具有六元环的核苷酸类似物

具有六元环的核苷酸类似物

发明领域本发明涉及包含能被结合到核酸上的六元环的化合物。特别地，六元环是环己烷、环己烯、四氢吡喃、四氢硫代吡喃或哌啶的衍生物。这些化合物可被用于构建寡聚化合物。本发明进一步涉及这些寡聚化合物用于杂交和作为探针的用途。此外，提供了检测核酸的方法，在该方法中使用这些寡聚化合物。

发明背景在分子诊断学领域，用聚合酶链式反应(PCR)检测靶核酸扮演着一个重要的角色。常规筛查存在有人类免疫缺陷性病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的血库是一个大规模应用基于PCR诊断学的例子。用于基于PCR分析的自动化系统通常在PCR反应过程中使用实时检测产物扩增，这种方法的关键之处在于使用带有报道基团或标记的修饰的寡核苷酸。

简单来说，PCR是一种用于酶合成特异核酸序列的体外方法，使用两个寡核苷酸引物杂交到互补链且两侧扩增出靶核酸中感兴趣区域的靶序列。连续重复的反应步骤包括模板变性、引物退火和用DNA聚合酶(DNA：脱氧核糖核酸)延伸退火的引物产生指数累积的特异片段，其末端通过引物的5端来确定。

在一方面，PCR反应过程中产生的DNA扩增产物的检测可在独立的工作步骤中被完成，这些步骤包括根据它们的电泳迁移率以鉴定扩增的片段和/或用一个杂交的探针来分析连接在固体支持物上的变性的扩增产物。

在另一方面，DNA扩增产物可在所谓的“均相”分析系统中被检测，一个“均相”分析系统包含当靶序列被扩增时能产生信号的报道分子或标记。一个“均相”分析系统的例子是在US 5,210,015、US 5,804,375和US 5,487,972中所详述的TaqMan系统。简单而言，该方法是基于一个双标记的探针和TaqDNA聚合酶的5′-3′外切酶活性。该探针与在PCR反应过程中要被扩增的靶序列互补且在每一聚合循环步骤中该探针位于两个PCR引物之间。该探针连接有两个荧光标记，之一是报道染料，如6-羧基荧光素(FAM)，由于第二个荧光染料，6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA)的空间接近，产生的能量转移使该报道染料的发射光谱淬灭。在每一扩增循环期间，在延伸一个引物DNA链的过程中Taq DNA聚合酶取代和降解该退火的探针，后者是由于该聚合酶内在的5′-3′外切酶活性。该机理也释放出来自活性淬灭的TAMRA的报道染料。因而，随着裂解探针的增加荧光活性也随之增加，与PCR产物形成的数量成正比。因此，可通过检测释放的荧光标记来测量扩增的靶序列。

在荧光染料分子之间能量转移的一个相似的原理应用于“均相”分析，使用所谓的“分子信标”(US 6,103,476)。这些“分子信标”是具有内部淬灭荧光团的发夹状核酸分子，当它们结合到靶核酸时其荧光被复原(US6,103,476)。它们被设计成如此一种方式，即该分子的环部分是互补于在PCR反应过程中的靶序列中一个区域的一个探针序列。其茎区通过退火在探针序列末端上的互补支臂序列而形成，一个荧光部分连接于一个支臂的末端并且一个淬灭部分连接于另一个支臂的末端，茎区使上述两部分互相紧密接近，导致荧光团的荧光通过能量转移而淬灭。因为该淬灭部分是非荧光发色团且发射出从受热的荧光团得到的能量，所以此探针不稳定而发出荧光。当该探针遇到一个靶分子，形成一个更长的杂交分子且比茎区杂交体更稳定，并且它的刚度和长度避免了茎区杂交体的同时存在。因而，所述分子信标经过自发构象重整迫使茎区分离，和使荧光团和淬灭剂互相分开，导致能被检测到的荧光的复原。

通过在LightCycler设备(见，如US 6,174,670)中使用的方法提供了更多的“均相”分析系统的例子，它们中间的一些有时称为“相吻探针”(“kissingprobe”)法。同样，此原理是基于两种相互作用的染料，然而，特征在于在荧光共振能量转移使染料供体激发一个染料受体。一个作为例证的方法是使用两个修饰的寡核苷酸作为杂交探针，杂交邻近的PCR反应过程的靶序列的内在序列。5′位修饰的寡核苷酸在其3′末端具有一个作为标记的染料供体。3′位修饰的寡核苷酸在其5′末端具有一个染料受体。接着在一个扩增循环过程中两个修饰的寡核苷酸的退火头尾定向到靶序列，染料供体和受体形成密切接近。通过单色光脉冲特异地激发染料供体，染料受体荧光被检测提供了一种测定所形成的PCR产物数量的量度。

另一种分析方法是所谓的“阵列”法，“阵列”是一种在设备上可设定地址的位置的排列(见，如US 5,143,854，US 6,022,963，US 6,156,501，WO90/15070，WO 92/10092)。位置的数目可在几个到成百上千范围内变化，最重要地，每一位置代表一个总的独立的反应位点。每一位置载有一个核酸当做例如一个“寡聚化合物”，它能作为第二个核酸，特别是靶核酸的结合配体。在EP-A-0 476 014和Hoheisel，J.D.，TIBTECH(1997)，Vol.15，465-469，WO89/10977，WO89/11548，US 5,202,231，US 5,002,867，WO93/17126中描述了制备它的方法。更进一步的开发已经提供了在十分小的面积内制造非常大的寡核苷酸探针阵列的方法(US 5,143,854，WO 90/15070，WO 92/10092)。具有大量寡核苷酸探针的微网格阵列(Microfabricated arrays)称作“DNA芯片”，为广泛应用提供了良好的前景(见，如US 6,156,501和US 6,022,963)。该方法的基础步骤是分离来自对照和测试样品的核酸，和在扩增过程中用不同的荧光染料结合标记。更详细地，根据在US 5,545,522；5,716,785；US 5,891,636；US 6,291,170中所描述的方法来实行，通过用包含细菌T7-启动子的引物来合成双链cDNA并且在存在核糖核苷三磷酸酯下转录标记的RNA，由此标记附着在一些核苷三磷酸酯上。这些标记的核酸任选地是阵列寡聚化合物的片段、混合物和杂交物。一个光学设备可用于测量对于每一个单独斑点的每一染料相对强度。两个探针之间的荧光水平的比率表示样品之间的相对基因表达量。在这过程中研究者可以同时评估一整组基因，优于在一个时间内只看到单个基因的结果。高度分化的特异基因的表达量可接着用常规的方法如RNA印迹或定量RT-PCR来检测。来自多个试验的数据可被结合来给具有其它未知功能的基因确定其功能信息。交叉有不同状态的显示相似表达谱的基因可能参与通常的生理或代谢途径。簇分析程序已被发展可用于检测基因的共表达组以反映功能信息。

用于“均相”分析系统的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸包括连接有如作为报道分子的染料的标记物的核苷酸、修饰的核苷酸或非核苷酸化合物，即单体单元，这样的单体单元的特征是，它们：(1)能被连接和/或结合到核酸的糖-磷酸聚合体主链，(2)不阻止修饰的寡核苷酸和它的互补的靶序列的配对，(3)为连接一或更多的标记提供功能基团。

通过核苷酸、修饰的核苷酸或非核苷酸化合物这些要求能被完成。另外，TaqMan方法需要能通过模板依赖性DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性消化寡聚化合物，各种修饰核苷酸也已经被结合进寡聚化合物中以影响它们的杂交行为或稳定性，见，如WO02/12263。

