测量中期因子或多效生长因子平用于诊断生长的测定

申请号 CN201380070622.5 申请日 2013-11-15 公开(公告)号 CN104956224A 公开(公告)日 2015-09-30
申请人 美国政府卫生与公共服务部; 发明人 J·巴伦; Y·H·季;
摘要 本 申请 提供了用于诊断对象中生长的方法和 试剂 盒 ,所述诊断通过提供取自对象的生长样品,通过 免疫测定 来确定所述样品中的中期因子或多效生长因子的 水 平,并且将从所述样品中确定的中期因子或多效生长因子水平与对照进行比较来实现。与所述对照比较,所述样品中升高的中期因子或多效生长因子水平是恶性生长的诊断依据,而与所述对照比较,所述样品中相等的或降低的中期因子或多效生长因子水平是良性生长的诊断依据。生长是指例如 乳头 状甲状腺癌(PTC)。
权利要求

1.一种用于诊断对象中生长的方法,所述方法包括:
(a)提供获取自对象的生长样品;
(b)通过免疫测定来分析所述样品以确定中期因子的平;
(c)将从所述样品确定的中期因子的水平与对照比较;以及
(d)基于从所述样品确定的中期因子的水平和所述对照的比较,提供对所述生长为良性生长或恶性生长的诊断。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述对照是在良性生长中的中期因子水平,并且与所述对照比较,从所述样品确定的相等的或降低的中期因子水平是良性生长的诊断依据。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述对照是良性生长中的中期因子水平,并且与所述对照比较,从所述样品确定的升高的中期因子水平是恶性生长的诊断依据。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法,其中所述样品是通过外科活检、开放活检或针刺活检获得。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中所述样品是通过细针穿刺获得。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法,其中所述生长是甲状腺结节。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法,其中所述生长是肿瘤
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法,所述方法还包括对所述生长的常规组织学或细胞学的检查。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法,其中所述免疫测定是夹心酶联免疫吸附测定(ELISA),所述夹心酶联免疫吸附测定包括将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包括与人中期因子特异性结合的抗体
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述抗体偶联至选自下组的标记:生物素、放射性核素、荧光分子、化学发光分子和酶。
11.根据权利要求9或10所述的方法,其中所述溶液包括聚合物
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述聚合物是聚-L-赖酸。
13.根据权利要求12所述的方法,其中在所述溶液中聚-L-赖氨酸的浓度是10μg/mL。
14.一种用于诊断对象中生长的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)抗体,所述抗体与人中期因子特异性结合,以及
(b)指导材料,所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品中的中期因子水平,并指示从所述样品确定的所述中期因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其中所述指导材料描述将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包括(i)所述与人中期因子特异性结合的抗体和(ii)聚合物。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒,所述试剂盒还包括溶液,所述溶液包括(i)所述与人中期因子特异性结合的抗体和(ii)聚合物。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述聚合物是聚-L-赖氨酸。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的试剂盒,其中所述生长是甲状腺结节。
19.根据权利要求14-18中任意一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括一个或多个对照中期因子水平的指示。
20.一种用于诊断对象中生长的方法,所述方法包括:
(a)提供获取自对象的生长样品;
(b)通过免疫测定来分析所述样品以确定多效生长因子的水平;
(c)将从所述样品确定的多效生长因子的水平与对照比较;以及
(d)基于从所述样品确定的多效生长因子的水平和所述对照的比较,提供对所述生长为良性生长或恶性生长的诊断。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述对照是在良性生长中的多效生长因子的水平,并且与所述对照比较,从所述样品确定的相等的或降低的多效生长因子水平是良性生长的诊断依据。
22.根据权利要求20或21所述的方法,其中所述对照是良性生长中的多效生长因子的水平,并且与所述对照比较,从所述样品确定的升高的多效生长因子水平是恶性生长的诊断依据。
23.根据权利要求20-22中任意一项所述的方法,其中所述样品是通过外科活检、开放活检或针刺活检获得。
24.根据权利要求20-23中任意一项所述的方法,其中所述样品是通过细针穿刺获得。
25.根据权利要求20-24中任意一项所述的方法,其中所述生长是甲状腺结节。
26.根据权利要求20-25中任意一项所述的方法,其中所述生长是肿瘤。
27.根据权利要求20-26中任意一项所述的方法,所述方法还包括对所述生长的常规组织学或细胞学的检查。
28.根据权利要求20-27中任意一项所述的方法,其中所述免疫测定是夹心酶联免疫吸附测定(ELISA),所述夹心酶联免疫吸附测定包括将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包括与人多效生长因子特异性结合的抗体。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述抗体偶联至选自下组的标记:生物素、放射性核素、荧光分子、化学发光分子和酶。
30.根据权利要求28或29所述的方法,其中所述溶液包括聚合物。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述聚合物是聚-L-赖氨酸。
32.根据权利要求31所述的方法,其中在所述溶液中聚-L-赖氨酸的浓度是10μg/mL。
33.一种用于诊断对象中生长的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)抗体,所述抗体与人多效生长因子特异性结合,以及
(b)指导材料,所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品的多效生长因子水平,并指示从所述样品确定的所述多效生长因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
34.根据权利要求33所述的试剂盒,其中所述指导材料描述将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包括(i)所述与人多效生长因子特异性结合的抗体和(ii)聚合物。
35.根据权利要求33或34所述的试剂盒,所述试剂盒还包括溶液,所述溶液包括(i)所述与人多效生长因子特异性结合的抗体和(ii)聚合物。
36.根据权利要求34或35所述的试剂盒,其中所述聚合物是聚-L-赖氨酸。
37.根据权利要求33-36中任意一项所述的试剂盒,其中所述生长是甲状腺结节。
38.根据权利要求33-37中任意一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括一个或多个对照多效生长因子水平的指示。

