极细小物体的高分辨率X射线成像 |
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申请号 | CN98803984.2 | 申请日 | 1998-04-08 | 公开(公告)号 | CN1175430C | 公开(公告)日 | 2004-11-10 |
申请人 | XRT有限公司; | 发明人 | 斯蒂芬·威廉·威尔金斯; | ||||
摘要 | 一种用于 X射线 成像的样品室(10),它包括形成一样品腔(12)的装置(11),以及装在该装置上的可被合适的入射束(5)激发产生X射线 辐射 (6)的物质体(20),该样品室如此设置,使得在使用时,至少一部分所述X射线辐射穿过所述样品腔(12)而照射到其中的样品(7),然后穿出所述装置接受探测(35)。 | ||||||
权利要求 | 1.一种用于X射线成像的样品室,它包括形成一样品腔的结构, 以及装在该结构上的可被合适的入射束激发产生X射线辐射的物质 体,该样品室如此设置,使得在使用时,至少一部分所述X射线辐射 穿过所述样品腔而照射到其中的样品,然后穿出所述结构接受探测。 |
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说明书全文 | 技术领域本发明总体上涉及利用穿透性辐射线比如X射线对极细小物体进 行高分辨率成像。本发明尤其适于进行X射线相衬显微成像,并可有 效地应用于显微物体与显微特征的极高空间分辨率(spatial resolution) 成像,所述显微物体与显微特征包括细小的生物系统,比如病毒和细 胞,可能还包括生物大分子。 背景技术一种已知的利用X射线的显微术是投影X射线显微术(projection X-ray microscopy),在这种显微术中,聚焦的电子束激励并在金属箔 或别的靶中生成一个点状X射线源。物体被置放在所述靶和一照相底 板或其他探测板之间的发散射线束中。最近又提出了许多关于利用电 子显微镜的电子束来激励用于X射线显微术的点状源的方案。Sasov 在《显微学杂志》(J.Microscopy)147、169、179(1987年)提出直接将 层析X射线照相设备结合到电子显微镜中去。Cazaux等人在《电子 显微学杂志》(J.Microsc.Electron.)14,263(1989年),Cazaux等人在 《物理学杂志》(J.Phys.)(巴黎)IV C7,2099(1993年),以及A.Michette 等人编辑、Cheng等人的《X射线显微学III》(Cheng et al X-ray Microscopy III,ed.A.Michette et al(Springer Berlin,1992))第184页, 提出了一种层析X射线照相附属设备的原型机,以作为使用电荷耦合 器件(CCD)探测器的扫描电子显微镜的附属设备。Ferreira de Paiva 等人(Rev.Sci.Instrum.67(6),2251(1996年6月))研究并进一步改进了 基于上述Cazaux及Cheng的方案的一种X射线显微层析照相 (microtomography)系统的性能。上述方案是对商品化的电子显微镜的 改进,能够生成分辨率大约为10μm的图像,而不需要对电子光学组 件(electron optical column)进行大的变动。上述作者断定,对于他们 所提出的设备,在X射线层析照相中,可获得1μm的分辨率。在这 些产品中,所有的系统部件和图像密度数据(image intensity data)的判 读方法均以吸收衬度机制(mechanism of absorption contrast)为基础。 在A Michette同S.Pfauntsch编辑的《X射线:第一个百年》 (“X-rays:The First Hundred Years”)(Wiley,1996,ISBN 0.471-96502-2) 第43-60页,可找到W.Nixon关于X射线显微学的一篇回顾文章。 本申请人的国际专利公开说明书WO 95/05725公开了适用于利用 硬性X射线进行微分相衬成像的各种方案和条件。其他的公开文献有 苏联专利1402871和美国专利5319694。