフィルター（１２）およびピンホール（１３）によって、蛍光の検出感度の向上と、Ｓ／Ｎ比の向上が図られる。

【０１３０】このような構成を有するこの発明の顕微鏡システムにおいて、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーのパルス光の照射のタイミングと同期して、二次元移動ステージ（１
０）を移動させながら、蛍光の強度をモニターすることにより、調整された試料（１００）の２次元蛍光画像を得ることができる。 なお、ポンプ光とイレース光の強度はフォトマル（１５）によりモニターしており、たとえば、信号処理を加えることでレーザー光の強度変換による各ピクセルごとの画像信号の変動を抑制でき、画質の向上を図ることができる。

【０１３１】もちろん、このような図２６に示した例において、各構成要素については様々な態様が可能であり、また、他の機能の付加も可能である。 たとえば、集光対物レンズ（９）としては、通常の光学レンズを用いれば、集光点中央で強度がゼロとなるイレース光集光ビームを形成することができ、また、光軸の周りを周回する対称な境界条件を与えるものを用いれば、非回折ビームである一次ベッセルビームを形成することができる。

【０１３２】以下に一次ベッセルビームを形成することのできる集光対物レンズ（９）としての光学系を例示して説明する。 （Ｉ）輪帯光学系 この輪帯光学系としては、たとえば図２７に例示したような、環状の輪帯スリット（１６）と通常のガラスレンズ（１７）とが組み合わされてなるものがある。 環状の輪帯スリット（１６）を用いる場合には、たとえば、輪帯スリット（１６）の前にエタロン（図示していない）
を配置させ、その一次回折光を利用して、通過する光量を増加させることが望ましい。

【０１３３】また、輪帯瞳をもともと有する輪帯光学系もあり、それ自体が一次ベッセルビームの形成に必要な境界条件を持っている。 この輪帯瞳をもともと有する輪帯光学系としては、たとえば、図２８に例示したような反射対物レンズなどがある。 この反射対物レンズは、カセグレンまたはシュバルツシルド型光学系であり、内側に配置されている凸曲面の反射ミラーが、光学瞳の中央部を遮蔽しており、実質上、上記の環状輪帯スリット（１６）と同様な役割を果たしている。 反射型光学系としては、図２９に例示したような斜入射型のＷａｌｔ
ｅｒ型レンズもある。 このＷａｌｔｅｒ型レンズは、極端な輪帯光学系であり、ほぼ理想的な環状輪帯スリットを用いたことと等価になる。

【０１３４】（II）回折光学系 軸対称な回折光学系（透過型および反射型を含む）も、
光軸の周りを周回する対称な境界条件を前記の数１２の波動方程式に与えるので、集光光学系として適用することができる。 この回折光学系としては、たとえばフレネルゾーンプレートがある。 図３０（ａ）（ｂ）は、各々、透過型および反射型のフレネルゾーンプレートを例示したものである。 フレネルゾーンプレートは、もともと結像能力を有しているので、集光能力と一次ベッセルビーム形成に必要な境界条件とを併せ持っている。

【０１３５】また、単に、境界条件を与えることのみを目的とする場合には、図３１に例示したように、同心円上に溝や螺旋溝が切られてなる回折格子が備えられていてもよい。 （III）アキシコン アキシコンも軸対称の光学系であり、軸上の点光源をその軸上の広い範囲に渡って結像させることができる。 図３２は、アキシコンの一例を示したものである。 この図３２に例示したアキシコンは、円錐面とメッキした平面とを有する、マクレオードと呼ばれる反射レンズである。 このアキシコンは、ある範囲で軸上の点に対し必ず軸上同一点が存在し、軸外の点に対してはそれと対称の点に像点が存在する。 このようなアキシコンも光軸の周りを周回する対称な境界条件を与えるものである。

【０１３６】以上のような光学系を集光対物レンズ（９）として備えることができる。 また、図２６に示した例において、蛍光検出器としては、フォトマルのような光電子倍増管以外にも、ＰＩＮフォトダイオードやＣ
ＣＤ等の半導体検出器が備えられていてもよい。 Rhodam
ine6G を蛍光ラベラー分子とした場合には、光源についても別の手段が可能である。 たとえば、イレース光を生成するためには、ラマンシフター（４）の代りに、ＯＰ
Ｏや色素レーザーを用いることも可能ではある。 この場合には、イレース光が波長可変となるためラベラー分子として、Rhodamine110などのローダミン系分子を利用することができる。

【０１３７】さらにまた、図２６の顕微鏡システムでは、調整された試料（１００）の二次元蛍光画像を得るために、二次元移動ステージ（１０）を集光ビームに対して相対的に二次元移動させるようになっており、この他にも、たとえば、従来のレーザー走査型顕微鏡のように、直接、ガルバノミラーなどにより光学系を振動させて、ビーム自体で調整された試料（１００）上を二次元走査することもできる。

