[0001] 本发明涉及蛋白S异常症的检测方法。

[0002] 本发明特别是在临床检查、分子生物学、以及医学等生命科学领域等中有用。

[0003] 蛋白S是在生物体内的血液凝固系统的控制机理中发挥中心功能的血浆蛋白质。

[0004] 该蛋白S主要存在于血液中，是活化蛋白C的补充因子(辅助因子)，能够提升活化蛋白C的活性，对于血液中的活化蛋白C的作用是必不可少的。

[0005] 此外，活化蛋白C是通过将促进人的血液凝固的活化血液凝固第V因子(第Va因子；FVa)和活化血液凝固第VIII因子(第VIIIa因子；FVIIIa)进行分解而发挥抑制血液凝固反应的作用的因子。

[0006] 蛋白S以1对1的方式特异性地与C4b结合蛋白质(补体第4因子b结合蛋白质；C4bBP)结合，形成复合体。换言之，C4b结合蛋白质是蛋白S的配体。

[0007] 该蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体形成反应如下所示，该反应为可逆反应。

[0008] 蛋白S+C4b结合蛋白质← →蛋白S-C4b结合蛋白质复合体

[0009] 而且，在人血液中，通常与蛋白S相比C4b结合蛋白质的摩尔浓度小，并且解离常数也小，所以血液中仅存在“蛋白S”和“蛋白S-C4b结合蛋白质复合体”。换言之，上述反应的平衡完全偏向右侧。

[0010] 通常，健康人的血液中(血浆中)的蛋白S，其约60％为“蛋白S-C4b结合蛋白质复合体”(即，结合型)，其约40％为“游离状态的蛋白S”(即，游离型)。

[0011] 此外，仅游离的蛋白S(即，游离型)显示对活化蛋白C的辅酶活性，能够提升活化蛋白C的活性。

[0012] 应予说明，在本说明书中，所谓“蛋白S”或者“C4b结合蛋白质”等用语，特别是在没有复合体(或结合型)或者游离(或游离型)等记载的情况下，分别指这些物质的复合体(或者结合型)和游离状态(或者游离型)的总称。

[0013] 以下示出了利用蛋白C和蛋白S的血液凝固系统的控制机理的示意图。

[0014]

[0015] 蛋白C在生物体内，通过被凝血酶·血栓调节蛋白复合体限制性分解，活化肽游离而被活化，成为活化蛋白C。

[0016] 活化蛋白C是通过分解促进人的血液凝固的活化血液凝固第V因子和活化血液凝固第VIII因子而发挥抑制血液凝固反应的作用的丝氨酸蛋白酶。

[0017] 蛋白S是活化蛋白C的补充因子(辅助因子)，因蛋白S的存在，活化蛋白C的活性上升，基于活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应和活化血液凝固第VIII因子的分解反应被促进。

[0018] 具有抑制血液凝固反应的作用的蛋白S的活性的降低或异常可能是在生物体内导致血栓症的原因。

[0019] 实际上，蛋白S的先天性异常症患者以高频率病发深部静脉血栓症、浅表性静脉炎或肺梗塞等静脉性血栓症、或者成为心力衰竭的原因的冠状动脉血栓症等动脉性血栓症等。

[0020] 另外，在弥散性血管内凝血症候群(DIC)、维生素K缺乏症或者肝功能降低症等中也能看到蛋白S的活性的降低或者异常。

[0021] 即，通过测定血浆等试样中的蛋白S的活性，能够掌握蛋白S的活性的降低或者异常，甚至对血栓症等疾病的发病的预测、早期发现以及治疗效果的判定等也起到重要的作用。

[0022] 然而，作为测定试样中的蛋白S的活性的方法，公开了如下的方法，即，使试样与来自蛇毒的蛋白C-活化剂一同在形成活化蛋白C的情况下孵育，添加血液凝固第XII因子、血液凝固第VII因子或者血液凝固第11因子(凝血酶原)的活化剂，并且对利用血液凝固因子及其活性剂作为媒介的由凝血酶原形成凝血酶的减少使用色素原凝血酶基质进行测光测定(参照专利文献1)。

[0023] 作为测定其它的试样中的蛋白S的活性的方法，公开了如下的方法，即，向血浆试样中添加将蛋白C进行活化的蛋白C活化物质或者活化蛋白C，接着加入活化血液凝固第IX因子进行孵育，用已知的方法测定生成的凝血酶的量，将其与测定蛋白S活性已知的标准品而得到的值进行比较，从而测定试样中的蛋白S的活性(参照专利文献2)。

[0024] 另外，作为测定其它的试样中的蛋白S的活性的方法，公开了如下的方法，即，将试样与活化蛋白C、血液凝固第VIII因子、磷脂质以及钙离子孵育，接着将该混合物与活化血液凝固第II因子(凝血酶)、活化血液凝固第IX因子以及活化血液凝固第X因子孵育，然后向该孵育混合物添加活化血液凝固第X因子特异性基质，测定通过该基质的分裂而生成的信号的量，由此测定试样中的蛋白S的活性(参照专利文献3)。

[0025] 在这些以往的试样中的蛋白S的活性测定方法及活性测定试剂中，其测定反应所使用的血液凝固反应的成分(因子)的至少一个直接使用试样中含有的成分(因子)。即，有赖于试样中含有的成分。

[0026] 因此，在直接使用这样的试样中含有的成分(因子)的以往的试样中的蛋白S的活性测定方法及活性测定试剂中，该成分(因子)〔例如，活化血液凝固第X因子〕因其试样提供者而缺损或者降低时，具有如下的问题，即，上述测定反应的反应成分(因子)的至少一个不能以充分量存在，所以测定反应无法充分进行，得到的蛋白S活性值根据情况与本来的值相比偏离，存在误差。

[0027] 即，具有测定值根据血液凝固反应的成分(因子)的试样中的存在量(浓度)或者其变异而受到影响。

[0028] 因此，本发明人等通过使含有不来自试样的活化蛋白C、磷脂质、钙离子、活化血液凝固第V因子、活化血液凝固第X因子、凝血酶原和凝血酶的基质的试样中的蛋白S的活性测定试剂、以及不来自试样的活化蛋白C、磷脂质、钙离子、活化血液凝固第V因子、活化血液凝固第X因子、凝血酶原和凝血酶的基质与试样接触，接着测定上述各成分的反应的结果由凝血酶的基质生成的信号量，接着根据试样中含有的蛋白S的活性而求出生成被抑制的信号量，由此发明、公开了得到试样中含有的蛋白S的活性值的试样中的蛋白S的活性测定方法(参照专利文献4和非专利文献1)。

[0029] 然而，以往的试样中的蛋白S的活性测定方法和活性测定试剂均用于测定游离的蛋白S(游离型)的活性。

[0030] 换言之，以往的试样中的蛋白S的活性测定方法以及活性测定试剂均无法测定试样中存在的全部的蛋白S〔蛋白S和C4b结合蛋白质的复合体(结合型)、以及游离的蛋白S(游离型)〕即总蛋白S的活性。

[0031] 然而，已知蛋白S异常症反复病发血栓症，近年大量报道了特别是蛋白S基因变异高频存在于亚洲人。

[0032] 例如，作为日本人的静脉血栓塞栓症(Venous Thromboembolism；VTE)的风险因素中的一个而备受关注的蛋白S德岛(PS-K155E基因变异)是报道中之一。

[0033] 此外，蛋白S德岛(PS-K155E基因变异)等因基因变异而发生的蛋白S的分子异常被分类为蛋白SII型异常症，血中分泌的蛋白S蛋白质量是正常的，但蛋白S活性降低。

[0034] 认为伴随该蛋白S的活性的降低的蛋白S异常症的检测对静脉血栓塞栓症等血栓症等的疾病的预防、诊断以及治疗有作用。

[0035] 然而，报道了用以往的方法和试剂，难以简便且正确地检测该蛋白S异常症(参照非专利文献2)。

[0036] 现有技术文献

[0037] 专利文献

[0038] 专利文献1：日本特开昭62-212569号公报

[0039] 专利文献2：日本特表平4-506603号公报

[0040] 专利文献3：日本特表平6-504682号公报

[0041] 专利文献4：日本特开2004-337143号公报

[0042] 非专利文献

[0043] 非专利文献1：Clin Chem Lab Med，2004，Vol.42，No.3，p.350-352

[0044] 非专利文献2：Journal of Thrombosis and Haemostasis，2006，Vol.4，p.2010-2013

[0045] 本发明的课题在于提供一种正确、简便且迅速地检测蛋白S异常症的方法。

[0046] 本发明人等对蛋白S异常症的检测方法反复进行研究，其结果，发现通过测定试样中的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量，将它们进行比较，由此能够解决上述课题，从而完成了本发明。

[0047] 即，本发明由以下的发明构成。

[0048] (1)一种蛋白S异常症的检测方法，是蛋白S异常症的检测方法，包括：测定试样中的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量的工序、以及将利用上述测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量进行比较的工序。

[0049] (2)如上述(1)所述的蛋白S异常症的检测方法，其中，将利用测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量进行比较，该总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量偏离(乖離)时，是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0050] (3)如上述(1)或(2)所述的蛋白S异常症的检测方法，其中，将利用测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量进行比较是求出该总蛋白S活性值除以该总蛋白S蛋白质量而得到的比活性。

[0051] 本发明的蛋白S异常症的检测方法能够正确、简便且迅速地检测蛋白S异常症。

[0052] 因此，通过使用本发明的蛋白S异常症的检测方法，能够简便且正确地检测蛋白S异常症，对血栓症等疾病的预防、诊断以及治疗等有作用。附图说明

[0053] 图1是表示试样中的总蛋白S的活性值的测定结果与试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定结果的比较的图。

[0054] I.蛋白S异常症的检测方法的总论

[0055] 本发明的蛋白S异常症的检测方法包括：测定试样中的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量的工序、以及将利用上述测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量进行比较的工序。

[0056] 应予说明，测定总蛋白S活性值是指对试样中存在的全部的蛋白S〔蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)和游离的蛋白S(游离型)〕测定其活性。

[0057] 换言之，除了测定“游离的蛋白S(游离型)”的活性，同时还测定“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”中含有的蛋白S为游离的蛋白S(游离型)的情况下呈现的活性。

[0058] 另外，测定总蛋白S蛋白质量是指对试样中存在的全部的蛋白S〔蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)和游离的蛋白S(游离型)〕测定其蛋白质量。