在本申请人待授权的国际专 利公开说明书WO 96/31098(PCT/AU96/00178)中,公开了实施硬性X 射线相衬成像的实际方法。这些方法最好使用微聚焦的X射线源(可以 是多色的),且在物体和射线源之间以及物体和像平面之间要有合适的 距离。在该申请中,以及在Wilkins等人的《多色硬性X射线相衬成 像(“Phase Contrast Imaging Using Polychromatic Hard X-rays”)》 (《自然》(伦敦)384,335(1996年)),以及在本申请人待授权的国际专 利申请PCT/AU97/00882中,公开了得到来自物体的X射线波场 (wavefield)在输出平面(exit plane)处的相变的各种数学方法和数值方 法。在这些参考文献中给出的例子主要涉及宏观物体及宏观特征,以 及在空间上与样品良好隔离的整装的普通实验室型X射线源。 发明内容本发明的目的是,至少在一优选实施例中的目的是,为显微物体 及显微特征的X射线相衬成像提供便利。 通过一种将电子显微镜作X射线成像改造的新方法,或者使用强 激光源或X射线同步辐射源(synchrotron sources)生成微聚焦X射线 源,本发明可以实现上述目的。 按照本发明的第一方面,提供了一种用于X射线成像的样品室, 它包括形成一样品腔的结构,以及装在该结构上的可被合适的入射束 激发产生X射线辐射的物质体,该样品室如此设置,使得在使用时, 至少一部分所述X射线辐射穿过所述样品腔而照射到其中的样品,然 后穿出所述结构接受探测。 在一种实施例中,所述样品室是一个完整的独立装置,其方式和 尺寸适于插入与之匹配的扫描电子显微镜或显微探针的支承装置,例 如样品载物台,中的合适位置,使得所述显微镜或显微探针的电子束 聚焦于所述可激励物质体,从而提供用来激励所述物质生成X射线的 入射束。 在另一种实施例中,所述物质可被入射的聚焦电磁辐射束激励而 产生X射线,所述电磁辐射束例如是激光束或者同步辐射射线束。 所述样品室最好是一个层列,各层在平行于层平面方向上的尺寸 在一微米左右到若干毫米例如10mm的范围内。所述样品室最好有下 述特征,以适合用于相衬成像:所述被激产生的X射线从中穿过的各 层应当高度均一,并具有非常平的表面,以使照射样品的入射射线束 保持高度的空间相干性,从而使有用的图像衬度最优化。在所述可激 励物质层之后的出射表面,以及样品室中随后的各层尤其应当如此。 所述可激励物质最好是一个贴附在形成所述样品室的结构上的物 质层,但也可以是独立式的。该结构最好包括一个底层和/或一个隔离 层,其将所述可激励物质层与所述样品隔离开,对X射线总体上透明, 或者对X射线的某个或某几个能带透明。尽管对于有关的射线能带基 本上透明,所述底层和/或隔离层也可以如此选择,使之强烈吸收所述 能带之外的能量,以加强对生成图像有用的X射线束的色相干性 (chromatic coherence)。 所述样品室可以是开放的,或者可以是密封的,例如可以允许在 向电子显微镜样品腔中置入样品之后将所述样品腔抽为真空。所述样 品腔或样品室可以设计为闭合的,若然,则所述结构包括一个透X射 线的窗口,通过该窗口,所述X射线射出所述结构,以被探测到。 所述可激励物质层的厚度最好在10到1000nm的范围内,而该层 与所述样品间的间隔可在1到1000μm的范围内。 按照该第一方面,本发明提供了一种X射线显微镜或显微探针, 其具有生成聚焦电子束的装置、支撑装置、样品室和探测器;所述样 品室包括形成一样品腔的结构,以及装在该结构上的可被合适的入射 束激发产生X射线辐射的物质体;所述样品室被固定在支承装置的适 当位置,使得所述电子束聚焦于所述样品室提供的可激励物质体,从 而提供所述入射束以激励所述物质体生成X射线;所述探测器位于样 品室外,所述X射线辐射穿过一部分样品室而照射到样品,使得照射 样品的至少一部分X射线穿出样品室接受探测。最好,为了实现极高 分辨率成像,所述生成聚焦电子束的装置包括一个场致发射极尖电子 源(field emission tip electron source)。 