增强纳米分光镜扫描的方法和装置 |
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| 申请号 | CN200580034050.0 | 申请日 | 2005-10-05 | 公开(公告)号 | CN101036039B | 公开(公告)日 | 2012-04-04 |
| 申请人 | VP控股有限公司; | 发明人 | V·波波尼恩; | ||||
| 摘要 | 一种确定线性聚合体样品中化学基团序列的同一性的装置和方法。该装置包括具有由等离子共振金属所形成镜表面的基体、光束源和由一个或多个设置在限定探测区域开口处周围的等离子共振粒子构成的透镜组件。当光束定向在探测区域的样品上时，粒子布置成在多个纳米透镜和基体表面上的面对的探测区域间产生近场电磁间隙模式。还包括一个探测器和一个 平移机构 ，该探测器用于接收由探测区域中样品所放射的或从样品所散射的光，并将接收到的光转换成间隙模式增强拉曼 光谱 ，由此识别探测区域中样品的取样化学基团，该平移机构用于相对于透镜组件移动样品，通过透镜组件的开口。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于确定线性聚合体样品中化学基团序列的同一性的装置，该装置包括： |
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| 说明书全文 | 增强纳米分光镜扫描的方法和装置技术领域[0002] 参考文献 [0003] 引用下列参考文献作为本发明的背景技术和/或作为提供可能应用于本发明的特定方面的方法。这些参考文献作为参考合并于此。 [0004] G.R.Brewer，Electron-Beam Technology in MicroelectronicFabrication，Academic Press，NY，1980)。 [0005] David Ginger等人，“The evolution of Dip-Pen Nanolithography”，Angew.Chem.Int.Ed.，v.43，p.30-45，2004)。 [0006] S.Hayashi，“Spectroscopy of Gap Modes in Meta Particle-SurfaceSystems”，Tpoics Appl Phys 81：71-95(2001)。 [0007] I-K.Kneipp 等 人“Ultrasensitive Chemical Analyses byRamanSpectroscopy”，Chem.Rev.，1999，vol.99，p.2957-2975，see p.271)。 [0008] J.Li等人“DNA molecules and configurations in a solid-statenanopore microscope”，Nature Materials，vol 2，p611-615(2003)。 [0009] V.Matyushin，A等人，“Tuning the setup of sputter-coated multilayersin nanocluster-based signal enhancing biochips for optimal performance inprotein and DNA-assays”J.Nanoscience and Nanotechnology Volume 4，Number 1/2(January/February 2004)，pp.98-105(2004)。 [0010] D.McCamant，“Femtosecond Broadband Stimulated Raman：A newApproach for 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扫描尖端方法已经适合于表面映射的光学探测。例如美国专利No.6,441,359中公开了一种近场光学扫描系统，其中近场光学器件承载在悬臂梁的自由端。