[0059] 换言之，除了测定“游离的蛋白S(游离型)”的蛋白质量，同时还测定“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”中含有的蛋白S的蛋白质量。

[0060] 应予说明，在本发明中，测定总蛋白S活性值的方法(活性测定方法)和试剂(活性测定试剂)没有特别限定，只要是能够测定总蛋白S的活性值的方法和试剂可以是任意的方法和试剂。

[0061] 另外，在本发明中，测定总蛋白S蛋白质量的方法(测定方法)和试剂(测定试剂)没有特别限定，只要是能够测定总蛋白S的蛋白质量的方法和试剂可以是任意的方法和试剂。

[0062] 接着，是将利用试样中的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量的测定而得到的总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量进行比较的工序，但对于该比较的方法适当地确定即可，没有特别限定。

[0063] 对于该比较的方法，例如可举出将利用测定而得到的总蛋白S活性值的数值和利用测定而得到的总蛋白S蛋白质量的数值进行比较，

[0064] 将利用测定而得到的总蛋白S活性值绘制成图的纵轴(也可以是横轴)，将利用测定而得到的总蛋白S蛋白质量绘制成图的横轴(也可以是纵轴)，在该图上进行比较，或者求出利用测定得到的总蛋白S活性值除以利用测定得到的总蛋白S蛋白质量而得到的比活性等。

[0065] 在本发明中，优选求出该总蛋白S活性值除以该总蛋白S蛋白质量而得到的比活性来进行利用测定得到的总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量的比较。

[0066] 应予说明，在本发明中，例如，将利用测定得到的总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量进行比较，在该总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量偏离的情况下能够确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0067] 例如，将利用测定得到的总蛋白S活性值的数值与利用测定得到的总蛋白S蛋白质量的数值进行比较，在偏离的情况下能够确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0068] 另外，例如，将利用测定得到的总蛋白S活性值绘制成图的纵轴(也可以是横轴)，将利用测定得到的总蛋白S蛋白质量绘制成图的横轴(也可以是纵轴)，从该图上判定，其结果，在该总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量偏离的情况下能够确定是蛋白S异常症或者疑似是蛋白S异常症。

[0069] 例如，在该图上，如上所述绘制的点(数据)不在y＝x的线(式)上，与该y＝x的线(式)分离时，可判定是偏离。

[0070] 另外，对多个已知未患蛋白S异常症的人测定总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量，将利用该测定得到的总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量如上所述绘制在图上，与对已知未患该蛋白S异常症的人的试样绘制的点(数据)的集合(或者表示该集合的式子)进行对比，与该集合(或者表示该集合的式子)分离的情况下，可判定为偏离。

[0071] 另外，例如，通过求出利用测定得到的总蛋白S活性值除以利用测定得到的总蛋白S蛋白质量而得到的比活性，进行利用测定得到的总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量的比较，该总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量偏离的情况下能够确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0072] 应予说明，求出利用测定得到的总蛋白S活性值除以利用测定得到的总蛋白S蛋白质量而得到的比活性例如可以通过利用测定得到的总蛋白S活性值的数值除以利用测定得到的总蛋白S蛋白质量的数值而能够求得该比活性，另外，通过将利用测定得到的总蛋白S活性值绘制成图的纵轴，将利用测定得到的总蛋白S蛋白质量绘制成图的横轴而绘制成图等也能够求得该比活性。

[0073] 而且，如上述那样求出利用测定得到的总蛋白S活性值除以利用测定得到的总蛋白S蛋白质量而得到的比活性，该比活性的值是不为1且比1小的偏离的值时，也可以判定为偏离。

[0074] 另外，对多个已知未患蛋白S异常症的人测定总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量，求出利用该测定得到的总蛋白S活性值除以利用该测定得到的总蛋白S蛋白质量而得到的比活性，与对于已知未患该蛋白S异常症的人的试样的比活性的值的集合(或者表示该集合的式子)进行对比，与该集合(或者表示该集合的式子)分离的情况下，能够判定偏离。

[0075] 应予说明，与对已知未患上述蛋白S异常症的人的试样的比活性的值的集合(或者表示该集合的式子)进行对比，与该集合(或者表示该集合的式子)分离的情况下，判定为偏离，但偏离对于已知未患蛋白S异常症的人的试样的比活性的值的集合的标准偏差的2倍的范围(更优选为该标准偏差的3倍的范围)的情况下，与该集合分离，可以判定为偏离。

[0076] 另外，例如将利用测定得到的总蛋白S活性值绘制成图的纵轴，将利用测定得到的总蛋白S蛋白质量绘制成图的横轴等，使该图上表示比活性，与在该图上表示的比活性相比，能够判定总蛋白S活性值与总蛋白S蛋白质量偏离的情况下，可以确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0077] 例如，在该图上如上所述绘制图的比活性的点(数据)不在y＝x的线(式)上，与该y＝x的线(式)相比向下分离时，判定为偏离，能够确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0078] 另外，对多个已知未患蛋白S异常症的人测定总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量，将利用该测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量如上所述绘制在图上，使该图上表示比活性，与对已知未患该蛋白S异常症的人的试样绘制的比活性的点(数据)的集合(或者表示该集合的式子)进行对比，与该集合(或者表示该集合的式子)相比向下分离时，判定为偏离，能够确定是蛋白S异常症或者疑似蛋白S异常症。

[0079] 应予说明，该对多个已知未患蛋白S异常症的人测定总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量，将利用该测定得到的总蛋白S活性值和总蛋白S蛋白质量如上所述绘制在图上，使该图上表示比活性，与对已知未患该蛋白S异常症的人的试样绘制的比活性的点(数据)的集合(或者表示该集合的式子)进行对比，与该集合(或者表示该集合的式子)分离的情况下，判定为偏离，但由对于已知未患蛋白S异常症的人的试样绘制的比活性的点(数据)的集合求得平均值和标准偏差(以下，有时称为“SD”)，为平均-2SD(更优选为平均-3SD)以下时，与该集合分离，可以判定为偏离。

[0080] II.试样中的总蛋白S的活性测定方法

[0081] 如先前所述，在本发明中，测定总蛋白S活性值的方法(活性测定方法)和试剂(活性测定试剂)没有特别限定，只要是能够测定总蛋白S的活性值的方法和试剂就可以是任意的方法和试剂，以下，对该试样中的总蛋白S的活性测定方法的例子进行说明。

[0082] I.总论

[0083] 虽然是试样中的总蛋白S的活性测定方法，但在总蛋白S活性的测定反应时，优选存在表面活性剂。

[0084] 应予说明，在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，基于蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时和基于该活性上升的活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时，优选存在表面活性剂。

[0085] 另外，在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，总蛋白S活性的测定反应时，优选存在由磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质。

[0086] 而且，在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，在基于蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时和基于该活性上升的活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时，优选存在由磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质。

[0087] 另外，试样中的总蛋白S的活性测定方法优选试样中的总蛋白S活性的测定通过包括下述的(a)～(c)的工序的方法进行。

[0088] (a)使活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质、钙离子、活化血液凝固第V因子、活化血液凝固第X因子、凝血酶原以及凝血酶的基质与试样接触。

[0089] (b)接着，测定基于上述(a)的各成分的反应的结果由凝血酶的基质生成的信号量。

[0090] (c)接下来，由基于该试样中含有的总蛋白S的活性而生成受到抑制的信号量，得到试样中含有的总蛋白S的活性值。

[0091] 另外，在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，优选试样中的总蛋白S活性的测定通过包括下述的(a)～(e)的工序的方法而进行。

[0092] (a)通过使试样至少与活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质以及钙离子接触，由此试样中含有蛋白S的情况下活化蛋白C的活性上升。

[0093] (b)接着，上述(a)的成分和活化血液凝固第V因子的存在下，活化蛋白C催化的活化血液凝固第V因子的分解反应因上述(a)中的活化蛋白C的活性的上升而被促进。

[0094] (c)接下来，被活化血液凝固第V因子促进的在磷脂质和钙离子的存在下由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应因上述(b)中的活化血液凝固第V因子的分解反应被促进而受到抑制，从而凝血酶的生成减少。

[0095] (d)接着，因上述(c)中的凝血酶的生成的减少，从凝血酶催化的凝血酶的基质生成信号的反应受到抑制。

[0096] (e)接下来，通过测定因上述(d)中的反应的抑制而生成被抑制的信号量，从而得到试样中含有的总蛋白S的活性值。

[0097] 2.试样中的总蛋白S的活性测定的方法

[0098] 作为试样中的总蛋白S的活性测定方法中的测定的方法，可举出下述的(1)或(2)所述的方法等，优选利用这些方法等进行。

[0099] (1)

[0100] (a)使活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质、钙离子、活化血液凝固第V因子(第Va因子；FVa)、活化血液凝固第X因子(第Xa因子；FXa)、凝血酶原以及凝血酶的基质与试样接触。

[0101] 应予说明，这些成分与试样的接触1次进行与全部的成分的接触，可以在1个阶段进行下述的反应体系的全部的反应(1步法)，另外，划分上述成分，分为多个阶段进行接触，由此可以分多个阶段进行下述的反应体系的反应(多步法)。

[0102] (b)通过上述(a)中的接触，进行上述的各成分的下述的反应。

[0103] 然后，测定通过该一系列的反应由凝血酶的基质生成的信号量。

[0104] 即，测定通过上述的一系列的反应，凝血酶的基质受到被凝血酶分解等的作用，其结果产生的信号的量(例如，吸光度等)。

[0105] (c)试样中含有蛋白S的情况下，活化蛋白C在磷脂质和钙离子的存在下活性上升，由此活化血液凝固第V因子的分解被促进，所以其结果从凝血酶催化的凝血酶的基质产生信号的反应受到抑制，信号的生成被抑制。

[0106] 该信号生成的抑制度与试样中含有的总蛋白S的活性值相应地变大。

[0107] 因此，上述(b)中，通过测定信号量，从而测定生成受到抑制的信号量，由此能够得到试样中含有的总蛋白S的活性值。

[0108]

[0109] (2)

[0110] 一种使用由活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质、钙离子、活化血液凝固第V因子(第Va因子；FVa)、活化血液凝固第X因子(第Xa因子；FXa)、凝血酶原以及凝血酶的基质构成的下述的反应体系测定试样中的蛋白S的活性值的方法，