一些化合物和它们作为单体单元结合到核酸中的用途在本领域中是众所周知。所述的化合物提供功能基团和/或连接部分可共价连接报道基团或标记。在化学合成寡聚化合物的过程中，“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”的骨架结构与“寡核苷酸”主链连接，例如通过基于亚磷酰胺化学产生磷酸二酯。在新产生的“修饰的寡核苷酸”中，一个给定的已掺入的化合物可代表一个“修饰的核苷酸”或“非核苷酸化合物”。通过连接部分的一个反应基团结合标记物，例如但不限制为一个位于骨架结构或“连接部分”的功能氨基，其通过反应基团连接着骨架。在“修饰的寡核苷酸”被合成之前，标记能共价地结合到此化合物上，或者之后从偶联了标记物的官能团上去除可选择的保护基团。各种“修饰的核苷酸“也可被结合到寡聚化合物中以影响它们的杂交行为或稳定性，见，如WO02/12263。

一些参考文献披露了包含六元环且它们结合到寡核苷酸上的修饰的核苷酸：WO93/25565披露了1，5脱水己糖醇核苷类似物和它的药物用途。在Verheggen，I.，等，Nucleosides&Nucleotides 15(1996)325-335；Verheggen，I.，等，J.of Med.Chem.36(1993)2033-2040；Pérez-Perez，M.-J.，等，Bioorg & Med.Chem.Letter 6(1996)1457-1460；Vastmans，K.，等，Collect.Symp.Series 2(1999)156-160；Andersen，M.W.，等，Pergamon，Tetrahedron Lett.37(1996)8147-8150；Ostrowski，T.，等，J.Med.Chem.41(1998)4343-4353；Allart，B.，等，Tetrahedron55(1999)6527-6546；De Bouvere，B.，等，Liebigs Ann./Recueil(1997)1453-1461；Verheggen，I.，J.Med.Chem.38(1995)826-835中进一步披露了1，5脱水己糖醇或己糖醇核苷类似物。US 5,314,893中披露了抗病毒的四氢吡喃，在Brown，S.G.，等，Drug Development Research 49(2000)253-259中描述了一种包含六元环的脱氧腺苷二磷酸衍生物。

WO01/18003描述了具有至少部分不饱和碳环的六元环核苷化合物。首先考虑到的是其药物用途。在Wang.J.，等，J.Med.Chem.43(2000)736-745；Rosenquist，A，等，J.Org.Chem.61(1196)6282-6288；Ramesh，K.，等，J.Org.Chem.57(1992)5861-5868；Pérez-Pérez，M.-J.，等，J.Org.Chem.60(1995)1531-1537；Konkel，M.J.，和Vince，R.，Tetrahedron 52(1996)799-808；Arango，J.H.，Nucleosides & Nucleotides 12(1993)773-784；Konkel，M.J.，和Vince.R.，Nucleosides & Nucleotides 14(1995)2061-2077；Katagiri，N.，等，Nucleosides &Nucleotides 15(1996)631-647；Luyten，I.，和Herdewijn，P.，Tetrahedron 52(1996)9249-9262；Wang.J.，等，J.Med.Chem.43(2000)736-745；Wang，J.，和Herdewijn，P.，J.Org.Chem.64(1999)7820-7827；Maurinsh，Y.，等，J.Org.Chem.62(1997)2861-2871；Wang，J.，等，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 20(2001)785-788；Maurinsh，Y.，等，Chem.Eur.J.5(1999)2139-2150中进一步地披露了含有环己烷或环己烯的核苷类似物。

WO 96/05213披露了包括或包含1，5脱水己糖醇核苷类似物的寡聚体和它们的用途。WO 97/30064涉及包含或含有1，5-脱水己糖醇核苷酸类似物的寡聚体，其表现出结合互补序列的序列特异性。进一步地，它们的合成和它们在诊断、杂交、分离核酸、位点特异性DNA修饰和治疗中的用途被披露。在Vastmans，K.，等，Biochem.39(2000)12757-12765；Pochet，S.，等，Nucleosides & Nucleotides18(1999)1015-1017；Kozlov，I.A.，等，Chemistry6(2000)151-155；Vandermeeren，M.，等，Biochem.Pharm.59(2000)655-663；Hendrix，C.，等，Chem.Eur.J.3(1997)1513-1520；Allart，B.，等，Chem.Eur.J.8(1999)2424-2431；Kozlov，I.A.，等，J.Am.Chem.Soc.121(1999)2653-2656；Hendrix，C.，等，Chem.Eur.J.3(1997)110-120；Van Aerschot，A.，等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34(1995)1338-1339；Froeyen，M.，等，Helvetica Chimica Acta 83(2000)2153-2182；Boudou，V.，等，Nucleic Acids Research 27(1999)1450-1456；Lescrinier，E.，等，Chem.Biol.7(2000)719-731；Kozlov，I.A.，等，J.Am.Chem.Soc.121(1999)1108-1109；Herdewijn，P.，等，Nucl.Acids Symp.Series 31(1994)161-162；Lescrinier，E.，等，HelveticaChimica Acta 83(2000)1291-1310；Kozlov，I.A.，等，J.Am.Chem.Soc.121(1999)5856-5859；De Winter，H.，等，J.Am.Chem.Soc.120(1998)5381-5394；Atkins，D.，等，Pharmazie 55(2000)615-617中进一步地披露了含有己糖醇或1，5脱水己糖醇的核酸。在WO 98/25943和WO 99/15509中也披露了吡喃糖苷(Pyranosyl)寡聚体。

WO 01/49687披露了环己烯核酸，它们和RNA的杂交行为和在诊断和治疗中的用途。在Wang，J.，等，J.Am.Chem.Soc.122(2000)8595-8602；Maurinsh，Y.，等，Chem.Eur.J.5(1999)2139-2150中进一步地披露了含有环己烷或环己烯的核酸。

WO 97/27317和WO 02/072779披露了大量用于核酸标记的化合物。

EP 0468352披露了包含含有一个六元环，但在该六元环的C4原子处含有一个额外的亚甲基基团，的通式的核酸衍生物。WO 01/02417和June K.-E.，Bioorg.Med.Chem.Lett.9(1999)3407-3410披露了含有一个六元氮杂-糖的核苷酸单体和含有它们的寡聚体。

被用于结合标记到核酸上或影响修饰的寡核苷酸性质的化合物要仔细地选择，因为它们可能：(a)干扰碱基配对，(b)无法提供具有足够刚度的骨架结构，(c)提供大的疏水结构产生低的水溶性，(d)仅提供有限的化学修饰的适应性，或(e)包含对映异构体混合物。

因此，本发明的一个目的是提供可被用于将标记结合到核酸中或影响它们的性质的新的化合物。

发明简述本发明涉及包含六元环部分的化合物，特别地，包含可被用于构建寡聚化合物的己糖醇或环己烯部分的特定的化合物。本发明还进一步涉及使用这些寡聚化合物来杂交和作为探针的用途。此外，公开了检测样品中的核酸的方法，在该方法中使用该寡聚化合物。己糖醇结构提供给亲水骨架结构一个特别有利的性质。此外，己糖醇和环己烯结构适合于有效的化学合成，具有对核酸酶降解的增强的稳定性且在脱嘌呤作用中是稳定的。

分子生物学和核酸化学的常规技术是本技术领域的常规技术，在下述文献中有解释，见，例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Clonging：A Laboratouy Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989；Gait，M.J.，寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，编辑(1984)；Hames，B.D.，和Higgins，S.J.，核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，编辑(1984)；和一系列丛书，酶学方法(Methods in Enzymology)，学院出版有限公司，上述所有的文献一并在此作为参考。于此上下文中提及的所有的专利，专利申请和公开一并在此作为参考。

本领域周知，“核苷”是碱基-糖化合物，核苷的碱基部分通常是杂环碱基，所述(杂环)碱基的最常见的两类是嘌呤和嘧啶，它们是天然(杂环)碱基，即，它们是天然存在的。更详细地，重要的天然(杂环)碱基是鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或甚至是甲基胞嘧啶。