按照本发明的第二方面,本发明提供了一种用来对一样品的一个 或若干个内部边界或者其他特征形成放大的X射线图像的方法,该方 法包括:将样品置入一个样品室中,所述样品室包含可激励物质体和 用于容纳样品的腔;将所述样品室安进一电子显微镜或显微探针的支 承装置中的合适位置,使得所述显微镜或显微探针产生的电子束聚焦 于所述可激励物质体;用一电子束照射所述可激励物质体,使所述物 质体产生X射线,所述射线的至少一部分穿过所述样品腔照射到所述 样品,包括所述样品的一个或多个内部边界或其他的特征,然后射出 所述样品室结构;在所述射线照射所述样品之后,探测并记录其至少 一部分射线,以生成所述样品之一个或多个内部边界或其他特征的图 像。 所述X射线成像可以是吸收衬度(absorption-contrast)成像或 相衬成像,或二者的因素都有。本发明尤其适合进行相衬成像。所述 图像可以由所述探测器系统或别的装置进行能带过滤(energy filtered),或者也可以同时采集对应于一系列X射线能带的一组图像。 由所述可激励物质生成的X射线最好在中性到硬性X射线范围 内,也就是从1keV到1MeV;所述X射线可以基本上是单色的,也 可以是多色的。在前一情形下,所述方法可能还包括增强单色性的步 骤。在实践所述方法或使用所述设备的过程中,样品到像平面的距离 最好在约10到200mm。 进一步,本发明提供了一种X射线显微成像配置,包括样品室, 该样品室包含支承样品的装置和可被合适的入射束激励以生成X射线 的物质体,所述物质体被固定在一个底层上,使用中所述底层设置在 所述物质体和所述样品之间从而用作一隔离层;位于样品室外、用于 探测穿过样品室的X射线辐射的探测装置;和调节所述样品与所述物 质体之间的相对位置的装置。 附图说明 下面结合附图通过实施例对本发明作进一步说明,图中: 图1是本发明第一方面的一个实施例的样品室的横剖面图,该样 品室用来进行如本发明第二方面的一实施例所述的高分辨率硬性X射 线显微成像; 图2是一变化的适于软性X射线的样品室; 图3是本发明另一实施例的样品室的类似视图,该样品室可对图 像放大率进行相当大的改变,例如从100倍到100 000倍; 图4是所述靶层被刻图或被分割的一个实施例的示意图; 图5示出的是图1中的样品室被安装到一扫描电子显微镜(SEM) 的样品载物台中的情况; 图6是另一个实施例,示出的是一结构更为松散的样品室安装在 其工作位置的情况; 图7是示于图6的实施例的修改; 图8是一示意图,用以示出图1中影响图像放大倍数以及此后要 加以引用的主要几何参数; 图9到图12是说明性的X射线强度分布图,是简单的圆柱形样 品在不同尺寸和不同条件下所计算出的X射线强度分布。 具体实施方式示于图1中的所述样品室10是一个完整的独立装置,通常为三维 长方体构型。该样品室包括形成一封闭样品腔12的结构,以及贴附在 该结构11上的可被合适的入射束5激励以生成X射线6的物质体或 者靶层20。样品室10如此设置,使得至少一部分所述射线6穿过样 品腔12,从而照射该腔中的样品7,然后从所述结构中射出,接受X 射线探测器35的探测。 装置10包括一个相对较厚的底层/隔离层22和一个相对较薄的窗 口层24。所述两层之间有一定距离,以形成所述样品腔12,该腔在侧 面由一圆周侧壁26封闭。靶层20系通过汽相淀积技术比如磁控电子 管喷镀、热发射或电子束发射或化学汽相淀积(CVD)而镀到所述底 层22的主表面23上,该面对于所述样品腔12来说是外表面。 在另一种方案中,所述样品腔12可以是开放的,但是,尤其是用 于在自然条件下或实验室中研究生物样品材料时,其最好用密封垫圈 或者其他合适的方式比如键合聚酯薄膜(bonded mylar)或环氧树脂 加以密封。 在本实施例中,所述可激励物质靶层20是一个被激层,其通常由 原子序数足够高的物质组成,以在电子束的激励作用下提供易于穿透 该被激层及所述样品室其余部分的中性到硬性X射线(>~1keV)。合 适的材料例如包括金、铂、铜、铝、镍、钼和钨。该靶层20的厚度通 常可以在10nm到1000nm。该层厚的选择要依据所希望的有效源大 小,而后者尤其受到所需要的视场及激励射束的几何形状的影响,因 为,由在所述被激层中激励产生的X射线源发出的X射线有一个发射 角。 