[0111] (a)使试样至少与活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质以及钙离子接触。

[0112] 由此，在试样中含有蛋白S的情况下，在磷脂质和钙离子的存在下活化蛋白C的活性上升。

[0113] (b)因活化蛋白C在上述(a)中的活性上升，活化蛋白C在磷脂质和钙离子的存在下催化的活化血液凝固第V因子的分解反应在表面活性剂的共存下被促进。

[0114] (c)被活化血液凝固第V因子促进的在磷脂质和钙离子的存在下由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应因上述(b)中的活化血液凝固第V因子的分解反应被促进而受到抑制，从而凝血酶的生成减少。

[0115] (d)因上述(c)中的凝血酶的生成的减少，从凝血酶催化的凝血酶的基质生成信号的反应受到抑制。

[0116] 应予说明，该信号生成的抑制度与试样中含有的总蛋白S的活性相对应地变大。

[0117] (e)测定因上述(d)中的反应的抑制而生成受到抑制的信号量。

[0118] 通过测定如上所述利用上述的反应而生成的信号量，即测定生成被抑制的信号量，由此得到试样中含有的总蛋白S的活性值。

[0119]

[0120] 3.试样

[0121] 在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，试样是指可含有蛋白S的物质。

[0122] 作为该试样，例如可举出生物体试样(来自人或者动物等的试样)等。

[0123] 作为生物体试样，例如可举出血液、血浆、唾液、汗、尿、泪、脊髓液、腹水、羊水等生物体的液体；肝脏、心脏、脑、骨、毛发、皮肤、指甲、肌肉、神经组织等脏器，组织、细胞等提取液等。

[0124] 4.活化蛋白C

[0125] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中使用的活化蛋白C的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用。

[0126] 例如，可举出来自人、牛或猪等哺乳动物的活化蛋白C等。另外，由血浆等体液或脏器等精制而制备的活化蛋白C，或者通过基因工程操作、细胞工程操作或细胞培养操作等而制备的活化蛋白C等。

[0127] 另外，试样中的总蛋白S的活性测定方法中的测定反应中，利用蛋白C活化物质等由蛋白C生成活化蛋白C，可以将其用作本发明中的活化蛋白C。

[0128] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，活化蛋白C通过与试样接触，从而在试样中含有蛋白S的情况下，在磷脂质和钙离子的存在下，该活化蛋白C的活性上升。

[0129] 然后，活化蛋白C成为在磷脂质和钙离子的存在下分解活化血液凝固第V因子的反应的催化剂。

[0130] 因此，通过存在蛋白S，从而活化蛋白C分解活化血液凝固第V因子的反应被促进。

[0131] 使上述的活化蛋白C等与试样接触、使活化蛋白C与活化血液凝固第V因子等接触可以同时进行。

[0132] 另外，可以将活化蛋白C和磷脂质一起与试样接触，以至少1分钟以上、优选为5分钟以上、在室温或者37℃等下孵育后，与活化血液凝固第V因子和钙离子接触，进行孵育，进行活化血液凝固第V因子的分解反应。

[0133] 对于使用该活化蛋白C时的浓度而言，使其与活化血液凝固第V因子接触，在表面活性剂、磷脂质以及钙离子的存在下使活化血液凝固第V因子分解时，通常优选为1pM～100nM。

[0134] 然而，为了较高地得到测定的灵敏度，优选活化蛋白C浓度高，所以作为上述的活化蛋白C浓度，更优选为10pM～10nM，特别优选为100pM～1nM。

[0135] 5.表面活性剂

[0136] 在总蛋白S的活性测定方法中，在该总蛋白S活性的测定反应时，优选存在表面活性剂。

[0137] 该表面活性剂只要适当地存在非离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂或者阳离子性表面活性剂等各种表面活性剂等中的1种或2种以上即可。

[0138] 作为该表面活性剂，例如可举出失水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、十甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯植物甾醇、植物甾烷醇、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯蓖麻油、固化蓖麻油或聚氧乙烯羊毛脂等非离子性表面活性剂；乙酸甜菜碱等两性表面活性剂；或者聚氧乙烯烷基醚硫酸盐或聚氧乙烯烷基醚乙酸盐等阴离子性表面活性剂等。

[0139] 应予说明，该表面活性剂为非离子性表面活性剂时，其HLB(Hydrophile-Lipophile Balance)优选为10～20的范围，更优选为12～18的范围，特别优选为13～16的范围。

[0140] 对于该表面活性剂而言，作为非离子性表面活性剂，优选Triton X-100〔聚氧乙烯(n＝9，10)对叔辛基苯基醚，HLB：13.5〕、Triton X-114〔聚氧乙烯(n＝7，8)对叔辛基苯基醚，HLB：12.4〕、NP-10〔聚氧乙烯(n＝10)壬基苯基醚，HLB：16.5〕、NP-11〔聚氧乙烯(n＝11)壬基苯基醚〕、NP-12〔聚氧乙烯(n＝12)壬基苯基醚〕、NP-13〔聚氧乙烯(n＝13)壬基苯基醚〕、NP-15〔聚氧乙烯(n＝15)壬基苯基醚，HLB：18.0〕、BT-9[聚氧乙烯(n＝9)仲烷基醚，HLB：13.5〕、或者BT-12〔聚氧乙烯(n＝12)仲烷基醚，HLB：14.5〕等。

[0141] 另外，作为两性离子性表面活性剂，优选为AM-301〔月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱水溶液〕等。

[0142] 而且，作为阴离子性表面活性剂，优选为肌氨酸盐LN〔月桂酰肌氨酸钠〕等。

[0143] 另外，作为阳离子性表面活性剂，优选为CA-2350〔十六烷基三甲基氯化铵〕等。

[0144] 应予说明，总蛋白S活性的测定反应时存在表面活性剂时的浓度没有特别限定，优选为0.00001～5％(W/V)，更优选为0.0001～1％(W/V)，进一步优选为0.001～0.1％(W/V)，特别优选为0.005～0.05％(W/V)。

[0145] 而且，在非离子性表面活性剂中非常优选为0.001～0.01％(W/V)，在两性离子性表面活性剂中非常优选为0.001～0.01％(W/V)，在阴离子性表面活性剂中非常优选为0.001～0.1％(W/V)，在阳离子性表面活性剂中非常优选为0.00001～0.001％(W/V)。

[0146] 应予说明，在总蛋白S的活性测定方法中，基于试样中含有的蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时和基于该活性上升的蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时，为了试样中的总蛋白S的活性测定，优选存在表面活性剂。

[0147] 6.磷脂质

[0148] (1)总论

[0149] 在总蛋白S的活性测定方法中，总蛋白S活性的测定反应时，存在磷脂质。

[0150] 该磷脂质的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用，

[0151] 例如，可举出来自人、牛或者猪等哺乳动物的磷脂质，来自其它的动物的磷脂质，来自植物的磷脂质，来自微生物的磷脂质或者人工合成的磷脂质等。

[0152] 总蛋白S活性的测定反应时，存在磷脂质时的浓度通常优选为0.03μM～100μM，更优选为0.3μM～50μM，特别优选为3μM～30μM。

[0153] 作为该磷脂质，例如可举出磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或二磷脂酰甘油等甘油磷脂质，或者鞘磷脂等鞘脂磷脂质等。

[0154] 应予说明，作为该磷脂质，总蛋白S活性的测定反应时，为了试样中的总蛋白S的活性测定，优选存在由磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质。

[0155] 另外，存在由该磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质时，作为这3种磷脂质的组成，优选磷脂酰乙醇胺的组成比为10％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为20％(W/V)以上。

[0156] 特别优选磷脂酰乙醇胺的组成比为30％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为30％(W/V)以上。

[0157] (2)基于活化蛋白C的催化剂反应中使用的磷脂质

[0158] 总蛋白S的活性测定方法中，基于试样中含有的蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时和基于该活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时，存在其活化蛋白C的活性上升反应和活化血液凝固第V因子的分解反应所需要的磷脂质。

[0159] 该磷脂质的由来(起源)、制备方法不限，可没有特别限制地使用。

[0160] 例如，可举出来自人、牛或者猪等哺乳动物的磷脂质，来自其它的动物的磷脂质，来自植物的磷脂质，来自微生物的磷脂质或者人工合成的磷脂质等。

[0161] 上述的活化蛋白C的活性上升反应时和活化血液凝固第V因子的分解反应时存在磷脂质时的浓度通常优选为0.1μM～100μM，更优选为1μM～50μM，特别优选为10μM～30μM。

[0162] 作为该磷脂质，例如可举出磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或二磷脂酰甘油等甘油磷脂质，或者鞘磷脂等鞘脂磷脂质等。

[0163] 应予说明，作为该磷脂质，上述的活化蛋白C的活性上升反应时和活化血液凝固第V因子的分解反应时，为了试样中的总蛋白S的活性测定，优选存在由磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质。

[0164] 另外，存在由该磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质时，作为这3种磷脂质的组成，优选磷脂酰乙醇胺的组成比为10％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为20％(W/V)以上。

[0165] 特别优选磷脂酰乙醇胺的组成比为30％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为30％(W/V)以上。

[0166] (3)基于活化血液凝固第X因子的催化剂反应中使用的磷脂质

[0167] 总蛋白S的活性测定方法中，活化血液凝固第V因子的存在下由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应时，存在该反应所需要的磷脂质。

[0168] 该磷脂质的由来(起源)、制备方法不限，可没有特别限制地使用。

[0169] 例如，可举出来自人、牛或者猪等哺乳动物的磷脂质，来自其它的动物的磷脂质，来自植物的磷脂质，来自微生物的磷脂质或者人工合成的磷脂质等。

[0170] 由上述的凝血酶原生成凝血酶的反应时存在磷脂质时的浓度通常优选为0.1μM～100μM，更优选为0.5μM～50μM，特别优选为1μM～10μM。

[0171] 作为该磷脂质，例如可举出磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或二磷脂酰甘油等甘油磷脂质，或者鞘磷脂等鞘脂磷脂质等。

[0172] 应予说明，作为该磷脂质，由上述的凝血酶原生成凝血酶的反应时，为了提高促进上述反应的效果，优选存在由磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，或者磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质。

[0173] 另外，存在由该磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸构成的磷脂质时，作为这2种磷脂质的组成，优选磷脂酰胆碱的组成比为85％(W/V)～50％(W/V)，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为15％(W/V)～50％(W/V)。

[0174] 特别优选磷脂酰胆碱的组成比为80％(W/V)～70％(W/V)，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为20％(W/V)～30％(W/V)。