“核苷酸”是进一步包括共价连接到核苷的糖部分的一个磷酸基团的“核苷”。对于包括呋喃戊糖(pentofuranosyl sugar)的那些“核苷”，磷酸基团可任一连接到该糖的2′，3′或5′羟基部分。“核苷酸”是“寡核苷酸”的“单体单元”，“寡核苷酸”在此更通常表示为“寡聚化合物”，或“多核苷酸”，更通常地表示为“多聚化合物”。因此，另一通常的表示是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰而不同于天然“核苷酸”，但仍然由(杂环)碱基、呋喃戊糖(pentofuranosyl sugar)、磷酸部分、(杂环)碱基相似物，呋喃戊糖相似物(pentofuranosyl sugar-like)和磷酸相似物部分或它们的结合组成。呋喃戊糖相似物部分是如1，5脱水己糖醇或环己烯基部分。例如，“标记”可被结合到“核苷酸”的碱基部分由此获得“修饰的核苷酸”。在“核苷酸”中天然(杂环)碱基也可被非天然(杂环)碱基即非天然存在的(杂环)碱基所取代，由此同样获得“修饰的核苷酸”。因而，该“修饰的核苷酸”含有其类似于天然(杂环)碱基的(杂环)碱基相似物部分或“碱基类似物”。“碱基类似物”通常并不在天然环境中出现，即，换句话说是非天然的，但能替换有功能的碱基，尽管在结构上有小的不同。根据本发明的内容，杂环碱基可以是天然的或非天然的。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本发明中可互换使用。

“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)通过如上对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物)中所描述的方法的一些修饰而不同于天然的核苷。

“非核苷酸化合物”不同于天然“核苷酸”，但在本发明中仍可理解为能类似于作为“寡聚化合物”的“单体单元”的“核苷酸”。因此，“非核苷酸化合物”能形成具有“核苷酸”的“寡聚化合物”。“非核苷酸化合物”甚至可以含有碱基相似物，呋喃戊糖相似物或磷酸相似物部分，然而，它们并不是同时存在于“非核苷酸化合物”中。

根据本发明，“寡聚体化合物”是由“单体单元”组成的化合物，所述单体单元可单独是“核苷酸”或“非天然化合物”，更特别地单独是“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)或“非核苷酸化合物”或是它们的结合。在本发明的上下文中，“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是“寡聚化合物”的亚群。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指来自多个作为“单体单元”的“核苷酸”形成的“多核苷酸”，即，“寡核苷酸”属于具有“单体单元”的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特定亚群。根据本发明，术语“寡核苷酸”仅包括由天然存在的“核苷酸”组成的“寡核苷酸”。磷酸基团通常指形成“寡核苷酸”核苷间主链。RNA和DNA的正常键或主链是3′-5′磷酸二酯键。

“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)属于具有作为“单体单元”的一或更多“核苷酸”、一或更多“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”的“寡聚化合物”的另一特异亚群。因此，术语“修饰的寡核苷酸“(或“寡核苷酸类似物”指功能十分类似于“寡核苷酸”的结构且在本申请自始至终可互换使用。综合来看，“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)能通过如由适当地修饰磷酸酯主链、核糖单元或核苷酸碱基的“寡核苷酸”的化学修饰来制备(Uhlmann和Peyman，Chemical Reviws 90(1990)543；Verma，S.，和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(l 998)99-134)。典型的修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷间连接键取代核苷间磷酸二酯连接键；脱氮或氮杂嘌呤和嘧啶取代天然嘌呤和嘧啶碱基，嘧啶碱基在5或6位具有取代基团；嘌呤碱基在2，6或8位或7-脱氮嘌呤在7位具有可变的取代基团；糖在如它们的2位具有取代基团；或碳环或开链式糖类似物。包含在本发明精神中的其它的修饰也为本领域的那些技术人员所周知。所述“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)被最好描述为在功能上与天然的“寡核苷酸”(或合成的“寡核苷酸”及天然同系物)有互换性，然而在结构上却不同。更详细地，示范的修饰在Verma，S.，和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO 02/12263中被披露。此外，修饰能被获得，其中核苷单元通过取代核苷间磷酸酯或糖磷酸酯连接键的基团被连接。这样的连接键包括那些在Verma，S.，和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134中所披露的。当不同于磷酸酯连接键的键被利用来连接核苷单元，这样的结构也被描述为“寡核苷”。

根据本发明的“寡聚化合物”如“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸”可被合成，其在本领域中大体上被描述且为本领域的专家所周知。制备特定序列的寡聚体化合物的方法在本技术领域中公知，并且包括，如，克隆和在适当的位置限制酶切适当的序列和直接化学合成。化学合成方法可以包括，如Narang，S.A.，等，Methods in Enzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.，等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151所披露的磷酸二酯法，Beaucage，S.L.，和Caruthers，M.H.，等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1862披露的亚磷酰胺(phosphoramidite)法，在Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280中所披露的H-膦酸酯法和在US 4,458,066中披露的固体载体法。

如上所述，本技术领域的熟练专家周知“核酸”是“核苷酸”的多聚化合物。在这里其被用于表示要被分析的在样品中的“核酸”，即在样品中它的存在、不存在或数量要被测定。因此，换句话说该“核酸”是靶物且因此也能表示为“靶核酸”。例如，如果要测定血液中是否包含人类免疫缺陷性病毒，该“靶核酸”是人类免疫缺陷性病毒的核酸。

本文所用的术语“引物”在本技术领域中为熟练专家所周知且指“寡聚体化合物”，主要指“寡核苷酸”，但也指“修饰的核苷酸”，它们能通过模板依赖性DNA聚合酶来“引发”DNA合成，也就是如寡核苷酸的3′-末端提供游离3′-羟基基团，在那里更多的“核苷酸”通过模板依赖性DNA聚合酶形成的3′-5′磷酸二酯连接键可被结合，由此脱氧核苷三磷酸被利用且焦磷酸被释放。

术语“探针”指合成的或生物产生的核酸(DNA或RNA)，通过设计或选择，包含特定核苷酸序列，可使它们在详细定义的预先确定的严格条件下特定地(即优先地)杂交“靶核酸”。“探针”可被认为等同于“捕捉探针”，意味着其“捕捉”靶核酸，使其能被从在其中其很难被检测到的不合需要的原料中分离。一旦分离完成，用适当的方法能实现该被捕捉的“靶核酸”的检测。“捕捉探针”通常已经结合到固相上。因此，一个特定的例子是在微阵列情况，其中众多的“捕捉探针”被结合到“固相”上，“捕捉”被标记的cRNA或cDNA。

“烷基”优选选自含有1到10个碳原子的烷基，其为线性、分支或环状形式。烷基的实际长度将依赖于该烷基所位于的特定位置的空间情况。如果有空间约束，则该烷基通常是较小的，最优选甲基和乙基。

“链烯基”优选选自含有2到10碳原子的链烯基。对于选择，和对于烷基一样进行相似的考虑。它们也能是线性、分支和环状的，最优选的链烯基是乙烯基。在链烯基中可有多于一个的双键。