该专利还公开了用于构建一排这种光学扫描系统的光学元件的微型制造方法。装置中尖端到样品的距离通过光学水平(level)偏转系统控制，以保持顶端靠近样品表面。该系统能通过扫描亚波长尺寸的孔径或通过扫描很接近于样品的固态浸没透镜来获得亚波长解析度。该装置并非设计成或可用于探测单个化学分子或基团，因为其所能产生的信号电平非常低。其他人(如Wolf)已经提议了扫描近场光学显微镜(SNOM)。 [0024] 一种用于化学分析的非常敏感的探针是表面增强的拉曼光谱或SERS(参见如Kneipp)。此外，SERS已经被应用于从样品表面获得高解析度光谱信息的高解析度扫描显微镜中，如美国专利No.6,002,471。该装置包括一个在扫描悬臂梁自由尖端的小型导电元件(一个等离子共振粒子或PRP)，以增强探针附近所放射的光。样品基体(substrate)由玻璃形成。该专利没有揭示或建议用于使用电磁间隙模式的方法来增强光谱解析度，该光谱解析度可能用于解析度单个化学结构，如DNA碱基，该专利也没给出建议能解读多个样品如一段平行DNA链的系统。 发明内容[0025] 一方面，本发明包括一种确定线性聚合体样品中化学基团序列，如核酸中的碱基序列的同一性的装置。该装置包括具有由等离子共振金属所形成镜表面的基体、光束源和由一个或多个设置在限定探测区域开口处周围的等离子共振粒子构成的透镜组件。当光束定向在探测区样本上时，粒子布置成在多个纳米透镜和基体表面上的面对的探测区域间产生近场电磁间隙模式，在多个纳米透镜和基体间的间隙中具有40nm或更小的选定间距。还包括一个探测器和一个平移机构，该探测器用于接收由探测区域中样品所放射的或从样品所散射的光，并将接收到的光转换成间隙模式增强拉曼光谱，由此识别探测区域中样品的取样化学基团，该平移机构用于相对于透镜组件移动样品，通过透镜组件的开口移动到探测区域内样品的下一个化学基团的位置上。 [0026] 该装置可进一步包括调焦机构，用于靠近或远离基体表面移动透镜组件以获得选定空间。 [0027] 透镜组件中的纳米透镜可以包括至少三个关于一中心轴对称布置的等离子共振粒子，该轴垂直于基体表面的平面，其中每个粒子的最大尺寸都小于200nm，跨过任何一对粒子的距离基本小于光束的波长。粒子可以是球形或椭圆形，它们的主轴定位于与中心轴相交。 [0029] 在一个普通实施例中，基体限定出一个与纳米透镜中形成的开口排成一行并有间隔的开口，并且平移机构运行以推动线性样品穿过基体和透镜开口。平移机构可以包括用于推动样品穿过该设备并穿过基体和透镜开口的电场。可选择地，样品可以在其相对端区域连接能与激光或磁性镊子效应器相互作用的粒子。这里，平移机构可以包括用于与粒子相互作用并推动样品穿过隧道和基体和透镜开口的激光或磁性镊子效应器。 [0030] 在另一个通常实施例中，透镜组件承载在其中具有开口的悬臂梁上，光束穿过该开口并被透镜探测区域接收。样品适用于固定在支架的一端上，并可螺纹移动地通过透镜和悬臂梁开口，其中，由平移机构产生的支架相对悬臂梁的运动对于推动样品穿过透镜组件开口有效。为了对多个线性样品的定序，该装置可以包括多个这种悬臂梁光束，和相关的透镜组件。 [0031] 另一方面，本发明包括一种确定线性聚合体样品中化学基团序列，如核酸中的碱基序列同一性的方法。该方法包括推动样品穿过透镜组件的开口，透镜组件由一个或多个设置在该开口周围的等离子共振粒子组成。如上所述，粒子在开口处限定了一个探测区域并且被布置成当光束定向到探测区域的样品上时，在多个纳米透镜和基体表面上的面对的探测区域之间的空间中产生近场电磁间隙模式，其中基体具有由等离子共振金属形成的镜表面，而且多个纳米透镜和基体表面之间的间隙具有小于或等于40nm的选定距离。当样品被推过透镜组件开口时，光束定向到具有探测区域的样品上，由探测区域中的样品所放射或所散射的光被接收并转换成间隙模式增强拉曼光谱，由此识别探测区域中的取样化学基团。 [0032] 上述为用于实现本发明方法的各种结构性实施例。 