[0175] 或者，存在由该磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸以及磷脂酰乙醇胺构成的磷脂质时，作为这3种磷脂质的组成，优选磷脂酰乙醇胺的组成比为10％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为20％(W/V)以上。

[0176] 特别优选磷脂酰乙醇胺的组成比为30％(W/V)以上，并且磷脂酰丝氨酸的组成比为30％(w/V)以上。

[0177] 应予说明，作为由该凝血酶原生成凝血酶的反应时的磷脂质，可以直接使用上述的活化蛋白C的活性上升反应时和活化血液凝固第V因子的分解反应时所使用的磷脂质。

[0178] 然而，如先前所述，适合的磷脂质的组成根据各反应而不同，所以优选使适于各个反应的组成的磷脂质在其反应时存在而使用。

[0179] 应予说明，即使由该凝血酶原生成凝血酶的反应时先前加入的适于上述的活化蛋白C的活性上升反应和活化血液凝固第V因子的分解反应的组成的磷脂质与适于由该凝血酶原生成凝血酶的反应的组成的磷脂质共存，对本发明的试样中的总蛋白S的活性测定方法和活性测定试剂完全没有妨碍。

[0180] 7.钙离子

[0181] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，基于试样中含有的蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时、基于活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时、以及基于活化血液凝固第X因子和活化血液凝固第V因子的由凝血酶原生成凝血酶的反应时，存在钙离子。

[0182] 作为该钙离子，钙离子本身自不必说，或者只要是钙盐等含有钙离子的化合物，就可以没有特别限制地使用。

[0183] 作为含有该钙离子的化合物，例如可举出氟化钙、氯化钙、溴化钙、碘化钙、硫酸钙、硝酸钙、乙酸钙、乳酸钙或者氰化钙等。

[0184] 对于使用该钙离子时的浓度而言，基于试样中含有的蛋白S的活化蛋白C的活性上升反应时、基于活化蛋白C的活化血液凝固第V因子的分解反应时、并且基于活化血液凝固第X因子和活化血液凝固第V因子的由凝血酶原生成凝血酶的反应时，通常优选为0.1mM～100mM，特别优选为1mM～10mM。

[0185] 8.活化血液凝固第V因子

[0186] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中使用的活化血液凝固第V因子(第Va因子；FVa)的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用。

[0187] 例如，可举出来自人、牛或猪等哺乳动的活化血液凝固第V因子等。

[0188] 另外，也可举出由血浆等体液或脏器等精制而制备的活化血液凝固第V因子，或者基因工程操作、细胞工程操作或细胞培养操作等而制备的活化血液凝固第V因子等。

[0189] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，活化血液凝固第V因子在表面活性剂、磷脂质以及钙离子的存在下被活化蛋白C分解。

[0190] 而且，试样中含有蛋白S时通过其蛋白S的存在，从而活化蛋白C的活性上升，该分解反应被促进。

[0191] 另外，活化血液凝固第V因子用于促进在磷脂质和钙离子的存在下由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应。

[0192] 因此，试样中含有蛋白S时，活化蛋白C的活性上升，活化血液凝固第V因子的分解反应被促进，活化血液凝固第V因子的存在量(浓度)变少。

[0193] 如此地，对于由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应的活化血液凝固第V因子的促进效果变小，所以由上述的凝血酶原生成凝血酶的反应受到抑制。

[0194] 可以同时进行使上述的活化血液凝固第V因子与活化蛋白C等接触，和使活化血液凝固第V因子与活化血液凝固第X因子和凝血酶原等接触。

[0195] 然而，优选将活化血液凝固第V因子和表面活性剂、磷脂质以及钙离子一起与活化蛋白C接触，以至少1分钟以上、优选为5分钟以上、在室温或者37℃等下孵育后，与活化血液凝固第X因子和凝血酶原等接触，进行孵育，进行由凝血酶原生成凝血酶的反应。

[0196] 对于使用该活化血液凝固第V因子时的浓度而言，使其与活化蛋白C接触，在表面活性剂、磷脂质以及钙离子的存在下进行分解活化血液凝固第V因子的反应时，通常优选为0.5pM～5nM。

[0197] 然而，若该活化血液凝固第V因子的浓度高，进行基于来自试样的成分(因子)等的血液凝固反应，血纤维蛋白析出或者产生大量的显色，不能进行正确的测定，所以作为上述的活化血液凝固第V因子浓度，更优选为5pM～500pM，特别优选为20pM～200pM。

[0198] 9.活化血液凝固第X因子

[0199] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中使用的活化血液凝固第X因子(第Xa因子；FXa)的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用。

[0200] 例如，可以举出来自人、牛或猪等哺乳动物的活化血液凝固第X因子等。

[0201] 另外，也可举出由血浆等体液或脏器等精制而制备的活化血液凝固第X因子，或者基因工程操作、细胞工程操作或细胞培养操作等而制备的活化血液凝固第X因子等。

[0202] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，活化血液凝固第X因子在磷脂质以及和钙离子的存在下催化由凝血酶原生成凝血酶的反应。

[0203] 基于该活化血液凝固第X因子的由凝血酶原生成凝血酶的反应由于活化血液凝固第V因子的存在而被促进。

[0204] 因此，如先前所述，若试样中含有蛋白S，则活化蛋白C的活性上升，由此活化血液凝固第V因子的分解反应被促进，因此对于由活化血液凝固第X因子催化的生成凝血酶的反应的活化血液凝固第V因子的促进效果变小，所以生成上述的凝血酶的反应受到抑制。

[0205] 对于使用该活化血液凝固第X因子时的浓度而言，使其与活化血液凝固第V因子和凝血酶原等接触，在磷脂质和钙离子的存在下，由凝血酶原生成凝血酶时，通常优选为0.1pM～300pM。

[0206] 然而，若该活化血液凝固第X因子的浓度高，则与先前的活化血液凝固第V因子的情况相同，进行基于来自试样的成分(因子)等的血液凝固反应，血纤维蛋白析出或者产生大量的显色，不能进行正确的测定，所以作为上述的活化血液凝固第X因子浓度，更优选为1pM～100pM，特别优选为10pM～50pM。

[0207] 10.凝血酶原

[0208] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中使用的凝血酶原的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用。

[0209] 例如，可以举出来自人、牛或猪等哺乳动物的凝血酶原等。

[0210] 另外，也可举出由血浆等体液或脏器等精制而制备的凝血酶原，或者基因工程操作、细胞工程操作或细胞培养操作等而制备的凝血酶原等。

[0211] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，凝血酶原在磷脂质和钙离子的存在下，成为由活化血液凝固第X因子催化的反应的基质，变为凝血酶。

[0212] 基于该活化血液凝固第X因子的由凝血酶原生成凝血酶的反应由于活化血液凝固第V因子的存在而被促进。

[0213] 因此，如先前所述，若试样中含有蛋白S，则活化蛋白C的活性上升，由此活化血液凝固第V因子的分解反应被促进，因此对于由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应的活化血液凝固第V因子的促进效果变小，所以由上述的凝血酶原生成凝血酶的反应受到抑制，生成的凝血酶的量(浓度)减少。

[0214] 对于使用该凝血酶原时的浓度而言，与活化血液凝固第V因子和活化血液凝固第X因子接触，在磷脂质和钙离子的存在下，由凝血酶原生成凝血酶时，通常优选为1nM～50μM，更优选为50nM～5μM，并且特别优选为100nM～1μM。

[0215] 11.凝血酶的基质

[0216] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中使用的凝血酶的基质只要是受到作为凝血酶的蛋白酶的催化作用(作为凝血酶的基质)而产生一些信号的基质，或者通过除了基于凝血酶的催化剂反应再持续其他的反应而产生一些信号，就可以没有特别限制地使用。

[0217] 虽然产生上述的一些信号，但其是指通过接受凝血酶的催化作用而能够检测光学、电、磁或其他的能量等中的信号(Signal)的生成或者变化。

[0218] 例如，可以举出通过接受凝血酶的催化作用而吸光度、透射率或荧光强度发生变化的物质、光的吸收曲线发生变化的物质、或者发光的物质等。

[0219] 作为其中一个例子，可以举出结合了游离时吸光度、透射率或荧光强度、或者光的吸收曲线发生变化这样的化合物的肽或者蛋白质、或结合了游离时发光这样的化合物的肽或者蛋白质等，且是因凝血酶的催化作用，上述的化合物从上述的肽或者蛋白质游离的物质等。

[0220] 对于这样的物质，通过接受凝血酶的催化作用，使上述化合物游离，从而能够以吸光度、透射率或荧光强度或者光的吸收曲线的变化或发光等形式检测出，所以能够通过测定生成的信号(吸光度、透射率或荧光强度或者光的吸收曲线的变化或发光等)的量而求出凝血酶的催化作用即凝血酶的酶活性。

[0221] 作为这样的物质，例如可举出“H-D-苯丙氨酰基-L-甲基哌啶-L-精氨酰基-对硝基苯胺·二盐酸盐”〔Test Team(注册商标)显色基质S-2238〕(制造商：Chromogenix-Instrumentation Laboratory公司〔意大利〕，销售商：SEKISUI MEDICAL公司〔日本〕)、“H-D-六氢酪氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-对硝基苯胺·二乙酸盐”〔SPECTROZYME(注册商标)TH〕(AMERICAN DIAGNOSTICA公司·Cosmo Bio公司)、“苯甲酰基-苯丙氨酰基-缬氨酰基-精氨酰基-对硝基苯胺·盐酸盐”[Thrombin Substrate I，Colorimetric](CALBIOCHEM公司·Cosmo  Bio公司)、“甲苯磺酰基-甘氨酰-脯氨酰-精氨酰基-对硝基苯胺”〔CHROMOZYMETH〕(PENTAPHARM公司)、“H-D-苯丙氨酰基-脯氨酰-精氨酰基-3-羧基-4-羟基-苯胺”(第一三共社)、“苯甲酰基-苯丙氨酰基-缬氨酰基-精氨酰基-AMC·盐酸盐”〔Thrombin SubstrateIII，Fluorogenic〕(CALBIOCHEM公司·Cosmo Bio公司)、“叔丁氧羰基-天冬酰基(○-苄基)-脯氨酰-精氨酰基-MCA”(Peptide Institute)、或者“叔丁氧羰基-缬氨酰基-脯氨酰-精氨酰基-MCA”(Peptide Institute)等。应予说明，特别优选“H-D-苯丙氨酰基-L-甲基哌啶-L-精氨酰基-对硝基苯胺·二盐酸盐”。