“炔基”优选具有2到10个碳原子，再且，那些碳原子能被排列成线性、分支和环状的方式，在炔基中可有多于一个的三键。最优选的炔基是丙炔基。

所有的“烷基”、“链烯基”和“炔基”能是未取代的或取代的。通过上述的杂原子的取代，将有助于增加在水溶液中的稳定性。

“保护基团”是一种被结合到功能部分(如与羟基中的氧、氨基中的氮或硫醇基中的硫连接，由此置换氢)以保护该功能基团不以不期望的方式反应的化学基团。保护基团通过其能被除去而不破坏所生成的分子的生物活性的事实被进一步地定义，在这里所生成的分子即指核酸结合性化合物结合到核酸上。本技术领域的熟练人员周知适合的保护基团。根据本发明，优选的保护基团是芴甲氧羰基(FMOC)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、一甲氧基三苯甲基、三氟乙酰基、levulinyl-或甲硅烷基。优选的可保护如在核苷酸或寡核苷酸5′末端的羟基的保护基团选自三苯甲基，如二甲氧基三苯甲基(DMT)。优选的在式I中的环外氨基的保护基团是酰基，最优选是苯甲酰基(Bz)、苯氧基乙酰基或乙酰基或甲酰基，和脒保护基团，例如N，N-二烷基甲脒基，优选二甲基甲脒基、二异丁基甲脒基和2正丁基甲脒基。优选的氧保护基团是芳酰基、二苯基氨基甲酰、酰基和甲硅烷基。在这些基团中最优选的是苯甲酰基，优选的甲硅烷基是三烷基甲硅烷基、如，三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。另一优选的甲硅烷基是三甲基甲硅烷基-氧代-甲基(TOM)(WO99/09044)。更进一步地，优选的保护基团是邻硝基-苄基，2-(4-硝基苯基)乙氧基羰基(NPEOC)，光活化化合物如2-硝基苯基-丙氧基-羰基(NPPOC)(Giegrich等，Nucleosides&Nucleotides 17(1998)1987)和烯丙氧基羰基。

“标记”，通常称作“报道基团”，一般是使核酸，根据本发明，特别是“寡聚化合物”或“修饰的寡核苷酸”，以及任何与其结合的核酸，能与来自液体的残留物，即样品(具有已结合“标记”的核酸也可以称作核酸结合化合物，标记的探针或就是探针)区别开的基团。其中“半抗原”(如生物素或洋地黄毒苷)，酶(如碱性磷酸酶或过氧化物酶)或荧光染料(如荧光素或罗丹明)，已大体上被证实适合作为非放射性指示剂分子或换句话说作为非放射性“标记”。通过不同的方法，这些“信号基团”或“标记”能被结合到或连接到核酸中。根据本发明的优选的“标记”是染料如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料和香豆素染料或半抗原如生物素。通常定义，“半抗原”是一个自己没有免疫原性(能导致免疫应答)的小分子，但是至少具有抗原的一个元件且能和抗体结合或和另一较大的载体分子结合而具有免疫原性。

术语“连接部分”指能将要被使用的部分(如，“固相”或“标记”)连接到“核苷酸”、“修饰的核苷酸”或“非核苷酸化合物”上的结合位置的原子基团。这些结合位置可以是如“核苷酸”或“修饰的核苷酸”的碱基、糖或磷酸部分，或“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”的碱基相似物、糖相似物或磷酸相似物部分。“连接部分”可提供柔性使得根据本发明的“寡聚化合物”，特别是“修饰的寡核苷酸”能结合到要被测定的“靶核酸”上而对于“固相”或“标记”没有大的障碍。“连接部分”，特别是那些非疏水的，如在DE 3943522中披露的基于连续的乙烯氧基单元的那些，为本技术领域的熟练专家所周知。在本发明的上下文中，连接部分包含一个反应基团，该基团是结合到如“固相”或“标记”的位点。

根据本发明，“固相”可以是在寡核苷酸合成中使用的可控孔度玻璃(CPG)、聚苯乙烯或硅胶。

在本文中所用的“荧光共振能量转移关系”和类似的术语涉及用“荧光供体标记”标记的“寡聚化合物”和另一种用“荧光受体标记”标记的“寡聚化合物”邻近杂交“靶核酸”使得“荧光供体标记”能转移共振能量到“荧光受体标记”，使“荧光受体标记”产生可测量的荧光发射。如果“荧光供体标记”和“荧光受体标记”在空间上分离相当大的距离，则“荧光供体标记”无法转移共振能量到“荧光受体标记”以使得该“荧光受体标记”发出可测量的荧光，因此该“荧光供体标记”和“荧光受体标记”无法形成共振能量转移关系。

“阵列”(array)是一种在设备上可设定地址的位置的排列(见，如US5,143,854，US 6,022,963，US 6,156,501，WO 90/15070，WO 92/10092)。该位置能以二维阵列、三维阵列或其它矩阵格式排列。位置的数目可在几个到成百上千范围内变化。最重要地，每一位置代表一个完全独立的反应位点。每一位置载有一个核酸作为如一个“寡聚化合物”，它能作为第二个核酸、特别是靶核酸的结合配体。在EP-A-0 476 014和Hoheisel，J.D.，TIBTECH(1997)，Vol.15，465-469，WO89/10977，WO89/11548，US 5,202,231，US 5,002,867，WO93/17126中描述了其的制造方法。更进一步的开发已经提供了在十分小的面积内制造非常大的寡核苷酸探针阵列的方法(US 5,143,854，WO 90/15070，WO 92/10092)。具有大量寡核苷酸探针的微网格阵列称作“DNA芯片”，为广泛应用提供了良好的前景(见，如US 6,156,501和US 6,022,963)。

在本发明的上下文中，“杂交”意思是在互补的核苷酸之间形成氢键，其可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核酸碱基，它们通过形成氢键配对。在本文中所用的“互补”也指在两个核苷酸间的序列互补性。例如，如果在寡核苷酸的一特定位置的核苷酸能氢键结合DNA或RNA分子的同样位置的核苷酸，那么该寡核苷酸和该DNA或RNA被认为是在该位置上互相互补。当在每一个分子中足够数目的相应位置被能用氢键互相结合的核苷酸占有时，该寡核苷酸和该DNA或RNA互相互补。因此，“特异杂交”和“互补”术语被用于表示具有足够程度的互补性，使得稳定和特异的结合发生在寡核苷酸和靶DNA或RNA之间。可理解特异杂交中寡核苷酸不需要100％与它的靶DNA序列互补。当寡核苷酸结合到靶DNA或RNA分子上而妨碍了靶DNA或RNA的正常功能，和产生足够程度的互补性以避免在希望的特异结合条件下，即在体内分析或治疗的生理条件的情况下，或体外分析情况下，在实施该分析的条件下，寡核苷酸和非靶序列的非特异性结合的时候，寡核苷酸能产生特异杂交。

“反应基团”是能与其它分子上的其它基团反应并连接的基团，优选的“反应基团”是羟基(-OH)、羧基、氨基或硫醇基。

发明详述在本发明的一个实施方案中，通过化学或酶促合成提供能被连接到核酸上的化合物，因此，在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中式I是

(式I)其中L是连接部分，其中B是杂环碱基，其中R1独立于R2、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R1是选自如下的基团：(1)保护基团，(2)标记，(3)固相，和(4)-H，其中R2独立于R1、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R2是选自-H或-OR6的基团，其中R3独立于R1、R2、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R3是选自如下的基团：(1)保护基团，(2)共价偶联到固相的连接部分，(3)亚磷酰胺(phosphoramidite)，(4)H-膦酸酯，和(5)三磷酸酯，其中R4独立于R1、R2、R3、R5、R5a、R5b和R6且R4是-H、-OH、烷基、卤素、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、标记或共价偶联到固相的连接部分，其中R6独立于R1、R2、R3、R4、R5、R5a和R5b，和其中R6是选自如下的基团：(1)-H，(2)保护基团，(3)共价偶联到固相的连接部分，(4)亚磷酰胺，和

(5)H-膦酸酯，其中在六元环的C1原子和Y之间的虚线表示可选择存在的双键，由此当双键存在时，Y是CR5a，或当双键不存在时，Y选自O、S、NR5和CR5aR5b，由此，R5、R5a和R5b彼此独立且独立于R1、R2、R3、R4和R6，和R5是独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基、保护基团或-H，和R5a和R5b是独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基或-H。