【０１３８】（実施例５）図３３は、共焦点型の超解像顕微機能を有するこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。 この図３３に例示した顕微鏡システムでは、調整された試料（１００）が、Coumarin50
0 により染色されたものとしている。

【０１３９】ポンプ光およびイレース光の光源として、
モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）が備えられており、このＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）の基本波（１０６４ｎｍ）はハーフミラー（２８）によって二系統に分岐される。 分岐された一方の基本波は、ＢＢＯ-1
結晶からなる三倍波発生器（１８）により３５５ｎｍに波長変換されて、ポンプ光とされる。 他方の基本波は、
ミラー（２９）を介してＢＢＯ-2結晶からなる二倍波発生器（１９）に入射され、この二倍波発生器（１９）により３５５ｎｍに波長変換されて、イレース光とされる。

【０１４０】イレース光は、ミラー（３０）を介して、
実施例２において例示したような位相板（３１）に照射され、この位相板（３１）によって中央部が電場強度がゼロとなる中空ビームに成形される。 この中空ビームとされたイレース光とポンプ光は、ダイクロックミラー（２０）により同じ光路を通るようにされる。

【０１４１】また、このダイクロックミラー（２０）と三倍波発生器（１８）との間には、偏光子（２１）が配設されており、この偏光子（２１）によって、ポンプ光の偏光面を自由に回転できるようになっている。 ダイクロックミラー（２０）により同軸上に光路を揃えられたポンプ光およびイレース光は、シュバルツシルド型反射光学系であるコンデンサーレンズ（２２）によりピンホール（２３）を照明する。

【０１４２】集光されたポンプ光およびイレース光により照明されたピンホール（２３）の像は、あらためてマイクロビーム形成用の光源として用いられる。 ピンホール（２３）を通過したポンプ光およびイレース光は、ダイクロックミラー（２４）を透過し、シュバルツシルド型反射光学系である対物レンズ（２５）によって、二次元移動ステージ（１０）上に設置されている、調整された試料（１００）上に、集光される。

【０１４３】シュバルツシルド型反射光学系であるコンデンサーレンズ（２２）および対物レンズ（２５）は、
アルミなどの金属膜がコーティングされた各鏡面を有しており、赤外から紫外領域までの広い波長領域の光を色収差なく結像できる。 したがって、波長の異なるポンプ光とイレース光とを、全く同じ結像性能、且つ高分解能で、調整された試料（１００）上に集光できる。 このシュバルツシルド型反射光学系は、輪帯光学系であり、内側に配置されている凸面鏡の半径を調整して、遮光率ρ
₀を０から１の間の値とすることで、一次ベッセルビームの形成に必要な境界条件を与える。

【０１４４】集光されたポンプ光およびイレース光の照射により、調整された試料（１００）から発光する蛍光は、対物レンズ（２５）を介して、ダイクロックミラー（２４）により反射される。 この際、ポンプ光とイレース光の散乱光や迷光は、ダイクロックミラー（２４）で反射されないので、信号光である蛍光光のみを分別できる。

【０１４５】そして、ダイクロックミラー（２４）により反射された蛍光光は、ピンホール（２６）を通過し、
シャープカットフィルター（２７）によってポンプ光とイレース光の残光がカットされて、フォトマル（１４）
の受光面に集光される。 このような図３３に例示したこの発明の顕微鏡システムにおける顕微鏡本体の光学系は、共焦点光学系である。 すなわち、ピンホール（２
３）および（２６）は、調整された試料（１００）上の集光点を中心にして光学的に共焦点位置にある。 このため、同等の共焦点光学系を有する走査型レーザー蛍光顕微鏡と同様にＳ／Ｎ比に優れ、しかも二次元移動ステージ（１０）の光軸方向の移動により、調整された試料（１００）の三次元の蛍光画像を得ることができる。

【０１４６】また、偏光子（２１）によって、超解像機能の他に新たな有用な機能が付加されている。 一般に、
分子は特定の方向の電気ベクトルに対して吸収が強くなり、たとえば、ベンゼン誘導体やプリン誘導体は分子平面の平面方向と同じ方向の電気ベクトルを持つ光を吸収する。 その場合、ポンプ光の偏光方向を回転させることによって、特定の方向に空間配向した分子のみを励起し、蛍光を起こさせることができる。 したがって、偏光子（２１）により、ポンプ光の偏光方向を変えながら、
蛍光画像を撮ることで、調整された試料（１００）の特定の分子あるいは組織の空間的配向特性を分析できるようになる。