附图说明[0034] 图1示出了根据本发明一个实施例构造的装置中的部件的布置； [0035] 图2a图示了通过将循环偏振光束引向根据本发明的一个实施例构造的具有六粒子纳米透镜的纳米透镜产生的导致近场电磁间隙模式的电磁现象，并且图2b显示了在2和6PRP间形成的纳米透镜； [0036] 图3a和3b示出了根据本发明的具有集成纳米透镜的悬臂梁端区域的透视图(3a)和横截面图(3b)。 [0037] 图4示出了具有固定于基体上表面的一排拉伸的DNA链的基体； [0038] 图5a和5b以透视图(5a)和横剖面图(5b)图示了本发明中使用的用于探测一段拉伸的DNA样品中连续单个碱基的光学现象； [0039] 图6a、6b和6c示出三缘星银纳米透镜的数值模拟结果。图6a示出在纳米透镜中心的场振幅的频率相关性，对应于2.45eV的等离子共振，图6b示出了沿y轴的场分布；和图6c示出了从顶端看出的场分布轮廓图。 [0040] 图7a，7b，和7c分别如图6a-6c，但显示四缘星银纳米透镜的数值模拟结果； [0041] 图8显示沿X轴的四缘星纳米透镜中的场分布，显示了PRP表面附近3000的最大放大率， [0042] 图9图示与纳米孔装置结合的等离子纳米透镜；和 [0043] 图10图示了与具有一排尖端的扫描装置结合的等离子纳米透镜。 具体实施方式[0044] A.定义 [0046] 样品中的“化学基团”可以包括聚合体中的亚基，或亚基一部分，如核酸碱基，或化学取代分子基团，如羟基、胺、烷基、酸或醛基团。这些化学基团特性通过独特的增强拉曼光谱信号或特征表现。 [0047] “间隙模式”指的是当等离子共振粒子被设置在金属表面附近(小于40nm)，优选等离子共振金属表面时，由外部电磁场在两个或多个等离子共振粒子间的距离间激发的电磁正交模式或电磁特征值。等离子共振粒子的例子是具有最大典型尺寸在5nm到200nm大小范围内的银或金粒子。 [0048] “间隙模式增强拉曼光谱”的样品涉及在样品的拉曼光谱中的光谱特征，该样品通过样品的间隙模式的存在增强。 [0049] B.用于纳米-光谱扫描的装置 [0050] 图1显示了一个装置，通常用35表示，用于检查附在表面的样品中化学基团的同一性。图中显示的是扫描台90和DNA芯片(chip)80，载于台上并具有多个拉伸的DNA链，如固定在芯片表面并且彼此平行的链82。用于固定拉伸的聚合体链如DNA链到芯片表面的方法将在下面讨论。根据这个实施例中的一个重要特征，支撑样品的芯片表面上具有等离子共振金属覆盖的镜面涂层，例如银、金或铝。 [0051] 所述DNA链通过扫描台90，如压电或电磁运动控制台扫描。具有电磁运动控制的台子允许扫描范围达到几十厘米或更多，从而允许扫描具有全部个体染色体的单分子DNA芯片。 [0052] 优选激光10产生的相干的、循环偏振光束。该激光可以包括两种用于执行非线性拉曼光谱如CARS和毫微秒感应拉曼光谱(D.McCamant)的激光器。代表性的激光系统用具有脉冲调制的和连续运行模式的Ti-蓝宝石(Ti-Sapphire)可调谐激光器。激发光束的波长优选被选定和调整到接近等离子共振基体的等离子共振吸收光谱中的最大光谱高峰。用等离子纳米透镜扫描的情况下，应该考虑对整个系统(等离子纳米透镜+等离子共振基体)的等离子共振吸收光谱调节频率。重要的是要注意到，由于等离子纳米透镜与等离子共振基体纳米透镜表面的纳米级(nanoscopic)接近度，所以等离子共振的吸收光谱被改变。 [0053] 光束通过光束放大器放大，或者在光波栅20中转换为扫描光波。用这种方法，单个光束分裂成一排光束，每个光束都定向进入纳米透镜60排列的个体等离子纳米透镜的光束。每个个体光束穿过光束分束器30和准直光学器件40定向到显微透镜排列50。显微透镜排列允许个体数字式控制定向进入个体等离子纳米透镜的每个个体光束，如排列60中的透镜62，承载在悬臂梁的自由端，如束64，将在下面更详细描述。 [0054] 如下文所述，本发明中描述的等离子间隙模式纳米透镜是基于局部等离子(电子的集体振荡)的能力，通过外电磁波激发内部金属纳米粒子以增强非常接近等离子共振表面附近的近场地带电磁场，并在非常小的纳米级空间内将其局部化。这种非传播电磁场是集中在靠近(几十纳米30-40nm)纳米粒子表面，并称为“近场电磁场”，以将其与远场地带的传播电磁场区分开。 [0055] 继续参考图1，供给每个悬臂梁排列内的等离子纳米透镜的光束可以通过由微机械加工的镜组件50调整，如Texas Instruments，Inc.，Dallas，Texas，出售的，商标为“数字式微镜装置”。该系统允许数字控制每个个体等离子纳米透镜照明和读取来自每个等离子纳米透镜的信号。系统对高速单独编程可选址的多波段脉冲模式照明的数字控制的执行特别有益，而且获得的散射信号对于执行超声的快速DNA排序引导数字化的序列信息进入计算机存储器。 [0056] 反馈悬臂弯曲系统保持等离子纳米透镜和样品DNA间的距离。这种控制系统是公知的并且描述为原子力显微镜，例如美国专利No.5,883,705中，或近场扫描光学显微镜，例如美国专利No.5,354,985中，这些专利在此引用作为参考。一种方法用于扫描过程中个体激发和控制排列60中的每个悬臂梁，如美国专利No.6,441,359中详细描述的，使用压力-电阻器反馈控制，也在此引用作为参考。 [0057] 每个等离子纳米透镜和相关DNA样品间距离优选保持在0.1nm到几纳米的水平，以便通过如图2和6a和6b中显示的激发近场电磁间隙模式以在纳米透镜和DNA样品和基体表面之间的间隙中获得最适宜的场放大和局部化(localiztion)。因为每个纳米透镜和样品的基体表面之间的间隙发生变化，电磁间隙模式的定位和强度也变化。因此，为了获得最大分散光(读出)信号和最大空间分辨率，通过改变纳米透镜和DNA样品(或基体表面)间距离可以控制电磁间隙模式的形状和局部化。通过优化这些间隙模式，可以获得允许辨别固定在基体表面的DNA链中的个体碱基的分辨率水平。根据芯片上DNA链的过度延展水平，对空间分辨率的需要随着碱基的不同、链的不同而不同。但是，距离的范围是从几纳米到小于1纳米。 [0058] 图1中显示的实施例中，从每个等离子纳米透镜与个体DNA碱基相互作用的散射几何图形的光反射向后穿过微透镜排列50、准直光学器件40和光束分束器30进入光纤带100的接收端。然而，可以理解的是，本发明不限于后向散射收集的光。在本发明的其他执行方式中，照明和收集几何图形可以是其他后向散射几何图形，这种情况下光照明和收集光学系统可以分开。 [0059] 散射信号光穿过光纤带100定向到多波段光谱分析器110的单色仪裂口上。使用凹口滤波器来消除入射光。衍射光栅120将散射光束分裂成一组单色光束，单色光束将变成个体拉曼光谱。在探测排列130上获得的光谱然后转换为数字式并传送到计算机140，在计算机中处理它们以产生芯片上DNA样品的序列信息。另一合适的光学设计(其中未示出)利用干涉仪探测法，如已经在先公开了(例如，F.Zenhausen)。 [0060] C.纳米透镜的操作和制造 [0061] 这部分记载了特殊纳米透镜结构，其设计为设置在非常接近样品基体的光滑金属表面，从而当透镜被光束照亮时产生局部间隙模式，例如，相干和/或循环偏振光束。这些模式可以被用于指示分子的光学读数，设置在镜面基体表面的纳米透镜间，具有用于获得低于纳米级分辨率的高空间分辨率，并且具有允许单个小分子如DNA链的个体碱基的光学信号的探测的信号扩大。 [0062] 纳米透镜的最常规设计包括一个并优选多个(例如，2-6)相对于彼此具有选定形状和选定粒子几何图形金属纳米粒子。如下所示，一个优选粒子几何图形是粒子关于中心轴对称排列，尽管也可以设想其它几何图形如杂乱的不规则图形。形成透镜的纳米粒子可以具有不同形状和尺寸并且彼此以纳米级靠近放置。但是，每个纳米粒子和系统的最大尺寸作为一个整体都没有超过照明光的波长。纳米粒子大小范围在5-200nm之间，例如，优选为20-50nm。 [0063] 图2是悬臂梁160的一部分的细节透视图，悬臂梁160在其自由(远)端承载一个六粒子纳米透镜180。正如所见，来自激光源的循环偏振光束190定向穿过共焦透镜光学器件50到纳米透镜180上。纳米透镜放置在由透明的绝缘体形成的固定器170上，其可以在一个用于控制纳米透镜和扫描探针装置中的样品之间距离的悬臂梁160自由端的实施例中。纳米透镜设置在非常接近样品基体上的金属镜表面200。