基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统 |
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| 申请号 | CN201610024305.5 | 申请日 | 2016-01-15 | 公开(公告)号 | CN105675868A | 公开(公告)日 | 2016-06-15 |
| 申请人 | 江涛; 蒋传路; 蔡金全; | 发明人 | 江涛; 蒋传路; 蔡金全; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统，所述系统包括：(1)胶质瘤患者 肿瘤 石蜡 包埋 试剂 盒 和任选地所述试剂盒使用 说明书 ；(2)免疫组化检测胶质瘤患者肿瘤中ATRX蛋白表达 水 平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书；和(3)免疫组化检测胶质瘤患者肿瘤中IDH1-R132H蛋白表达的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。当联合IDH1-R132H和ATRX损失作为诊断标志物区分原发胶质母细胞瘤、WHO分级II/III的少突胶质细胞瘤、WHO分级II/III的星形细胞瘤和继发胶质母细胞瘤，其中诊断特异性明显高于IDH1-R132H或ATRX损失状况这两个单一标记物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统，其特征在于所述系统包括：(1)检测胶质瘤患者肿瘤中ATRX蛋白表达水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书；和(2)检测胶质瘤患者肿瘤中IDH1-R132H蛋白表达的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。 |
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| 说明书全文 | 基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统技术领域背景技术[0002] 根据WHO的分类，弥散性胶质瘤分为II级、III级和胶质母细胞瘤的星形细胞胶质瘤、少突星形胶质瘤和少突胶质瘤。较低级别胶质瘤(LGGs，II级)的患者比高级别胶质瘤(III级和IV级)的患者具有更有利的预后，在50-75％的低级别胶质瘤患者中，肿瘤继续生长和发展成为更高级别，导致神经疾病和最终死亡。 [0003] 星形细胞瘤是脑肿瘤中最常见的病理类型，极易复发或恶性进展，即使经过手术、放疗和化疗也很难治愈。恶性的星形细胞瘤如胶质母细胞瘤是最致命的颅内肿瘤。星形细胞瘤患者预后取决于某些临床因素，如发病年龄、KPS评分、手术切除范围、病理类型、肿瘤级别和分子标记物特征。当前，胶质瘤诊断仅以形态学为基础，难以明确客观地诊断胶质瘤病理类型，也不能全面反映肿瘤的生物学行为，不能准确判断患者预后和指导术后临床治疗。 [0004] IDH(isocitrate dehydrogenase，异柠檬酸脱氢酶)和ATRX(X-linked alpha thalassaemia mental retardation)的突变在胶质瘤发生的早期出现和表征胶质瘤的特定亚型。多数致癌IDH1突变是杂合错义突变，在395位置(G395A)G变为A，导致了在酶活性位点密码子132(IDH1-R132H)的精氨酸被组氨酸替代。ATRX突变或损失影响星形胶质细胞的生物学行为，与星形胶质细胞肿瘤患者的有利生存有关。 发明内容[0005] 本发明目的是提供一种基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统。 [0006] 在一种实施方式中，基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统，它包括：(1)检测胶质瘤患者肿瘤中ATRX蛋白表达水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书；和(2)检测胶质瘤患者肿瘤中IDH1-R132H蛋白表达的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。 [0007] 在一种实施方式中，基于IDH1-R132H和ATRX表达的胶质瘤分型系统，所述系统包括：(1)胶质瘤患者肿瘤石蜡包埋试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书；(2)免疫组化检测胶质瘤患者肿瘤中ATRX蛋白表达水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书；和(3)免疫组化检测胶质瘤患者肿瘤中IDH1-R132H蛋白表达的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。 [0009] 在一种实施方式中，ATRX核内表达损失的评估标准：如果肿瘤细胞核未被染成棕色，而非肿瘤细胞核、小胶质细胞、淋巴细胞和星形细胞表现为强阳性，那么定义为ATRX核内表达损失。 [0010] 在一种实施方式中，所述系统用于区分原发胶质母细胞瘤、WHO分级II/III胶质瘤的少突胶质细胞瘤、WHO分级II/III胶质瘤的星形细胞瘤和继发胶质母细胞瘤。 [0011] 在一种实施方式中，所述免疫组化检测胶质瘤患者肿瘤中ATRX蛋白表达水平的试剂盒检测ATRX蛋白氨基酸序列位点为2211-2413。 [0012] 除了通过免疫组化的方法外，IDH1-R132H还可通过焦磷酸测序技术(pyro-sequencing)检测实现，ATRX突变可通过外显子测序检测，其表达损失也可由转录组测序(ma-seq)来检测。这些检测方法目前都较为技术较复杂，且价格较高，普及性较差，与此对比，IDH1R132H和ATRX核内蛋白损失可通过免疫组化的方法检测，方法一致性强，技术要求不高，价格更为经济，临床实用性和普及型强，适合推广应用。 [0013] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。 [0015] 图1是IDH1-R132H蛋白在胶质瘤组织中的免疫组化染色结果图：弥散星形细胞瘤、少突星形胶质瘤和少突胶质瘤(A/B/C)表现出IDH1-R132H蛋白阳性表达；间变星形细胞瘤、间变少突星形细胞瘤和间变少突胶质瘤(D/E/F)也表现出IDH1-R132H阳性；以及原发胶质母细胞瘤和复发胶质母细胞瘤呈IDH1-R132H阴性(G/H)；继发胶质母细胞瘤呈IDH1-R132H阳性(I)。 [0016] 图2是ATRX核内蛋白在胶质瘤组织中的免疫组化染色结果图：弥散星形细胞瘤(WHO II，A)、间变星形细胞瘤(WHO III，C)和继发胶质母细胞瘤(WHO III，E)表现出明显的肿瘤细胞核内ATRX蛋白表达损失；少突胶质细胞瘤(WHO II，B)、间变少突胶质细胞瘤(WHO III，D)和原发胶质母细胞瘤(WHO IV，F)表现出明显的肿瘤细胞核内ATRX蛋白阳性表达；和血管内皮细胞呈现阳性表达ATRX核内蛋白，可作为阳性对照。 [0017] 图3是IDH1-R132H和ATRX核内蛋白损失作为胶质瘤病理类型诊断的ROC评估图：使用IDH1-R132H作为判别pGBM(原发胶质母细胞瘤)和II、III级胶质瘤及sGBM(继发胶质母细胞瘤)的诊断标志物的AUC为0.7414(敏感性63.19％，特异性85.09％，A)；ATRX损失作为区分pGBM，少突胶质细胞瘤(WHO分级II/III)，和sGBM，星形细胞瘤(WHO分级II/III)诊断的生物标志物的AUC为0.8241(敏感性76.67％，特异性88.15％，图3B)；以及当联合IDH1-R132H和ATRX损失作为诊断标志物区分pGBM和少突胶质细胞瘤(WHO分级II/III)，星形细胞瘤(WHO分级II/III)、sGBM时，AUC为0.7407(敏感性53.33％，特异性94.815％，图3C)，其中诊断特异性明显高于IDH1-R132H或ATRX损失状况这两个单一标记物。 具体实施方式[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 [0019] 1.患者资料与标本来源 [0020] 总计211例胶质瘤入组本项研究，全部来自北京天坛医院胶质瘤治疗中心。所有患者于2008年1月至2015年3月接受手术切除、放疗和烷化剂治疗，术后病理诊断均为胶质瘤(依据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准)。 [0021] 所有患者中男性112例，女性99例，年龄16-69岁，平均(40)岁。该研究通过有关单位伦理委员会批准并签署患者知情同意书。 [0022] 2.肿瘤组织石蜡包埋 [0023] 2.1主要仪器和试剂 [0024] 石蜡包埋机：生产厂家：郝思琳；产品编号：TEC2800 [0025] Milli-Q型超纯水系统：生产厂家：Millipore [0027] 2.2实验步骤 [0028] 2.2.1脱水 [0029] 表1：脱水流程 [0030]溶液 时间(min) 30％乙醇 90min 50％乙醇 90min 70％乙醇 90min 85％乙醇 90min 95％乙醇 90min 100％乙醇I 60min 100％乙醇II 60min [0031] 2.2.2透明 [0032] 表2：透明流程 [0033]溶液 时间(min) 1/2乙醇+1/2二甲苯 60min 二甲苯I 60min 二甲苯II 60min [0034] 2.2.3渗透 [0035] 表3：渗透流程 [0037] 2.2.4包埋 [0038] 将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。 [0039] 3.石蜡切片 [0040] 3.1主要仪器和试剂 [0041] 石蜡切片机：生产厂家：国SLEE；产品编号：CUT4062； [0042] 切片刀：生产厂家：国SLEE； [0043] Milli-Q型超纯水系统：生产厂家：Millipore； [0045] 载玻片：生产厂家：上海桑戈生物科技有限公司 [0046] 恒温箱：生产厂家：Thermo公司 [0047] 3.2石蜡块的固着与整修 [0048] 在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 [0049] 固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。 [0050] 整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。 [0051] 3.3切片 [0052] 切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。 [0054] 切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。 [0055] 切片方法：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。 [0056] 3.4贴片烤片 [0057] 切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。采用捞片法进行贴片。蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入48℃的温水浴中，摊平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用载玻片捞起，蜡片应捞在玻片的1/3处，蜡片厚度一般在3～5μm。蜡片放入烤片架上，放入62℃恒温箱6h以上。 [0058] 4.免疫组织化学染色 [0059] 4.1主要仪器和试剂 [0060] 微量台式离型剂：生产厂家：Eppendorf；型号：541D； [0061] 涡旋混合器：生产厂家：TonDa；型号：TDX-1； [0062] Milli-Q型超纯水系统：生产厂家：Millipore [0063] 水浴加热器：生产厂家：北京长风仪器公司；产品编号：HHSY11-N1； [0064] 盖玻片：生产厂家：上海桑戈生物科技有限公司 [0065] 显微镜：生产厂家：日本Olympus公司；型号：IX51； [0066] 磁力恒温搅拌器：生产厂家：上海南汇电讯器材厂；型号：CHJ-1； [0067] 乙醇、二甲苯、H2O2和枸橼酸盐来自北京化工厂； [0068] 抗ATRX抗体：生产厂家：Abeam公司；型号：ab97508 [0069] 抗IDH1-R132H抗体：生产厂家：德国Dianova公司；型号：H09 [0070] 二抗-HRP多聚体：生产厂家：北京全式金生物技术有限公司；型号：PV-6000[0071] DAB显色剂：生产厂家：北京全式金生物技术有限公司； [0072] 4.2实验步骤 [0073] 4.2.1按如下步骤进行脱蜡水化 [0074] 4.2.2脱蜡流程 [0075] 表4：脱蜡流程 [0076]溶液 时间(min) 二甲苯I 5min 二甲苯II 5min 无水乙醇I 5min 无水乙醇II 5min 95％乙醇 5min 80％乙醇 5min [0077] 4.2.3蒸馏水洗涤5min。 [0078] 4.2.4抗原修复将玻片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的抗原修复盒中。微波炉内高火档3min，使温度达95℃左右，调至低火档，加热15min。取出抗原修复盒，自然冷却至室温。取出玻片，PBST缓冲液洗涤，5min/次x3次。 [0079] 4.2.5 3％H2O2室温避光封闭8-10min。 [0080] 4.2.6 PBS缓冲液洗涤，5min/次x3次。 [0081] 4.2.7加一抗(抗ATRX抗体，1∶800；或抗IDH1-R132H抗体，1∶60)，4℃孵育12h。 [0082] 4.2.8甩掉一抗，PBS缓冲液洗涤，5min/次x3次。 [0083] 4.2.9孵育二抗，37℃，30min，PBS洗涤3次，每次5min。 [0084] 4.2.10 DAB显色。按试剂盒说明配置DAB显色液，滴一滴DAB染液于组织上，显微镜下观察，显色合适时及时用自来水冲洗终止染色。 [0085] 4.2.11苏木素染核2min。 [0086] 4.2.12缓流水冲洗10min。 [0087] 4.2.13 1％盐酸酒精分色5s，流水冲洗自来水返蓝10min。 [0088] 4.2.14脱水透明，步骤如下： [0089] 4.2.15脱水透明流程 [0090] 表5：脱水透明流程 [0091]溶液 时间(min) 95％乙醇 5min 无水乙醇I 5min 无水乙醇II 5min 二甲苯I 5min 二甲苯II 5min 二甲苯III 5min [0092] 4.2.16封片：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。贴上标签，注明材料、染色法，置通风柜内晾干，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。显微镜观察，拍照分析。 [0093] 5.染色结果判定标准 [0094] IDH1-R312H染色的评估标准：(1)广泛的肿瘤细胞质强染色被定义为阳性；(2)散在的弱阳性或巨噬细胞染色被定义为阴性。 [0095] ATRX核内表达损失的评估标准：如果肿瘤细胞核未被染成棕色，而非肿瘤细胞核如内皮细胞、小胶质细胞、淋巴细胞和星形细胞表现为强阳性，那么定义为ATRX核内表达损失。 [0096] 6.统计学与生物信息学分析 [0097] 6.1 ROC(Receiver operating characteristic)曲线被用于评估ATRX损失诊断胶质瘤的特异性和敏感性。 [0098] 6.2 p＜0.05被认为差异有意义。 [0099] 6.3所有的分析都是使用软件GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)和SPSS version 16.0(SPSS，Chicago，IL，USA)。 [0100] 7.结果 [0101] IDH1-R132H和ATRX蛋白核内损失在胶质瘤中发生的频率及其诊断价值 [0102] 为了研究ATRX蛋白核内损失与胶质瘤病理诊断的相关性，我们入组了211例胶质瘤患者，连续取样，包括星形细胞瘤103例(A，AA)，25例少突胶质细胞瘤(O，AO)，少突星形细胞瘤123例(OA，AOA)和181例胶质母细胞瘤(原发胶质母细胞瘤(pGBM)，继发胶质母细胞瘤(sGBM))。其中30例组织在接近整个组织或特定的模式没有免疫反应，或存在坏死区，因此不考虑统计评价。 [0103] IDH1-R132H染色阳性和阴性是明确的。IDH1-R132H染色阳性下表现出强的细胞质染色同时弱的核染色(图1)。在我们64例II级星形细胞瘤中，37例阳性(57.81％，图1A)。II级少突星形胶质瘤(40/49，81.63％，图1B)和少突胶质瘤(9/12，75％，图1C)有一个更高的阳性率。间变星形细胞瘤(13/27，48.15％，图1D)、间变少突星形细胞瘤(38/68，55.88％％，图1E)和间变少突胶质瘤(5/9，55.56％，图1F)IDH1-R132H发生率也很高。在114pGBM中，检出阳性17例(14.91％，图1G/H)，而59例sGBM中40例阳性(67.8％，图1I)结合IDH1-R132H(表6，p＝0.009，Fisher精确检验)。 [0104] 在ATRX免疫组化阳性的174(402)例组织中，免疫反应呈明显核染色(图2，表6)。在228例明显阴性的肿瘤组织中，肿瘤细胞核呈ATRX损失，而内皮细胞和炎症浸润细胞以及残留的神经元呈ATRX表达阳性。ATRX损失的频率在星形细胞瘤中较高(A，49/64，76.56％；AA， 21/27，77.78％；sGBM，45/59，76.27％，图2A/C/E)，在OA，AOA较低(OA，23/49，46.94％；AOA， 20/68，29.41％)，在O，AO和pGBM中损失频率最低(O，1/12，8.33％；AO，1/9，11.11％；pGBM， 14/114，12.28％，图2B/D/F，P＝0.009，Fisher精确检验)。 [0105] 表6 IDH1-R132H和ATRX核内损失在胶质瘤中的发生频率 [0106] [0107] [0108] 我们还进行了接受者操作特征(ROC)分析划定的敏感性和特异性IDH1-R132H和(或)ATRX损失的组织学分类。如图3所示，使用IDH1-R132H作为判别pGBM和II、III级胶质瘤及sGBM的诊断标志物的AUC为0.7414(敏感性63.19％，特异性85.09％，图3A)。ATRX损失作为区分pGBM，少突胶质细胞瘤(WHO分级II/III)，和sGBM，星形细胞瘤(WHO分级II/III)诊断的生物标志物的AUC为0.8241(敏感性76.67％，特异性88.15％，图3B)。当联合IDH1-R132H和ATRX损失作为诊断标志物区分pGBM和少突胶质细胞瘤(WHO分级II/III)，星形细胞瘤(WHO分级II/III)、sGBM时，AUC为0.7407(敏感性53.33％，特异性94.815％，图3C)，其中诊断特异性明显高于IDH1-R132H或ATRX损失状况这两个单一标记物。这些结果表明，IDH1-R132H联合ATRX损失状况具有很好的胶质瘤病理组织学诊断预测能力。 |
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