[0222] 可以同时进行使上述的活化血液凝固第V因子、活化血液凝固第X因子与凝血酶原等接触，和使生成的凝血酶与该凝血酶的基质接触，也可以分为不同的阶段进行。

[0223] 应予说明，均使生成的凝血酶与凝血酶的基质接触，以至少1分钟以上、优选为5分钟以上，在室温或者37℃等下进行孵育，由凝血酶的基质生成信号。

[0224] 对于使用该凝血酶的基质时的浓度而言，该凝血酶的基质受到凝血酶的催化作用时，通常优选为5μM～100mM，特别优选为50μM～10mM。

[0225] 12.信号量的测定

[0226] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中的凝血酶的基质通过接受由凝血酶原生成的凝血酶的催化作用而生成信号。

[0227] 在试样中的总蛋白S的活性测定方法中，测定由该凝血酶的基质生成的信号的量。

[0228] 此外，试样中含有蛋白S时，该信号的量是基于试样中的总蛋白S的活性值而生成受到抑制的信号的量。

[0229] 该生成的信号量(生成被抑制的信号量)的测定基于其信号适当地进行即可。

[0230] 例如，信号为吸光度、透射率或荧光强度或者光的吸收曲线的变化或发光等的情况下，通过对吸光度、透射率、荧光强度或者发光强度等进行测定等而进行。

[0231] 更具体而言，凝血酶的基质为上述的“H-D-苯丙氨酰基-L-甲基哌啶-L-精氨酰基-对硝基苯胺·二盐酸盐”、“H-D-六氢酪氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-对硝基苯胺·二乙酸盐”、“苯甲酰基-苯丙氨酰基-缬氨酰基-精氨酰基-对硝基苯胺·盐酸盐”、或者“甲苯磺酰基-甘氨酰-脯氨酰-精氨酰基-对硝基苯胺”等在肽上结合对硝基苯胺的物质的情况下，通过在波长405nm或其附近的波长测定吸光度而进行因凝血酶的催化作用游离的对硝基苯胺在波长405nm附近具有的光的吸收。

[0232] 此时，吸光度的测定可以是仅主波长的单波长测定，或者可以是在主波长和副波长测定的双波长测定。

[0233] 而且，该吸光度的测定可以利用终点法，或者可以速率法。

[0234] 13.试样中含有的总蛋白S的活性值

[0235] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，若试样中含有蛋白S，则活化蛋白C的活性上升，活化血液凝固第V因子的分解反应被促进，活化血液凝固第V因子的存在量(浓度)变少。

[0236] 如此地，对于由活化血液凝固第X因子催化的由凝血酶原生成凝血酶的反应的活化血液凝固第V因子的促进效果变小，所以由上述的凝血酶原生成凝血酶的反应受到抑制。

[0237] 由此，凝血酶的生成减少，所以从该凝血酶催化的凝血酶的基质生成信号的反应也受到抑制，生成的信号的量受到抑制。

[0238] 即，与试样中含有的总蛋白S的活性值相应地，该信号生成的抑制度变大。

[0239] 因此，试样中的总蛋白S的活性测定方法中，测定通过使试样与活化蛋白C等接触进行如上所述的反应而生成的信号量，即通过测定生成受到抑制的信号量，从而得到试样中含有的总蛋白S的活性值。

[0240] 测定该生成受到抑制的信号量后，适当地进行得到试样中含有的总蛋白S的活性值即可，例如可以如下所述地进行。

[0241] 对已知总蛋白S的活性值的试样中的至少一个和已知总蛋白S的活性值为“零”的试样(生理食盐水或者纯水等)，如上所述进行测定操作，求出生成的信号量(生成受到抑制的信号量)。

[0242] 然后，将该生成的信号量(生成受到抑制的信号量)与试样中含有的总蛋白S的活性值的关系表示成数式或者图等，制成校正曲线。

[0243] 该校正曲线即表示信号生成的抑制度与试样中含有的总蛋白S的活性值的关系。

[0244] 接着，对总蛋白S的活性值未知的试样，如上所述相同地进行测定操作，求出生成的信号量(生成受到抑制的信号量)。

[0245] 将该信号量代入上述的校正曲线，求出相当的总蛋白S的活性值。

[0246] 由此，能够由总蛋白S的活性值未知的试样中生成的信号量(生成受到抑制的信号量)，得到该试样的总蛋白S的活性值。

[0247] 应予说明，上述的校正曲线表示信号量(生成受到抑制的信号量)即信号生成的抑制度与试样中含有的总蛋白S的活性值的关系，但该校正曲线中的信号量(生成受到抑制的信号量)可以是测定得到的信号量，也可以是以该信号量的值为基础算出的数值。

[0248] 换言之，上述的校正曲线可以表示以测定得到的信号量的值为基础算出的数值与试样中含有的总蛋白S的活性值的关系。

[0249] 应予说明，该情况下，以测定得到的信号量的值为基础算出的数值与生成受到抑制的信号量相对应。

[0250] 作为以测定得到的信号量的值为基础算出的数值，例如可举出对测定得到的信号量的每单位时间的变化量的数值、或者测定得到的信号量的值相对于时间进行一阶微分而算出的数值、或进行二阶微分而算出的数值等。

[0251] 作为例子，可以举出将利用测定得到的吸光度的每1分钟的变化量、或者利用测定得到的吸光度相对于时间进行一阶微分而得到的吸光度变化的速度、或将利用测定得到的吸光度相对于时间进行二阶微分而得到的吸光度变化的加速度等。

[0252] 14.蛋白质

[0253] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，优选在上述的活性测定反应时存在人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)或蛋清白蛋白等白蛋白，酪蛋白，或者明胶等蛋白质。

[0254] 存在该蛋白质的浓度通常优选为0.1μM～1mM。

[0255] 15.盐

[0256] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，优选在上述的活性测定反应时存在卤素元素和碱金属的盐或者卤素元素和碱土类金属的盐等盐。

[0257] 作为卤素元素和碱金属的盐，例如可以举出氯化钠、氯化钾、氟化钠、氟化钾、溴化钠或者溴化钾等。

[0258] 另外，作为卤素元素和碱土类金属的盐，例如可以举出氯化镁、氟化镁或者溴化镁等。

[0259] 存在该盐的浓度通常优选为5mM～1M，特别优选为50mM～250mM。

[0260] 16.稀释液

[0261] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，为了试样中的总蛋白S的活性测定，优选利用稀释液稀释试样后，进行上述的活性测定反应。

[0262] 该稀释液的pH没有特别限定，优选为pH6.0～pH10.0(20℃)的pH范围，更优选为pH6.5～pH8.5(20℃)的pH范围。

[0263] 应予说明，为了将pH保持在上述的pH范围，优选在该稀释液中适当存在或含有在上述的pH范围具有缓冲能力的缓冲剂。

[0264] 另外，在该稀释液中，根据需要可以适当地含有蛋白质、盐、表面活性剂、防腐剂、稳定化剂、活化剂、或者糖类等成分。

[0265] 作为该稀释液，例如可举出水、生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水、或者缓冲液等。

[0266] 虽然利用该稀释液稀释试样时的稀释倍率没有特别限定，但为了试样中的总蛋白S的活性测定，优选为2倍～60倍，更优选为5倍～40倍，特别优选为10倍～20倍。

[0267] 17.pH

[0268] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，优选在pH6.0～pH10.0(20℃)的范围进行上述的活性测定反应，特别优选在pH6.5～pH8.5(20℃)的范围进行。

[0269] 应予说明，试样中的总蛋白S的活性测定方法中，为了将活性测定反应中的pH保持在上述的pH范围，优选适当地存在在上述的pH范围具有缓冲能力的缓冲剂。

[0270] 18.其它的成分

[0271] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，在上述的活性测定反应时根据需要可以适当地存在防腐剂、稳定剂、活化剂、或者糖类等除上述记载的成分之外的成分。

[0272] 19.测定方法

[0273] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中的试样中的总蛋白S的活性的测定可以通过手工方法进行，或者可以使用自动分析装置等装置进行。

[0274] 20.测定阶段

[0275] 试样中的总蛋白S的活性测定方法中，上述详述的活性测定反应可以1次使全部的成分与试样进行接触，在1个阶段进行全部的反应(1步法)，另外还可以划分成分，通过分多个阶段进行接触而分多个阶段进行活性测定反应(多步法)。

[0276] 分多个阶段时，没有特别限制，例如可如下进行。

[0277] (1)2步法-1

[0278] (a)使试样、活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质、钙离子以及活化血液凝固第V因子接触。

[0279] (b)接着，使上述(a)的物质与活化血液凝固第X因子、凝血酶原以及凝血酶的基质接触。

[0280] (2)2步法-2

[0281] (a)使试样、活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质以及钙离子接触。

[0282] (b)接着，使上述(a)的物质与活化血液凝固第V因子、活化血液凝固第X因子、凝血酶原、凝血酶的基质以及磷脂质接触。

[0283] (3)3步法

[0284] (a)使试样、活化蛋白C、表面活性剂、磷脂质以及钙离子接触。

[0285] (b)接着，使上述(a)的物质与活化血液凝固第V因子接触。

[0286] (c)进而，使上述(b)的物质与活化血液凝固第X因子、凝血酶原以及凝血酶的基质接触。

[0287] III.试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法

[0288] 如先前所述，本发明中，测定总蛋白S蛋白质量的方法(测定方法)和试剂(测定试剂)没有特别限定，只要是能够测定总蛋白S的蛋白质量的方法和试剂，可以是任意的方法和试剂，以下对该试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法的例子进行说明。

[0289] 1.总论

[0290] 虽然是试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法，但优选通过使将针对蛋白S的抗体固定化的载体粒子与试样接触，测定由上述抗体与试样中含有的蛋白S的抗原抗体反应而生成的凝聚物，从而在测定试样中的总蛋白S蛋白质量的方法中，在上述抗原抗体反应的反应时使C4b结合蛋白质存在。

[0291] 应予说明，试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，优选载体粒子为胶乳粒子。

[0292] 另外，试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，优选试样中的总蛋白S蛋白质量的测定利用包括下述(a)和(b)的工序的方法进行。

[0293] (a)使试样与C4b结合蛋白质混合、接触，在该混合液中形成上述试样中含有的游离的蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体的工序。