优选地，R6和R3不是同时为固相、同时为亚磷酰胺、同时为H-膦酸酯，或一个为亚磷酰胺和一个为H-膦酸酯，或一个为固相和一个为亚磷酰胺，或一个为固相和一个为H-膦酸酯。优选地，当选自R1、R3或R6的一个残基是固相时，则其它两个残基选自除固相外的R1、R3或R6。本技术领域的熟练专家知道在式I中所例证的化合物，不会混淆它们能被连接到核酸上的有关性质。

在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物的式I中的R4是-H或OH。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物的式I中的杂环碱基是天然的或非天然的杂环碱基。优选地，该天然的杂环碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或甲基胞嘧啶。更优选地该天然的杂环碱基是嘧啶或7-脱氮嘌呤，更优选尿嘧啶。优选地，嘧啶、特别是尿嘧啶的C5原子、或7-脱氮嘌呤的7位是连接部分L的结合位点。

式I中的连接部分L的性质被设计成使R1基团和B之间具有足够的空间距离以至：(a)当R3是三磷酸酯时，根据本发明的化合物能被聚合酶识别和在聚合反应过程中结合到延长的核酸链上；(b)根据本发明的化合物一结合到核酸链上，优选就能和互补的碱基进行碱基配对，就是通过扩增反应产生的探针的杂交能力优选应不被显著地影响；和(c)如果不想要R1基团插入，则从靶核酸去除R1基团以避免相互作用或淬灭作用。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物中的连接部分L包含碳、氧或氮原子和一个反应基团。优选的反应基团是羧基、氨基、硫醇基或羟基。L优选是任选取代和任选间断的碳氢链衍生物并且优选多于2个碳原子，优选多于3个碳原子和优选至多30个碳原子长。任选的间断物是-CH=CH-、-C≡C-、-NH-、-CONH-、-S-、-O-、-SO2-、脲基、亚苯基、亚环己基和式-CH＝CH-NH-、-CH＝CH-CH2-NH-、-NH-C(＝NH2)+-、-NH-C(＝NH2)+-NH-和-C(＝O)-O-的基团。为避免产生疑问，1，2-，1，3-和1，4-亚苯基分别当作为2、3和4个碳原子长度。导入所述任选的间断物以便于合成此链和/或提供更多的亲水元件以维持该链的线性结构和阻止其自我折叠。优选地，连接部分是C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、氨基烯丙基或丙烯酰胺基部分的衍生物，更优选地，连接部分是C2-C10、C3-C10或C4-C10烷基的衍生物。

在核苷三磷酸酯上的连接部分L的结合位点是在碱基部分上。为了不妨碍杂交，优选L能被结合到那些据信可被暴露在DNA双螺旋结构的大凹槽中的原子，这些原子是胞嘧啶的C5、C6或C4上的氨基；尿嘧啶的C5、C6或结合到C4的氧；胸腺嘧啶的C5甲基、C6或结合到C4的氧；腺嘌呤的N7、C8或C6上的氨基；鸟嘌呤的N7、C8或结合到C6的氧，或脱氮腺嘌呤或脱氮鸟嘌呤的C7。

在另一个实施方案中，R1独立于R2、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R1是保护基团、标记、或固相。在另一个实施方案中，R1独立于R2、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R1是标记或固相。在另一个实施方案中，R1独立于R2、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，其中R1是保护基团或标记。在最优选的实施方案中，在根据本发明的化合物的式I中R1是标记。

优选地，该标记是染料或半抗原，优选荧光染料。优选地，该染料选自如下：(1)荧光素染料，(2)罗丹明染料，(3)花菁染料，(4)香豆素染料，和(5)偶氮染料。

优选地，半抗原是生物素。

根据本发明，优选的化合物是通过使用酶能容易地被结合到核酸上的化合物。因此，在十分优选的实施方案中，在根据本发明的化合物的式I中R3是三磷酸酯，R2是-OR6，其中R6是-H，和R4是-H或-OH。

在本发明另一个十分优选的实施方案中，当在根据本发明的化合物的式I中双键不存在时，Y是O、S或CR5aR5b。最优选地，Y是O。根据本发明的十分优选的化合物表示为式II：(式II)术语“H/OH”应表示为-H或-OH可存在，换句话说，它应该被描述为可以是-H或-OH的残基K。

在本发明另一个十分优选的实施方案中，环己烯衍生物被提供，即在六元环的Cl原子和Y之间的虚线表示在根据本发明的化合物的式I中存在双键，由此Y是CR5a和R5a是独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基或-H，优选R5a是-H。

在本发明的一个优选的实施方案中，亚磷酰胺被提供以适于化学合成根据本发明的寡聚化合物，更特别地，根据本发明的化合物具有式I，其中R2独立于R1、R3、R4、R5、R5a、R5b和R6，和R2是-OR6，其中R6是亚磷酰胺；和R3独立于R1、R2、R4、R5、R5a、R5b和R6，和R3是保护基团或共价偶联到连接部分的固相，优选地，R3是保护基团。

在本发明的另一个实施方案中，包含具有式S-B-L-R7单体单元的寡聚化合物被提供，其中S是包含六元环的部分，B是杂环碱基，L是连接部分，和R7是标记、保护基团或固相。优选地，六元环是环己烷、环己烯、四氢吡喃、四氢硫代吡喃或哌啶的衍生物，优选地，R7是标记或固相，更优选R7是标记。

在本发明的一个优选的实施方案中，具有式III的单体单元的寡聚化合物被提供如下：

(式III)其中L是共价的连接部分，和B是杂环碱基，其中R7独立于R5、R5a、R5b、R8、R9、R10和R11，其中R7选自如下的基团：(1)保护基团，(2)标记，(3)固相，和(4)-H，其中R8独立于R5、R5a、R5b、R7、R9、R10和R11，其中的R8选自-H和-OR11基团，其中R9和R11彼此独立且独立于R5、R5a、R5b、R7、R8或R10，和其中R9和R11选自如下的基团：(1)-H，(2)共价偶联到固相的连接部分，(4)磷酸酯，(6)具有核苷酸、修饰的核苷酸、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的磷酸二酯，其中R10独立于R5、R5a、R5b、R7、R8、R9和R11，且R10是-H、-OH、烷基、卤素、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、标记或共价偶联到固相的连接部分，其中在六元环的Cl原子和Y之间的虚线表示可选择存在双键，由此当双键存在时，Y是CR5a，或当双键不存在时，Y选自O、S、NR5和CR5aR5b，由此，R5、R5a和R5b彼此独立且独立于R7、R8、R9、R10和R11，和R5是独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基、保护基团或-H，和R5a和R5b是独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基或-H。

优选地，R8和R9不同时是-H，或当R8是OR11时，R9和R11不同时是-H以避免仅有一个单体被考虑，本技术领域的熟练专家根据本发明知道那些无意义的化合物，即R9和R11不同时是磷酸酯，或-H和磷酸酯。优选地，当选自R7、R9、R10或R11的一个残基是固相或共价偶联到固相的连接部分时，则其它选自R7、R9、R10或R11的残基不是固相或共价偶联到固相的连接部分。

磷酸酯或三磷酸酯残基可以是修饰的磷酸酯或磷酸酯的类似物，如硫代磷酸酯或α-硫代-三磷酸酯。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物的式III中的杂环碱基是天然的或非天然的杂环碱基。优选地，该天然的杂环碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或甲基胞嘧啶。更优选地，该天然的杂环碱基是嘧啶或7-脱氮嘌呤，更优选尿嘧啶。优选地，嘧啶、特别是尿嘧啶的C5原子、或7-脱氮嘌呤的7位是连接部分L的结合位点。

