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用于使用20基因群组评估及治疗溃疡性结肠炎和相关疾病的标记物和方法

申请号 CN200980134148.1 申请日 2009-08-28 公开(公告)号 CN102165315B 公开(公告)日 2014-06-18
申请人 森托科尔奥索生物科技公司; 发明人 X·李; F·巴里鲍德;
摘要 本 发明 公开了用于评估在受试者中的诸如溃疡性结肠炎之类的胃肠相关 疾病 的靶向疗法的适用性的方法,所述方法评价在样本中的20成员或5成员基因群组中的一个或多个基因表达的存在、不存在、和/或量级。所述方法允许在患者开始接受这样的疗法之前能够识别靶向疗法的有效性。
权利要求

1.由SEQ ID No:1-20组成的核酸片段群组在制备用于预测采用靶向疗法治疗患者的胃肠相关疾病的适用性的方法中的试剂中的用途,所述方法包括:
a)由从所述患者获得的标本制备核酸样本;
b)将所述样本与由SEQ ID No:1-20组成的核酸片段群组接触,以检测所述群组中片段的平;
c)对照参考标准评价所述样本,以确定存在于所述样本中的对应于SEQ ID No:1-20的核苷酸序列组成群的所有成员的量的改变量级;以及
d)将所述改变量级与用所述靶向疗法治疗胃肠相关疾病的适用性相关联。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述患者为患有胃肠相关疾病的患者,并且所述靶向疗法为抗TNFα抗体
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述抗TNFα抗体为英夫利昔单抗。
4.根据权利要求2所述的用途,其中所述胃肠相关疾病为溃疡性结肠炎。
5.根据权利要求4所述的用途,其中所述参考标准来自未治疗的溃疡性结肠炎患者的结肠活检组织,所述患者为所述靶向疗法的响应者或所述靶向疗法的非响应者。
6.根据权利要求1所述的用途,其中所述群组为核酸片段的阵列。
7.根据权利要求1所述的用途,其中所述评价步骤包括对照参考标准评价所述样本,以及确定关于所述群组的成员中的每一个的平均强度值是否等于或高于X或低于Y。
8.根据权利要求7所述的用途,其中关于所述群组的成员中的每一个的平均强度值等于或高于X表明所述患者将为所述靶向疗法的响应者,而关于所述群组的成员中的每一个的平均强度值低于Y表明所述患者将为非响应者。
9.根据权利要求2所述的用途,其中所述样本来自这样的源,所述源选自在给予治疗之前提供所述样本的患者、安慰剂治疗的患有胃肠相关疾病的患者以及来自生物库的样本。
10.根据权利要求1所述的用途,其中所述样本包括结肠活检样本。
11.根据权利要求1所述的用途,其中所述样本包括外周血细胞。
12.权利要求1所述的用途,其中所述方法是一种基于阵列的测试方法,所述方法用于预测采用靶向疗法治疗患者的胃肠相关疾病的适用性,所述方法包括:
a)由从所述患者获得的标本制备核酸混合物;
b)用可检测标记物标记所述标本核酸,以形成样本;
c)将所述样本与包含多个核酸片段的阵列接触,其中每一个核酸片段被固定到所述阵列的基底表面上的离散的和已知的地址,其中由对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列组成的胃肠相关基因群组被识别为由地址限定的所述阵列的特征物,并且其中所述阵列还包含在所述基底上的已知地址处的至少一个校正核酸;
d)确定所述标本核酸结合到所述核酸片段上的程度;以及
e)比较结合到参考标准上的程度,以允许能够评估所述治疗适用性。
13.根据权利要求12所述的用途,其中所述比较步骤包括对照参考标准评价所述样本,以确定由对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列的量的改变量级。
14.根据权利要求13所述的用途,其中所述评价步骤包括对照参考标准评价所述样本,以及确定用于所述胃肠相关基因群组的成员中的每一个的平均强度值是否等于或高于X或低于Y。
15.根据权利要求12所述的用途,其中所述胃肠相关疾病为溃疡性结肠炎,并且所述胃肠相关基因群组为溃疡性结肠炎相关基因群组。
16.根据权利要求12所述的用途,其中所述靶向疗法为抗TNFα抗体。
17.根据权利要求12所述的用途,其中所述标本来自患者的结肠活检组织,所述患者选自疑似患有溃疡性结肠炎的患者和诊断患有溃疡性结肠炎但没有经过治疗的患者。
18.根据权利要求12所述的用途,其中所述标本来自这样的源,所述源选自在给予治疗之前提供所述标本的患者、用安慰剂治疗的类似疾病或病症的患者以及来自生物库的样本。
19.根据权利要求12所述的用途,其中所述标本包括结肠活检样本。
20.根据权利要求12所述的用途,其中所述标本包括外周血细胞。
21.根据权利要求12所述的用途,其中所述比较结合程度的步骤还包括严格测试溃疡性结肠炎相关基因群组的阵列的特征物强度改变的相似性。
22.一种用于在细胞或患者中测试胃肠相关疾病的靶向疗法适用性的试剂,包括选自以下的至少一个成员:含有至少15个核苷酸的寡核苷酸,所述寡核苷酸包括或互补于对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列中的每一个的核苷酸序列;由对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列中的每一个的至少一部分编码的多肽;和由对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列中的每一个的至少一部分编码的多肽的配体。
23.根据权利要求22所述的试剂,其中所述胃肠相关疾病为溃疡性结肠炎,并且所述靶向疗法为抗TNFα抗体。
24.根据权利要求23所述的试剂,其中所述抗TNFα抗体为英夫利昔单抗。
25.根据权利要求22-24中任一项的试剂的用途,所述试剂用于制备在患者样本中测试胃肠相关疾病的靶向疗法适用性的方法中的试剂盒,所述方法包括将所述患者样本与权利要求22-24中任一项所述的试剂接触,以及将对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列的每一基因或蛋白的至少一部分的水平与参考标准比较。
26.根据权利要求25所述的用途,其中所述测试通过RT-PCR完成。
27.根据权利要求25所述的用途,其中所述测试通过ELISA完成。
28.根据权利要求25所述的用途,其中所述靶向疗法为抗TNFα抗体。
29.根据权利要求28所述的用途,其中所述抗体为英夫利昔单抗。
30.根据权利要求25所述的用途,还包括对照参考标准评价所述样本,以及确定用于所述胃肠相关基因群组的成员中的每一个的平均强度值是否等于或高于X或低于Y。
31.一种用于预后或诊断性用途的试剂盒,包括含有至少15个核苷酸的寡核苷酸和表达标记物基因的细胞,所述寡核苷酸包括或互补于含所述标记物基因的核苷酸序列的多核苷酸或其互补链;其中所述标记物基因选自对应于SEQ ID No.1-20的核苷酸序列。
32.根据权利要求31所述的试剂盒,其中所述试剂盒适于筛选治疗剂用于UC的适用性。
33.权利要求22-24中任一项的试剂在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于测试用于溃疡性结肠炎的疗法的有效性的方法中,所述方法包括:
a)用权利要求22-24中任一项所述的试剂的至少2个成员接触取自正接受溃疡性结肠炎治疗的患者的样本;
b)测定所述至少2个成员的水平;以及
c)将所述至少2个成员的水平与所述疗法的有效性相关联。
34.根据权利要求33所述的用途,其中所述疗法包括TNFα的拮抗剂。
35.根据权利要求34所述的用途,其中所述拮抗剂为TNFα的抗体。
36.根据权利要求35所述的用途,其中所述抗体为英夫利昔单抗。

说明书全文

用于使用20基因群组评估及治疗溃疡性结肠炎和相关疾

病的标记物和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及表征胃肠相关疾病(诸如溃疡性结肠炎)的表达谱和核酸的识别,并且涉及这种表达谱和核酸在诊断溃疡性结肠炎和相关疾病中的用途。本发明还涉及用于识别、使用和测试调节溃疡性结肠炎的候选试剂和/或靶点的方法。

背景技术