在用电子激励靶层20的情况下,该靶层可能需要电接地,以防止 靶层充电,如果该层是导体的话。别的通过所述底层借助于热传导冷 却所述靶层的改进措施也可以很有好处。 入射粒子或射线束,在此优选实施例中是电子束,最好有足够的 能量,以激励出具有成像所需特征能量的X射线或成像所需的X射线 韧致辐射波段。在由电子束激励的情况下,电子的能量最好是这样的, 即,相对于建议在成像中使用的干线(principal lines)特征X射线能 量,其具有足够的超压,以产生足够的X射线强度。这要求电子的加 速电压可能在1kV到150kV。 所述底层或隔离层22的可能作用方式如下: (i)作为相对较薄的靶层20的物理支承; (ii)作为隔离层,以提供样品和射线源之间的可控隔离; (iii)作为透射射线的能带过滤器; (iv)作为靶层的辅助冷却装置。 在此,其厚度可以在1μm到500μm。该厚度是控制要得到的放 大倍数的主要决定因素。该层的另一功能是减小在其上产生相对较硬 的X射线的层厚,为此,与靶层20相比,该层通常要由原子序数较 低或密度较小的材料组成。合适的材料包括:精制硅(商品化的晶片), 研磨或抛光的玻璃,铍、硼、云母、青玉、金刚石的薄层及其他用作 底层的半导体材料。这些材料可以加工出接近原子级的光滑表面。在 用作底层时,该层最好能够为被激材料薄膜(层20)提供物理支承, 且最好: (i)高度均一,即,在原子级别上密度、厚度均一; (ii)具有极为光滑的表面。 以便不会显著降低由所述被激层产生的X射线波场的空间相干 性,也就是保持照射样品的入射射线束的高度的空间相干性。这样, 基于在国际专利公开说明书WO96/31098中所描述的设计,图像衬度 就得到了最优化。 层22另外的一个功能是截去电子束在所述被激层中的溅射和散 布,从而缩减X射线源的有效尺寸。在特定情况下,如果所述靶材料 力学上足够稳固,且如果靶厚并不会加剧X射线源有效尺寸的扩大的 话,可以不需要层22。 对所述样品室的所述基础设计的一种可能的修改是,挖空所述底 层/隔离层,以减弱吸收效应(尤其是在激励低能X射线比如AlKα 的情况下)。在图2中示出了加以修改后的这种通常类型的样品室10′, 在该图中,加撇的相应标号表示与前图中类似的部件。在层22′中形成 的空腔标为30。在该空腔30和样品腔12′之间有一个剩余的薄部22a。 该剩余薄部可以在样品一侧再镀上类似于薄层20′的一薄层材料25, 但该层的目的是用作低能X射线的吸收过滤层。 出射层或者窗口层24、24′的作用可以是容纳所述样品,还可以过 滤掉所述底层/隔离层22、22′被激产生的任何不希望有的X射线。所 述底层/隔离层的有效源尺寸比被激层的要大,从而导致分辨率的损 失,所以需要上述过滤过程。用于该出射层或窗口层的合适的材料可 以是卡普顿(聚酰亚胺薄膜)、铝、聚酯薄膜、硅和锗。层24最好是 光滑的且具有均一的密度,以避免在图像中因为相衬效应而产生额外 的图像纹理。合适地选择所述厚度,以实现充分的能带过滤及对其中 被封闭的样品的充分的物理支承。该出射窗口还可以镀上一层合适的 X射线选择吸收剂。 对所述样品室的另一种改进为图3中的10″,其可使图像的放大 倍数在相当大的范围内变动,比如从100倍到100 000倍。在图3中, 类似的部件以带双撇的相应标号指示。放大倍数的改变是通过提供可 激励靶层20″和底层22″而实现的,所述靶层和底层整体作为一个可在 一圆周壁42内朝向或背离22a部分平动的单元40。或者是,所述周 壁结构42可以朝向或背离所述靶层20″平动。 在另一种改进方案中,靶层20可以在一连续的底层22上被分割 或刻图。图4示意了一个举例性的方案,其中,构成靶层20的金点 20a间隔分布在一个硅基底22上。这种设计的优点是,用较宽的、聚 焦不那么严格的电子束5仍然可以生成“源”尺寸可精确预测的X射 线束6。 所述的样品室通常可以用微切削加工技术或普通技术加工成选定 的尺寸,使之可以作为一个完整的独立单元,在其样品腔12中预置入 样品7之后,被插入一种或多种类型的商品化电子显微镜或显微探针 的样品载物台中。图5正是示意了一扫描电子显微镜(SEM)中基于 图1的实施例的这样的装置。