【０１４７】（実施例６）図３４は、この発明の顕微鏡システムの他の一例を示した要部構成図である。 この図３４に例示した顕微鏡システムは、超解像顕微機能の他に、中空マイクロビームを用いたマイクロマニュピュレータ機能をも有している。 さらに、通常の蛍光顕微機能も持ち合わせ、レーザー走査をしなくとも常にリアルタイムで、調整された試料（１００）からの蛍光像をモニターできるようになっている。

【０１４８】この図３４に例示した顕微鏡システムにおいて、調整された試料（１００）は、Rhodamine6G により染色されたものとなっている。 超解像顕微機能のためのポンプ光とイレース光の光源および波長変換用の非線形媒質として、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー（３２）および非線形結晶であるＫＴＰ結晶（３５）が備えられている。 また、マイクロマニュピュレータ機能用の中空マイクロビームを形成するためのレーザー光源および波長変換用の非線形媒質として、連続発振ＣＷのＮｄ：ＹＡＧレーザー（３３）およびＫＴＰ結晶（３
６）が備えられている。 さらにまた、通常の蛍光顕微機能のための光源として、水銀ランプ（３１）も設けられている。

【０１４９】まず、超解像顕微機能について説明する。
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３２）の基本波はＫＴＰ結晶（３５）により波長変換されて、ポンプ光としての５３
２ｎｍの２倍高調波が発振される。 このポンプ光の一部は、ハーフミラー（３７）により取り出されて、ミラー（３８）を介して、Ｂａ（ＮＯ ₃ ）結晶で構成されたラマンシフター（３９）に入射され、このラマンシフター（３９）により５６３ｎｍに波長変換されて、イレース光とされる。

【０１５０】イレース光はダイクロックミラー（４０）
に入射し、このダイクロックミラー（４０）によって、
混入した５３２ｎｍの二倍高調波がカットされて、５６
３ｎｍの光のみが純度良く抽出される。 このイレース光は、さらに、実施例２において例示したような位相板（６）により、中央部で電場強度がゼロとなる中空ビームに成形される。

【０１５１】この中空ビームに成形されたイレース光とポンプ光とは、ダイクロックミラー（４１）により同じ光路を通るようにされる。 ハーフミラー（３７）とダイクロックミラー（４１）との間には偏光子（２１）が設置されており、この偏光子（２１）によってポンプ光の偏光面を自由に回転できるようになっている。

【０１５２】ダイクロックミラー（４１）により同軸上に光路を揃えられたポンプ光およびイレース光は、さらにリレーレンズ（４２）により成形された後、ハーフミラー（４３）により反射されて対物レンズ（９）に入射し、この集光対物レンズ（９）によって、二次元移動ステージ（１０）上に設置されている、調整された試料（１００）上に集光される。

【０１５３】ポンプ光およびイレース光の照射によって調整された試料（１００）から発光する蛍光は、ハーフミラー（４３）および（４４）を透過し、ハーフミラー（４５）によってレンズ（４６）に入射する方向に反射される。 そして、レンズ（４６）によってピンホール（４７）の中央に集光された後、レンズ（４８）を介してスペクトルメーター（４９）に入射する。

【０１５４】ピンホール（４７）は、空間フィルターとして機能し、調整された試料（１００）以外、たとえば光学系など、から発する蛍光等をカットして、測定のＳ
／Ｎ比を高める役割をする。 また、この図３４に示した例では、蛍光検出器としてスペクトルメーター（４９）
が備えられているため、単に蛍光強度を測定するだけでなく、蛍光スペクトルの観測やレーザー照射に対する時間応答の測定をも行うことができるので、調整された試料（１００）の化学構造や組成の解析ができる。 さらに、偏光子（７）によって、ポンプ光とイレース光の偏光面を相対的に変化させることで、組成の空間配向情報も得られる。

【０１５５】このように、調整された試料（１００）に対する様々な測定や解析を行うことができる、非常に優れた超解像顕微機能を有している。 次に、マイクロマニュピュレート機能について説明する。 マイクロマニュピュレートにおいて粒子を捕獲する場合は、基本的に、連続発振光源を用いる必要があるので、連続発振光源として、ＣＷのＮｄ：ＹＡＧレーザー（３３）が備えられている。

【０１５６】このＮｄ：ＹＡＧレーザー（３３）の基本波がＫＴＰ結晶（３６）により波長変換されて５３２ｎ
ｍの二倍高調波が発生される。 この二倍高調波を、マイクロマニュピュレートに用いる中空マイクロビーム生成用の光源としている。 ハーフミラー（３８）を通過した二倍高調波は、ラマンシフター（３９）によって５６３
ｎｍに波長変換され、さらに、ダイクロックミラー（４
０）により、混入した５３２ｎｍの二倍高調波がカットされて、５６３ｎｍの光のみが純度良く抽出される。