[0294] (b)使将上述混合液与针对蛋白S的抗体固定化的载体粒子接触，测定由蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体和上述抗体的抗原抗体反应而生成的凝聚物的工序。

[0295] 2.针对蛋白S的抗体

[0296] 试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，针对蛋白S的抗体是指能够与蛋白S结合的抗体(抗蛋白S抗体)。

[0297] 作为该抗蛋白S抗体，例如可举出(可与蛋白S结合的)单克隆抗体、多克隆抗体、含有多克隆抗体的抗血清、嵌合抗体、人源化抗体或者单链抗体(scFv)、以及这些抗体的片段〔Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv、sFv、dsFv等〕等。

[0298] 另外，可以使用在上述的抗体或者抗体片段中结合蛋白质或者低分子化合物的衍生物。

[0299] 应予说明，抗蛋白S抗体的来源没有特别限定，例如可举出哺乳动物(小鼠、兔、大鼠、绵羊、山羊、或马等)、或者鸟类(家鸡、鹌鹑、野鸡、鸵鸟、或鸭等)等。

[0300] 3.载体粒子

[0301] 试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，载体粒子只要能够将上述的抗蛋白S抗体固定化，就可以没有特别限制地使用。

[0302] 即，是利用蛋白S与抗蛋白S抗体的抗原抗体反应进行试样中的总蛋白S蛋白质量的测定的测定试剂和测定方法中使用的载体粒子、或者能够使用的载体粒子即可。

[0303] 该载体粒子的材质没有特别限定，例如可举出聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸共聚物、聚丙烯醛、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、明胶、二氧化硅、氧化铝、碳黑、金属化合物、金属、陶瓷或者磁性体等。

[0304] 而且，作为该载体粒子，例如可举出胶乳粒子、金属胶体粒子、脂质体、微胶囊、或者红血球等粒子等。

[0305] 另外，作为该载体粒子，优选为胶乳粒子。

[0306] 试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，可以利用物理吸附法、化学结合法或者它们的并用等公知的方法进行将抗蛋白S抗体固定在载体粒子。

[0307] 利用物理吸附法时，根据公知的方法，可以使抗蛋白S抗体与载体粒子在缓冲液等溶液中混合并接触，或通过使溶解于缓冲液等的抗蛋白S抗体与载体粒子接触等而进行。

[0308] 另外，利用化学结合法进行时，可以根据日本临床病理学会编“临床病理临时增刊特集第53号用于临床检查的免疫分析-技术和应用-”，临床病理刊行会，1983年发行；日本生化学会编“新生化学实验讲座1蛋白质IV”，东京化学同人，1991年发行等中记载的公知的方法，使抗蛋白S抗体和载体粒子与戊二醛、碳二亚胺、酰亚胺酯或者马来酰亚胺等二价性的交联试剂混合并接触，使抗蛋白S抗体与载体粒子的各氨基、羧基、巯基、醛基或者羟基等分别与上述的二价性的交联试剂反应而进行。

[0309] 另外，如果为了抑制将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子的自然凝聚、或非特异性反应等而需要进行处理，则可以按照在将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子的表面，使牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶、蛋清白蛋白或其盐等蛋白质，表面活性剂或者脱脂奶粉等接触并被覆等公知的方法进行处理，进行载体粒子的阻断处理(掩蔽处理)。

[0310] 应予说明，将试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定利用胶乳免疫比浊法等比浊法进行测定时，胶乳粒子等载体粒子的大小(粒径)没有特别限制。

[0311] 然而，从生成将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子与试样中含有的蛋白S的凝聚物(凝聚块)的程度、和测定该生成的凝聚物的容易度等理由出发，载体粒子的大小(粒径)优选其平均直径(平均粒径)为0.01μm～10μm，更优选为0.04μm～1μm。

[0312] 另外，试样中的蛋白S的蛋白质量的测定方法中，载体粒子可以使用其大小(粒径)、材质、或者形状等不同的2种以上的载体。

[0313] 应予说明，将试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定利用胶乳免疫比浊法等比浊法进行测定的情况下，对于将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子的测定反应时的浓度，根据上述的特异性结合物质的载体表面上的分布密度、载体粒子的大小(粒径)、试样和测定试剂的混合比率等各种条件，最佳的浓度不同，所以不能一概而论。

[0314] 然而，通常将试样和测定试剂混合，在载体粒子固定化的抗蛋白S抗体与试样中含有的蛋白S进行抗原抗体反应的测定反应时，将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子的浓度在该测定反应时的反应混合液中一般形成0.005～1％(W/V)，此时，优选在测定试剂中含有反应混合液中成为上述浓度这样的浓度的将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子。

[0315] 试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法中，可以使将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、酪蛋白或其盐等蛋白质；钙离子等各种金属离子；钙盐等各种盐类；各种糖类；脱脂奶粉；正常兔血清等各种动物血清；叠氮化钠或抗生物质等各种防腐剂；活化物质；反应促进物质；聚乙二醇等灵敏度增加物质；非特异性反应抑制物质；或者非离子性表面活性剂、两性表面活性剂或阴离子性表面活性剂等各种表面活性剂等中的1种或者2种以上共存。

[0316] 而且，使上述的各物质共存时的浓度没有特别限定，优选为0.001～10％(W/V)，特别优选为0.01～5％(W/V)。

[0317] 4.C4b结合蛋白质

[0318] 试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法中，优选存在C4b结合蛋白质。此处，C4b结合蛋白质是指由肝细胞、巨噬细胞产生的高分子糖蛋白质，与蛋白S以1比1特异性结合而形成复合体的蛋白质。

[0319] 另外，试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法中使用的C4b结合蛋白质的由来(起源)、制备方法不限，可以没有特别限制地使用。

[0320] 例如，可举出来自人、牛或猪等哺乳动物的C4b结合蛋白质等。另外，由血浆等体液或脏器等精制而制备的C4b结合蛋白质，或者基因工程操作、细胞工程操作或细胞培养操作等而制备的C4b结合蛋白质等。

[0321] 试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，对于在总蛋白S蛋白质量的测定试剂中存在上述的C4b结合蛋白质的浓度而言，在将试样和测定试剂混合后的测定反应液中，C4b结合蛋白质与试样中含有的游离蛋白S的比优选设定为0.9以上(C4b结合蛋白质/游离蛋白S≥0.9)。

[0322] 应予说明，对于在总蛋白S蛋白质量的测定试剂中存在上述的C4b结合蛋白质的方法，只要在固定化于载体粒子的抗蛋白S抗体与试样中含有的蛋白S进行抗原抗体反应的测定反应时，能够使该C4b结合蛋白质存在于上述的总蛋白S蛋白质量的测定试剂，可以是任意的方法。

[0323] 例如，也可以通过制备在缓冲液中含有上述的C4b结合蛋白质的试剂，与含有将抗蛋白S抗体固定化的载体粒子的试剂进行混合，由此在载体粒子固定化的抗蛋白S抗体与试样中含有的蛋白S进行抗原抗体反应的测定反应时，存在C4b结合蛋白质。

[0324] 应予说明，通常健康人的试样中，虽然存在“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”和“游离的蛋白S(游离型)”这双方，但本发明中，通过使C4b结合蛋白质与试样混合、接触，从而试样中含有的游离的蛋白S与该C4b结合蛋白质形成复合体。

[0325] 即，试样中的蛋白S全部成为“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”。

[0326] 由此，试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，对全部的蛋白S〔蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)、以及游离的蛋白S(游离型)〕，能够测定其蛋白质量、即总蛋白S的蛋白质量。

[0327] 5.试样

[0328] 试样中的总蛋白S的蛋白质量测定方法中，试样是指有蛋白S存在的可能性、且进行蛋白S存在的有无、或者含量(浓度)的测定的物质。

[0329] 作为这样的试样，例如可以举出人或者动物的血液、血清、血浆、唾液、汗、尿、泪、髓液、羊水、腹水等体液，或者肝脏、心脏、脑、骨、毛发、皮肤、指甲、肌肉、神经组织等脏器，组织或细胞等提取液等，可含有蛋白S的试样。

[0330] 6.测定方法

[0331] 试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法是通过对利用在载体粒子固定化的“针对蛋白S的抗体”和试样中含有的“蛋白S”的抗原抗体反应而生成的凝聚物进行测定，从而在测定试样中的总蛋白S蛋白质量的方法中，该抗原抗体反应的反应时使C4b结合蛋白质存在。

[0332] 试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法中的测定操作可以根据公知的测定操作而进行。

[0333] 该测定可以利用手工方法进行，或者可以使用分析装置等装置进行。

[0334] 另外，该测定可以利用1步法(1试剂法)进行，或者可以利用2步法(2试剂法)等多个操作步骤进行的方法而实施。

[0335] 以下，使用以胶乳免疫比浊法为测定原理的试样中的总蛋白S蛋白质量的测定试剂，以进行试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定的情况作为例子，具体进行说明。

[0336] (1)首先，作为试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定试剂，准备以下的物质。

[0337] 第1试剂：含有C4b结合蛋白质的缓冲液

[0338] 第2试剂：含有将针对蛋白S的抗体固定化的胶乳粒子的缓冲液

[0339] (2)将血浆等试样的一定量与上述的第1试剂的一定量混合，在一定温度下静置一定时间。

[0340] 应予说明，试样与第1试剂的混合比率(量比)适当地选择即可。

[0341] 另外，上述的静置时的温度优选为室温(1～30℃)或者微温(30～40℃)的范围内的一定温度(例如，37℃等)。

[0342] 通过试样与第1试剂的混合，试样中含有的游离的蛋白S与该C4b结合蛋白质形成复合体。

[0343] 即，试样中的蛋白S全部成为“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”。

[0344] (3)一定时间后，在上述的试样与第1试剂的混合液中，添加、混合上述的第2试剂的一定量，作为反应混合液，在一定温度下静置一定时间。

[0345] 应予说明，对第2试剂的添加量适当地选择即可。

[0346] 另外，上述的静置时的温度优选为室温(1～30℃)或者微温(30～40℃)的范围内的一定温度(例如，37℃等)。

[0347] 而且，上述的静置的时间优选为1分钟～10分钟的一定时间，更优选为3分钟～5分钟的一定时间。

[0348] 通过向试样与第1试剂的混合液中添加、混合第2试剂，进行在胶乳粒子固定化的抗蛋白S抗体与试样中的蛋白S(蛋白S与C4b结合蛋白的复合体(结合型))的抗原抗体反应(测定反应)。