优选地，R7是标记或固相，更优选地R7是标记。

式I中的连接部分L的性质被设计成使R1基团和B之间具有足够的空间距离以至：(a)当R3是三磷酸酯时，根据本发明的化合物能被聚合酶识别和在聚合反应过程中结合到延长的核酸链上；(b)根据本发明的化合物一旦结合到核酸链上，优选就能和互补的碱基进行碱基配对，就是通过扩增反应产生的探针的杂交能力优选应不被显著地影响；和(c)如果不想插入R1基团，则从靶核酸去除R1基团以避免相互作用或淬灭作用。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物中的连接部分L包含碳、氧或氮原子和反应基团，优选的反应基团是羧基、氨基、硫醇基或羟基。L优选任选被取代和任选被间断的碳氢化合物链衍生物和优选多于2个碳原子，优选多于3个碳原子和优选至多30个碳原子长。任选的间断物是-CH＝CH-、-C≡C-、-NH-、-CONH-、-S-、-O-、-SO2-、脲基、亚苯基、亚环己基和式-CH＝CH-NH-、-CH＝CH-CH2-NH-、-NH-C(＝NH2)+-、-NH-C(＝NH2)+-NH-和-C(＝O)-O-的基团。为避免产生疑问，1，2-，1，3-和1，4-亚苯基分别当作为2、3和4个碳原子长度。导入任选的间断物以便于合成此链和/或提供更多的亲水元件以维持该链的线性结构和阻止其自我折叠。优选地，连接部分是C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、氨基烯丙基或丙烯酰胺基部分的衍生物。更优选地，连接部分是C2-C10、C3-C10或C4-C10烷基的衍生物。

在核苷三磷酸酯上的连接部分L的结合位点是在碱基部分上，为了不妨碍杂交，优选L能被结合到那些据信可被暴露在DNA双螺旋结构的大凹槽中的原子，这些原子是胞嘧啶的C5、C6或C4上的氨基；尿嘧啶的C5、C6或结合到C4的氧；胸腺嘧啶的C5甲基、C6或结合到C4的氧；腺嘌呤的N7、C8或C6上的氨基；鸟嘌呤的N7、C8或结合到C6的氧，或脱氮腺嘌呤或脱氮鸟嘌呤的C7。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物的式III中的R7是标记。优选地，该标记是染料或半抗原，优选荧光染料。更优选地，该染料是选自如下组：(1)荧光素染料，(2)罗丹明染料，(3)花菁染料，(4)香豆素染料，和(5)偶氮染料。

优选地，半抗原是生物素。

在本发明的一个十分优选的实施方案中，化合物是修饰的寡核苷酸，由此，根据本发明的化合物的式III中的R8是-OR11，和R9和R11是寡核苷酸或修饰的寡核苷酸和R10是-H或-OH。

在本发明一个十分优选的实施方案中，当双键不存在时，Y是O、S或CR5aR5b。在本发明一个十分优选的实施方案中，根据本发明的化合物是己糖醇衍生物，即当双键不存在时，根据本发明的化合物的式III中的Y是O。

在本发明一个十分优选的实施方案中，根据本发明的化合物是环己烯基衍生物，即在六元环的Cl原子和Y之间的虚线表示存在双键，由此Y是CR5a并且R5a独立地选自烷基、链烯基、炔基、芳基、酰基或-H，优选R5a是-H。

对于用于LightCycler设备使用的方法，在寡聚化合物的合成过程中，根据本发明的化合物将被优选直接连到该寡聚化合物的3′或5′末端。

优选地，对于TaqMan中使用的方法，结合到根据本发明的寡聚化合物上的标记R7可以位于根据本发明的寡聚化合物的中间、在根据本发明的寡聚化合物的5′末端或3′末端。

标记优选荧光标记，优选荧光素或罗丹明染料。根据本发明的寡聚化合物可以进一步包含其它标记，在其中一个标记的发射波长与另一个标记的吸收波长重叠。优选，寡聚化合物进一步包含第二标记作为淬灭剂，淬灭荧光标记的荧光发射，该荧光标记能是荧光素。优选的淬灭剂是荧光罗丹明或花菁染料或非荧光标记如dabcyl(“暗淬灭剂”)。在最优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物在TaqMan方法中不能被酶扩增以用作为探针，主要内容在US5,210,015、US 5,487,972或US 5,804,375中阐述了。优选地，在寡聚体化合物3′末端的单体单元是2′，3′-双脱氧核苷酸或3′-磷酸化核苷酸。优选用于TaqMan方法的根据本发明带有标记，优选荧光标记的单体单元，以及带有另一个标记，优选第二个荧光标记的第二单体单元，可以位于根据本发明的寡聚化合物的中间或在根据本发明的寡聚化合物的5′末端和/或3′末端。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物包含一个修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸含有一个单体单元，是：(1)带有连接到核苷酸上的第二标记的连接部分，或(2)带有连接到修饰的核苷酸或非核苷酸化合物的第二标记的连接部分。优选，该第二标记是第二染料，其优选荧光染料并且优选选自如下的基团：(1)荧光素染料，(2)罗丹明染料，(3)花菁染料，(4)香豆素染料，和(5)偶氮染料。

优选地，根据本发明的寡聚化合物不能被酶扩增，因此，优选的在寡聚化合物3′末端的单体单元是2′，3′-双脱氧核苷酸或3′-磷酸化核苷酸。

本技术领域的熟练专家承认根据本发明的化合物或根据本发明的寡聚化合物的六元环可以进一步地带有取代基且在根据本发明的方法中仍具有功能的事实。特别地，不但六元环，连接部分也可进一步地带有卤素、硫醇基、羟基、氨基、烷基、链烯基、炔基、芳基取代基，由此烷基、链烯基、炔基、芳基取代基可任选地包含杂原子，或用更多的取代基任选地取代的芳杂基取代基。优选的也是位于式I或III的六元环上的C5原子的另一个取代基，其选自烷基、链烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨烷基、卤素、叠氮基、羟基、羧基或氨基部分。这些化合物可用于测试是否它们能被用于根据本发明的方法或用途，通过如用已描述的互补寡核苷酸来进行简单的杂交试验，分析的方法用LightCycler设备或TaqMan设备，或在根据本发明的化学合成方法中使用亚磷酰胺或固相连接的化合物。

根据本发明的寡聚化合物可被合成，如在本技术领域中已大体上被描述和为本领域的专家所周知。特别优选的结构单元为此是根据本发明的化合物。本技术领域周知制备寡聚化合物如具有特定序列的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的方法，包括，如，克隆和在适当的位置限制酶切适当的序列和直接化学合成。化学合成方法可以包括，如Narang，S.A.，等，Methods in Enzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.，等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151所披露的磷酸二酯法，Beaucage等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859披露的亚磷酰胺法，在Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280中所披露的H-膦酸酯法和在US 4,458,066中披露的固体载体法。特别优选的是亚磷酰胺法。因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了根据本发明的寡聚化合物的化学合成方法，包含如下的步骤：(a)提供根据本发明的化合物，其中R2是-OR6和R6是亚磷酰胺和R3是保护基团，(b)提供一个通过另一个-OH基团连接到固相上的核苷或修饰的核苷的-OH基团，或提供一个通过在寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3′末端的核苷酸或修饰的核苷酸的另一个-OH基团连接到固相上的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的-OH基团，(c)使亚磷酰胺的亚磷原子和游离的OH基团反应以形成亚磷酸酯并且氧化此亚磷酸酯为磷酸三酯，(d)任选地用步骤(c)中任何未反应的-OH基团和另一个化合物反应以阻止在随后的步骤中步骤(c)中未反应的5′-OH基团的任何进一步反应(“加帽”反应)(“Capping”-reaction)，(e)在除去步骤(d)的羟基保护基团以提供游离的-OH基团后，任选地用核苷、修饰的核苷或根据本发明的化合物的亚磷酰胺衍生物重复步骤(c)到(d)，其中R2是-OR6和R6是亚磷酰胺和R3是保护基团，和(f)将寡聚化合物从固相上裂解下来，除去保护基团和由此转换磷酸三酯为磷酸二酯，和(g)分离寡聚化合物。