【０１５７】この５６３ｎｍ光は、位相板（６）により、中央部で電場強度がゼロとなる中空マイクロビームに成形され、ダイクロックミラー（４１）およびリレーレンズ（４２）を通過して、ハーフミラー（４３）により集光対物レンズ（９）に入射するように反射される。
そして、集光対物レンズ（９）により、調整された試料（１００）上に集光される。

【０１５８】このように、マイクロマニュピュレート用の５６３ｎｍ中空マイクロビームは、上述した超解像機能用のイレース光と同じ光学系を用いることができる。
「光ピンセット」と称されている従来のマイクロマニュピュレートでは単一の粒子しか移動させることができなかったが、この中空マイクロビームを用いたマイクロマニュピュレートは、中空マイクロビーム内に複数個の粒子を閉じ込めることができ、「光ピペット」として機能することができ、高度なマイクロマニュピュレートを行うことができる。 もちろん、レーザー強度も非常に弱くてすむので、試料へのダメージを減少させることができる。

【０１５９】実際のマイクロマニュピュレートの際には、全体の顕微鏡像をモニターしながら操作するので、
顕微鏡像をモニターするための通常の蛍光顕微機能をも付加されている。 この蛍光顕微機能のための光源としては水銀ランプ（３１）が備えられており、この水銀ランプ（３１）からの光は、ハーフミラー（４４）、ハーフミラー（４３）および集光対物レンズ（９）を介して、
調整された試料（１００）上に照射される。 そして、この光照射により発光した蛍光像は、ふたたび、集光対物レンズ（９）、ハーフミラー（４３）およびハーフミラー（４４）を介して、ＣＣＤカメラ結像レンズ（５０）
に入射し、このＣＣＤカメラ結像レンズ（５０）によって、ＣＣＤカメラ（５１）の受光面上に直接結像される。 この蛍光像は、直接、ＣＲＴ上で随時モニターできる。

【０１６０】したがって、ＣＲＴ上の蛍光像を見ながら、中空マイクロビームにより、たとえば赤血球などの粒子を、高度にマイクロマニュピュレートすることができる。 （実施例７）この発明の顕微鏡システムでは、顕微鏡本体を優れた超解像性および操作性とするめに、イレース光を集光して得られるビームを、一次ベッセルビームとすることが望ましい。

【０１６１】一次ベッセルビームの成形は、上述したように集光光学系に備えられる位相板や、輪帯光学系、回折光学系、アキシコンなどを用いて行う他にも、イレース光の光源としての気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーの共振器内に一次のベッセルビームを形成するのに必要な境界条件を与えることで、イレース光自体を一次ベッセルビームとすることが可能である。

【０１６２】図３５は、その境界条件を兼ね備えたレーザー共振器の一例を示した要部構成図である。 この図３
５に例示したレーザー共振器は、通常の焦点距離ｆのレンズ（５３）、位相板（５４）、出力ミラー（５５）を備えており、さらに、端面の共振器ミラーとして、リング状の輪帯ミラー（５２）を備えている。

【０１６３】このリング状輪帯ミラー（５２）内でビーム光軸に対して軸対称な境界条件が与えられ、さらに、
光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電場が互いにπだけずれた位相差をビームに与える位相板をレーザー共振器内に設けることにより、一次ベッセルビームを直接発生させることができる。 このようなリング状輪帯ミラー（５２）や位相板をレーザー共振器内に設けて境界条件を与えることにより、顕微鏡本体の集光光学系の構造を単純にし、アライメントなどを非常に簡単なものとすることができる。

【０１６４】図３６は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５６）
が図３５に例示した構成のレーザー共振器を持つ場合の、この発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。 この図３６に示した例では、調整された試料（１００）がRhodamine6G により染色されたものであるとし、光源として、図３５に例示した構成のレーザー共振器を持つモードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー（５
６）が備えられている。

【０１６５】このＮｄ：ＹＡＧレーザー（５６）は、直接一次ベッセルビームの基本波を発生させることができ、この基本波をＫＴＰ結晶（５７）によって５３２ｎ
ｍの二倍高調波に波長変換して、ポンプ光として、また、その二倍高調波の一部をＢａ（ＮＯ ₃ ） ₂結晶からなるラマンシフター（４）により５６３ｎｍに波長変換して、イレース光とする。

【０１６６】このイレース光は、すでに一次ベッセルビームであるので、集光光学系において、前述した実施例におけるイレース光を中空ビームとする位相板（６）
や、一次ベッセルビームとする輪帯光学系などの光学系を備える必要がなく、そのままダイクロックミラー（７）（８）および集光対物レンズ（９）を介して、調整された試料（１００）上に集光させることができる。

