生物分子检测方法 |
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| 申请号 | CN201380041216.6 | 申请日 | 2013-06-28 | 公开(公告)号 | CN104541160B | 公开(公告)日 | 2017-05-17 |
| 申请人 | 株式会社日立高新技术; | 发明人 | 斋藤俊郎; 今井健太; 今井恭子; 今井一成; 柳至; 柳川善光; 安藤正彦; 板桥直志; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的在于提供一种无需事先调整试样的浓度，在宽广的动态范围内，以高灵敏度且高吞吐量检测 生物 分子的方法和装置。本发明使电荷保持体与检测对象的生物分子进行特异性结合，测量其 复合体 通过微小的孔隙时产生的 电流 变化，逐个对检测对象的生物分子进行检测。通过将检测部阵列化，能够以高吞吐量检测生物分子试样。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生物分子检测方法，其特征在于， |
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| 说明书全文 | 生物分子检测方法技术领域背景技术[0003] 癌(非专利文献1)、神经系统的疾病(非专利文献2)、感染症的感染初期时(非专利文献3)的情况中，认为在血清中存在的蛋白质的浓度为从10-16到10-12M。在生物分子的定量或者检测中，通常主要进行使用ELISA法、化学发光法或者流式细胞仪的微球分析等，但是，即使检测灵敏度低，也为10-12M左右(非专利文献4)，对疾病早期诊断的应用非常受限制。 [0004] 例如，假定通常的血液检查，设被检验者的血清试样为50ul左右时，在10-17M(10aM)的标记的情况下仅存在约300个分子，与测量浓度相比更需要计数分子数量的技术，但这样的技术现在没有实用化，期待具有aM数量级的检测灵敏度的检测技术被实用化。 [0005] 专利文献1中公开一种使用流式细胞仪来求取捕捉了抗原的微粒子的数量的方法。 [0006] 另外，近些年，提出对100ul中只存在10-20个分子的试样(浓度换算为10-19M)也能够使用抗原-抗体反应来检测的数字ELISA(digital ELISA)方法(非专利文献5)。该方法通过固定了抗体的磁微粒子捕捉抗原(检测对象的生物分子)后，使之与附有生物素的第二抗体反应，进而与附有抗生蛋白链菌素的半乳糖酶反应，向磁微粒子上导入酶。接着，将该微粒子放入将光纤束末端蚀刻而列阵状设置了微小的孔的结构中，使化学发光基质与其作用，由此求取通过光纤的其化学发光亮点数，计数抗原的分子数量。 [0007] 现有技术文献 [0008] 专利文献 [0009] 专利文献1：日本专利第4748542号 [0010] 非专利文献 [0011] 非专利文献1：Srinivas,P.R.,Kramer,B.S.&Srivastava,S.Trends in biomarker research for cancer detection.Lancet Oncol.2,698-704(2001). [0012] 非专利文献2：Galasko,D.Biomarkers for Alzheimer’s disease–clinical needs and application.J.Alzheimers Dis.8,339-346(2005). [0013] 非专利文献3：Barletta,J.M.,Edelman,D.C&Constantine,N.T.Lowering the detection limits of HIV-1viral load using real-time immuno-PCR for HIV-1p24antigen.Am.J.Clin.Pathol.122,20-27(2004). [0014] 非专利文献4：Giljohann,D.A.&Mirkin,C.A.Drivers of biodiagnostic development.Nature 462,461-464(2009). [0015] 非专利文献5：David M Rissin et al,Nature Biotechnology,28,1641(2010).[0016] 非专利文献6：Fologea D.et al.,Appl Phys Lett.,91,053901-3(2007).[0017] 非专利文献7：Romero-Cano,M.S.et al.,Journal of Colloid and Interface Science,198,266-272(1998). 发明内容[0018] 发明要解决的课题 [0019] 专利文献1公开的方法中，若考虑光学系统则并行化并不现实，测量可能需要时间。另外，非专利文献5公开的方法中，虽然在某种程度上可以并行处理，但是通过一次检测可检测的分子数受到光纤数量，即阵列状的微小孔数限制。因此，存在当试样浓度低时需要浓缩，相反，当浓度高时需要稀释等，需要检测前的浓度调整这样的在实际应用中处理变得复杂的问题。 [0020] 鉴于上述课题而作出本发明，提供一种对检测对象的生物分子逐一计数的方法，特别提供一种无需事先调整试样浓度，作业简便的检测方法。 [0021] 用于解决课题的手段 [0022] 经本发明的发明人悉心研究，开发出对检测对象的生物分子逐一进行分子计数的方法，且其计数的分子数量没有限制的方法。 [0023] 具体来说，是如下方法：在固定了大量检测用抗体的电荷保持体上捕捉生 物分子后，与电荷保持体上固定了第二抗体的结构反应，由此，生成经由生物分子连接两个电荷保持体的电荷保持体的缔合体，利用在基板上设置了多个组合了电场效应型晶体管和孔隙的检测部的设备，并行检测电荷保持体缔合体。通过设置多个检测部，即使检测对象分子数量增加也可以充分对应。 [0024] 发明效果 [0025] 本发明提供一种在现有检测方法中无法实现的、对检测对象的生物分子逐一对其分子数进行计数的检测方法。 [0026] 特别是，通过使用电场效应型晶体管进行检测，使检测部容易并行化，可以容易地使检测高速化。例如，在1mm角的基板上可以容易地以1um的间距制作电场效应型晶体管和孔隙，例如容易在1秒内检测出10万个通过孔隙的电荷保持体复合体，因此，在10分钟内平均可以检测出6×1013个电荷保持体复合体。例如，若设检体为50ul的血清，则作为摩尔浓度，可以在从高浓度1uM到低浓度1aM(30分子/50ul)的大范围内用同样的方法进行测量。 [0028] 图1是用于说明本发明的检测方法的一例的图。 [0029] 图2是用于说明本发明的检测设备的结构的一例的图。 [0030] 图3是用于说明本发明的检测设备的结构的一例的图。 [0031] 图4是说明本发明的检测设备的概念的图。 [0032] 图5是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0033] 图6是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0034] 图7是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0035] 图8是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0036] 图9是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0037] 图10是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0038] 图11是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0039] 图12是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0040] 图13是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0041] 图14是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0042] 图15是表示本发明的检测设备的制造方法的图。 [0043] 图16是说明本发明的检测设备的结构的图。 [0044] 图17是说明本发明的检测设备的结构的图。 [0045] 图18是说明本发明的检测设备的结构的图。 [0046] 图19是说明本发明的检测设备的结构的图。 [0047] 图20是用于说明本发明的检测方法的一例的图。 [0048] 图21是用于说明本发明的检测方法的一例的图。 [0049] 图22是用于说明本发明的检测装置的结构的一例的图。 [0050] 图23是用于说明本发明的检测方法以及装置的结构的一例的图。 具体实施方式[0051] 本实施例中公开一种生物分子检测方法，其特征在于，使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的第一抗体的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应，测量所述电荷保持体的各自的电荷量，由此检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。这里，评价生物分子的存在量的意思是对分子个数进行计数。因此，当测量对象为液体且知道全体的容积或量时，与浓度测量的意义相同。 [0052] 此外，在其他实施例中公开一种生物分子检测方法，其特征在于，使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应而得到反应液，相对于在基板表面上设置2个对置电极，在所述电极之间设有贯通所述基板的孔隙的基板，所述反应液从基板的一面侧通过所述贯通的孔隙流动到另一面侧，通过测量所述电极间的电流，检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。 [0053] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测方法，其特征在于，在基板表面上设置绝缘膜、控制栅极、源极、漏极、通道以及相对于具有所述控制栅极、所述源极、所述漏极、所述通道的平面，从该平面的一面侧向另一面侧贯通的孔隙，是通过所述控制栅极给所述通道带来电场效应的电场效应晶体管，所述 贯通的孔隙被配置在所述控制栅极中所述通道侧的侧面与所述通道中所述控制栅极侧的侧面附近之间，使所述反应液流入所述贯通的孔隙，根据从所述源极向所述漏极流动的电流的变化，检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。 [0054] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测方法，其特征在于，所述电荷保持体是从磁微粒子、高分子微粒子、蛋白质、核酸中选出的。 [0055] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测装置，其特征在于，包括：使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的第一抗体的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应的单元；测量每个所述电荷保持体的电荷量的单元。 [0056] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测装置，其特征在于，作为测量每个所述电荷保持体的电荷量的单元，使用具备电场效应晶体管和贯通的孔隙的设备。 [0057] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测方法，其特征在于，使用设置有第1溶液槽、第2溶液槽、分隔所述第1溶液槽和所述第2溶液槽的膜、在所述膜上设有贯通的孔隙，在第1溶液槽和第2溶液槽中设置了测量物质在所述贯通的孔隙中移动而产生的电流的电极的装置，将使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的第一抗体的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应而得到的反应液放入所述第1溶液槽，检测所述第1溶液槽和所述第2溶液槽之间流动的电流的变化，由此检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。 [0058] 此外，在实施例中，所述生物分子检测方法的特征在于，所述贯通的孔隙的直径比使用的电荷保持体的直径大，比直径的2倍小。而且，膜的厚度为所述电荷保持体的直径的2倍以下更好。 [0059] 此外，在实施例中，所述生物分子检测方法的特征在于，所述电荷保持体是从磁微粒子、高分子微粒子、蛋白质、核酸中选出的。 [0060] 此外，在实施例中公开了一种生物分子检测装置，其特征在于，具备：设置有第1溶液槽、第2溶液槽、分隔所述第1溶液槽和所述第2溶液槽的膜、在所述膜上设有贯通的孔隙，在第1溶液槽和第2溶液槽中设置有测量物质在 所述贯通的孔隙中移动而产生的电流的电极的设备；使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的第一抗体的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应的单元；将反应液放入所述第1溶液槽，检测所述第1溶液槽和所述第2溶液槽之间流动的电流的变化的单元。 [0061] 在用于对本实施方式进行说明的全部图中，对具有同一功能的部分赋予同一符号，尽可能省略其重复的说明。以下，基于附图详细说明本发明的实施方式。实施方式中记载的设备构造以及材料是用于将本发明的思想具体化的一个例子，并不严格确定材料以及尺寸等。 [0062] 实施例1 [0063] 使用图1的示意图对本发明的概念进行说明。 [0064] 图1中表示使对于检测对象的生物分子101特异性结合的第一抗体102和第二抗体104反应而生成的三明治复合体105。在第一抗体102和第二抗体104上预先结合官能团103。 作为反应方法，为了高效率地得到三明治复合体105，优选第一抗体102使用单克隆抗体，第二抗体104使用多克隆抗体，并且分别按顺序反应。 [0065] 图1中表示通过上述生成的三明治复合体105和电荷复合体107生成的二聚体109。为了使电荷保持体107和三明治复合体105结合，使和官能团103特异性结合的结合分子108预先与电荷保持体107结合。例如在官能团103中可以使用生物素，在结合分子108中可以使用抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素。 [0066] 通过使在表面上修饰了结合分子108的电荷保持体107与三明治复合体105反应，可以得到三明治状地夹持生物分子101的电荷保持体107的二聚体109。 [0067] 相对于生物分子101的浓度，使10倍，更优选100倍以上的浓度的第一抗体102和第二抗体104进行反应，为了高效率地获得三明治复合体105是理想的。 [0068] 在使电荷保持体107与三明治复合体105反应时，通过使电荷保持体107的浓度多达三明治复合体105浓度的10倍以上、更优选是100倍以上的条件 下反应，可以将对于一个电荷保持体107附加多个三明治复合体105的情况抑制到足够低，是理想的。如上所述，在得到三明治状地夹持生物分子101的电荷保持体107的二聚体109后，利用检测设备114测量生物分子101存在的分子数量。 [0069] 配合检测吞吐量，在支持体113上配置多个检测设备114。支持体113隔着第一溶液槽111和第二溶液槽112来配置。在检测设备114中，在基板119上设置有源极116、漏极117、控制栅极115、通道121。孔隙118为贯通基板119的孔，被设置在控制栅极115和通道121之间的基板119上或者包含通道121的全部或者一部分的位置上。 [0070] 将包含三明治状地夹持生物分子101的电荷保持体107的二聚体109、和二聚体以外的反应物110的反应液放入第一溶液槽111，在第一溶液槽111和第二溶液槽112之间，例如通过施加电场使含有电荷保持体107的反应物从第一溶液槽111向第二溶液槽112经由孔隙118移动。检测设备114为通过控制栅极115给通道121带来电场效应的电场效应晶体管。在通道121附近设置有孔隙118，通过测量由于电荷保持体107通过孔隙118而从源极116流向漏极117的电流的变化，检测电荷保持体107的通过。 [0071] 根据本设备，识别电荷保持体107是以单体状态通过，还是以三明治状夹持生物分子101的电荷保持体107的二聚体109通过，并计数二聚体109的个数，由此可以评价生物分子101的存在数量。通过测量电流变化量，可以充分识别未反应物106或二聚体以外的反应物110和二聚体109。 [0072] 电荷保持体107中，可以使用由聚苯乙烯等高分子形成的微粒子。通过在表面上导入羧基并控制其密度，可以控制表面上带电的负电荷量。或者，若向高分子微粒子的表面导入氨基，则可以保持正电荷，通过控制该氨基的密度，可以控制正的电荷量。 [0073] 另外，电荷保持体107中可以使用蛋白质。例如，若使用BSA(牛血清白蛋白)，则可以作为带负电的电荷保持体来使用。在使用由高分子形成的微粒子时，需要充分抑制凝集，或者预先充分去除凝集物后再使用。否则，有可能难以判断是三明治状夹持生物分子101的电荷保持体107的二聚体109，还是凝集物。另一方面，在电荷保持体107中使用蛋白质时，具有凝集物的存在 不成问题的优点。其中，球状蛋白质对于水的溶解性等方面理想。 [0074] 电荷量正或负都可以使用，电荷量优选较大，基于这点，优选使用由聚苯乙烯等高分子形成的微粒子。 [0075] 单独的单体的电荷保持体107相连地侵入孔隙，与二聚体的识别有可能变得困难，但是电荷保持体107的电荷量越大，通过静电排斥，电荷保持体107彼此难以存在于与二聚体同等的距离，可以抑制发生这种错误。 [0076] 电荷保持体107的直径比孔隙118的直径小即可。更理想的情况下，从液体中的分散性、扩散速度的方面来说优选较小，优选为10um以下，更优选为2um以下。 [0077] 孔隙118的直径需要比电荷保持体107的直径大。另外，由于需要区别未反应的单体、和生物分子结合后的二聚体109，因此最好是具有电荷保持体107直径的2倍以下的大小。 [0078] 流过通道121的电流，基于通过孔隙118的电荷保持体107的有效电荷量和有效电场引起的电场变化而变化，通过检测该变化，识别电荷保持体107为单体还是二聚体。需要使流过通道121的电流层的厚度尽可能薄，检测由1个电荷保持体107引起的电场变化引起的电流。为此，需要使通道121的厚度变薄。通道121的厚度如果比电荷保持体107的直径薄，则能够逐一检测出通过孔隙118的电荷保持体107，可以识别二聚体119和二聚体以外的反应物110。 [0079] 图2表示检测设备114的详细的结构图。 [0080] 具有：绝缘膜200、通道201、控制栅极202、源极203、漏极204、背栅极205、孔隙206、以及成为对202～205的接头的配线207。 [0081] 孔隙位于控制栅极的通道侧的侧面与通道的控制栅极侧的侧面之间(图2A)，或者在通道的控制栅极侧的端部(图2B)，或者在通道的控制栅极侧的侧面附近的通道中(图2C)。 [0083] 在源漏极上以源极电压<漏极电压的方式施加了电压的状态下，通过控制控制栅极，本设备进行晶体管动作。是所谓侧栅型的晶体管。当晶体管为导通 (ON)状态时，在控制栅极侧(孔隙侧)的通道侧部分感应出反转层，因此，电流在控制栅极侧的通道侧部流动。反转层的厚度还基于控制栅极的电压而定，但是极薄，为2～3nm程度以下。 [0084] 根据以上的结构，通过利用反转层效应和厚度方向上的量子阱的限域效应，在薄膜的通道的侧壁部可以形成伪1维的最细电流通路。由于是伪1维的最细电流通路，所以对孔隙中的对象物引起的微小的电场变化极其敏感地反应。因此，可以使检测信号的变化比(检测敏感度)极其高。 [0085] 通道的电流是由控制栅极电场感应的电子而导致的。因此，孔隙可以配置在控制栅极和通道的电流通路之间。由此，孔隙中的对象物引起的电位变化，可以极其有效地调制控制栅极和通道之间的电场，将该变化反映到通道电流中。 [0086] 孔隙越接近通道中的侧部的电流通路，可以使检测敏感度越高。其最甚情况例如图2B、图2C所示，是通道侧部的一部分成为孔隙的一部分的构造，或者，在极其接近通道侧部的地方具有孔隙的构造。另一方面，例如，即使在控制栅极侧的通道侧部的电流通路与背栅之间配置孔隙，孔隙中的对象物引起的电流变化也极其小。这是由于即使在背栅侧配置孔隙，控制栅极在通道中形成的电场也几乎无法调制。 [0087] 根据以上内容，对于孔隙配置而言理想的区域如图3区域300所示。孔隙的配置可以在控制栅极与通道侧部之间，以及通道侧部的伪1维的最细电流通路中。 [0088] 如图2B以及图2C所示，通道的一部分成为孔隙区域时，能够进行非常高灵敏度的检测(sensing)。另一方面，如图2A所示，通道和孔隙由绝缘膜分离时，由于通道不直接接触对象物或含有对象物的溶液，因此通道腐蚀以及通道表面状态的变异等的可能性低，提高设备的可靠性。 [0089] 此外，为了进一步抑制电流通路的通道宽度方向的扩展，在通道侧部形成更稳定的1维电子传导通路，向背栅205施加电压，使电子更集中于控制栅极侧的电场控制是有效的。 [0090] 图4是将本设备中由虚线分隔的部分作为夹持孔隙的2个容量来模型化的图。 [0091] C1为由控制栅极和孔隙间的虚线分隔的部分的电容，C2为由孔隙和通道间的虚线分隔的部分的电容。作为形成的设备，例如，当孔隙直径为20nm，控制栅极和孔隙间的距离为50nm，通道和控制栅极的厚度为3nm，作为控制栅极和孔隙间的绝缘膜而使用氧化膜(介电常数3.9)时，当用四角柱近似孔隙，并将其一边设为20nm时，C1约为2.76×10-19F。 [0092] 若将孔隙中的电荷量变化设为ΔQ，则孔隙附近的通道端的阈值电压偏移ΔVth如式(1)所示。 [0093] ΔVth＝ΔQ/C1…式(1) [0094] 若使用球状蛋白质BSA(牛血清白蛋白，直径：7～8nm)作为电荷保持体，则根据非专利文献6，由于pH7下的BSA表面电荷量为-18e，所以直径20nm的孔隙中通过1个BSA时和通过2个BSA时的差值为ΔVth＝10.4V，得到非常大的阈值偏移差。 [0095] 另外，当作为电荷保持体而使用直径为40nm左右的聚苯乙烯微球时，例如根据非专利文献7，根据将过硫酸钾用于开始剂时的聚苯乙烯的表面电荷密度(-32μC/cm2)，将微球的表面的电荷量估计大约为1.6×10-16C，孔隙直径为80nm的所述设备的结构时，通过1个聚苯乙烯微球时和通过2个聚苯乙烯微球时的差值为ΔVth＝36.2V，得到非常大的阈值偏移差。 [0096] 在本设备中可以实现接近该理想阈值电压偏移的值。其理由在于，首先，作为电流通路，在薄膜通道端形成极细的1维电子传导，因此在孔隙附近的通道端的电场变化(阈值变化)大致被反映到晶体管的阈值变化中(当通道较厚，电流通路的厚度方向的宽度较宽时，即使单一电荷来到附近，由于在离该电荷较远部分流过电流，所以不会得到大的阈值偏移。另外，即使电流在通道的宽度方向上整面流动也是一样，不会得到大的阈值偏移。正是由于本设备的结构和动作方式，可以实现像这样的接近大阈值偏移的值)。 [0097] 此外，通过使孔隙和通道靠近或者使孔隙和通道接触，在控制栅极和通道间的电场中，可以遮断由孔隙旁边向通道迂回的电场。其结果，孔隙中的电场调制可以无遗漏地传递到通道，可以实现如上所述的接近极大阈值偏移的值。 [0098] 如上所述，通过作为电荷保持体来使用蛋白质和高分子微粒子，在以单体通过时和作为二聚体通过时，根据本发明的检测设备检测出较大电位差，可以 利用充分的检测敏感度来检测/识别这两者。 [0099] 在将控制栅极设为一定电压的检测中，通过孔隙的电荷保持体引起的电流变化可以由孔隙-通道间的距离与孔隙-控制栅极间的距离来调整，如果延长孔隙-控制栅极间的距离，则电荷保持体引起的电流变化变大。另外，根据式(1)，通过降低孔隙和控制栅极间的介电常数，电荷保持体引起的电流变化也变大。进一步，通过调整pH，调整电荷保持体的有效电荷量，也可以使电流变化增大。如此，使检测灵敏度提高也是本设备特别值得一提的优点。这是通过将孔隙配置在通道电流通路和控制栅极间所得到的特征。此外，综合考虑可使用的电压和耐压等，将孔隙-控制栅极间的距离设定为检测敏感度最好的距离。 [0100] 另外，本设备中的背栅不是必须的。背栅的效应为可以使电流通路更集中在孔隙侧以及可以进行阈值电压的调整。 [0101] 实施例2 [0102] 在本实施例中，使用图5～图14表示制作在本发明中使用的检测设备的工艺的一例。 [0103] 当然，本发明的制作方法并不限于本工艺。工艺流程在各图中以(a)、(b)、(c)的形式表示。(c)是俯视图，(a)是(c)中的A-A’截面图，(b)是(c)中的B-B’截面图。 [0104] 工艺1：Si基板208上沉积SiN膜209、SiO2膜210。例如沉积SiN膜15nm、SiO2膜15nm。(图5)工艺2：沉积N型多晶硅211，将控制栅极、背栅、源极、漏极区域图案化。例如，设N型多晶硅的沉积膜厚度为100nm。(图6)工艺3：形成非掺杂的薄膜多晶硅层212。形成方法例如有：在沉积非晶硅后，通过退火进行结晶化来形成的方法；在沉积非晶硅或多晶硅后，通过氧化形成薄膜的方法。通过这些方法可以形成5nm以下的薄膜硅通道。 [0105] (图7)工艺4：沉积SiO2膜210。例如设膜厚为10nm。(图8)工艺5：通过干法蚀刻，将SiO2膜和非掺杂多晶硅图案化，形成通道。另外，在栅极、源极、漏极区域上覆盖的非掺杂硅层，也如图9这样进行加工。(图9)工艺6：作为层间膜，按顺序沉积SiO2膜210、SiN膜209、SiO2膜210、SiN膜209。例如，膜厚由下部开始SiO2/SiN/SiO2/SiN＝20nm/10nm/150nm/200nm。(图10)工艺7：形成控制栅极、背栅、源极、漏极的接点。配线207的材料，例如使 用Al。(图11)工艺8：作为配线上的层间膜，形成SiN膜209，之后，形成用于与配线接触的焊盘 215。沉积膜厚例如设为200nm。(图12)工艺9：通过干法蚀刻将通道上以及附近213挖深。(图 13)工艺10：使用KOH与TMAH液对Si晶片背面进行各向异性蚀刻，形成薄膜区域。蚀刻时的掩膜例如可以使用SiN膜。(图14)工艺11：在如上所述的区域(形成控制栅极和通道侧部之间以及通道侧部的伪1维的最细的电流通路的区域)中形成孔隙214。 [0106] 孔隙的形成，例如通过TEM光束进行开孔，可以形成50nm以下的细微孔隙。另外，通过利用干法蚀刻形成孔隙，孔隙的直径可以在50-1000nm之间成形为任意大小(图15)。