[0002] 溃疡性结肠炎(UC)是多因素自身免疫疾病,其复杂的发病涉及未识别的遗传因素、生物因素和环境因素。通过使用取自UC患者的发炎的结肠镜组织活检相对于非炎性活检标本的微阵列分析,最近研究揭示了一些炎性细胞因子的调节异常,然而,在UC方面的病原学、发病、以及肿瘤坏死因子α(TNFα)的作用仍然鲜为人知。TNF是克隆氏病中的一种关键促炎细胞因子,如由英夫利昔单抗治疗克隆氏病患者的以下疗效所证实的:诱导并维持临床缓解,闭合肠外瘘、肛瘘和直肠阴道瘘,维持瘘管闭合以及类固醇类逐渐减少。然而,尽管事实上也发现TNFα在UC患者血液、结肠组织和大便中的含量增加,但支持TNF在UC发病中的作用的证据是有争议的。尽管使用了支持TNF在UC中的关键致病作用的常规疗法,但由Rutgeerts等人进行的临床研究(ACT-1)显示,英夫利昔单抗在第0、2、6周和其后每8周施用时,在具有中度至重度活动期的UC患者体内实现临床响应和缓解的过程中是有效的。
[0003] 微阵列技术是强有的工具,因为它允许能够同时分析成千上万基因的表达,并且也可为自动化的,从而允许高通过量格式。在与复杂宿主功能相关的疾病(诸如称为免疫介导的炎性疾病(诸如UC)的那些)中,微阵列结果可提供在设计疾病诊断和管理的新方法中可具有实用性的基因表达谱。这些方法也起到识别新基因和注释与该疾病或病症无关的迄今未知功能的基因的作用。因此,需要识别和表征可用于开发用于诊断和治疗自身免疫疾病(诸如UC和克隆氏病)以及其他疾病和病症的方法、以及预测患者如何响应治疗干预的方法的新的基因标记物。
[0004] 基因表达可以若干不同的方式(包括通过使用siRNA、shRNA、反义分子和DNA酶)来调节。SiRNA和shRNA两者均通过RNAi途径起作用,并且已成功用于抑制基因表达。Fire和Mello首先在蠕虫中发现RNAi,并首先在植物中报道基因沉默现象与dsRNA有关,该现象被认为是植物细胞与RNA病毒感染作斗争的一种方式。在此途径中,长的dsRNA病毒产物被DICER样酶加工成21-25bp长度的较小片段,然后该双链分子解链并被加载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。已识别了哺乳动物细胞中的类似途径,其中的显著差异是dsRNA分子的长度必须小于30bp,以便避免诱导所谓的干扰素响应,干扰素响应不具有基因特异性并且导致细胞内蛋白合成的全面停止。
[0005] 合成siRNA已被成功设计成选择性靶向单个基因,并且可被体外或体内递送到细胞。ShRNA是siRNA分子的DNA当量,具有被合并到细胞基因组中的优点,并且在每个有丝分裂周期过程中在细胞基因组中被复制。
[0006] DNA酶也已用来调节基因表达。DNA酶是穿过单链RNA的催化性DNA分子。它们对于RNA靶序列是高度选择性的,因此可通过靶向信使RNA来下调特定基因。
[0007] 因此,需要识别和表征可用于开发用于诊断和治疗自身免疫疾病(诸如UC和克隆氏病)以及其他疾病和病症的方法的新的基因标记物。

发明内容

[0008] 本发明涉及诊断和/或治疗UC和/或相关疾病或病症的方法,以及预测用于治疗的候选试剂适用性的方法。本发明包括基因群组(一组是20个基因,一组是5个基因)的发现,该基因群组在响应用于UC治疗的患者体内(在减轻UC症状过程中有效)相对于不响应治疗的患者具有改进的表达平。改进的表达水平构成了表达谱,该表达谱可起到预测患者对治疗的响应性的生物标记谱的作用。
[0009] 在具体实施例中,本发明包括预测用于UC治疗的适用性的方法,该方法根据构成该谱图的20个基因中的一者或多者在治疗之前的基因表达模式。这些基因中的一者或多者可能来自某类基因,诸如防御响应、免疫响应、信号转导和病原体响应中涉及的那些,如下文和图1等等所示。在典型实施例中,该细胞样本表达至少两个表达谱基因。该表达谱基因可能示出增加或减少。
[0010] 另外,本发明包括通过评估20基因群组或5基因群组中的一个或多个基因的表达谱来识别受试者的方法,该受试者患有UC和/或相关疾病或病症,是用特定治疗剂治疗的候选者。
[0011] 在一个实施例中,将UC相关基因谱用于建立基于阵列的、用于预后或诊断目的的方法,该方法包括:
[0012] (a)从得自患者的标本制备核酸的代表性混合物,并且导致用可检测标记物标记混合物中的所述样本核酸;
[0013] (b)将样本与包含多个核酸片段的阵列接触,其中每一个核酸片段被固定到基底表面上的离散和已知的地址,其中UC相关生物标记群组被识别为由地址限定的阵列特征物,该阵列还包含在该基底上的已知地址处的至少一个校正核酸,并且接触操作在样本核酸可以特异性结合到固定在阵列上的核酸片段的条件下进行。
[0014] (c)对来自接受治疗的患者的所有试验样本与参考标准进行统计比较;以及[0015] (d)将试验样本的特征物的强度改变模式与作为UC相关基因谱图成员的那些特征物的强度改变模式相比较,其中历史模式的样本取自对抗TNF抗体治疗有响应的患者。
[0016] 任选地,对基因群组的成员的水平变化进行统计分析,以评估这些变化的显著性以及识别哪些成员为该基因群组的有意义成员。
[0017] 在可供选择的实施例中,本发明包括试剂盒,该试剂盒用于根据基因表达模式来预测候选试剂用于治疗UC和/或相关疾病或病症的适用性。
[0018] 本发明还提供本文所述的任何发明。附图说明
[0019] 图1示出用于基因群组成员的生物过程分布。
[0020] 图2以点图表示法示出5探针组分类器的英夫利昔单抗响应者/非响应者表达谱,从而将英夫利昔单抗响应者(R)与非响应者(NR)相比较。图中示出了每一个样本的归一化强度(黑圈)。针对5个基因中的每一个的每一个响应者和非响应者群体,图中也示出了中值强度、第75百分率和第25百分率以及最小值和最大值。

具体实施方式

[0021] 定义
[0022] 示出以下定义,以说明和限定用于描述本发明的多个术语的含义和范围。
[0023] 多肽的“活性”、“生物活性”和“功能活性”是指UC相关基因群组中的基因响应其与另一蛋白或分子的特异性相互作用而发挥的活性,如根据标准技术在体内、原位或体外所测定的那样。这种活性可为直接的活性(诸如与第二蛋白缔合或对第二蛋白的酶活性),或间接活性(诸如通过该蛋白与第二蛋白的相互作用或通过如细胞内信号传导或凝血级联中的一系列相互作用介导的细胞过程)。
[0024] “抗体”包括任何含有这样的分子的多肽或肽,该分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分,诸如(但不限于)重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、骨架区或它们的任何部分、片段或变体。术语“抗体”还旨在涵盖抗体、其消化片段、特定部分或变体,包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分,包括单链抗体及其片段。例如,抗体片段包括(但不限于)Fab片段(如通过木瓜蛋白酶消化得到)、Fab’片段(如通过胃蛋白酶消化和部分还原得到)和F(ab’)2片段(如通过胃蛋白酶消化得到)、facb片段(如通过纤溶酶消化得到)、pFc’片段(如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化得到)、Fd片段(如通过胃蛋白酶消化、部分还原以及重聚集得到)、Fv或scFv片段(如通过分子生物学技术得到),并且单域抗体(如VH或VL)由本发明涵盖(参见如Colligan等人(编辑),CurrentProtocolsin Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994-2001);Colligan 等 人,Current Protocols in Polypeptide Science,John Wiley & Sons,NY(1997-2001))。
[0025] 如本文所用,术语“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”是指包括多个固定的靶元件的制品或装置,每一个靶元件包括“克隆”、“特征物”、“点”或包含特定组合物的限定区域,诸如固定至固体表面的生物分子(如核酸分子或多肽),如下文将更详细讨论的那样。
[0026] 本发明核酸序列的“补体”或其“互补”是指与第一多核苷酸相比具有互补破基序列和反向取向的多核苷酸分子。