本技术领域的熟练专家周知进行这些反应步骤的方法。

在本发明另一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的寡聚化合物的酶促合成的方法，包括如下的步骤：(a)将根据本发明的其中所述的化合物的R3是三磷酸酯的化合物，在存在末端转移酶或聚合酶下，用多核苷酸、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3′末端的核苷酸或修饰的核苷酸中的OH基团进行培养，所述OH基团优选是可扩增的，由此，该化合物被结合到OH基团上，所述OH基团优选是可扩增的，由此，释放出焦磷酸酯(pyrophosphate)，(b)可选地在存在末端转移酶或聚合酶下，将步骤a)的产物的3′末端上的OH基团用核苷三磷酸酯或修饰的核苷三磷酸酯进行培养，所述OH基团优选是可扩增的，由此，该核苷酸或修饰的核苷酸与OH基团连接，所述OH基团优选是可扩增酯，由此，释放出焦磷酸酯，(c)可选地重复步骤(a)或(b)或两者，和(d)分离寡聚化合物。

在使用末端转移酶的情况下，根据本发明的酶促合成方法的步骤b)和c)可优选不执行。

在本发明的另一个优选的实施方案中，用于分析靶核酸和寡聚化合物之间的相互作用的组合物包含根据本发明的具有不同序列的寡聚化合物的多元阵列(an array of a plurality of oligomeric compounds)。最优选的，此寡聚化合物是根据本发明的寡聚化合物，即其是具有式III的化合物，其中R7是固相或R9、R10或R11是共价偶联到固相的连接部分，即这些残基是与固相结合的位点。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物具有式I，其中R2是-OR6和R6是亚磷酰胺，和R3是共价偶联到连接部分的固相或保护基团，其被用于根据本发明的寡聚化合物的化学合成。

在本发明另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物被用于标记核酸，即通过酶结合被标记的修饰的核苷酸到核酸上，其中酶合成根据本发明的寡聚化合物的方法是用根据本发明的三磷酸酯衍生物来实现的。更详细地，根据本发明的一种化合物具有式I，其中R3是三磷酸酯，R2是-OR6，其中R6是-H，和R4是-H或-OH，它被用于酶合成标记的核酸，即根据本发明的寡聚化合物。

还在另一个优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物或根据本发明的组合物被用于同互补核酸的杂交反应，如杂交一个根据本发明的寡聚化合物到在预先确定的位置连接在固相上以形成微阵列的多元寡核苷酸上。甚至在另一个优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物被用作引物、探针或捕捉探针，结合包含六元环的根据本发明的化合物到寡聚化合物上特别是可用于稳定根据本发明的寡聚化合物，防止被核酸酶消化和嘌呤碱基的脱嘌呤。

还在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明的寡聚化合物被提供，其是结合到固相上，和其是优选具有式III的化合物。特别优选可序列特异地捕捉RNA，如己糖醇核酸可主要地结合RNA(Lescrinier，E.，等，Chem.Biol.7(2000)719-731)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于检测样品中的靶核酸的方法，包含如下的步骤：(a)提供可能含有靶核酸的样品，(b)提供根据本发明的寡聚化合物，其基本上与靶核酸的部分或全部互补，(c)可选地用模板依赖性DNA聚合酶和引物来扩增靶核酸，(c)在寡聚化合物和靶核酸结合的条件下，将样品和寡聚化合物接触，(d)测定靶核酸和寡聚化合物之间的结合产物或杂交的程度作为靶核酸的存在、不存在或数量的量度。

优选地在该方法步骤(d)中，通过经模板依赖性DNA聚合酶的核酸外切酶水解而从与靶核酸杂交的寡聚化合物释放的第一或第二荧光标记的数量来测定杂交的程度，优选地，根据本发明的寡聚化合物包含两个标记，优选两个荧光标记。

扩增操作优选用聚合酶链式反应特异地扩增靶核酸至可检测的数量。其它可行的扩增反应是连接酶链式反应(LCR；Wu，D.Y.，和Wallace，R.B.，Genomics4(1989)560-569；和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany，F.，PCR Methods and Appl.1(1991)5-16)；缺口-LCR(Gap-LCR)(WO90/01069)；修复链式反应(EP 0439182)，3SR(Kwoh，D.Y.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli.J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO92/08808)，和NASBA(US 5,130,238)。此外，有链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ-扩增(见综述，如Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Current Opinion inBiotechnology4(1993)41-47)。

优选的模板依赖性DNA聚合酶是Taq聚合酶。

在本发明的一个检测靶核酸的方法的优选的实施方案中，在TaqMan分析中所使用的方法被考虑，由此，根据本发明的寡聚化合物被用于作为探针。因此，根据本发明的寡聚化合物包含一个标记如R7，其可优选为荧光标记，优选荧光素。根据本发明的寡聚化合物可进一步包含其它的荧光标记，其中一个荧光标记的发射波长与另一个荧光标记的吸收波长重叠。优选地，寡聚化合物还包含第二荧光标记作为淬灭剂，淬灭荧光标记的荧光发射，该荧光标记能是荧光素。优选的淬灭剂是荧光罗丹明或花菁染料。淬灭剂也可以是非荧光化合物或染料如dabcyl(“暗淬灭剂”)。根据本发明的寡聚化合物在TaqMan方法中不能被酶扩增以用作为探针，主要内容在US 5,210,015、US 5,487,972或US5,804,375中阐述了。优选地，在寡聚化合物3′末端的单体单元是2′，3′-双脱氧核苷酸或3′-磷酸化核苷酸。优选用于TaqMan方法的根据本发明的化合物带有标记，同样第二个化合物带有该标记，所述化合物可以位于根据本发明的修饰的寡聚化合物的中间或在根据本发明的修饰的寡聚化合物的5′末端和/或3′末端。因此对于在TaqMan分析中使用的方法，在该方法的测定步骤中，荧光标记和第二个标记，即淬灭剂之间的空间关系随着杂交而变化，优选通过模板依赖性DNA聚合酶，优选Taq聚合酶的核酸外切酶的水解核酸结合化合物，由此作为核酸外切酶水解的结果释放出标记。在根据本发明的寡聚化合物和靶核酸之间的杂交程度通过在杂交过程中从根据本发明的寡聚化合物中释放出的标记的数量来测定。因此，本发明一个优选的实施方案是在步骤(d)中通过杂交到核酸的寡聚化合物经模板依赖性DNA聚合酶的核酸外切酶水解而被释放的标记的数量来测定杂交程度。

在本发明一个十分优选的实施方案中叙述了更详细的TaqMan分析方法，提供了一种测定样品中靶核酸的方法，包括如下步骤：(a)将包含单链核酸的样品和含有互补于靶核酸某一区域的序列的寡核苷酸及根据本发明的寡聚化合物接触，该寡聚化合物中R7是荧光标记且其含有第二荧光标记，和由此所述的寡聚化合物含有互补于相同的靶核酸序列链的第二区域的序列，但不包括由寡核苷酸定义的核酸序列，以便在杂交的条件下产生双链体的混合物，其中的双链体包含退火到寡核苷酸及寡聚化合物的靶核酸，使得第一个寡核苷酸的3′末端位于寡聚化合物的5′末端的上游，(b)在足以允许聚合酶的5′-3′核酸酶活性裂解退火的、寡聚化合物和释放出的被标记的片段的条件下保持步骤(a)的混合物具有5′-3′核酸酶活性；和(c)检测和/或测定释放出的被标记的片段。