【０１６７】もちろん、調整された試料（１００）上の集光ビームは、一次ベッセルビームとなっている。 このように一次ベッセルビームを形成する光学系が全てレーザー内に強固に組み込まれていることにより、簡単な構成であるとともに、ずれに強く、安定性に優れた集光光学系となり、超解像性および操作性をさらに向上させることができる。

【０１６８】一次ベッセルビームを形成する境界条件を与えることのできる光学系としては、上記のリング状の輪帯ミラー（５２）や光軸と直交する面内の電場に関して軸対象にある電場が互いにπだけすれた位相差をビームに与える位相板の他にも、輪帯回折格子、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャーなどを、イレース光レーザー光源の共振器内に備えることができる。

【０１６９】なお、一般に、レーザーは、その共振器の構成によって、様々なモードパターンをもつビームパターンを生成することができるので、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型の高次発振モードでは、図３７
（ａ）〜（ｄ）に例示したように、レーザービームの中央部で強度がゼロとなるパターンが存在する。 よって、
光源としての各種レーザーは、そのレーザー共振器を図３５に例示したような構成とする他にも、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型の高次発振モードをもつレーザービームを発振させることで、一次ベッセルビームと同様に、優れた超解像性を有することができるようにもなる。

【０１７０】（実施例８）上述したようなこの発明の顕微鏡システムでは、いくつかのフィルター素子を用いることで、発光検出器に入射する、試料からの蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。 一般に、超解像顕微鏡では、検出すべき観察試料からの蛍光の他に、いくつかのバックグラウンド光が存在する。 これらのバックグラウンド光としては、ｉ）ポンプ光の散乱光、ｉｉ）
イレース光の散乱光、ｉｉｉ）試料以外の光学系からの蛍光がある。

【０１７１】ｉ）については、ポンプ光の波長λ１の散乱光であり、主に集光レンズ表面での散乱や、観察試料を保護するカバーガラスの界面での散乱である。 ｉｉ）
については、ｉ）と同様の理由によるイレース光の波長λ１の散乱光である。 イレース光は、ポンプ光よりも強度が強いので、蛍光検出に障害となる。 ｉｉｉ）については、光学系のレンズやカバーガラスの硝材が理想的な無蛍光石英や蛍石であれば、これらの硝材からの２５０
ｎｍ以上の波長領域の蛍光は存在しない。 しかし、材質が悪いと、不純部やカラーセンターにより、それらからの蛍光がある。

【０１７２】これらのバックグラウンド光は、この発明の顕微鏡システムにおける超解像の顕微鏡本体においても発生する場合があるため、蛍光に混入して検出器に入射してしまうのを防ぎ、Ｓ／Ｎ比の向上を図ることが望ましい。 図３８に例示したように、基本的には、光学フィルターと空間フィルターの組み合わせでバックグラウンド光を完全に除去するこができる。

【０１７３】通常、ポンプ光の波長λ１が一番短く、イレース光の波長λ２、およびＳ１からＳ０への脱励起時の蛍光の波長帯域が長波長側に存在する。 Rhodamine6G
は、Ｓ１からＳ２への吸収帯域とＳ１からＳ０への蛍光波長帯域が重複し、波長λ２と検出する蛍光波長とが近接しているので、このような分子を蛍光ラベラー分子として使用する場合には、バックグラウンド光の除去を入念に行うことが好ましい。

【０１７４】まず、ｉ）のポンプ光の散乱光の除去は、
一般にポンプ光とイレース光との波長が比較的離れているので、高分子を含んだ吸収剤をガラス基板に拡散したり、干渉膜をガラス基板上にコートして成るシャープカットフィルターを設けることにより行うことができる。
このようなシャープカットフィルターによって、たとえば図３８から明らかなように、波長λ２より短波長側を完全に除去できることがわかる。 たとえば、誘電体多層膜を用いたものでは、最適設計を行えば、波長分別設計位置の前後大体３０ｎｍ程度の間隔を置いて、これより波長幅で短波長側の光をほぼ１００％除去し、反対に長波長側の光を透過させることができる。 Rhoudamine6Gでは、前述の図１４に例示したように、蛍光測定波長領域とポンプ光とを４０ｎｍ以上間隔があけられるので、シャープカットフィルターにより、ポンプ光の散乱光を、
試料からの蛍光から分離して取り除くことができる。

【０１７５】このようなシャープカットフィルターは、
たとえば、前述の実施例４における図２６に例示したように、蛍光検出器（フォトマル（１４））の前に、蛍光の光路上に設置させることができる。 次に、ｉｉ）のイレース光の除去は、ノッチフィルターを設けることにより行うことができる。 ノッチフィルターは、誘電体多層膜を用いたフィルターであり、図３８に例示したように、特定の波長のみを透過させないようにしたものである。 誘電体多層膜を多く積層して、膜厚を最適化すれば、設計波長を中心に２０ｎｍ程度バンド内の光を完全に除去できる。