[0027] 如本领域已知的,“同一性”是介于两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系,如通过比较该序列所确定的那样。在本领域中,“同一性”也意指介于多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性,如通过介于这些序列的字符串之间的匹配所确定的那样。“同一性”和“相似性”可易于通过已知的方法计算,包括(但不限于)以下文献中描述的方法:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.(编辑),OxfordUniversity Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.(编辑),Academic Press,New York,1993;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M. 和 Griffin,H.G.( 编 辑 ),Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987;以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.(编辑),M Stockton Press,New York,1991;以及Carillo,H.和Lipman,D.,Siam J.Applied Math,48:1073(1988)。另外,同一性百分比的数值可从用Vector NTI Suite 8.0(Informax,Frederick,MD)的AlignX组件的缺省设置生成的基酸和核苷酸序列对比获得。
[0028] 如本文所用,术语“与...特异性杂交”、“与...特异性杂的”、“特异性杂交”和“与...选择性杂交”是指在严格条件下核酸分子优先与特定核苷酸序列结合、形成双链或杂交。术语“严格条件”是指在探针将优先杂交于其靶序列、和更小量值、或根本不杂交于其他序列的条件。在核酸杂交的背景中(如在阵列杂交、Southern杂交或Northern杂交中),“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是依赖于序列的,并在不同的环境参数下是不同的。以下详细描述了可用来实施本发明的可供选择的杂交条件。在可供选择的方面,在温和条件、严格条件和甚严格条件下进行杂交和/或洗涤,如以下更详细所述的那样。可供选择的洗涤条件也用于不同的方面,如本文更详细所述的那样。
[0029] 如本文所用,短语“标记的生物分子”或“用可检测组合物标记的”或“用可检测部分标记的”是指含有可检测组合物(即标签)的生物分子(如核酸),如下文详细所述的那样。标签也可为另一个生物分子,就核酸而言,如作为“分子信标”的茎环结构形式的核酸,如下文所述。这包括通过(如)切口平移、随机引物延伸、用简并引物扩增等等方法,将标记的基(或可结合到可检测标签的碱基)合并到核酸中。可使用任何标签,如化学发光标签、放射标签、酶标签等等。可通过任何手段检测标签,如目视检测、光谱检测、光化学检测、生物化学检测、免疫化学检测、物理检测、化学检测和/或化学发光检测。本发明可使用包含具有可检测标签的固定核酸的阵列。
[0030] 如本文所用,术语“核酸”是指单链或双链形式的脱核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸。术语“核酸”可与基因、DNA、RNA、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探针和扩增产物互换使用。该术语也涵盖DNA主链类似物,诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3′-硫缩、亚甲基(甲基亚氨基)、3′-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)。
[0031] 如本文所用,术语“样本”或“核酸样本”是指含有DNA或RNA的样本、或代表从天然源分离的DNA或RNA的核酸。“核酸样本”为适用于与另一核酸(如固定探针)杂交的形式(如可溶性水溶液形式)。样本核酸可以从特定的细胞或组织分离、克隆、或提取。由其制备核酸样本的细胞或组织样本通常取自患有或疑似患有UC或相关疾病或病症的患者。分离细胞和组织样本的方法为本领域的技术人员所熟知,并且包括(但不限于)抽吸、组织切片、穿刺活检等等。很多情况下,样本为“临床样本”,其衍生自患者的样本,包括组织切片,诸如取自用于组织学目的的冷冻切片或石蜡切片。样本也可衍生自(细胞的)上清液或取自患者或取自细胞培养物的细胞本身、取自组织培养的细胞以及其中期望检测对候选药物的响应可为可取的其他介质。在一些情况下,可以用标准技术(诸如PCR)在杂交前扩增核酸。探针可由来自以下一个或多个特定(预选的)部分的核酸源制备并可共同代表来自以下一个或多个特定(预选)部分的核酸源:如聚合酶链式反应(PCR)扩增产物集合、基本上整条染色体或染色体片段、或基本上整个基因组,如为克隆(如BAC、PAC、YAC等等)的集合形式(参见下文)。
[0032] “核酸”为核苷酸的聚合物,其中核苷酸包含连接到糖的碱基,糖继而通过调解的至少二价的分子(诸如磷酸)彼此连接。天然存在的核酸中,糖为2′-脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)。非天然多核苷酸或寡核苷酸含有改性的碱基、糖或连接分子,但通常认为根据天然存在的核酸而设计的非天然多核苷酸或寡核苷酸模拟了天然存在的核酸的互补性。非天然寡核苷酸的实例为具有硫代磷酸酯主链的反义分子组合物。“寡核苷酸”通常是指具有少于30个核苷酸的核酸分子。
[0033] 术语“谱”意指模式并与多个特征的变化量级和方向有关。可对谱进行严格地解释,即其中谱中显示特性的特征的量级和/或数量的变化基本上类似于参考谱,或其可以不太严格地解释,例如,通过要求趋势而不要求特征特性全部或子集的绝对匹配。
[0034] 术语“蛋白”、“多肽”、和“肽”包括“类似物”、或“保守变体”和“模拟体”或“拟肽”,其具有的结构和活性大致对应于该变体从其衍生的多肽,如上文详细所述的那样。
[0035] “多肽”为通过肽键接合的氨基酸残基的聚合物,肽通常是指含有12个或更少残基的氨基酸聚合物。肽键可通过核酸模板导向而天然产生或用本领域熟知的方法合成而产生。
[0036] “蛋白”为包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白还可以包含附接到不参与肽键形成的氨基酸侧基的取代基。通常,通过真核细胞表达形成的蛋白也含有水化合物。本文蛋白是按其氨基酸序列或主链来限定,而且无论是否已知都不指定取代基。
[0037] 术语“受体”代表(如)细胞中由于与特定配体或结合配偶体相互作用而能影响生物活性的分子。细胞膜结合的受体通过细胞外配体结合域、一个或多个跨膜或穿膜域以及通常涉及信号转导的细胞内效应域来表征。配体结合至细胞膜受体引起细胞外域的变化,该变化在整个细胞膜上传递,与一个或多个细胞内蛋白直接或间接地相互作用,并改变细胞的特性,诸如酶活性、细胞形状、或基因表达谱。受体也可以被解开到细胞表面,并可以是胞质受体、核受体、或完全从细胞释放。非细胞相关受体称为可溶性受体或配体。
[0038] 无论是否相应地明确指出,本文引用的所有出版物或专利的全文均以引用方式并入本文中,因为它们示出本发明时的技术水平和/或提供了本发明的描述和使本发明得以实现。出版物是指任何科学出版物或专利公布、或可以任何媒体格式获得的任何其他信息,该媒体格式包括所有记录格式、电子格式或印刷格式。下列参考文献以引用方式全文并入本文中:Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1987-2001);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,NY(1989);Harlow和Lane,antibodies,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989);Colligan等人(编辑),Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994-2001);Colligan 等 人,Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(1997-2001)。
[0039] 基因群组识别和验证
[0040] 本发明提供用于筛选调节UC症状(尤其是直肠粘膜层和全部或部分结肠)的组合物的新型方法。如本文所用,所谓“UC”或语法当量意指由痢疾、直肠出血、里急后重、排粘液、和腹部痉挛痛表示的疾病状态或病症。
[0041] 在一个方面,在需要诊断信息的不同患者样本中确定基因表达水平,从而得到表达谱。特定样本的表达谱基本上是样本状态的“指纹”;虽然两种状态可能具有任何相似表达的特定基因,但同时评估大量基因允许生成患者样本状态所特有的基因表达谱。也就是说,可以将正常组织与损害组织区分开,并将取自经治疗患者的组织与取自未经治疗患者的组织区分开。通过比较在已知不同疾病状态下的组织的表达谱,在这些状态的每一种中获得关于哪个基因是重要的(包括基因的上调和下调两者)信息。
[0042] 在疾病组织差异表达的序列(基因)的识别允许以多种方式使用该信息。例如,可以对具体治疗方案进行评价。