样品室10在装上样品之后被置放在一个 支座50中,后者然后被悬挂固定在样品载物台60的上壁61上。支座 50包括一对带有内折的底翼52a、53a的固定侧壁52、53,该两侧壁 悬垂固定在上壁61上。在所述底翼52a、53a上,支承有可调的滑轨 54、55。各相应的压力调节器(piezo-actuators)56对滑轨54、55相 对于侧壁52、53在水平方向上,对样品室10相对于滑轨54、55在垂 直方向上,进行精确的细调。 样品室10在载物台上壁61上的一个照射孔62的下方对中,通过所 述照射孔,一电子束从保持在一扫描线圈72中的屏蔽管70内射向靶层 20。该电子束系从一合适的电子束源(图中未示出)生成,被一聚焦 磁体75环绕以将该电子束聚焦至靶层20上。对于极高空间分辨率X 射线成像,所述电子束源最好是场致发射极尖电子源,以使点源尺寸 最小,从而增强如早先所述的侧向空间相干性(lateral spatial coherence)。 样品载物台60用作针对杂散辐射的屏蔽,如同在通常技术中一样 被固定在一个可进行大幅垂向调节的支架64上。整个装置安放在一个 易抽空的由一层外壁76构成的室77中。在该装置的侧边装有一个辅 助电子探测器78,以帮助准直和聚焦。 样品载物台60还包括一个环形部分66,其有一个中央孔67,该 孔由一个带驱动装置69的光阑68控制。样品载物台60的底部63支 承有一个X射线记录介质,用作探测器35,在此,其处于真空状态。 但应当注意,在许多情况下,探测系统可以在所述真空室之外,如果 是这样,就要在所述外壁76上设置合适的X射线透窗装置。另外, 在本发明的另外的改进方案中,所述样品室本身可以构成所述外壁76 上的真空窗。 使用上述的改进方案,就可以用显微镜来实现X射线吸收衬度成 像或相衬成像:X射线6在穿出窗口层24之后,在X射线记录介质35 上被探测到。使用CCD探测器的X射线成像系统或者感光的荧光成 像板适合用作所述记录介质35。扫描仪可以用来影印所述成像板。本 发明另一种有有益效果的实施例中,使用二维能量析像探测器,比如 基于CdMnTe者,或者超导Josephson结,以同时生成各对应于一个 X射线窄能带的一个或多个有效的X射线图像。所述图像是可用于本 申请人待授权的国际专利申请PCT/AU97/00882所述的相位恢复方法 (phase retrieval methods)中的相当适合的数据,尤其适合用于本文 所述的显微成像所要求的高空间分辨率成像。 示于图4的设计适用于显微物体和显微特征,包括细小的生物系 统比如病毒、细胞,可能还有生物大分子,的极高空间分辨率成像。 该方案使得可以实现极细小的有效射线源尺寸,从而可以通过使源物 距离非常小(直至几十微米量级或更小)同时使物至像平面的距离在 宏观量级比如约10到100mm而获得高空间分辨率和高效的放大倍数。 入射电子束5在靶上的聚焦宽度最好在10到1000nm。如前所述,为 了使相衬成像效果最佳,如同本申请人待授权的国际专利申请 WO96/31098所述,除了样品之外,所有的部件都应当尽可能地保持X 射线束高度的侧向空间相干性,在实践中,这意味着,这些部件应具 有极为光滑,事实上为原子级光滑的表面,而且最好具有高度均一的 密度,也就是说,各部件应当高度均一,没有宏观缺陷和杂质。 所述X射线基本上既可以是多色的,也可以是单色的,这要随用 途和图像的生成方法而定。在后一情况下,最好对单色性进行增强, 例如通过合适地选择材料和/或撞击所述靶层的电子的激励电压。在前 一情况下,最好使用能敏探测器。 图6示出了另一种实施例,其中,样品室110装在样品载物台上 壁161的照射孔162中。孔162包括一个总体上为圆柱形的腔200, 后者具有一个渐张的或锥形的上开口202和一个直径缩小的下开口 204。腔200被一个固定的圆周环126分为下部和上部。所述圆周环 126类似于图1所示实施例中的侧壁26。用来放置样品127的一个窗 口台124被可调节地放置在一个唇状的环轨154上:与前文所述的实 施例一样,由压力调节器156、157对样品的位置进行侧向和轴向的调 节。 一个包括靶层120和底层/隔离层122的组合板置放在环126上, 并且,如果需要的话,在顶上再设置一个固定环95,就完全完成了样 品室的组装。