【０１７６】特に、Rhodamine6G の場合には、蛍光発光領域が５５０〜６５０ｎｍの領域に広がり、イレース光の波長が５６２ｎｍとなっているが、ノッチフィルターにより、５６２ｎｍ近傍のイレース光の散乱光が検出器に入射することを防ぐことができる。 また、Rhodamine6
G のように、二重共鳴吸収過程と誘導放出とを利用して試料からの発光蛍光の抑制を行う場合には、Ｓ１からＳ
２への吸収帯域とＳ１からＳ０への蛍光波長帯域が重複するので、発光検出器に入射する試料からの蛍光が一部損失することとなる。 しかしながら、ノッチフィルターを用いることにより、５５０〜６５０ｎｍの領域のうち、５６２ｎｍを含む２０ｎｍ程度の狭域の蛍光が欠損するだけで、観察対象である蛍光の損失も極力少なくすることができる。

【０１７７】さらに、試料からの蛍光以外のバックグラウンド光をより完全に除去させるために、バンドパスフィルターを配設させることも好ましい。 バンドパスフィルターは、誘電体多層膜をガラス基板にコートして成るものであり、ノッチフィルターとは反対に、特定の波長を含み、その前後の波長領域の光のみを透過させることができる。

【０１７８】したがって、ポンプ光とイレース光の波長と透過せず、且つ、蛍光発光波長帯域のみに透過特性のバンドパスフィルターが備えられていることにより、原理的には完全に試料からの蛍光以外の波長をカットすることができる。 以上のように、シャープカットフィルター、ノッチフィルター、バンドパスフィルターを併用して、たとえば発光検出器へ試料からの発光を集光する発光集光光学系において、備えることにより、蛍光ラベラー分子が脱励起する際に発光する蛍光を、非常に優れたＳ／Ｎ比で検出することができる。

【０１７９】ｉｉｉ）の試料以外の光学系からの蛍光の除去については、光学系のレンズやカバーガラスの硝材の不純物やカラーセンターに起因するものであるので、
理想的な合成石英（つまり無蛍光石英）や蛍石を利用すれば問題ない。 このような硝材としては、合成石英の他に、ＣａＦ ₂ 、ＮａＦ、Ｎａ ₃ ＡｌＦ ₆ 、ＬｉＦ、Ｍｇ
Ｆ ₂ 、ＳｉＯ ₂ 、ＬａＦ ₃ 、ＮｄＦ ₃ 、Ａｌ ₂ Ｏ ₃ 、Ｃ
ｅＦ ₃ 、ＰｂＦ ₂ 、ＭｇＯ、ＴｈＯ ₂ 、ＳｎＯ ₂ 、Ｌａ
₂ Ｏ ₃ 、ＳｉＯなどを用いることができる。

【０１８０】もちろん、試料からの蛍光と試料以外の光学系からの蛍光とを分離させるフィルター光学系をも設置させておくことが望ましい。 このようなフィルター光学系としては、スリットまたはピンホールなどの空間フィルターがある。 図３９は、フィルター光学系が備えられているこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。

【０１８１】この図３９に例示した顕微鏡システムのフィルター光学系では、遮光ボックス（６２）の中において、ノッチフィルター（１４）の前方に、ノッチフィルター（５８）、バンドパスフィルター（５９）、シャープカットフィルター（６０）が順に配設されている。 さらに、遮光ボックス（６２）におけるダイクロックミラー（２４）側の面部は、ピンホール（６１）を有している。

【０１８２】また、調整された試料（１００）のレーザー光照射面側は、カバーガラス（６３）によりカバーされて保護されている。 このカバーガラス（６３）は、たとえば上記した硝材により形成されている。 このような図３９の顕微鏡システムにおいて、ピンホール（２３）
と、空間フィルターとして機能するピンホール（６１）
とは、対物レンズ（６４）と調整された試料（１００）
面に対して共焦点位置となっている。 このような共焦点光学系の場合には、光線追跡をすると自明であるが、ポンプ光およびイレース光の集光点以外のところ、言い換えると試料面でないところで発光した蛍光は、ピンホール（６１）を通過して、発光検出器であるフォトマル（１４）の受光面に到達できない。

【０１８３】たとえば、カバーガラス（６３）から発光した蛍光は対物レンズ（６４）を通ると、ピンホール（６１）上には結像しない。 従って、結像しない大多数の蛍光は、ピンホール（６１）を通過することができない。 また、対物レンズ（６４）面から発光した蛍光は、
対物レンズ（６４）レンズで直接ピンホール（６１）に集光しないので、ピンホール（６１）を通過せず、フォトマル（４）の受光面に到達しない。