因为通过共焦光学器件定向的远场光可以聚焦到光点直径稍微小于或大约等于1微米的周围，这是由衍射光学器件所决定，而且纳米透镜的直径(围绕纳米透镜粒子182的圆周直径)优选在50-200nm范围内，即小于照明光的波长。在图中还看到，光照明面积(在350指示的虚线圆周)通常大于纳米透镜面积。因此，建立一个0.5-1.0微米直径的纳米透镜以匹配焦点是可能的。这种情况中，纳米透镜将作为纳米天线工作，其经过局部等离子激发将电磁能汇聚到纳米透镜中心。 [0064] 图2a中显示的实施例中，等离子纳米透镜185具有一个由六金属纳米粒子组成的类星结构，如粒子182，每个粒子都具有大偏心率(优选大于5)的扁长球体的形状，或具有一端半球帽的圆柱型纳米棒状，或金属纳米丝。该粒子几何图形还可以在图2B中的185处看到，纳米透镜粒子结构195、205、215和225分别为5、4、3和2粒子的透镜。 [0065] 正如以上注意到的，每个纳米透镜的照明优选通过激光束或圆偏振的非相干电磁波。在图2a的200处显示的电磁场的最大增强在靠近纳米透镜轴的透镜的中心部分获得。这区域具有小于或等于几纳米的直径。如通过图6a-6c、7a-7c和8、以下记载的数值模拟的结果显示，其可以在纳米透镜中心获得的场扩大因数达到1500-3000。那种扩大因数有效地超过了可以在由球形纳米粒子和现有技术中其他形状的纳米粒子组成的结构中完成的扩大。据报道获得的最大局部场扩大的数值模拟是300(H.Xu)。 [0066] 本发明的纳米透镜可以通过各种公知方法构造。通常，利用已有的基于电子束平板印刷或聚焦离子束平板印刷(G.R.Brewer)、或基于扫描通道显微镜平板印刷技术建立的方法，与悬臂梁整体构造纳米透镜。另一构造方法可以基于模板辅助自组合(Y.Xia)。可选方法如浸笔纳米平板印刷技术可以在不同支撑材料(e.g.，D.Ginger)或以自组合技术(e.g.，C.M.Niemeyer)为基础的DNA上制造等离子纳米透镜。在一个实施例中等离子纳米透镜可以集成到悬臂自由端，悬臂是扫描探针装置的一部分，并且扫描扫描探针设备的同时可以执行悬臂尖端控制纳米透镜和样品间距离的功能，扫描探针设备如原子力显微镜-AFM或扫描近场光学显微镜-SNOM。图3中介绍了等离子纳米透镜的一个可能的执行集成到扫描探针光谱装置中的悬臂梁。 [0067] 图3显示等离子纳米透镜如何被集成到扫描探针光谱装置的悬臂的一个自由端，并可以在样品扫描同时执行悬臂尖端控制纳米透镜和样品间距离的功能。悬臂160由不透明材料部分260的合成材料和形成光学窗口250的光学透明部分170所准备，允许入射的循环偏振光与纳米透镜180相互作用并且有效地激发局部等离子体(LP)和间隙模式(GM)。 [0068] D.包含基体样品的制备 [0069] 装置中基体或支撑被设计成增强非常接近表面的电磁场，并涂覆一层等离子共振材料的薄膜，如银、金或铝。膜厚度优选在25-200nm之间，例如，50nm。适当的基体，例如玻璃基体可以通过公知的方法涂覆金属膜，如真空蒸发或射频溅射工艺。典型的基体涂层和其生产方法在美国专利5,611,998中公开为“光化学传感器和生产方法，”该专利在此引用作为参考，及参照V.Matyushin，也在此引用作为参考。 [0070] DNA链长度，例如从100纳米到2.5毫米，设置在如在图1中82处显示的基体上。链间距离应该在200-300微米间并且应该对应于悬臂排列中邻近悬臂间的距离。优选距离为250微米，其对应于250微米节距，此为光学纤维带应用中的标准节距。 [0071] 图4显示在本发明装置和方法中应用的典型芯片或基体80。如图所示，获取的DNA样品，例如来自染色体DNA，长达到2.5毫米(5Mbase)的单链DNA碎片的形式。如在210处指示的，该链设置在具有等离子共振光学增强特性滑动表面80上。它们设置在有序的、可寻址的方式。DNA链的每一端在右/左条形码220a和220b上连接在互补的寡核苷酸上。各链之间的距离应当在200～300微米之间的范围内，且应该对应于悬臂列中相邻悬臂之间的距离。