[0043] 这可以通过制备包含重要疾病基因组的生物芯片来完成,该生物芯片随后可用于这些筛选。也可在蛋白基础上进行这些方法,也就是说,可对UC相关基因产物蛋白的蛋白表达水平进行评估,以用于诊断目的或筛选候选试剂。另外,在治疗前,可用包含UC相关基因谱的核酸序列测量患者是否有可能响应治疗。
[0044] UC相关基因序列可包括核酸和氨基酸序列两者。在一个优选的实施例中,UC相关基因序列是重组核酸。本文中所谓术语“重组核酸”意指通常通过聚合酶和核酸内切酶操纵核酸而最初形成于体外且为一般不存在于自然界中的形式的核酸。因此,就本发明的目的而言,分离的核酸(以线性形式)或通过连接通常不接合的DNA分子而形成于体外的表达载体两者均视为重组的。应当理解,一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞或生物体中,就可以非重组方式复制,即,使用宿主细胞的体内细胞机器而非体外操纵来复制;然而,就本发明的目的而言,此类核酸一旦被重组产生,即使随后会以非重组方式复制,就仍然视为重组的。
[0045] 实施本发明的方法
[0046] 本发明提供了基于计算机、阵列的方法,这些方法依赖两份或更多份样本中的结合分子(如核酸序列)的相对量。也提供了计算机实现的方法,以用于确定两份或更多份样本中的结合分子(如核酸序列)的相对量,并使用确定的相对结合量来预测对具体疗法的响应性,以及监测和增强治疗处理。
[0047] 在实施本发明的方法时,将两份或更多份标记生物分子(如核酸)的样本施加至两个或更多个阵列,其中阵列具有大致相同的固定结合分子补体(如能与标记的样本核酸杂交的固定核酸)。该两个或更多个阵列通常为相同阵列的多个复本。然而,因为阵列上的每一个“点”、“克隆”或“特征物”具有类似的生物分子(如相同序列的核酸)并且每一个点中的生物分子(如核酸)是已知的(这是核酸和其他阵列的典型特征),用于本发明的多个阵列在构造上不必相同,只需要每一个特征物在基底上的位置是已知的,即具有地址。因此,在一个方面,样本中的多个生物分子(如核酸)与阵列比较地结合(如同时杂交)并且收集的信息被编码,以使得结果是基于特征物(如核酸序列)的内在特性而不是基于其在基底上的位置。
[0048] 核酸的扩增
[0049] 可将采用寡核苷酸引物的扩增用于生成在本发明组合物和方法中使用的核酸,以检测或测量杂交至阵列的试验样本或对照样本的水平等等。技术人员可选择和设计合适的寡核苷酸扩增引物。扩增方法在本领域中也是熟知的,并且包括(如)聚合酶链反应(PCR)(PCR PROTOCOLS,A GUIDE TOMETHODS AND APPLICATIONS(编辑),Innis,Academic Press,N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995)(编辑),Innis,Academic Press,Inc.,N.Y.);连接酶链式反应(LCR)(参见(如)Wu(1989)Genomics 4:560;Landegren(1988)Science241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117);转录扩增(参见(如)Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173);以及自主序列复制(参见(如)Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874);Qβ复制酶扩增(参见(如)Smith(1997)J.Clin.Microbiol,35:
1477-1491)、自动Qβ复制酶扩增测定法(参见(如)Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10:
257-271)和其他RNA聚合酶介导的技术(如NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario);
还可参见Berger(1987)Methods Enzymol,152:307-316;Sambrook;Ausubel;美国专利No.4,683,195和No.4,683,202;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:563-564。
[0050] 核酸杂交
[0051] 在实施本发明的方法时,使核酸的试验样本和对照样本与(如)阵列上的固定探针核酸杂交。在可供选择的方面,在温和条件、严格条件和甚严格条件下进行杂交和/或洗涤。核酸杂交的详尽指南存在于(如)SambrookAusubel,Tijssen中。通常,对于在限定的离子强度和pH下的特定序列,将高度严格杂交和洗涤条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。Tm为50%的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。
对于特定的探针,将甚严格条件选择为等于Tm。用于互补核酸(在阵列上或Southern印迹或Northern印迹中的滤膜上具有不止100个互补残基)杂交的严格杂交条件的实例为在42℃下使用标准杂交溶液(参见(如)Sambrook)进行过夜杂交。高度严格洗涤条件
的实例为在72℃下用0.15M的NaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例为在65℃下用
0.2×SSC洗涤15分钟(参见(如)Sambrook)。通常,在高严格性洗涤之前用中严格性或低严格性洗涤移除背景探针信号。对于(如)不止100个核苷酸的双链,中严格性洗涤的实例为在45℃下使用1×SSC洗涤15分钟。对于(如)不止100个核苷酸的双链,低严格
性洗涤的实例为在40℃下使用4×至6×SSC洗涤15分钟。
[0052] 在本发明的组合物和方法的可供选择的方面,如在实施对比核酸杂交,诸如用阵列进行的对比基因组杂交(CGH)时,将荧光染料 和 用来差异标记来自两份样本的核酸片段,如阵列固定的核酸相对于样本核酸,或从对照细胞或组织得到的核酸相对于从测试细胞或组织得到的核酸。许多商业器械被设计成适应这两种染料的检测。为了增加或氟或其他氧化敏感性化合物的稳定性,可在杂交混合物、杂交溶液和/或洗涤溶液中使用抗氧化剂和自由基清除剂。因此, 信号显著增加,并且杂交时间可能更长。参见WO 0194630A2和美国专利申请No.20020006622。
[0053] 为了进一步增加杂交灵敏度,可在受控的不饱和湿度环境下进行杂交;因此,当湿度不饱和时,杂交效率得到显著改善。参见WO 0194630A2和美国专利申请
No.20020006622。如果湿度受到动态控制(即,如果杂交期间湿度发生变化),则杂交效率可得到改善。在动态平衡的湿度环境下,将有助于质量传递。可逐步或连续地调节杂交环境中的湿度。可使用包括壳体和控制器的阵列装置,该壳体和控制器允许操作者控制预杂交、杂交、洗涤和/或检测阶段的湿度。该装置可具有检测、控制和存储元件,以允许对湿度和温度控制(其为恒定和精确的或为波动的)、以及对整个程序循环期间(包括预杂交、杂交、洗涤和检测步骤)的其他参数进行预先编程。参见WO 0194630A2和美国专利申请No.20020006622。
[0054] 本发明的方法可包括具有渗透波动的杂交条件。也可通过包括变化的高张度/低张度(如溶质梯度)的杂交环境来提高杂交效率(即达到平衡的时间)。在装置中建立溶质梯度。例如,将低盐杂交溶液置于阵列杂交室的一侧,而将较高浓度的盐缓冲液置于另一侧,以在室中生成溶质梯度。参见WO 0194630A2和美国专利申请No.20020006622。
[0055] 阻断重复核酸序列的杂交能力
[0056] 本发明的方法可包括阻断重复核酸序列在固定核酸片段中的杂交能力(即,阻断“杂交能力”)的步骤。可通过将样本核酸序列与未标记的或作为另外一种选择标记的重复核酸序列混合而阻断样本核酸序列中重复核酸序列的杂交能力。可将样本核酸序列在与阵列固定的核酸片段接触的步骤之前与重复核酸序列混合。阻断序列为(例如)Cot-1DNA、鲑鱼精DNA、或特异性的重复基因组序列。重复核酸序列可为未标记的。用于使用(如)Cot-1移除和/或消除重复序列的杂交能力的多种方法是已知的;参见(如)Craig(1997)Hum.Genet,100:472-476;WO 93/18186。使用磁性纯化和亲和力PCR可从文库探针中移除重复DNA序列,参见(如)Rauch(2000)J.Biochem.Biophys.Methods 44:59-72。