[0349] 而且，利用该抗原抗体反应(测定反应)，形成“…〔抗蛋白S抗体＝胶乳粒子＝抗蛋白S抗体〕-〔蛋白S〕-〔抗蛋白S抗体＝胶乳粒子＝抗蛋白S抗体〕…”的交联，生成将抗蛋白S抗体固定化的胶乳粒子彼此的凝聚物。

[0350] (4)而且，分析装置或者分光光度计等中，对反应混合液照射光，对由生成的胶乳粒子彼此的凝聚物而产生的信号、即适当的波长的透射光强度的减少(吸光度的增加)或者散射光强度的增加进行测定，由此求出生成的上述凝聚物的量、即试样中的总蛋白S的蛋白质量。

[0351] (5)而且，通过将“进行试样的测定而得到的测定值(透射光强度的减少(吸光度的增加)或者散射光强度的增加的值)”和“进行标准液、标准血清等标准物质(含有已知浓度的蛋白S的试样)的测定而得到的测定值(透射光强度的减少(吸光度的增加)或者散射光强度的增加的值)”进行比较，由此算出进行测定的试样中的总蛋白S的蛋白质量(浓度)。

[0352] 实施例

[0353] 以下，利用实施例进一步说明本发明。应予说明，本发明并不限于此。

[0354] 〔实施例1〕(总蛋白S的活性值与总蛋白S的蛋白质量的比较)

[0355] 对利用试样中的总蛋白S的活性测定方法和活性测定试剂得到的总蛋白S的活性值与利用通过胶乳比浊法的试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法和测定试剂得到的总蛋白S的蛋白质量进行比较。

[0356] 1.利用试样中的总蛋白S的活性测定方法和活性测定试剂的测定

[0357] 1.总蛋白S的活性测定试剂

[0358] (1)稀释液

[0359] 以使下述的成分分别成为记载的浓度的方式溶解于纯水中，将pH调整为pH8.0(20℃)，制备稀释液。

[0360] Triton X-100(和光纯药工业社，日本) 0.06％(W/V)

[0361] 牛血清白蛋白(BSA) 0.1％(W/V)

[0362] 氯化钠 0.1M

[0363] 柠檬酸三钠 10.6mM

[0364] 三(羟基甲基)氨基甲烷 50mM

[0365] (2)第1试剂

[0366] 以使下述的成分分别成为记载的浓度的方式溶解于纯水中，将pH调整为pH8.0(20℃)，制备第1试剂。

[0367] 活化蛋白C(精制人活化蛋白C；Enzyme Research Laboratories，Inc公司，美国) 397pM

[0368] 表面活性剂

[0369] 磷脂质

[0370] 氯化钙 2.5mM

[0371] 牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich公司，美国) 0.1.％(W/V)

[0372] 氯化钠 0.1M

[0373] 三(羟基甲基)氨基甲烷 50mM

[0374] 应予说明，表面活性剂是以Triton X-100(和光纯药工业社，日本)为0.006％(W/V)的浓度的方式含有。

[0375] 另外，磷脂质是以24μM的浓度的方式含有，所述磷脂质是如下制备的磷脂质，即，向试验管中分别采集磷脂酰丝氨酸(猪脑磷脂酰丝氨酸；PS；DOOSAN Serdary Research Laboratories公司，韩国)0.4mg、磷脂酰胆碱(猪肝脏磷脂酰胆碱；PC；DOOSAN Serdary Research Laboratories公司，韩国)0.4mg、以及磷脂酰乙醇胺(猪肝脏磷脂酰乙醇胺；PE；DOOSAN SerdaryResearch Laboratories公司，韩国)0.4mg，蒸发器蒸发作为溶剂的氯仿后，添加蒸馏水激烈搅拌1分钟后，在60℃下进行10分钟超声波处理而制备磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺的组成比为1∶1∶1(即，33.33％(W/V)∶33.33％(W/V)∶
33.33％(W/V))的磷脂质。〔应予说明，以下有时将该磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺的组成比为1∶1∶1的磷脂质称为“磷脂质(PS∶PC∶PE＝1∶1∶1)”。][0376] (3)第2试剂

[0377] 以使下述的成分分别为记载的浓度的方式溶解于纯水中，将pH调整为pH8.0(20℃)，制备第2试剂。

[0378] 活化血液凝固第V因子(精制人活化血液凝固第V因子；Haematologic Technolies，Inc公司，美国) 357pM

[0379] 表面活性剂

[0380] 磷脂质

[0381] 氯化钙 2.5mM

[0382] 牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich公司，美国) 0.1％(W/V)

[0383] 氯化钠 0.1M

[0384] 三(羟基甲基)氨基甲烷 50mM

[0385] 应予说明，表面活性剂以使Triton X-100(和光纯药工业社，日本)为0.006％(W/V)的浓度的方式含有。

[0386] 另外，磷脂质以使上述的磷脂质(PS∶PC∶PE＝1∶1∶1)为24μM的浓度的方式含有。

[0387] (4)第3试剂

[0388] 以使下述的成分分别为记载的浓度的方式溶解于纯水中，将pH调整为pH7.5(20℃)，制备第3试剂。

[0389] 活化血液凝固第X因子(精制牛活化血液凝固第X因子；New England Biolabs，Inc公司，美国) 50pM

[0390] 凝血酶原(精制人凝血酶原；Enzyme Research Laboratories，Inc公司，美国) 738nM

[0391] Test Team(注册商标)显色基质S-2238(凝血酶的基质〔凝血酶的显色基质〕；制造商：Chromogenix-Instrumentation Laboratory公司〔意大利〕，销售商：SEKISUI MEDICAL公司〔日本〕 750μM

[0392] 磷脂质

[0393] 氯化钙 5.0mM

[0394] 牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich公司，美国) 0.1％(W/V)

[0395] 氯化钠 0.15M

[0396] 三(羟基甲基)氨基甲烷 50mM

[0397] 应予说明，磷脂质是以7.5μM的浓度的方式含有，所述磷脂质是如下制备的磷脂质，即，向试验管中分别采集磷脂酰丝氨酸(猪脑磷脂酰丝氨酸；PS；DOOSAN Serdary Research Laboratories公司，韩国)0.6mg、磷脂酰胆碱(猪肝脏磷脂酰胆碱；PC；DOOSAN Serdary Research Laboratories公司，韩国)0.4mg、以及磷脂酰乙醇胺(猪肝脏磷脂酰乙醇胺；PE；DOOSAN Serdary Research Laboratories公司，韩国)1.0mg，用蒸发器蒸发作为溶剂的氯仿后，添加蒸馏水激烈搅拌1分钟后，在60℃下进行10分钟超声波处理而制备的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺的组成比为3∶2∶5(即，30％(W/V)：20％(W/V)：50％(W/V))的磷脂质。〔应予说明，以下有时将该磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺的组成比为3∶2∶5的磷脂质称为“磷脂质(PS∶PC∶PE＝3∶2∶5)”。〕

[0398] 2.试样

[0399] 将下述的(1)～(4)分别作为试样使用。

[0400] (1)健康人211名的血浆

[0401] (2)7名判断为属于蛋白S的基因变异的PS-K155E杂合体(作为蛋白S异常症之一的蛋白S德岛)的血浆

[0402] (3)1名判断为属于蛋白S的基因变异的PS-K155E纯合体(蛋白S异常症之一的蛋白S德岛)的血浆

[0403] (4)1名判断为属于蛋白S的基因变异的C206F杂合体(蛋白S异常症之一)的血浆[0404] 3.试样中的总蛋白S的活性值的测定

[0405] 各试样的总蛋白S的活性值的测定可以使用Hitachi High-Technologies公司(日本)的7170S形通用自动分析装置而进行。

[0406] (1)对上述2的试样分别利用上述1的(1)的稀释液以稀释倍率15倍进行稀释。

[0407] (2)在上述(1)中稀释的试样2.0μL中，添加上述1的(2)的第1试剂的98μL，在37℃下反应1.4分钟。

[0408] (3)接着，添加上述1的(3)的第2试剂的20μL，在37℃下反应8.3分钟。

[0409] (4)接下来，添加上述1的(4)的第3试剂的236μL，在37℃下反应。

[0410] (5)添加上述(4)中的第3试剂后，测定主波长405nm和副波长505nm中的吸光度的变化12.3分钟。

[0411] 4.试样中的总蛋白S的活性值的计算

[0412] 对上述3的(5)中测定的第3试剂添加后的吸光度变化(反应的时间进程)的值进行微分，求得试样中的总蛋白S的活性值。

[0413] 此外，预先，对总蛋白S活性值为已知的试样，如上述3所述进行测定，将测定的第3试剂添加后的吸光度变化(反应的时间进程)的每分钟的吸光度变化量相对于时间求线性方程(微分线性)，将该直线的斜率相对于该已知的总蛋白S活性值制图，制成校正曲线。

[0414] 而且，对上述2的试样如上述3所示进行测定，将得到的第3试剂添加后的吸光度变化(反应的时间进程)的每分钟的吸光度变化量相对于时间求线性方程(微分线性)，将该直线的斜率代入上述的校正曲线，算出试样中的总蛋白S的活性值。

[0415] 即，由利用测定得到的吸光度求出吸光度变化的加速度(吸光度的二阶微分值)，代入校正曲线，算出试样中的总蛋白S的活性值。

[0416] 将进行该试样中的总蛋白S的活性值的测定而得到的结果示于图1。

[0417] II.利用通过胶乳比浊法的试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定方法和测定试剂的测定

[0418] 1.通过胶乳比浊法的总蛋白S的蛋白质量的活性测定试剂

[0419] (1)第1试剂

[0420] 基于B.Dahlbeack等的方法〔Biochem.J.，209卷，847～856页，1983年〕，由人血浆制备C4b结合蛋白质。

[0421] 接着，制备含有0.1％(W/V)BSA、0.3mol/L氯化钠和0.05％叠氮化钠的50mM MES-盐酸缓冲液〔pH6.2(20℃)〕。

[0422] 向其中，以成为25μg/mL的浓度的方式添加如上所述制备的C4b结合蛋白质，制成第1试剂。

[0423] (2)第2试剂

[0424] (a)抗蛋白S抗体的制备

[0425] 本发明人等以精制的游离状态的蛋白S作为免疫抗原，根据常法进行抗蛋白S抗体的制备。

[0426] 对在蛋白S的与C4b结合蛋白质的结合部位以外的部位特异性地结合的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞进行筛选，得到小鼠/小鼠的杂交瘤细胞(9H6株)。