作为理想的孔隙直径，虽然依存于分析中使用的电荷保持体大小，但是需要形成得比电荷保持体直径大，以使电荷保持体可以通过。另外，如果一次可以使2个以上的电荷保持体通过孔隙，则可能产生测量误差，因此理想的孔隙直径比电荷保持体直径的2倍小。 [0107] 图15(c)中具备源极215A、漏极215B、通道215E。源极215A和漏极215B可以颠倒，在通道215E内电子从源极215A向漏极215B方向流动。另外，虽然具有栅极215C、背栅215D，但是也可以没有背栅215D。孔隙214形成在通道215E和栅极215C之间。 [0108] 通过以上的工艺可以形成本设备。另外，虽然在上述工艺中表示了基于多晶硅形成通道的例子，但是也可以使用SOI晶片，将相当于通道区域的部分反复进行SOI氧化和清洗并进行薄膜化来形成晶体管。虽然需要精密的膜厚管理，但由于单结晶Si成为通道，所以检测电流值稳定且增大。检测信号的稳定化可以使识别精度提高，检测电流值的增大使检测信号处理变容易，所以可以使检测信号处理高速化。 [0109] 实施例3 [0110] 本实施方式中，使用图16到图19表示了本发明的设备、和根据其检测信号显示检测对象分子的存在量以前的一系列系统的例子。 [0111] 图16是在半导体基板的1个芯片600上设置有本发明的带有孔隙的FET传感器的单体或者阵列、对由传感器检测出的信号进行变换的ADC单元等信号处理电路，在此输出的信号发送到PC601，将作为二聚体被检测出的电荷保持体的检测数，即检测对象的分子数在PC上显示的系统方块图。 [0112] 通过设为传感器阵列，可以并行解析检测对象分子，因此，检测出的信号数量增加，其结果，可以提高解析结果的可靠性。由于在1个芯片上形成传感器阵列和ADC、其他周边信号处理电路，所以可以形成小的模块，可以使系统整体小型化。另外，通过集成化可以降低制造成本。 [0113] 图17是将形成有带孔隙的传感器的单体或者阵列部分和周边电路的一部分的芯片603、和形成了ADC与其他信号处理电路的芯片604在板602上连接，将输出的信号发送到PC，将作为二聚体而检测出的电荷保持体的检测数，即检测对象分子数在PC上显示的系统方块图。 [0114] 为了使检测精度提高，而频繁更换带有孔隙的FET传感器部分时，通过像这样分开制作传感器部分为主的芯片和信号处理电路为主的部分，可以仅更换传感器部分的芯片。由此可以降低用于解析的费用。 [0115] 图18是将形成了带有孔隙的FET的单品或者少数阵列、和ADC与其他信号处理电路的芯片605排列在板602上进行芯片并联，将在此输出的信号发送到PC，将作为二聚体而检测出的电荷保持体的检测数，即检测对象分子数在PC上显示的系统方块图。 [0116] 与将带有孔隙的FET的大规模阵列和ADC、周边信号处理电路集成在1个芯片上相比，将带有孔隙的FET的单品或者少数的阵列和ADC、周边信号处理电路形成在1个芯片上可以降低制造负荷，芯片制造变得容易，与其相伴，成品率也提高。另外，可以对应于所希望的解析来决定传感器的并列数量，所以可以降低用于解析的费用。 [0117] 图19A以及图19B是分别形成带有孔隙的FET的单品或者少数的阵列为主的芯片606、和ADC与周边信号处理电路部607、608，在板上进行连接的系统的方块图。 [0118] 由于分别形成带有孔隙的FET的单品或者少数阵列、和ADC与周边信号处理电路，因此可以降低制造负荷，使每个芯片的制造进一步变得容易，与其相伴，成品率也提高。另外，可以仅更换带有孔隙的FET传感器部分的芯片。这时，由于可以只更换特别劣化的一部分的传感器部分，所以可以进一步为降低解析费用做出贡献。 [0119] 实施例4 [0120] 使用图20的示意图，说明作为检测对象的生物分子，将核酸作为对象的本发明的检测方法。 [0121] 使电荷保持体704与检测对象的核酸分子701结合。作为其方法之一，修饰核酸分子701的末端，使与导入的第一官能团702特异性结合的第二官能团703预先与电荷保持体704结合。例如，可以作为第一官能团702使用生物素，作为第二官能团703使用抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素。在核酸分子的末端结合生物素的方法中，例如可以采用使用末端脱氧核苷酰转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase)等酶在末端结合生物素化寡核苷酸的方法。作为第二官能团703而使用抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素的方法，例如在作为电荷保持体704而使用聚苯乙烯微球时，可以从市售品中选择在表面上涂有抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素的聚苯乙烯微球。例如，可以使用英潍捷基(Invitrogen)公司生产的“FluoroSphere”等产品群的市售品。 [0122] 通过使附加有第一官能团702的核酸分子701与10倍量、最好是100倍量的电荷保持体704(在表面上结合了第二官能团703)反应，根据泊松概率容易推测出，不在1个电荷保持体704上固定多个核酸分子701，固定有核酸分子701的电荷保持体704的90％以上是仅固定有1个核酸分子701的电荷保持体(图20的708)。 [0123] 预先制作通过第一官能团702以及第二官能团703结合了具有与检测对象的核酸分子701互补的碱基排列的核酸探针分子706的电荷保持体704。第一官能团702以及第二官能团703中，可以容易使用所述的生物素和抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素的组合。 [0124] 通过将该预先制作的电荷保持体的复合体705与仅固定有1个核酸分子701的电荷保持体708混合，可以得到二聚体707。 [0125] 在电荷保持体的复合体705中，不需要只固定一个核酸探针分子706，对于电荷保持体704固定多个核酸探针分子706，在混合效率方面是理想的。为了高效率地得到二聚体707，在混合时最好是使电荷保持体的复合体705与仅固定1个分子的电荷保持体708相比以过剩的量，最好是多10倍左右来反应。 [0126] 使用实施例1所述的方法以及检测设备，可以如实施例1所述那样高灵敏度地检测所得到的二聚体707，特别是基于通过孔隙电荷量的电流变化量，可 以明确地识别并检测未反应的单体、和反映出检测对象的核酸分子701的存在量的二聚体707。 [0127] 实施例5 [0128] 使用图21的模式图，说明检查有无蛋白质间相互作用的本发明的检测方法。 [0129] 对于第一蛋白质801和第二蛋白质802的各个分别结合电荷保持体804。因此，将第一官能团805与蛋白质801、802结合，将与第一官能团805特异性结合的第二官能团803和电荷保持体804结合。 [0130] 例如，第一官能团805中可以使用生物素，在以无细胞发现系统制作蛋白质时，可以在C末端或者N末端一起发现生物素。例如通过使用市售的试剂(Roche Diagnostic公司生产的RTS AviTag E.coli生物素化套件)，可以容易地导入生物素。 [0131] 可以使用抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素作为第二官能团803。例如，当使用聚苯乙烯微球作为电荷保持体804时，可以从市售品中选择在表面上涂有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的聚苯乙烯微球。例如，可以使用英潍捷基(Invitrogen)公司生产的“FluoroSphere”等产品群的市售品。 [0132] 通过将第一蛋白质801和第二蛋白质802各自分别固定在电荷保持体804上，得到第一蛋白复合体806和第二蛋白复合体807。通过使两者反应，得到二聚体808。 [0133] 使用实施例1所述的方法以及检测设备，可以如实施例1所述那样高灵敏度地检测所得到的二聚体808，可以高灵敏度地评价第一蛋白质801与第二蛋白质802之间是否有相互作用。 [0134] 作为针对特定的蛋白质，简便地筛选与之具有相互作用的蛋白质是否包含在特定库中的方法，也可以使用该评价方法。 [0135] 实施例6 [0136] 针对本发明的检测装置的结构，使用图22进行说明。 [0137] 第一溶液槽901和第二溶液槽902由支持体903隔开，检测设备被设置为与支持体903上的第一溶液槽901连接的配置。支持体903上设置有未图示的贯通孔，该贯通孔与检测设备的孔隙的位置一致，以贴紧支持体的方式被固定。 另外，贯通孔比孔隙的直径大，最好是将贯通孔与孔隙的中心设置为一致。支持体903通过接合部904与溶液槽本体接合。 [0138] 虽未图示，但在检测设备中设置有检测在源极和漏极间产生的电流的变化的配线。另外，在支持体903上可以仅配置一个检测设备，也可以配置多个检测设备。在设置多个检测设备时，对于各个检测设备，如果可以个别地检测源极和漏极间产生的电信号，则能够同时并行地进行测量处理。 [0139] 含有分析对象物的试样溶液，从送液单元909经阀908通过送液口906被供给到第一溶液槽901。在送液单元909中具有将试样的生物分子和带有抗体的电荷保持体进行混合、反应、精制的单元(图未示出)。混合中，可以使用利用搅拌子的方式和利用超声波的方式等。反应虽然可以在常温下进行，但是在需要保持37度的情况下最好具备温度控制器。精制中，在电荷保持体中使用磁微粒子的情况时，通过从外部施加磁场，可以使精制容易进行。在将高分子微粒子、蛋白质或核酸分子用于电荷保持体的情况下，需要使用薄膜进行精制，最好是使用吸引装置。在将测量对象的试样和试剂混合的状态下，将试样溶液导入第一溶液槽901。 [0140] 清洗液从清洗液单元910经阀908通过送液口906被供给到第二溶液槽902。该清洗液用于对通过检测设备的孔隙从第一溶液槽901移动到第二溶液槽902的试样溶液进行冲洗。试样以及清洗液的废液都通过阀908从废液口907排出。 [0141] 在各溶液槽中配置有电极905，PC911通过配线916控制的电压施加装置913所生成的电压通过电极905被施加到第一溶液槽901和第二溶液槽902之间。在第一溶液槽901中的试样溶液内含有的电荷保持体的二聚体，根据被施加的电场，通过配置在支持体903上的检测设备的孔隙，从第一溶液槽901输送向第二溶液槽902。电荷保持体通过检测设备的孔隙而生成的电信号通过配线914被送到PC911，进行数据处理。 [0142] 另外，配线914与检测设备的源极、漏极连接，获取电荷保持体通过孔隙而生成的电信号并发送到PC911。识别并检测二聚体通过时的电信号与单体通过时的电信号的差别，通过计数二聚体通过孔隙的数量，计算试样溶液中含有的检测对象物的量。 [0143] 通过经由配线915由PC911控制的控制装置912，控制溶液槽的温度、pH。通过具有以上结构的检测装置，实施生物分子的检测。 [0144] 实施例7 [0145] 使用图23对本发明的检测方法以及装置的其他结构进行说明。 [0146] 在本实施例中公开了以下方法：代替电荷保持体的电荷量而利用其物理大小，检测在经由生物分子的电荷保持体复合体通过孔隙时，电荷保持体的二聚体物理上堵塞孔隙而产生的、在孔隙中流动的电流的变化，由此检测生物分子的存在，并求取其存在量。 [0147] 经由检测对象的生物分子的电荷保持体的二聚体的形成，可以与实施例1中记载的方法相同地进行。 [0148] 第一溶液槽901与第二溶液槽902由支持体903隔开，具有孔隙的薄膜917被设置成与支持体903上的第一溶液槽901连接的配置。支持体903上设有贯通孔，设置成该孔与薄膜917的孔隙的位置一致的配置。 [0149] 另外，孔隙的直径比使用的电荷保持体的直径大，比直径的2倍小。另外，所述膜的厚度在电荷保持体直径的2倍以下，在明确识别电荷保持体的复合体和单独的电荷保持体的方面是理想的。 [0150] 支持体903与溶液槽本体通过接合部904接合。 [0151] 试样溶液从送液单元909经阀908通过送液口906被供给到第一溶液槽901。送液单元909中具备将试样的生物分子与带有抗体的电荷保持体进行混合、反应、精制的单元(图未示出)。混合中，可以使用利用搅拌子的方式和利用超声波的方式等。反应虽然可以在常温下进行，但是在需要保持37度的情况下，最好具备温度控制器。精制中，在电荷保持体中使用磁微粒子的情况下，通过从外部施加磁场，可以使精制容易进行。在将高分子微粒子、蛋白质与核酸分子用于电荷保持体的情况下，需要使用薄膜进行精制，最好是使用吸引装置。 [0153] 清洗液从清洗液单元910经阀908通过送液口906被供给到第二溶液槽902。 [0154] 试样溶液以及清洗液的废液经阀908从废液口907排出。 [0155] 在各溶液槽中配置有电极905，PC911通过配线916控制的电压施加装置913所生成的电压通过电极905被施加到第一溶液槽901和第二溶液槽902之间。 [0156] 与实施例1中说明的方法同样地制作的试样的电荷保持体的二聚体，根据被施加的电场，通过配置在支持体903上的具有孔隙的薄膜917的空隙，从第一溶液槽901输送到第二溶液槽902。利用电流计918测量在第一溶液槽901和第二溶液槽902之间流动的电流。电流计918产生的电信号通过配线919输送到PC911，进行数据处理。PC911通过配线915控制的控制装置912控制溶液槽的温度、pH。 [0157] 电流计918测量电解质的阳离子或者阴离子通过孔隙而产生的电流。当电荷保持体通过具有孔隙的薄膜917的孔隙时，由于电荷保持体在物理上堵塞孔隙，所以电流值减少。该电流值的减少量依存于通过的电荷保持体物理大小。因此，根据电荷保持体是单体或是二聚体，电流减少量明显不同。 [0158] 因此，通过测量该电流值减少量，能明确识别通过的是二聚体还是单体。此外，作为经时变化，尖峰状地产生该电流减少，因此，可以对通过的二聚体的数量进行明确的计数。通过具有以上的方法、结构的检测装置，可以实施生物分子的检测。 [0159] 符号说明 [0160] 101：生物分子，102：第一抗体，103：官能团，104：第二抗体，105：三明治复合体，106：未反应物，107：电荷保持体，108：结合分子，109：二聚体，110：二聚体以外的反应物， 111：第一溶液槽，112：第二溶液槽，113：支持体，114：检测设备，115：控制栅极，116：源极， 117：漏极，118：孔隙，119：基板，120：反应液的流动，121：通道， [0161] 200：绝缘膜，201：通道，202：控制栅极，203：源极，204：漏极，205：背栅，206：孔隙，207：接点、配线，208：Si基板，209：硅氮化膜，210：硅氮化膜，211：多晶硅，212：多晶硅，214： 孔隙，215：焊盘， [0162] 300：孔隙配置区域， [0163] 600：半导体基板芯片，601：PC，602：板，603：形成了带有孔隙的传 感器的单体或者阵列部分与周边电路的一部分的芯片，604：ADC和其他的信号处理电路，605：形成了带有孔隙的FET的单品或者少数阵列、ADC和其他信号处理电路的芯片，606：带有孔隙的FET的单品或者少数阵列为主的芯片，607：ADC和周边信号处理电路部，608：ADC和周边信号处理电路部， [0164] 701：核酸分子，702：第一官能团，703：第二官能团，704：电荷保持体，705：电荷保持体复合体，706：核酸探针分子，707：二聚体，708：电荷保持体， [0165] 801：第一蛋白质，802：第二蛋白质，803：第二官能团，804：电荷保持体，805：第一官能团，806：第一蛋白复合体，807：第二蛋白复合体，808：二聚体， [0166] 901：第一溶液槽，902：第二溶液槽，903：支持体，904：接合部，905：电极，906：送液口，907：废液口，908：阀，909：送液单元，910：清洗液单元，911：PC， [0167] 912：控制装置，913：电压施加装置，914：配线，915：配线，916：配线，[0168] 917：具有孔隙的薄膜，918：电流计，919：配线。 |
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