[0057] 阵列一般为固定到板表面上的如限定为“点”或“簇”、或“特征物”的多个靶元件,其中每一个靶元件包含一个或多个固定到固体表面的生物分子(如核酸或多肽),以用于特异性结合(杂交)至样本中的分子。固定核酸可含有来自特异性消息(如cDNA文库)或基因(如基因组文库)的序列,包括人基因组的序列。其他靶元件可含有参考序列等等。
阵列的生物分子可以以不同的大小和不同的密度排列在固体表面上。生物分子在簇中的密度和簇在阵列上的数量取决于多种因素,诸如标签的性质、固体载体、基底表面的疏水性程度等等。每一个特征物可以包含大致相同的生物分子(如核酸)、或生物分子的混合物(如不同长度和/或序列的核酸)。因此,例如,特征物可以含有不止一个DNA克隆片段的复本,并且每一个复本可以断裂成不同长度的片段。
[0058] 其上固定有生物分子(如核酸)的阵列基底表面可包括硝化纤维、玻璃、石英、熔融二氧化、塑料等等,如下文进一步讨论的那样。本发明的组合物和方法可合并阵列的全部或部分设计、以及相关组分和方法,如在美国专利No.6,344,316、No.6,197,503、No.6,174,684、No.6,159,685、No.6,156,501、No.6,093,370、
No.6,087,112、No.6,087,103、No.6,087,102、No.6,083,697、No.6,080,585、
No.6,054,270、No.6,048,695、No.6,045,996、No.6,022,963、No.6,013,440、
No.5,959,098、No.5,856,174、No.5,843,655、No.5,837,832、No.5,770,456、
No.5,723,320、No.5,700,637、No.5,695,940、No.5,556,752、No.5,143,854中所述;还可参见(如)WO 99/51773、WO99/09217、WO 97/46313、WO 96/17958、WO 89/10977;还可参 见 ( 如 )Johnston(1998)Curr.Biol.8:R171-174;Schummer(1997)Biotechniques23:
1087-1092;Kern(1997)Biotechniques 23:120-124;Solinas-Toldo(1997)Genes,Chromosomes&Cancer 20:399-407;Bowtell(1999)Nature GeneticsSupp.21:25-32;
Epstein(2000)Current Opinion in Biotech.11:36-41;Mendoza(1999Biotechniques
27:778-788;Lueking(1999)Anal.Biochem.270:103-111;Davies(1999)Biotechniques
27:1258-1261。
[0059] 基底表面
[0060] 可在本发明组合物和方法中使用的基底表面包括(例如)玻璃(参见(如)美国专利No.5,843,767)、陶瓷、和石英。阵列可具有刚性、半刚性或挠性材料的基底表面。基底表面可为平坦的或平面的,成形为深凹、凸起区域、蚀刻沟槽、孔、小珠、细丝等。基底表面也可包括多种材料,诸如硝化纤维、纸张、晶体基底(如砷化镓)、金属、准金属,聚丙烯酰吗啉、多种塑料和塑料共聚物、 聚乙烯、聚丙烯、乳胶、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、人造丝、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、和乙酸纤维素。可以对基底进行涂覆,可以使基底和涂层官能化,以(如)允许能够结合到胺。
[0061] 包含校正序列的阵列
[0062] 本发明设想使用包含固定校正序列的阵列以用于使基于阵列的杂交反应的结果归一化,以及用于采用这些校正序列的方法,如,以确定校正序列的复本数,以“归一化”或“校正”比率分布。该校正序列可与阵列上固定核酸序列中的独特序列大致相同。例如,来自阵列上每一个“点”或“生物位点”的“标记物”序列(其仅位于该点上,从而使其成为用于该点的“标记物”)用一个或多个“对照点”或“校正点”上的对应序列表示。
[0063] “对照点”或“校正点”用于“归一化”,从而得到可靠并且可重复的信息。对照点可提供一致的结果,而与杂交到阵列的标记样本(或来自样本的标记结合分子)无关。对照点可用来生成“归一化”或“校正”曲线,以补偿本发明的基于计算机的、基于阵列的方法中使用的介于两个(或更多个)阵列之间的可能的强度误差。
[0064] 在阵列上生成对照物的一个方法应当为使用所有生物分子(如核酸序列)的等摩尔混合物点缀在阵列上并生成单一的点。该单一的点应当具有来自阵列上所有其他点的等量的生物分子(如核酸序列)。通过改变该等摩尔混合物的浓度可生成多个对照点。
[0065] 样本和标本
[0066] 样本核酸可以从特定的细胞、组织、或其他标本中分离、克隆、或提取。由其制备核酸样本的细胞或组织样本通常取自患有或疑似患有UC或相关病症的患者。分离细胞和组织样本的方法为本领域的技术人员所熟知,并且包括(但不限于)抽吸、组织切片、穿刺活检等等。很多情况下,样本会是“临床样本”,其衍生自患者的样本,包括全血、或组织切片,诸如取自用于组织学目的的冻切片或石蜡切片。样本也可衍生自(细胞的)上清液或取自患者或取自细胞培养物的细胞本身、取自组织培养的细胞以及其中期望检测对候选药物的响应可为可取的其他介质。在一些情况下,可以用标准技术(诸如PCR)在杂交前扩增核酸。
[0067] 在一个实施例中,本发明为预测疾病消退或治愈的治疗前方法。该方法包括:(1)从诊断患有UC或相关疾病或病症的个体取结肠组织活检或其他标本;(2)测量基因群组中的表达谱基因的表达水平;(3)将基因的预治疗表达水平与来自治疗响应者的预治疗参考谱进行比较;以及(4)通过监测基因群组的表达水平来预测治疗响应。
[0068] 评估生物标记实用性的方法
[0069] 用于评估患者对治疗的响应或疾病预后的本发明生物标记基因群组的预后实用性可通过使用用于评估患者疾病状态的其他方法来验证。例如,可以通过某种成像方法(诸如(但不限于):通过摄影、放射性测量、或磁力共振技术成像)来评估和记录疾病的总量度。健康或疾病的综合指标还包括血清或血液组成(蛋白、肝酶、pH、电解质、红细胞容积、血细胞比容、血红蛋白、或特异性蛋白)。然而,在一些疾病中,病原学仍然知之甚少。UC是这一种疾病的实例。
[0070] 患者评估和监测
[0071] 此基因群组中的一些属于据此前报道在UC患者异常表达的基因类别,诸如转录因子、复制蛋白和氧化酶,在UC治疗中还没有研究整个治疗过程中的基因表达模式,并且没有识别任何基因表达模式具有预测价值。本文所公开的基因表达生物标记群组允许生成用于快速可靠预测的方法、预测UC试验的临床效果的诊断工具、或用于跟踪UC治疗功效的预后工具。提供基于检测样本中这些基因的预后方法。例如,可以将这些组合物与一系列免疫介导的炎性疾病的诊断、预防和治疗结合使用。
[0072] 治疗剂
[0073] 拮抗剂
[0074] 如本文所用,术语“拮抗剂”是指这样的物质,该物质抑制或中和本发明的UC相关基因群组的基因产物的生物活性。此类拮抗剂以多种方式实现此效果。一类拮抗剂会以足够的亲和力和特异性与基因产物蛋白结合,以中和该蛋白的生物效应。包括在这类分子中的是抗体和抗体片段(诸如(例如)F(ab)或F(ab’)2分子)。另一类拮抗剂包括基因产物蛋白的片段、突变蛋白或小有机分子(即拟肽),此类拮抗剂会结合至基因产物的同源结合配偶体或配体,从而抑制基因产物与其同源配体或受体的特异性相互作用的生物活性。UC相关基因拮抗剂可以是这些类别中的任何者,只要其为抑制该基因产物的至少一种生物活性的物质。
[0075] 拮抗剂包括涉及基因产物蛋白或其片段的一个或多个区域的抗体、涉及同源配体或受体的抗体、以及抑制基因产物的至少一种生物活性的基因产物的部分肽或其同源配体。另一类拮抗剂包括如本领域已知的本文所公开的靶向基因序列的siRNA、shRNA、反义分子和DNA酶。
[0076] 合适的抗体包括与阻碍UC相关基因产物激活或防止UC相关基因产物结合到其同源配体、或阻止UC相关基因产物信号转导的单克隆抗体竞争以用于结合到UC相关基因产物上的那些。
[0077] 靶向UC相关基因产物诱导剂的治疗剂可以提供更好的成功机会。基因表达可以若干不同的方式、包括通过使用siRNA、shRNA、反义分子和DNA酶来调节。可将合成的siRNA、shRNA、和DNA酶设计成特异性地靶向一种或多种基因并且它们可易于递送到体外或体内的细胞。