该距离优选为250微米，其对应于250微米的节距，该节距对应于标准光学纤维带中节距。 [0072] 公知的用于伸展和确定线性聚合体样品如DNA、RNA、核酸似物、多肽、线性碳水化合物方向的方法，例如，样品聚合体如DNA的相对端，可以被共价连接到如橡胶或玻璃珠的微球体上，然后该珠通过脉冲激光分子镊操纵直到获得一个合适程度的伸展，优选过度伸展。图4中图示的这种方法显示微球体290a、290b连接在DNA链210相对端。每个球体是通过激光束如束300a、300b“捕获”，用于操纵球体以伸展和确定基体表面上布置的链方向。一旦获得布置，链底区域通过与配置在基体条形码区域的互补寡核苷酸固定到基体上。记载的用于捕获和操纵激光束中的微球体的方法，例如，美国专利No.5,620,875中和美国专利申请No.2004/0001371中，其全部内容在此引用作为参考。 [0073] 在相关方法中，聚合体链的末端共价地配置到磁珠上，或配置到固体支撑和磁珠，磁场(或多个)应用于珠(或多个)直到获得适当的伸展度和链方向。更通常，链相对端可以配置到一对相对移动的支撑上，该确定支撑位置直到产生理想的伸展度和方向，如美国专利No.6,342,353中公开的一样，该专利通过与此引用作为参考。 [0074] 通过电泳在狭窄微通道内将带电的聚合体链拉成线性结构的方法也是公知的。 [0075] 一旦聚合体链被伸展和定向用于连接到基体，则样品分子通过多种合适的固定方法中的任何一种被固定在基体上。正如以上提到的，基体可以由末端区域能与在样品DNA链的末端区域的顺序混合的核苷酸提供。其中链通过操纵粒子共价地配置到链末端而伸展，基体可以包含化学基团或用于固定粒子到基体的磁结构，该链处于拉伸状态。一种用于金属表面的常用化学连接化学物质为共价的布置在所述样品链末端区域的硫醇试剂。 [0076] 更一般地，DNA分子被固定的基体表面的制备过程是DNA混合探测方法的本领域技术人员所公知的(见实例，JP.Rabe)。 [0077] E.扫描和探测方法 [0078] 如上文指示的，本发明的装置和方法的一个重要应用是确定核酸样品如染色体或全部染色体组DNA的序列。这部分将公开以上本发明涉及该特殊应用的装置和方法的操作，相同操作和方法将用于测定任何样品中的化学基团。 [0079] 简言之，该方法用于测定一个或多个处于基体上限定探测区域的单分子化学基团或相似分子的集合。在该应用中，单个纳米透镜被承载在例如悬臂梁自由端，被移动向样品，例如在小于10-40微米距离的范围内，直到观测到区别增强拉曼光谱特征的最大增强。可选择地，纳米透镜被可选择地靠近和远离样品表面移动的同时，可以记录光谱特征，以产生样品的时变光谱。例如，纳米透镜振荡在0.1到10nm的范围内，可以在产生时变光谱中使用。 [0080] 更一般地，本发明的方法用于检查样品中化学基团同一性的方法包括第一步配置样品到具有镜表面的基体，样品由镜表面支撑，而镜表面由等离子共振金属形成。当纳米透镜和基体间间隙小于或等于30nm时，光束定向到如上所述的类型的纳米透镜上以便在纳米透镜和基体表面上的面对的探测区域间产生近场电磁间隙模式。然后靠近或远离基体表面移动透镜组件，纳米透镜和基体表面间空间小于40nm，产生电磁间隙模式，其增强由探测区域内样品产生的拉曼光谱信号。通过样品放射的光或由样品分散的光在探测区域由探测的和转换为间隙模式增强的拉曼光谱被接收，其中探测区域的样品化学基团可以被识别。 [0081] 其中样品包含多个沿样品分子的线性部分排列的基团，在用于识别连续碱基基团的核酸样品情况下，当纳米透镜相对于基体移动时，将刚公开的过程连续地应用于每个碱基。这可以通过悬臂相对于固定基体平移，基体台相对于固定纳米透镜移动而实现。如上所述，当纳米透镜设置在每个连续的位置上，其靠近或远离样品移动以找到光学探测距离或产生时变光谱。透镜和样品碱基可以通过一种或多种记录技术保留记录。例如，一种“控制”纳米透镜可以追踪承载在基体上的已知的序列DNA样品中的探测碱基。通过沿一个或多个未知序列样品追踪这些序列，该装置可以确保透镜和基体间的相对移动起到保存样品和连续DNA碱基间的记录的作用。