可以看到,样品腔112部分地是由底层/隔离层122、环 126和窗口台124限定而成的,所述靶层到样品的间距可以由压力调 节器156、157在轴向上进行调节。 当然,一般来说,在显微镜中可以调节所述靶层或样品载物台以 改变放大倍数。 图7是对图6所示实施例的修改,其中,类似的部分以带撇的相 应标号表示。在此,所述部件形成一个由侧壁152限定而成的独立的 装置150,该装置密合安装在开口204′的边缘203之上的腔200′中。 在所述侧壁152上固定有分隔环126′,所述侧壁还有一个内折的底翼 152a,用来滑动支承唇状环154′。 在前述的每一个实施例中,只有单个样品腔12。为了特定的用途, 一个独立的样品室装置可以形成具有分立的样品腔的多个子室。 下面对扫描电子显微镜中的利用所述样品室进行X射线成像的装 置的重要参数作一详细说明。为了此说明的目的,下列示于图1中的 参数值可能要用到:这些值是适合用于实施本发明实施例的典型值或 有代表意义的值。 t1靶层20的厚度 10nm(及100nm) t2支承/隔离层22的厚度 10微米 t3样品腔12的厚度 几微米(通常t3≤t2) t4窗口层24的厚度 几十微米,但此参数不是关键参数 α入射电子束5的会聚角 2° βX射线束6的角宽 10° loi窗口到探测器的距离 100mm 由于源尺寸有限而导致的图像模糊现象 由于射线源的尺寸有限而导致的像平面上的图像模糊在下述空间 量级(spatial scale of order)上: ~|t1sin(β/2)|+|t1tan(α/2)| 这里仅考虑了纯几何效应。 对于为上述参数所选定的数值,该式给出的值约为1nm,因此在 所取参数的情况下该值可以忽略不计。 放大倍数 影响放大倍数的主要几何参数M示于图8的示意图中。利用该近 似,图像的放大倍数可由下式给出: M≈(loi+t2+t4)/t2~loi/t2 对于loi~100mm,t2~10μm: M=100/0.01=104。 因此,物体上的2.5nm大小的细部特征在图像中看起来有 0.025mm(25μm)大。这样就可以与利用基于电荷耦合器件和感光的荧 光成像板的高分辨率数字X射线成像系统可得到的一般空间分辨率相 比拟了。 视场 为了有对样品(物)的大视场,希望β和t2都大。所述视场为 =2t2tan(β/2)≈2t2β/2 对于在前选取的特定参数值,在物平面处: ~2×10×tan(5°)≈2μm 如果使用电子成像系统,通过扫描所述探针束,从同一样品可记 录到许多图像。一个2微米的样品视场在像平面上对应的面积为 (2×104)×(2×104)(μm2)=20×20(mm2) 这也与高分辨率电子成像系统比如CCD成像系统等的视场相当匹 配。 衬度和分辨率 要对衬度和分辨率与用微聚焦射线源进行X射线成像所涉及的关 键物理参数之间的关系进行详细的分析,会涉及以下关键量: s 射线源尺寸 R1 射线源到物平面的距离 R2 物平面到像平面的距离 λ X射线的波长 u=1/d 其中,u是在物体中的空间频率,其对应的空间周期为d D 像平面上的空间分辨率 α 在准平面波的情况下的角偏向(angular divergence) 本发明人同其他人一起,对于对薄物体的部分相干照射的衬度和 分辨率进行了经典光学处理,文章发表于Rev.Sci.Instrums.68(7)July 1997(在本申请的优先权日之后)。对于吸收衬度和相衬对成像的作用, 处理结果均可以表达为光学转换函数。在本说明书所附的表1中,归 纳了决定X射线显微成像之衬度和分辨率的一些关键条件。更为具体 地,可以看出,在球面波情形下(当前情形下),最佳相衬由下式给出: u=(2λR1)-1/2 取R1=10μm λ=0.1nm 则有d=1/u~40nm。 由于射线源尺寸有限(比如s=10nm),对分辨率的相干限制dlow 是 u=1/s=108m-1或者dlow=10nm。 u的清晰度上限1/s是与上述最佳相衬相应的,在上述情形下,系 当R1=s2/2λ=(10×10-9)2/(2×10-10)=0.5μm时。 这些结果,对于给定X射线波长条件下要得到最佳衬度所需的关 键参数的大小,给出了一些感性的认识。 