[0078] 本发明涵盖反义核酸分子,即与编码UC相关基因产物多肽的有义核酸互补的分子,如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。因此,反义核酸可氢键结合到有义核酸。反义核酸可与整个编码链互补、或仅与其一部分互补,如与蛋白编码区(或开放读框)的全部或部分互补。反义核酸分子对核酸序列编码链非编码区的全部或部分可为反义,其中核酸序列对UC相关基因产物多肽进行编码。非编码区(“5′和3′未翻译区”)为在编码区的侧面的5′和3′序列,并且未翻译成氨基酸。
[0079] 本发明也提供嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所用,“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括有效连接至异源多肽(即除相同的UC相关基因产物多肽之外的多肽)的UC相关基因产物多肽的全部或部分(优选生物活性的)。在融合蛋白中,术语“有效连接”旨在指示UC相关基因产物多肽与异源多肽彼此框内熔融。异源多肽可融合至UC相关基因产物多肽的氨基末端或羧基末端。在另一个实施例中,UC相关基因产物多肽或其域或活性片段可与异源蛋白序列或其片段融合,以形成嵌合蛋白,其中多肽、域或片段不是端到端地融合,而是介入异源蛋白骨架内。
[0080] 在另一个实施例中,融合蛋白为免疫球蛋白融合蛋白,其中UC相关基因产物多肽的全部或部分融合至衍生自免疫球蛋白家族成员的序列。可将本发明的免疫球蛋白融合蛋白掺入药物组合物中并给药到受试者,以抑制介于配体(可溶或膜结合的)和细胞表面上的蛋白(受体)之间的相互作用,从而抑制体内的信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可用来影响UC相关基因产物多肽的同源配体的生物利用率。抑制配体/受体相互作用在治疗学上可为有效的,既可用于治疗增殖性和分化性疾病,又可用于调节(如促进或抑制)细胞存活。免疫球蛋白嵌合蛋白的优选实施例是CH1域被删除的免疫球蛋白或具有介入改性的骨TM架区内的活性多肽片段的MIMETIBODY 构造,如在共同未决的专利申请PCT WO/04002417中所提出的那样。此外,本发明的免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原,以产生针对受试者中的UC相关基因产物多肽的抗体,以纯化配体,并且在筛选测定法中使用,以识别抑制受体与配体相互作用的分子。
[0081] 组合物及其用途
[0082] 根据本发明,中和抗UC相关基因产物的拮抗剂(诸如本文所述的单克隆抗体)可用来抑制UC相关基因产物的活性。另外,此类拮抗剂可用来抑制适合此类治疗的UC和UC相关炎性疾病(包括(但不限于)湿性疾病)的发病。待治疗的个体可以是任何哺乳动物并且优选为灵长类,属于哺乳动物的伴侣动物,并且最优选为人类患者。所施用的拮抗剂的量根据其使用目的和施用方法而变化。
[0083] UC相关基因拮抗剂可以通过在需要预防或终止病理活性的组织中导致效果的多种方法来施用。此外,抗UC相关基因产物的拮抗剂不必局部存在,以对UC相关基因产物活性赋予效果,因此,可以将它们给药到实现触及含有UC相关基因产物的体腔或流体的任何部位。就发炎的、恶性的、或者说是失能的组织而言,这些方法可以包括直接施用含有该拮抗剂的制剂。这类方法包括液体组合物的静脉注射给药、液体或固体制剂透皮给药、口服、局部给药、或空隙给药或术间给药。给药可能受其主要功能可能不是作为药物递送媒介物的装置的植入的影响。
[0084] 对于抗体,优选的剂量为约0.1mg/kg至100mg/kg体重(通常为约10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体是在脑中起作用,则约50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的。一般地,部分人抗体和全人抗体在人体内具有比其他抗体更长的半衰期。因此,使用较低剂量和较低频率的给药通常是可以的。可用修饰(诸如脂化)来稳定抗体以及提高摄取和组织渗透(如渗透到脑中)。Cruikshank等人描述了用于抗体脂化的方法((1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)。
[0085] 可将UC相关基因产物拮抗剂核酸分子插入载体中并用作基因疗法载体。基因疗法载体可通过(例如)静脉注射、局部给药(美国专利No.5,328,470)、或通过立体定位注射(参见(如)Chen等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057)递送到受试者。基因疗法载体的医药制备可包括可接受稀释剂中的基因疗法载体、或可包含其中嵌入了基因递送媒介物的缓释基质。作为另外一种选择,凡是整个基因递送载体可从重组细胞未受损地制备的,如逆转录病毒载体,则该医药制备可包括产生该基因递送体系的一个或多个细胞。
[0086] 药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
[0087] 药物遗传学
[0088] 可将通过本文所述筛选测定法识别的对UC相关基因产物多肽的活性或表达具有刺激或抑制效应的试剂或调节剂给药到个体,以(预防性地或治疗性地)处理与该多肽的异常活性相关的疾病。结合这样的治疗,可以考虑个体的药物遗传学(即,研究介于个体的基因型和该个体对外来化合物或药物的响应之间的关系)。治疗剂代谢的差异可通过改变介于药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系导致严重毒性或治疗失效。因此,基于个体基因型的考虑,个体的药物遗传学允许选择有效的试剂(如药物),以用于预防性或治疗性治疗。这种药物遗传学还可用来确定适当的剂量和治疗方案。因此,可确定个体内UC相关基因产物多肽的活性、UC相关基因产物核酸的表达、或UC相关基因产物基因的突变量,从而选择适当的试剂,以用于个体的治疗性或预防性治疗。
[0089] 由于患者中改变的药物处置和异常行为,药物遗传学研究对药物响应的临床上显著的遗传变异。参见(如)Linder(1997)Clin.Chem.43(2):254-266。通常,可区分两类药物遗传学病症。以改变药物对人体作用方式的单个因子传递的遗传病症被称为“改变的药物作用”。以改变人体对药物作用方式的单个因子传递的遗传病症被称为“改变的药物代谢”。这些药物遗传学病症可以罕见的缺陷或以多态性形式发生。例如,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传性酶病,其主要的临床并发症为摄取氧化剂药物(抗疟疾药物、磺胺类药物、止痛药、硝基呋喃类药物)和食用蚕豆后出现的溶血。
[0090] 作为示例性实施例,药物代谢酶的活性为药物作用的强度和持续时间两者的主要决定因素。就为什么一些患者在服用标准和安全剂量的药物后不能获得预期药物效应或表现出过度的药物反应和严重毒性,药物代谢酶(如N-乙酰基转移酶2(NAT 2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现对此作出了解释。这些多态性在群体中以两种显型表达:强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM在不同群体当中的患病率是不同的。例如,用于CYP2D6的基因编码是高度多态性的,并且在PM中识别了若干突变,该突变都导致功能性CYP2D6的缺失。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者在接受标准剂量时通常经历过度的药物反应和副作用。如果代谢物为活性治疗部分,则PM将不显示治疗响应,如通过其CYP2D6形成的代谢物吗啡所介导的可待因的镇痛作用所证实的那样。其他极端情况为所谓的对标准剂量无响应的超快代谢者。最近,已识别超快代谢的分子基础是由于CYP2D6基因的扩增。
[0091] 因此,可确定个体内UC相关基因产物多肽的活性、编码多肽的核酸的表达、或编码多肽的基因的突变含量,从而选择适合用于该个体的治疗性或预防性治疗的药剂。此外,可利用药物遗传学研究,将编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因型应用于识别个体的药物响应显型。在应用于剂量或药物选择时,该知识可避免在使用多肽活性或表达的调节剂(例如通过本文所述的示例性筛选测定法之一所识别的调节剂)治疗受试者时发生不良反应或治疗失效,从而提高治疗或预防效率。
[0092] 治疗方法
[0093] 本发明提供治疗有患这样一种疾病的风险(或易患该疾病)或患有该疾病的受试者的预防和治疗方法两者,该疾病与UC相关基因产物多肽的异常表达或活性相关和/或其中涉及了UC相关基因产物多肽。
[0094] 如本领域所知或如本文所述,本发明提供用于在细胞、组织、器官、动物、或患者中使用至少一种UC相关基因产物的拮抗剂调节或治疗至少一种UC相关基因产物相关的疾病或病症的方法。