可选择的，当悬臂设备的排列沿DNA链移动时，装置中的悬臂梁之一可以是一个扫描原子力显微镜探针用于探测一个控制DNA链的每个碱基上的探针的移动。 [0082] 在更常用的应用中，多个线性样品链例如DNA链在单个基体排成一行，用于多个纳米透镜同时读取，如图1装置中的82处所示。图5a和5b示出了应用于读取多个伸展排列的DNA链如基体310承载的210链的操作。尽管附图显示出由在自由端支撑纳米透镜180的悬臂梁160构成的单透镜组件，但是，应当理解，该装置可以包括多个透镜组件，每个用于基体上排列的各链。 [0083] 当透镜组件组沿着基体移动时，各透镜组件得到垂直调整(在朝向基体的方向上)，以优化光谱信号。如图5b所示，这种垂直移动对放置近场电磁模式集中所产生的间隙模式有效，该近场电磁模式在具有标记为310的等离子共振表面的PRP如185形成的透镜之间。 [0084] 各链化学基团(基)的增强拉曼光谱使用多隧道拉曼分光镜连续测量，并借助于具有数字记录的二维ICCD阵列数字化。来自拉曼分光镜的信号存储在计算机存储器中以进一步分析。最终的结果以核苷酸A、T、G、C基序列的形式获得。在扫描程序中，纳米透镜尖端将探测分光镜和地形学上的DNA链的各碱基(A、T、G、C)。 [0085] 对每个碱基连续记录SERS光谱，该碱基允许通过碱基特征的其独特的增强光谱信号来识别DNA链中的每个特定碱基(A、T、G、C)，并允许直接重新排列个体DNA分子片段。已知在等离子共振基体上获得的A、T、G、C的SERS光谱，以给出允许识别不同碱基的特殊光谱。本发明通过将激发场聚焦于透镜和基体之间的小型间隙中，并利用拉曼信号的间隙模式增强性，允许识别DNA的个体碱基，由此，允许逐个碱基的DNA直接读取。 [0086] 具有可以用在排列中的纤维光学尖端的悬臂数量原则上没有限定，但是，对于最大的人类染色体(人类染色体1号包括约263百万的碱基)的扫描序列来说，该装置将需要约100个透镜组件，每个读取约2.5～3.0Mbase的片段。假设0.01秒的取样时间，该装置将在不到约10小时的扫描时间内完成该染色体序列。实际上，使用该设备可能以每个碱基0.01～1秒的取样速度并行地执行高达几百个通道列(每个通道1个DNA链)。 [0087] 更一般地，本发明的用于测定样品中化学基团同一性的方法包括以下步骤：首先将样品连接在具有将样品支撑在其上的镜表面的基体上，该镜表面由等离子共振金属形成。光束定向到上述类型的纳米透镜上，以当多个纳米透镜和基体之间的间隙小于或等于4nm时，在多个纳米透镜和基体表面上的面对的探测区域之间的空间中产生近场电磁间隙模式。然后，将透镜组件靠近或远离基体表面移动，且多个纳米透镜与基体表面之间的间距小于40nm，以产生电磁间隙模式，其增强了由探测区域中的样品产生的拉曼光谱学信号。由探测区域中样品所放射的或所散射的光由探测器接收，并转换成间隙模式增强拉曼光谱，由此识别探测区域中的样品化学基团。 [0088] 本发明可获得的拉曼光谱放大程度可以由图6～8来理解。在这些图中，电磁场强E通过模拟系统和使用积分方程近似值来求解近场近似值中的Maxwell方程来计算。图6a示出了用于三粒子透镜的eV函数中E的变化。图6C中示出了透镜中心区域中的场分布。图6b图示了沿着图6C中x＝0上y轴的场强。如图所示，场强放大率在y＝0.5的点上达到的最大值约1400(在整个入射光上的放大率)，接近图6c中的上部粒子。 [0089] 图7a～7c示出了相似的一套图，但是，此处的透镜由四个对称粒子构成，如图7c的场分布图表可见。图7b示出了沿着x＝0且y坐标由下到上变化的E对称分布。当该图是沿着-1，-1和+1，+1之间对角线建立时，得到图8所示的图，其示出了在靠近远离中心的粒子之间的点上近3000的放大。 [0090] 根据普遍的机构，拉曼增强性是电磁机构，其中拉曼信号与E4成比例(M.Moskovits，Rev.Mod.Phys.v.57，p.783，1985)，其中E是分子区域中场的局部增强性。4 10 在场放大率因子为500的情况下，拉曼信号增强性将为500 ＝6.25×10 ，其显著高于文献中已有的报道。