对图像密度数据的分析,以及有效纯相(effective pure phase)图 像和吸收衬度图像或者混合图像的分离,最好基于麦克斯韦方程或其 合适的变式,例如,利用傅里叶光学或者合适的强度转换方程 (Transport of Intensity Equations,TIE),如在本申请人早先在此领域 的申请中,尤其是在待授权的国际专利申请PCT/AU97/00882中所陈 述者。 为了帮助说明在利用本发明对极细小物体进行X射线显微成像的 情形下所预期的衬度和分辨率的特性,在图9到图12中示出了几个计 算出来的说明性X射线强度分布图(图像截面)。这些计算是针对简单 的圆柱形样品(物)——不同尺寸的聚苯乙烯纤维,在不同的成像条件 下进行的,其中,X射线为1keV,R1(射线源到物的距离)可变但 R1+R2(R2是物像距)不变。主要的可观测特征是用1keV的X射线可达 到的衬度和分辨率水平。在一级近似情况下,可以从表1所给的结果 得到最大衬度的条件。 据以绘制图9到图12的计算是利用基于电磁辐射传播的Kirchhoff 方程的波动光学进行的。所述计算涉及相当多的数值积分。吸收和相位效 应都考虑到了。如图中可见,曲线表示像平面上的强度,其依赖于到物的 距离。四幅图的纤维直径各不相同,但X射线都是1keV,R1+R2 都固定在10cm。每一幅图都示出了R1(从而可知R2)的不同的值的曲 线。垂直的虚线标出了有关纤维的边缘。即使对于最细的纤维(0.05μ m),对于合适的R1值,也有大约4%的衬度,这样的值是有用的。单 位强度值对应于在没有物时所获得的强度。 X射线显微镜中的物体再现 样品(物)的投影结构,基于物的性质和所希望达到的精确度和复杂 度,可以多种方式对一个或多个数字化图像进行重组而得到。在此, 重组意味着要确定物体的投影折射率的实部(折射)和虚部(吸收)沿着光 轴的分布。 在许多情况下,尤其对于显微镜一般所观测的薄物体而言,最为 有用的出发点或许是下述线性化衍射方程(1维): 其中,λ是X射线波长,z=R1R2/(R1+R2),并且,对于显微成象, z≈R1,而I、φ和μ分别是图像强度、物体相位和吸收传播函数的傅 里叶表达式。变量u代表空间频率。假定入射的单色平面波在z方向 传播。这里的讨论是在平面波情形下进行的,但对于显微技术来说, 球面波事实上更为合适。通过适当的代数变换,球面波的情况可以从 所述平面波的情形推导出来。 通常,不可能仅测量一次I(u)就同时确定φ(u)和μ(u)。至少需要 利用不同的z值和λ值进行两次独立的测量。但是,如果是纯相位物 体(pure phase object),则式(1)中的最后一项消失,仅测量一次I(u), 也就是仅测量一幅图像,原则上就足以确定φ(u),也就是由于物体的 存在而导致的相移的空间分布了。但是,即使在这里,进行若干次测 量也是有好处的,这样可以减少噪声的影响,以及“迁移函数”sin(π λz u2)的零值的影响,对于特定的空间频率u值,这二者会导致信息 的损失。这就是在本方法中,“焦距”z和/或波长λ的可变性被视为有 用的性能的原因之一。 对于充分小的λz u2值,式(1)还可以进一步简化,即,式中的sin 项和cos项可以展开为一阶,从而得到: I(u)-I0(u)≈-2πλzu2φ(u) (2) 该式类似于所述强度转换方程的形式(M.R.Teague J.Opt.Soc.Am., A73,1434-41,(1983);T.E.Gureyev,A.Roberts,& K.A.Nugent,J.Opt. Soc.Am.,A12 1932-41,1942-46(1995);Gureyev & Wilkins,J.Opt.Soc. Am.A15,579-585(1998).)。该式描述了已经被证明(见Wilkins等,《自 然》(1996))了的微分相衬方法(Pogany,Gao,& Wilkins,ReV.Sci. Instrum.68,2774-82(1997))。 