[0095] UC相关基因产物拮抗剂的组合物可以在UC或UC相关病症(诸如克隆氏病或其他肠胃疾病)的治疗中得到治疗应用。
[0096] 本发明也提供用于在细胞、组织、器官、动物、或患者中调节或治疗至少一种胃肠、免疫相关疾病的方法,该疾病包括(但不限于)胃溃疡、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、克隆氏病等等中的至少一者。参见(如)MerckManual,第12-17版,Merck&公司(Rahway,NJ)(1972,1977,1982,1987,1992,1999),Pharmacotherapy Handbook,Wells等人(编辑),第二版,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(1998,2000),各自全文以引用方式并入。
[0097] 以UC相关基因产物多肽的异常表达或活性来表征的疾病还描述于本公开的别处。
[0098] 1.预防方法
[0099] 在一个方面,本发明提供了这样的方法,该方法通过给受试者施用调节该多肽的表达或至少一种活性的试剂,用于在受试者中至少基本上预防与UC相关基因产物多肽的异常表达或活性相关的疾病或病症。可通过(例如)如本文所述的诊断或预防测定法中的任何者或两者的组合来识别由患UC相关基因产物的异常表达或活性引起或促成的疾病的风险的受试者。可在表现出该异常的特征性症状之前进行预防试剂的给药,使得疾病或病症得到预防、或其进展得到延缓。例如,可根据异常的类型使用激动剂或拮抗剂,以用于治疗受试者。可根据本文所述的筛选测定法来确定适当的试剂。
[0100] 2.治疗方法
[0101] 本发明的另一个方面属于用于治疗目的的调节UC相关基因或基因产物的表达或活性的方法。本发明的调节方法涉及使细胞与可调节多肽的活性中的一种或多种的试剂接触。调节活性的试剂可为如本文所述的试剂,诸如核酸或蛋白、多肽的天然存在的同源配体、肽、拟肽、或其他小分子。在一个实施例中,该试剂刺激多肽的生物活性中的一种或多种。在另一个实施例中,该试剂抑制UC相关基因或基因产物多肽的生物活性中的一种或多种。这种抑制剂的实例包括反义核酸分子和抗体以及本文所述的其他方法。这些调节方法可在体外(如通过用该试剂培养细胞)、或作为另外一种选择在体内(如通过将试剂给药到受试者)进行。因此,本发明提供治疗患有以UC相关基因产物多肽的异常表达或活性来表征的疾病或病症的个体的方法。在一个实施例中,该方法涉及施用调节(如上调或下调)表达或活性的试剂(如通过本文所述的筛选测定法识别的试剂)或试剂的组合。在其中活性或表达异常高或上调和/或其中减少的活性可能具有有益效果的情况下,对活性进行抑制是可取的。
[0102] 虽然已概括地描述了本发明,但还将在以下的实例中进一步公开本发明的实施例,该实例不应理解为限制本权利要求的范围。
[0103] 实例1:样本采集和分析患者
[0104] 从接受了5mg/kg或10mg/kg的英夫利昔单抗(IFX)的22名患者亚群分析在第0周获得的23个活检组织(11个活检组织来自10个非响应者,12个活检组织来自12个响应者;在两周内从相同受试者获得非响应者活检组织中的两个)。从预英夫利昔单抗活检组织中分离信使RNA,将其标记并杂交到Affymetrix HGU133Plus_2.0阵列。通过独立的数据集验证了该预测性响应标记。此前已详细描述过ACT1的试验设计(ClinTrials.gov IdentifierNCT00036439),包括患者合格准则、随机化和试验操作规程。
[0105] 在方案指定的时间点,从随机进行ACT1的患者子集中采集活检组织。根据Institutional Review Board(机构审查委员会)规定来采集所有活检组织。该机构审查委员会或伦理委员会在每一个临床试点处核准了该方案,并且所有患者都提供了知情同意书。
[0106] 在第8周确定响应。对英夫利昔单抗的响应被限定为完全粘膜治愈(即0或1的Mayo内窥镜评分)和针对UC的0或1级的组织学评分。尽管一些患者示出组织学的改善,但未实现粘膜治愈的患者均被认为是非响应者。下表1中示出了该队列的基线特性。
[0107] 肠活检标本和RNA制备
[0108] 在第0周进行内窥镜检查过程中,从距离肛外缘15厘米至20厘米处采集活检组织。在液氮中快速冷冻活检组织,并处理之前保存在-80℃下。使用RNeasy微型试剂盒,根据制造商说明书(Qiagen Inc.,Valencia,CA)分离总RNA。使用2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA)分析RNA的质量和数量。
[0109] 来自用英夫利昔单抗治疗的24位UC患者的活检组织的独立验证队列从University Hospital Gasthuisberg(Leuven Belgium)获得。在静脉注射5mg/kg英夫利昔单抗之前一周内获得活检组织。将活检组织在-80℃下冷冻,然后对其进行处理,以用于mRNA表达。用如上文限定的响应,在输注后4-6周确定对英夫利昔单抗的响应。使用与用于ACT1样本相同的方法处理Leuven队列样本,以用于mRNA分离和杂交。
[0110] 微阵列杂交
[0111] 在GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0阵列上,根据制造商的方案(Affymetrix,Santa Clara,CA)进行微阵列杂交。该芯片允许对不止47,000个转录物和变体、包括38,500个良好表征的人类基因进行表达水平分析。用GeneChip Scanner 3000扫描该芯片,并用GeneChip Operating Softwareversion 1.4(Affymetrix,Santa Clara,CA)获得阵列的每一个特征物的荧光强度。
[0112] 微阵列数据分析
[0113] 通过使用Partek Genomic Suite 6.3(Partek Inc.,St.Charles,MO)分析的杂交强度分布和Pearson的相关性来评价数据质量。Pearson相关系数在0.80至1.0的范围内。使用GeneSpringGX 7.3(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)对所有样本的探针组强度进行归一化。
[0114] 通过使用对log-2转化的归一化强度进行的方差分析(ANOVA)识别介于英夫利昔单抗非响应者与响应者样本之间的显著差异。5%的错误发现率(FDR)应用于多重测试修正。选择具有不止2倍差异表达的转录物,以用于有待分析的比较。要排除通过了ANOVA和倍数变化筛选但在配对比较的两种条件下都未检测到的探针组,只在代表该条件的样本当中选择被至少一次指定为“检出”(检测到)或“边缘的”(有限的检测)样本。
[0115] 分类预测分析
[0116] 使用GeneSpring GX 7.3的“K近邻”算法生成针对每一个患者样本的英夫利昔单抗响应性的分类。通过弃一法交叉验证评价包含转录物的分类器,该转录物在英夫利昔单抗治疗之前在介于非响应者(n=11个样本)和响应者(n=12个样本)之间显示显著差异表达。计算p值以测定试验样本被随机分类的概率。使用Fisher’s Exact Test(Fisher精确检验)来选择最高预测性转录物。
[0117] 无监督聚类分析
[0118] 对获自微阵列数据分析的数据应用分层聚类分析。在GeneSpringGX7.3中使用介于两个基因或患者的表达谱之间的Pearson相关性计算相似矩阵,从而运行聚类。结果直观表示为二维热量图,其具有两个树状图(未示出),一个指示出患者之间的相似性,另一个指示出基因之间的相似性。
[0119] 功能注释
[0120] 使用National Institutes of Health(美国国家卫生研究院)DAVID在线(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行基因注释富集分析。使用Fisher精确检验确定统计显著性。p值≤0.05的功能分类被认为是显著的。
[0121] 区分响应者与非响应者的基线基因标记
[0122] 基于在第8周对英夫利昔单抗的响应,用22名患者建立英夫利昔单抗治疗之前第0周的粘膜活检组织表达谱(11个活检组织来自10个非响应者,12个活检组织来自12个响应者;在两周内从相同受试者获得非响应者活检组织中的两个)。总共109个代表90个基因的探针组,其中102个探针组上调,7个探针组下调,并且通过了5%的FDR和2倍差异表达界值。