[0427] 将利用该杂交瘤细胞(9H6株)而产生的小鼠抗蛋白S·单克隆抗体的5mg溶解于0.5mL的磷酸钠缓冲液(pH7.5)。

[0428] 向其中，加入溶解有0.6mg的S-乙酰基巯基琥珀酸酐的0.01mL的N，N-二甲基甲酰胺，在室温下孵育30分钟。

[0429] 接着，向其中分别加入0.1M EDTA水溶液0.02mL、1M三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲液(pH7.0)0.1mL、以及1M羟胺盐酸缓冲液(pH7.0)0.1mL，在30℃下孵育30分钟。

[0430] 其后，将其用含有5mM EDTA的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡化，用葡聚糖凝胶G-25柱进行凝胶过滤，得到经巯基·琥珀酰化的小鼠抗蛋白S单克隆抗体。

[0431] (b)抗蛋白S抗体固定化胶乳粒子悬浊液的制备

[0432] 将平均粒径0.192μm的胶乳粒子的10％悬浊液1.0mL和50mM MES-盐酸缓冲液〔pH6.0(20℃)〕1.0mL进行混和，进而添加320mM碳二亚胺(同仁化学研究所；制品编号：348-03631)水溶液32μL进行混和，在冰上放置10分钟。

[0433] 向上述冰上放置10分钟的胶乳粒子悬浊液1.2mL中，加入将上述(a)制备的经巯基·琥珀酰化的小鼠抗蛋白S单克隆抗体以0.083g/dL的浓度与50mM MES-盐酸缓冲液〔pH6.0(20℃)〕混和的液体1.8mL，在4℃下搅拌一夜。

[0434] 接着，利用离心分离除去上清液后，使沉淀部分在含有0.8％BSA的50mM Tris-盐酸缓冲液〔pH8.0(20℃)〕中悬浊，在37℃下放置3小时，进行阻断处理。

[0435] 接下来，利用离心分离回收沉淀部分后，利用含有0.1％BSA的0.05％叠氮化钠水溶液将其再分散，以使波长700nm中的吸光度为15，0OD的方式悬浊。

[0436] 使其形成抗蛋白S抗体固定化胶乳粒子悬浊液。

[0437] (c)第2试剂的制备

[0438] 利用含有0.1％BSA的0.05％叠氮化钠水溶液将由上述(b)制备的抗蛋白S抗体固定化胶乳粒子悬浊液稀释10倍，制备含有0.1％的“抗蛋白S抗体固定化胶乳粒子”的悬浊液。

[0439] 使其形成第2试剂。

[0440] 2.试样

[0441] 将上述的I的2的(1)～(4)的各试样用作试样。

[0442] 3.试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定和算出

[0443] (1)测定顺序

[0444] (a)测定是使用东芝-120FR自动分析装置(TOSHIBA MEDICAL SYSTEMS公司制)进行。

[0445] 首先，向测定用容器(比色皿)中，添加上述2的试样3μL。

[0446] 接下来，向这些测定用容器(比色皿)中，添加上述1的(1)的第1试剂100μL进行混合。

[0447] 而且，在37℃下静置这些测定用容器(比色皿)。

[0448] 由此，形成上述的试样中含有的游离的蛋白S与上述的第1试剂中的C4b结合蛋白质的复合体。即，试样中含有的蛋白S全部成为“蛋白S与C4b结合蛋白质的复合体(结合型)”。

[0449] (b)在上述的第1试剂的添加后第4分40秒(第16点)，向这些测定用容器(比色皿)内的混合液，进一步添加上述1的(2)的(c)的第2试剂的100μL进行混合。

[0450] (c)在上述的第1试剂的添加后第5分35秒(第19点)，将这些测定用容器(比色皿)内的混合液的吸光度(波长700nm)作为试样盲检进行测定。

[0451] 而且，在37℃下静置这些测定用容器(比色皿)，进行反应。

[0452] 由此，进行在上述的胶乳粒子固定化的抗蛋白S抗体与上述的试样中含有的蛋白S的抗原抗体反应，生成胶乳粒子的凝聚块。

[0453] (d)在上述的第1试剂的添加后第9分47秒(第33点)，将该测定用容器(比色皿)内的反应混合液的吸光度(波长700nm)作为上述试样的测定值进行测定。

[0454] (e)由上述(d)中测定的吸光度(测定值)减去由上述(c)中测定的吸光度(试样盲检)，得到吸光度差。

[0455] 应予说明，该吸光度差与试样中含有的总蛋白S蛋白质量(浓度)成比例。

[0456] 由这些试样的吸光度差制成校正曲线，将利用相同的方法测定实际样品(3.2％柠檬酸血浆)时的吸光度差代入校正曲线，求得试样中的总蛋白S蛋白质浓度。

[0457] 这样，得到上述2的各试样的总蛋白S的蛋白质量。

[0458] 将进行该试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定而得到的结果示于图1。

[0459] III.测定结果

[0460] 1.图的说明

[0461] 将对上述I中的试样中的总蛋白S的活性值的测定结果与上述II中的试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定结果进行比较的图示于图1。

[0462] 在该图中，横轴(x)表示上述II的利用胶乳比浊法的试样中的总蛋白S的蛋白质量的测定结果。该测定值的单位为“μg/mL”。

[0463] 另外，该图中，纵轴(y)表示上述I中的试样中的总蛋白S的活性值的测定结果。该测定值的单位为“μg/mL当量”。

[0464] 2.健康人的试样的比较

[0465] 将对上述I的总蛋白S的活性值的测定结果与上述II的利用胶乳比浊法的总蛋白S的蛋白质量的测定结果的比较如下进行。

[0466] 对于试样为健康人211名的血浆的情况，由上述I的总蛋白S的活性值的测定结果和上述II的总蛋白S的蛋白质量的测定结果，求出蛋白S的比活性(总蛋白S活性值/总蛋白S蛋白质量)。

[0467] 算出该健康人211名的血浆的试样的蛋白S的比活性的平均值和标准偏差(SD)，求出平均±2SD(0.98±0.26)的范围。

[0468] 偏离该范围的试样为10，所以对除去该10的试样的健康人201名的试样，再次算出由总蛋白S的活性值的测定结果和总蛋白S的蛋白质量的测定结果求得的蛋白S的比活性(总蛋白S活性值/总蛋白S蛋白质量)的平均值和标准偏差，求出平均±2SD(0.99±0.20)的范围和平均±3SD(0.99±0.30)的范围。

[0469] 应予说明，该图表示对各试样，试样中的总蛋白S的活性值除以总蛋白S的蛋白质量而得的比活性。

[0470] 该图中，用实线表示比活性的平均值y＝0.99x的式子的线。

[0471] 另外，在该式y＝0.99x线的上和下，以虚线将表示平均±2SD的线(y＝1.19x，以及y＝0.79x)示于该图中。

[0472] 而且，在该式y＝0.99x线的上方以点线将表示平均+3SD的线(y＝1.29x)示于该图中，另外在该式y＝0.99x线的下方以实线将表示平均-3SD的线(y＝0.69x)示于该图中。

[0473] 对于健康人211名的血浆的试样的测定结果，在该图1中，看到从上述的y＝0.69x(平均-3SD)的线向下偏离的有7个。

[0474] 即，看到总蛋白S的活性值除以总蛋白S的蛋白质量而得的比活性为0.69以下的试样有7个。

[0475] 这些比活性为0.69以下的7个试样中，即总蛋白S的活性值和总蛋白S的蛋白质量偏离较大的7个试样中，对得到许可的3个试样调查蛋白S基因的碱基序列，其结果，这3个试样中的任一个均被判定为蛋白S基因的PS-K155E变异(蛋白S异常症中的一个)。〔图1中，对这3个试样标记箭头(↓或者↑)。〕

[0476] 由此，测定试样中的总蛋白S的活性值和试样中的总蛋白S的蛋白质量，将利用该测定得到的总蛋白S的活性值和总蛋白S的蛋白质量通过求出比活性等进行比较，由此确认能够检测蛋白S的基因的变异等的蛋白S异常症。

[0477] 3.判定为蛋白S的基因变异(蛋白S异常症)的试样的比较

[0478] 对判定为上述I的2的(2)～(4)的蛋白S的基因变异(蛋白S异常症)的各试样(总计9名的试样)，对上述I的总蛋白S的活性值的测定结果和上述II的利用胶乳比浊法的总蛋白S的蛋白质量的测定结果进行比较。

[0479] 图1中，将判定为属于上述I的2的(2)的蛋白S的基因变异的PS-K155E杂合体(蛋白S异常症之一)的7名的血浆的试样以“●”表示。

[0480] 另外，将判定为属于上述I的2的(3)的蛋白S的基因变异的PS-K155E纯合体(蛋白S异常症之一)的1名的血浆的试样以“◆”表示。

[0481] 而且，将判定为属于上述I的2的(4)的蛋白S的基因变异的C206F杂合体(蛋白S异常症之一)的1名的血浆的试样以“□”表示。

[0482] 可知判定为属于蛋白质S的基因变异的这9个试样(●、◆以及□)均从上述的图1中的y＝0.69x(平均-3SD)的线向下偏离。

[0483] 即，可知对于判定为属于蛋白S的基因变异的这9个试样(●、◆以及□)而言，总蛋白S的活性值除以总蛋白S的蛋白质量而得的比活性为0.69以下。

[0484] 换言之，可知这9个试样的总蛋白S的活性值和总蛋白S的蛋白质量偏离较大。

[0485] 因此，测定试样中的总蛋白S的活性值和试样中的总蛋白S的蛋白质量，通过对利用该测定得到的总蛋白S的活性值和总蛋白S的蛋白质量利用求出比活性等进行比较，由此能够检测蛋白S的基因的变异等的蛋白S异常症，其可从这些蛋白S的基因变异的9个试样的比较结果中得到确认。

[0486] 产业上的可利用性

[0487] 本发明的蛋白S异常症的检测方法能够正确、简便且迅速地检测蛋白S异常症。

[0488] 因此，通过使用本发明的蛋白S异常症的检测方法，能够简便且正确地检测蛋白S的异常症，对血栓症等疾病的预防、诊断以及治疗等有作用。