在本发明的另一个实施方案中，在US 6,174,670中提供了用于LightCycler设备的方法，对于用于LightCycler设备的方法，根据本发明的化合物优选将位于3′-或5′-末端，即在寡聚化合物合成后单体单元位于其的3′-或5′-末端。这些方法应用荧光共振能量转移技术(见，如美国专利号No..4,996,143，5,565,322，5,849,489和6,162,603)及基于当一个供体和一个相应的荧光受体标记彼此在一定的距离内被定位，在两个荧光标记之间的能量转移发生，其能目测或另外被检测和/或定量方法测定的事实。本文所用的两个探针每一个含有荧光标记，由此它们中的至少一个是根据本发明的寡聚化合物，在特定的位置能杂交到扩增的产物上，可通过探针和靶核酸的互补性被测定。根据本发明的寡聚化合物的根据本发明的荧光标记可是荧光供体或受体标记。在适当的位置上探针杂交到扩增产物，产生一个FRET信号。荧光分析能被执行，用例如，光子计数表面荧光显微镜系统(含有合适的分色镜和过滤光片为监视特定角度的荧光发射)、光子计数光电倍增器系统或荧光计。用氩离子激光器、高亮度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其它的高强度的光源通过适当的滤光片在希望的范围内激发出的光能激发起始能量转移。关于本文所用的荧光供体和相应的荧光受体标记，“相应”指具有与荧光供体标记的发射光谱重叠的激发光谱的荧光受体标记。因此，在它们之间能产生有效的非放射性能量转移。优选的荧光标记是作为荧光供体标记的荧光素，由此荧光受体标记是罗丹明，但是，优选的是花菁染料，优选US 6,174,670中描述的Cy5。

因此，在本发明一个实施方案中，提供了一种检测样品中是否存在靶核酸的方法，包括如下步骤：执行至少一个循环步骤，其中一个循环步骤中包含扩增步骤和杂交步骤，其中所述的扩增步骤包含将所述的样品和引物接触以产生扩增产物，如果在样品中存在靶核酸的话，其中所述的杂交步骤包含将所述的样品接触一对探针，其中以互相不超过5个核苷酸的方式，所述配对的探针的成员杂交到所述的扩增产物上，其中所述的配对的探针的第一个探针是用荧光供体标记所标记的，和其中所述的配对的探针的第二个探针是用相应的荧光受体标记所标记的，且因此其中探针之一是根据本发明的寡聚化合物，和检测在所述的第一个探针的所述的荧光供体标记和所述的第二个探针的所述的荧光受体标记之间的荧光共振能量转移是否存在，其中存在FRET是在样品中存在靶核酸的指征，和其中不存在FRET是在样品中不存在靶核酸的指征。

因此，在本发明一个优选的实施方案中，提供了一个检测样品中靶核酸的方法，包含如下步骤，在存在两个核酸探针的条件下通过聚合酶链式反应扩增核酸，其中一探针是根据本发明的寡聚化合物，杂交靶核酸邻近的区域，所述的探针之一用荧光受体标记来标记及另一探针用荧光能量转移配对的荧光供体标记来标记，以使这两个探针和靶核酸杂交，荧光供体和受体标记彼此长度不超过25个核苷酸，所述的聚合酶链式反应包含如下步骤，添加热稳定聚合酶、核苷酸和用于靶核酸的引物到样品中，及样品在至少一个变性温度和一个延伸温度之间进行热循环；生物样品通过荧光供体标记的吸收波长处的光激发，并检测来自荧光能量转移配对的荧光发射。

在本发明另一个优选的实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，包含如下步骤，在存在两个核酸探针的条件下，通过聚合酶链式反应扩增核酸，其中一探针是根据本发明的寡聚化合物，杂交核酸邻近的区域，所述的探针之一用荧光受体标记来标记及另一探针用荧光能量转移配对的荧光供体标记来标记，以使这两个探针和靶核酸杂交，荧光供体和受体标记彼此长度不超过25个核苷酸，所述的聚合酶链式反应包含如下步骤，添加热稳定聚合酶、核苷酸和用于靶核酸的引物到样品中，及使样品在至少变性温度和延伸温度之间进行热循环；生物样品通过供体标记的吸收波长处的光激发，并监测来自荧光能量转移配对的温度依赖性荧光。

在本发明另一个优选的实施方案中，提供了一种测定样品中靶核酸存在或数量的方法，包含如下的步骤：a)提供来自要被分析的样品的靶核酸，b)从靶核酸合成双链互补DNA，c)在存在根据本发明的化合物和核苷三磷酸酯下，扩增靶核酸，由此获得标记的靶核酸，d)将标记的靶核酸与寡聚化合物阵列在规定的位置上杂交，和e)在每一个规定的位置上测量荧光强度，由此靶核酸的存在或数量被测定。

这是使用阵列方法用于检测靶核酸的方法。优选地，在US 5,545,522；5,716,785；US 5,891,636；US 6,291,170中描述的方法被用于根据本发明的方法的步骤b)和c)，由此，用包含细菌T7-启动子的引物合成双链cDNA，和在存在核糖核苷三磷酸酯下标记的RNA被转录，由此标记被结合到一些核苷三磷酸酯上。在此靶核酸优选核糖核酸。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明涉及一个由几部分组成的试剂盒，由此该试剂盒含有模板依赖性聚合酶，优选具有5′-3′核酸外切活性，优选Taq聚合酶，一组引物，核苷酸和根据本发明的寡聚化合物，优选其中R7是标记，本技术领域所周知的这样的试剂盒还包含塑料皿，在扩增程序中其可被使用，如96孔或384孔的微量滴定板或就是普通的反应管，如德国汉堡Eppendorf制造的反应管和所有的其它用于进行根据本发明的该方法的试剂。

在另一个优选的实施方案中，提供的由几部分组成的试剂盒含有根据本发明的化合物，其是三磷酸酯并能通过酶反应结合到核酸上。该试剂盒还包含核苷三磷酸和聚合酶，可以是如核糖核苷三磷酸酯和RNA聚合酶。

在本发明的另一个实施方案中，试剂盒含有更多的试剂用于分离核酸。因此，该试剂盒能额外地含有对核酸有亲和性的材料，优选该对核酸有亲和性的材料包括具有二氧化硅表面的材料。优选地，该具有二氧化硅表面的原料是玻璃，最优选，该对核酸有亲和性的材料是如在WO96/41811或WO01/37291中描述的包含磁性玻璃颗粒的组合物。该试剂盒能进一步地或额外地包含溶解缓冲液，其含有如离液剂、去垢剂或醇或它们的混合物，能溶解细胞及单独地提供蛋白酶，如K蛋白酶，用于消化多余的蛋白。根据本发明的试剂盒中的这些成分可被单独地提供在试管中或储存容器中。根据这些成分的性质，它们甚至可被提供在单个的试管或储存容器中。当DNA或RNA结合到该颗粒上时，该试剂盒可进一步或额外地包含清洗溶液，其适用于磁性玻璃颗粒的清洗步骤。该清洗溶液含有缓冲液中的乙醇和/或离液剂，所述缓冲液为不含上述的乙醇和/或离液剂并具有酸性pH。通常清洗溶液或其它溶液被提供作为储液，其在使用前被稀释。该试剂盒可进一步或额外地包含洗脱剂或洗脱缓冲液，即洗脱结合在磁性玻璃颗粒上的DNA或RNA的溶液或缓冲液(如10mM Tris，1mMEDTTA，pH 8.0)或纯水。进一步地，可存在额外的试剂或缓冲溶液，其能被用于核酸即DNA或RNA的纯化过程。

提供以下的实施例、参考文献和附图，有助于理解本发明，在附加的权利要求书中阐明了本发明真正的保护范围。应理解，可以不违背本发明的精神的方式进行修改。

附图说明