[0123] 当分类为生物过程时,存在先天性免疫过程的优势。五个最占优势的先天性免疫过程是防御响应、免疫响应、信号转导、对其他生物体的响应、以及对害虫、病原体或寄生生物的响应(图1)。十探针组成员是细胞因子/趋化因子或细胞因子/趋化因子受体。探针组中包括CXCL8/白介素(IL)-8,即对中性粒多形核白细胞(PMN)具有趋化性的趋化因子。也存在用于CXCL8/IL-8、CXCR1/IL-8RA和CXCR2/IL-8RB的受体。也存在CXCL11/I-TAC,即激活T细胞和自然杀伤细胞的趋化因子。最后,当将非响应者与响应者比较时,IL-1β、IL-1RN和IL-11上调程度均不止四倍。
[0124] 响应者和非响应者的分类预测分析
[0125] 使用Fisher’s Exact Test(Fisher精确检验)来选择最高预测性探针组,该最高预测性探针组将第0周显示差异表达的109个探针组内的非响应者与响应者区分开。对第0周的响应者和非响应者进行分类的20个探针组的子集(表2)具有95.4%(21/22)的总体精确度、91.7%(11/12响应者)的灵敏度和100%(10/10非响应者)的特异性
(表2)。表中示出了参与免疫响应的基因(IL-1β、TLR2、TREM1和LILRA1)、参与信号转导的基因(PDFAB、PBEF1和FCN1)或参与G蛋白偶联受体蛋白信号通道的基因(GPR109B、C5AR1[C5R1]和FPRL1)。这20个基因中的8个由PMN表达,该PMN大量存在于患有活动期UC的患者的结肠粘膜中。20探针组分类器的分层聚类示出非响应者和响应者当中的清晰分离(未示出)。随后确定了允许当量分类的最小转录物数目。包含选自上述20个的少至
5个探针组的分类器能够达到90.9%(20/22)的总体精确度、91.7%(11/12响应者)的灵敏度和90.0%(9/10非响应者)的特异性(表2和表3)。获得的5个基因是BCL6、CREB5、C5AR1、FPRL1、和OSM。BCL6和CREB5均具有稍微高的预测强度,而剩余的3个基因具有相同的预测强度。值得注意的是,剩余的15个基因中的任何者都可替代C5AR1、FPRL1、和OSM,而不会对5探针组分类器的预测质量造成任何损失(数据未示出)。当将响应者与非响应者比较时,使用5探针组分类器对整个10个非响应者和12个响应者进行的分层聚类示出显著的分离(未示出),在整个5探针组具有对照非常鲜明的表达谱。单个错误分类的响应者具有非常类似于非响应者的表达谱,CREB5除外。最后,图2示出使用归一化的原始强度对5基因分类器进行的点图表示,其中当比较响应者与非响应者时,在基线处的5个基因中的每一个都可见显著差异。
[0126] 分类预测验证
[0127] 使用Leuven队列作为由16个非响应者和8个响应者构成的独立验证测试集,验证了20探针组和5探针组分类器。对于上述两种分类器,都获得了75%(18/24)的总体精确度、87.5%(7/8响应者)的灵敏度和68.8%(11/16非响应者)的特异性。使用20探针组分类器在16个非响应者和8个响应者当中进行的分层聚类显示,4个错误分类的非响应者和1个错误分类的响应者的表达谱分别非常类似于响应者和非响应者。
[0128] 这些探针组都通过了5%FDR和2倍差异表达界值。使用独立队列建立和验证了两个预测性响应标记,一个是20探针组,另一个是20探针组中的5探针子集。对于所有109个在第0周差异表达的基因,4个非响应者被错误分类,但其表达模式类似于响应者(数据未示出)。这提出这些患者要么较慢表明来自英夫利昔单抗治疗的临床有益效果、要么具有影响其临床响应但通过第0周的粘膜表达谱却不明显的因素。来自ACT1队列的一个响应者被20探针组分类器和5探针组分类器错误分类,而独立验证队列中的一个响应者被错误分类。
[0129] 响应标记的实用性。可以如下所述评估和使用用于本文所述的对UC进行英夫利昔单抗治疗的响应标记。
[0130] 1)结肠镜活检标本得自患有活动期UC(或克隆氏病或相关疾病和病症)的患者的损伤的位点。然后,RNA将从活检标本分离,并经受实时RT-PCR分析。在存在MultiScribe Reverse Transcriptase(MultiScribe反转录酶)(ABI biosystem,Foster City,California)的情况下,50μl体积内的1微克总RNA被转化为cDNA。通过在25℃下温育10分钟,随后在48℃下温育30分钟来进行该反应。将反应体系置于95℃下5分钟,使Reverse Transcriptase(反转录酶)灭活。在采用ABI 7900系统(Foster City,California)进行的实时PCR中,每个反应用25纳克cDNA。在存在AmpliTaq Gold DNA聚合酶(ABI biosystem,Foster City,California)的情况下,反应在50℃下温育2分钟,随后在95℃下温育10分钟。然后,反应运行40个循环,每个循环在95℃下运行15秒、60℃下运行1分钟,并且使用对响应标记中的基因具有特异性的引物/探针组。看家基因(诸如GAPDH或actin)用作内校准器。使用Applied Biosystems描述的δ-δCt法并根据用作校准器或比较器的非响应者样本中的值来计算基因表达中的相对改变。
[0131] 2)如果类似基因表达谱满足用于某种疗法的基因谱标记的参数(即上述谱图中5个或20个标记基因中的一者或多者表现出的表达水平可相对于非响应者预测响应者),那么患者被认为是对该疗法的可能治疗响应者。在此情况下,将采用该疗法治疗该患者。
[0132] 3)如果该基因表达谱不满足响应者的基因谱标记的参数(即更低的表达水平),那么患者被限定为可能的治疗非响应者。在此情况下,可以不采用该疗法治疗该患者。这允许患者在被视为非响应者之后能够更早避免接受某种疗法。这可允许患者接受不同类型的疗法。
[0133] 与参考标准相关的比较方法:
[0134] 应在基因芯片阵列上分析总RNA,以用于表2中列出的20基因群组的表达强度或表2中以粗体列出的5基因群组的表达强度。以下工序是对照参考标准来评价本发明的基因群组成员的示例性方法,以便比较20基因群组或5基因群组成员的值:
[0135] 1.在治疗之前,从预期UC(或相关病症)患者的活检标本提取总RNA,并按照上述实例1中指定的方法评估总RNA的数量和质量。
[0136] 2.按照如下方式将总RNA在三个单独的、相同的基因芯片阵列(如GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0阵列)上一式两次地运行:
[0137] a.根据制造商(如Affymetrix(Santa Clara,CA))的方案进行RNA扩增、靶合成和标记、芯片杂交、洗涤和染色。
[0138] b.使用(如)GeneChip Scanner 3000扫描GeneChips(基因芯片)。
[0139] c.用(如)GCOS 1.4(GeneChip Operating System)(基因芯片操作系统)分析数据,该软件使用Affymetrix缺省分析设置和全局标度作为归一化方法,并将每一个阵列的修整的平均靶强度随意地设定到500。
[0140] d.通过对在整个三个阵列上的一式两次当中的每一个基因的数据进行相关性分析来确定数据质量。
[0141] i.应当实现相关系数>0.9。
[0142] e.用代表变异性的标准误差来计算平均强度值。
[0143] f.患者应当响应抗TNFα抗体(如英夫利昔单抗)的治疗的前提如下:
[0144] ii.用于每一个基因探针组的平均强度值为等于或大于X(表2);或
[0145] iii.用于5(或20)基因群组的平均强度值为等于或大于X(表2)。
[0146] g.患者不应当响应抗TNFα抗体(例如英夫利昔单抗)的治疗的前提如下:
[0147] iv.用于每一个基因探针组的平均强度值为小于Y(表2);
[0148] 或
[0149] v.用于5(或20)基因群组的平均强度值为小于Y(表2)。
[0150] 虽然以上结合某些具体实施例进行了图示和描述,但本发明并非旨在受限于所示细节。相反,本发明涉及UC相关的基因和基因产物。对于本文所公开的多核苷酸、抗体、设备、和试剂盒以及它们的用途,以及用于预测对治疗的响应和控制UC相关生物标记基因的水平的方法,在权利要求等同内容的范围内、以及在不脱离本发明的精神的前提下,可以对该细节进行各种修改
[0151] 表1.研究队列的基线特性
[0152]
[0153] 表2:基线IFX探针组分类器
[0154]
[0155] 表3:基线IFX预测性标记的特性
[0156]
[0157] 表4-对响应者和非响应者进行比较的基线差异调节的基因
[0158]
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[0162] 参考文献
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