【０１８４】図３８のノーテーションに従えば、発光検出器に入射する蛍光強度Ｉ _signalは、次式のように表すことができる。

【０１８５】

【数１９】

【０１８６】この式において、Ｆ（λ）は蛍光ラベラー分子の蛍光強度であり、λ _ex1とλ _ex2は発光検出器の感度域の下限波長と上限波長を示している。 図３８が示すように、このＩ _signalは、バックグラウンド光の混入してない、試料からの蛍光強度に対応している。 なお、
図３９において、対物レンズ（６４）を反射対物レンズとすると、レンズ硝材からの蛍光が無くなるので、よりＳ／Ｎ比を向上させることが可能となる。

【０１８７】（実施例９）図４０は、実施例６における図３４に例示したこの発明の顕微鏡システムに対応する電気系システムの一例を示したものである。 図４０に示した例では、この発明の顕微鏡システムの全系は、基本的に、パーソナルコンピュータ（６６）によって制御される。

【０１８８】このパーソナルコンピュータ（６６）は、
ＹＡＧレーザーの発振、および調子されたたとえば図３
４における試料（１００）の走査ステージである二次元移動ステージ（１０）の駆動制御を行う。 系のタイミングは全てパーソナルコンピュータ（６６）のクロックに準拠している。 このクロックは、分周器（６７）により、レーザー発振可能な周波数まで分割され、分周されたクロック信号は、ゲート＆ディレイジェネレータ（６
８）により、遅延および波形成形されて、レーザー制御用のＱスイッチ信号とフラッシュランプ信号として、Ｙ
ＡＧレーザーを制御する。

【０１８９】レーザーショットごとの蛍光スペクトルは、ＣＣＤアレー（６９）でモニターされる。 具体的には、レーザーショットにより、調整された試料（１０
０）から発光した蛍光は回折格子（７０）で分光され、
一次元のＣＣＤアレー（６９）により蛍光スペクトルとして検出される。 ＣＣＤアレー（６９）の各画素の蓄積データは、二次元移動ステージ（１０）の移動およびレーザー発光と同期しながら、レーザーショットごとにパーソナルコンピュータ（６６）のメモリに転送される。

【０１９０】パーソナルコンピュータ（６６）のメモリに記憶された蛍光スペクトルデータからは、パーソナルコンピュータ（６６）の数値演算処理により、特定の蛍光波長のデータだけが抽出されて、このデータによって調整された試料（１００）の二次元走査画像が形成される。 測定された各波長に対して二次元操作画像を画像解析することにより、単なる蛍光像を得るだけでなく、２
次元組成分析をも可能となる。

【０１９１】さらに、水銀ランプ（３１）の照射で得られる調整された試料（１００）の蛍光画像は、同時にＣ
ＣＤカメラ（７１）でモニターされ、その蛍光画像データは図時フレームメモリー（７２）に蓄積できるようになっている。 このことにより、二次元走査画像とは別に、随時、調整された試料（１００）の蛍光像の全体をモニターしておくことができる。 この機能は、前述したように、特に、中空マイクロビームを用いたマイクロマニュピュレートを行う際に大変便利である。

【０１９２】この他、パーソナルコンピュータ（６６）
は、ＣＲＴ（７３）およびフレームメモリー（７２）を制御し、画像表示や、画像処理を随時行うことができる。 このようにして形成された画像データは、たとえばＣＲＴ（７３）またはビデオプリンター（７４）により出力できる。 この発明は以上の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能である。

【０１９３】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によって、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態へ励起させるイレース光を、簡単でコンパクトな光学系を用いて、優れたビームプロファイルで集光させることができ、安定性および操作性が高く、優れた超解像性を有する、新しい顕微鏡システムが提供される。 また、試料へダメージを与えることなく、中空ビームであるイレース光を用いて試料粒子の捕獲および移動を行うことのできる、マイクロマニュピュレータ機能を有する、新しい顕微鏡システムも提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】分子の電子構造を例示した概念図である。

【図２】図１の分子の波長λ１による第一励起状態への励起を例示した概念図である。

【図３】図１の分子の波長λ２による第二励起状態への励起を例示した概念図である。

【図４】図３の第二電子励起状態から基底状態への発光を伴う脱励起過程を例示した概念図である。

【図５】第二励起状態ん発光収率の小さい分子における長解像顕微鏡の原理を例示した概念図である。

【図６】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。

【図７】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよび第一励起状態の分子数の一例を示した図である。

【図８】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよび測定タイミングの一例を示した図である。

【図９】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよび測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１０】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよび測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１１】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよび測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１２】高い励起状態からの分子の脱励起過程を例示した図である。