为了获得这种增强性，样品分子应当处于多粒子纳米透镜的中心。然而，如 13 果分子同时靠近等离子共振表面，则场增强性可以高至3,000，提供高达8.1×10 的拉曼信号增强性，允许探测单分子化学基团。 [0092] F.与纳米孔设备结合的等离子纳米透镜 [0093] 通过使用本发明拉曼等离子透镜来光谱读取长(long length)生物高聚物大分子(如DNA、RNA或多肽)序列的另一种方法是，推动生物高聚物分子穿过安装有纳米透镜的纳米级大小的孔径，如图9所示。 [0094] 参照该附图，借助于电场(电泳或电渗方法)推动生物高聚物(DNA链)穿过人造纳米孔280。人造纳米孔设备的实例已有公开，如J.Li等人“DNA molecules and configurations in a solid-state nanoporemicroscope”，Nature Materials，Vol.2，p.611-615(2003)，和D.Hansford和Mauro Ferrari于2003年11月6日公开的美国专利申请US20030205552A1。在这些设备中，通过纳米孔的碱基速度可以非常高，在每秒百万碱基的范围内，但是也可以根据所使用电场和介质的电解液组成物来调解，如上述参考文献中所公开。 [0095] 在另一个实施例中，可以使用通过具有300a和300b的激光或磁镊的DNA生物高聚物来机械操作。通过纳米孔280的单体迁移速度可以控制在宽的范围内，并可以降低至每秒几千或单体，其适合于使用等离子纳米透镜的单体拉曼光谱探测。来自激光源190的照明光束用于激发来自DNA碱基(单体)的增强拉曼信号。增强机制如上所述，且是由于两种方式的间隙模式一GM激发的场局部化和增强导致，这两种方式为：在构成纳米透镜180的不同等离子纳米粒子之间，和在等离子纳米粒子180和放置在远离绝缘体材料270的隔膜上的等离子共振基体310之间。散射信号195由光学透镜收集，并由拉曼光谱仪进行分析，如上所述。 [0096] 该方法相对上述公开的一个重要优点是，其消除了Brownian运动，仍保留溶液中的生物高聚物，由此避免了与固态表面上生物高聚物(DNA)处理有关的困难。减少或消除Brownian运动对于等离子纳米透镜的有效运行十分有用，该纳米透镜用于通过辨别每个单体的独特化学基团来拉曼光谱探测每个单体。 [0097] G.与具有多个喷头尖端(fountain tips)的扫描设备相结合的等离子纳米透镜的使用 [0098] 本发明的另一个实施例在图10中示出。DNA链210可以通过使用聚合体锚定装置290连接在固体基体的表面上。该连接可以通过使用在滑动表面上组成图案的互补(complementary)寡核苷酸条形码220以可寻址的方式完成。具有纳米透镜180的纳米孔安装在其中有孔(设计成纳米管)的悬臂梁喷头尖端340的自由端上，其放置在扫描设备的悬臂梁160上。在这种情况下，生物高聚物的移动速度也由扫描设备的扫描速度控制，并可以在宽的范围内变化。悬臂梁尖端应当做成在顶端具有纳米孔的喷头型。可以用于本发明中的排列扫描设备的实例公开在Eric Henderson′s等人在2004年4月6日公布的美国专利US6,716,578中和J.Xu等人“Microfabricated Quill-Type SurfacePatterning Tools for the Creation of Biological Micro/Nano Arrays”，Biomedical Microdevices，v.6，p.117-123(2004)。通过使用激光光束190从悬臂梁顶端的纳米透镜180的照明和通过回收在拉曼光谱仪中分析的散射光束195来收集拉曼光谱。悬臂梁具有通道330，扫描过程中，DNA链210位于该通道中。 [0099] 安装在纳米孔洞上的纳米透镜的精确调整可以通过使用多光束光镊获得，该光镊如其所公开的实施例那样(J.Prikulis等人，Nano Letters，v.4，p.115-118，2004)。 |
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