如果线性理论不适用,则可以回到Fresnel-Kirchoff基础衍射方 程(傅里叶空间): F(u)=exp(-ikz)Q(u)exp(iπλz u2) (3) 并尝试求得能最好地模拟观测到的强度I(x)=|F(x)|2的物体透射函 数(object transmission function)Q。这可以反复迭代进行,类似于光 学全息图像和电子显微镜图像的再现(恢复)的数值形式中所用的方式, 并有人描述过若干种方法(J.R.Fienup,″Phase Retrieval Algorithms:A Comparison″(相位恢复算法的比较),Appl.Opt 21 2758(1982);R.W. Gerchberg and W.O.Saxton,Optik(Stuttgart)35 237,(1972))。但是, 收敛常常非常慢,因此,算法还有相当大的改进余地。 上述内容涉及的均是物体结构的一维或二维投影。对于三维物体 的再现,通常需要至少两次投影(体视术)或更多次投影(用于X射线层 析照相)。在本方法中,利用射束的偏转可以实现前者;后者则需要有 精确旋转样品的装置,所述装置可以由普通的机械装置实现,但要在 本发明所述的标准显微镜结构的基础上作进一步的改进。 所述样品室及与之相关的高分辨率硬性X射线成像(尤其是相衬成 像)方法的优点如下: ·极高的空间分辨率(即,高效的放大倍数)。 ·可作为专用样品室与高分辨率扫描电子显微镜结合使用。 ·可用来在电子显微镜中在自然条件下或实验室中研究生物样 品,不必要求生物样品本身处在真空中,尽管样品室是在真空中(但样 品室被适当地密封,例如用密封垫圈或环氧树脂)。 ·由于具有在比通常的生物材料软性X射线显微术更高的能量下 获得图像衬度的能力,减少了辐射对样品的伤害。 ·可以通过使用不同的被激靶材料和/或电子加速电压而改变X 射线特征能量。 ·由于是整体结构,提高了机械稳定性。 ·样品室的出射窗可以用作低能X射线的带阻过滤器(rejection filter),因而去除(清除)了不想要的背景辐射(尤其是来自所述底层/隔 离层的背景辐射),所述背景辐射由于具有较大的有效源尺寸而可能损 害整体的分辨率。 ·样品室的容积可以做得相当小。甚至可以通过合适的密封垫圈 和施加压力而现场调节其容积,从而可以作适当的调节,以改善样品 有关的特定特征的清晰度。 ·样品室一般可重复使用。 ·通过显微镜中的合适的加热载物台,样品室可以被维持于例如 室温。 ·可以通过迁移电子束或者平移样品室而观察大面积的样品,并 可记录不同程度的曝光量。 ·通过使用所述辅助电子探测器,或者通过使用电子成像探测 器,可以方便地监控电子束在被激靶上的聚焦。 ·或者通过使激励射束在靶上扫描,或者通过转动整个样品室, 可以实现有限区域内的计算机化X射线层析照相(CT)。 表1 无透镜轴向式成像(in-line imaging)的特征总结 (据Pogany等,Rev.Sci.Instrums.1997年7月) A.总体上 优点:设备简单,也就是,无透镜,无反射镜,无像差。 一般的单色性要求。 类似于现有的X射线照相系统。 减少了非相干的散射的影响。 波幅和相位信息均可从强度数据得到。 缺点:要求高度侧相干的源。 可能需要合适的图像再现方法。 有效的物理放大倍数受到源尺寸及样品与源间的隔离的限 制。 无法物理接触焦平面,从而要考虑使用各种不同的对比机制。 对射束路径上的部件比如窗口和过滤装置的质量的敏感度提 高了。 表1续 有关的量 平面波R1>R2 球面波R2>R1 B.相位衬度 最佳衬度:u= (2λR2)-1/2 (2λR1)-1/2 相干分辨率限度:u= 1/α R2 1/s 清晰度,u的上限 无 1/s,在R1=s2/2λ时有最 佳衬度 清晰度,u的下限(如果对 微分相衬作一些修正,该 下限则可大幅减小) α/2λ(=相干宽度-1),在 R2=2λ/α2时有最佳衬度 无 (相干宽度=λR1/s) 对高分辨率的限制 平行性(collimation),探 测器分辨率,物与探测器 的接近度,能量的散布 (energy spread) 源尺寸,物与探测器的 接近度,能量的散布 C.吸收衬度 清晰度,u的上限 无;条件是R2<1/uα 1/s,任意R1 清晰度,u的下限 无 无 对高分辨率的限制 探测器分辨率,物与探测 器的接近度,能量的散布 源尺寸,能量的散布 |