【図１３】第一電子励起状態から第二電子励起状態に励起する波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光長帯域に重なりをもつ分子のエネルギーダイヤグラムを例示した図である。

【図１４】ローダミン６Ｇの分子構造式および光学的性質としての各断面積と波長との関係を例示した図である。

【図１５】ベッセルビームを表現するための座標系を例示した図である。

【図１６】ベッセルビームのビーム面の位相分布を例示した図である。

【図１７】一次ベッセルビームの２次元強度分布を例示した図である。

【図１８】位相板がイレース光の集光ビームに与える位相分布の一例を示した図である。

【図１９】集光光学系の開口数の一例を示した図である。

【図２０】実施例１のこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強度の一例を示した図である。

【図２１】光軸周りに不連続に変化する屈折率分布を持つ位相板を例示した概念図である。

【図２２】光軸周りを四分割して不連続に変化する屈折率分布を持つ位相板において、位相板がイレース光に与える位相分布を例示した概念図である。

【図２３】（ａ）（ｂ）は、各々、位相板の構造と光学パラメータを例示した平面図および側面図である。

【図２４】実施例２のこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強度の一例を示した図である。

【図２５】実施例３のこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強度の一例を示した図である。

【図２６】この発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。

【図２７】環状輪帯スリットと通常のガラスレンズとが組み合わされてなる輪帯光学系の一例を示した図である。

【図２８】輪帯光学系の一例である反射型対物レンズを例示した図である。

【図２９】輪帯光学系の一例であるＷａｌｔｅｒ型レンズを例示した図である。

【図３０】（ａ）（ｂ）は、各々、回折光学系の一例である透過型および反射型のフレネルゾーンプレートを例示した図である。

【図３１】同心円上に溝をもつ透過型回折格子を例示した図である。

【図３２】アキシコン光学系の一例を示した図である。

【図３３】この発明の顕微鏡システムの他の一例を示した要部構成図である。

【図３４】この発明の顕微鏡システムの他の一例を示した要部構成図である。

【図３５】一次ベッセルビームを直接発振できるレーザー共振器の一例を示した要部構成図である。

【図３６】Ｎｄ：ＹＡＧレーザーが図３５に例示したレーザー共振器を持つ場合の、この発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。

【図３７】（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は、各々、ｎ＝
０，ｎ＝１，ｎ＝２，ｎ＝３の高次ビームに関する振幅分布と強度分布とを例示した図である。

【図３８】各種フィルターの波長特性と検出光波長特性の関係を例示した図である。

【図３９】フィルター光学系が備えられているこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。

【図４０】図３４のこの発明の顕微鏡システムに対応する電気系システムの一例を示した要部構成図である。

【符号の説明】

１ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ２ ＢＢＯ結晶 ３ ハーフミラー ４ ラマンシフター ５ ミラー ６ 位相板 ７ ダイクロックミラー ８ ダイクロックミラー ９ 集光対物レンズ １０ 二次元移動ステージ １００ 調整された試料 １１ 蛍光集光レンズ １２ シャープカットフィルター １３ ピンホール １４，１５ フォトマル １６ 輪帯スリット １７ ガラスレンズ １８ 三倍波発生器 １９ 二倍波発生器 ２０，２４ ダイクロックミラー ２１ 偏光子 ２２ コンデンサーレンズ ２３ ピンホール ２５ 対物レンズ ２６ ピンホール ２７ シャープカットフィルター ２８ ハーフミラー ２９，３０ ミラー ３１ 水銀ランプ ３２，３３ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ３５，３６ ＫＴＰ結晶 ３７，３８，ハーフミラー ３９ ラマンシフター ４０，４１ ダイクロックミラー ４２ リレーレンズ ４３，４４，４５ ハーフミラー ４６，４８ レンズ ４７ ピンホール ４９ スペクトルメーター ５０ ＣＣＤカメラ結像レンズ ５１ ＣＣＤカメラ ５２ 輪帯ミラー ５３ レンズ ５４ 位相板 ５５ 出力ミラー ５６ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ５７ ＫＴＰ結晶 ５８ ノッチフィルター ５９ バンドパスフィルター ６０ シャープカットフィルター ６１ ピンホール ６２ 遮光ボックス ６３ カバーガラス ６４ 対物レンズ ６５ コンデンサーレンズ ６６ パーソナルコンピュータ ６７ 分周器 ６８ ゲート＆ディレイジェネレータ ６９ ＣＣＤアレー ７０ 回折格子 ７１ ＣＣＤカメラ ７２ フレームメモリー ７３ ＣＲＴ ７４ ビデオプリンター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 尾松 孝茂 神奈川県横浜市戸塚区平戸５−10−９ Ｆターム(参考） 2H052 AA00 AA07 AA09 AB24 AB26 AC14 AC34 AD34 AF07