说明书全文

测量中期因子或多效生长因子平用于诊断生长的测定

背景技术

[0001] 癌症是全世界主要的死亡原因。许多癌症的存活率可以通过早期发现和治疗得到改善。然而,对于许多癌症,诊断方法是高度侵入性的,例如,涉及外科活检。微创方法,如针刺活检,往往不可靠。需要更可靠的癌症检测方法,同时也是微创检测方法。
[0002] 中期因子,也被称为MK,MDK和NEGF2,是富含基酸和半胱氨酸的13-kDa肝素结合生长因子,其影响各种靶细胞的生长、存活、迁移和基因表达。人中期因子是由MDK基因编码。该MDK基因的表达是通过视黄酸或缺引起,并且通过糖皮质激素来抑制。MDK的表达在妊娠中期中较高,但是在大多数成人组织中较低或不表达(Muramatsu等,Proc.Jpn.Acad.,Ser.B,86:410-425(2010))。
[0003] MDK基因表达在维尔姆斯氏(Wilms)瘤标本中和在人胃、结肠、胰腺、和食管癌细胞系中增加(Tsutsui等,Cancer Res.,53:1281-1285(1993))。中期因子的血清水平在患者体内随着食道、胃、十二指肠、结肠、肝细胞、胆管/胆囊、胰腺、甲状腺或肺癌中升高(Ikematsu等,Brit.J.Cancer,83(6):701-706(2000))。原位杂交和免疫组织化学分析表明,MDK表达和中期因子的产生在人甲状腺乳头状癌标本中增加(Kato等,Mod.Pathol.,13(10):1060-1065(2000))。
[0004] 需要用于检测生物样品中中期因子表达的经改良的方法、组合物和试剂盒,其可能有助于对增殖性疾病(如癌症)的诊断和预后用途。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供了一种用于诊断对象中生长的方法,所述方法包括提供获取自对象的生长样品,通过免疫测定来分析所述样品以确定中期因子的水平,并且将从所述样品确定的中期因子的水平与对照比较。相对于所述对照,从所述样品确定的中期因子的水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0007] 本发明也提供了一种用于诊断对象中生长的试剂盒,所述试剂盒包括抗体和指导材料,所述抗体与人中期因子特异性结合,所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品的中期因子水平。附图说明
[0008] 图1是点状图,描绘了在细针穿刺(FNA)样品中的中期因子和甲状腺球蛋白的浓度,所述样品是已经由组织学上证实的良性甲状腺结节(空心圆)或乳头状甲状腺癌(PTC)(实心圆)的样品。
[0009] 图2是柱状图,描绘了良性甲状腺结节或恶性乳头状甲状腺癌(PTC)的FNA样品中的中期因子与甲状腺球蛋白的比例(MK/Tg,平均值±SEM)。仅通过细胞学发现是良性的(良性-C)甲状腺结节与那些通过术后组织学发现是良性的(良性-H)甲状腺结节分别表示。
[0010] 图3是点状图,描绘了来自同一个乳头状甲状腺癌的单个FNA样品中的MK/Tg比例的变化。显示了从四个患有PTC的对象的每一个中获取的3-4单个穿刺的MK/Tg值。对象5同时有术前的体内FNA样品(对象5-内)和甲状腺切除术之后立即获得的离体(ex vivo)FNA样品(对象5-离)。
[0011] 图4是线状图,描绘了用夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测的已知浓度的重组中期因子蛋白样品的吸光度,所述ELISA测定通过在含有或不含有10微克/毫升聚-L-赖氨酸(PLL)的检测抗体溶液中进行。
[0012] 图5是点状图,描绘了组织学证明为良性甲状腺结节(空心圆)或PTC组织(实心圆)的离体FNA样品中的多效生长因子和甲状腺球蛋白的浓度。
[0013] 图6A是点状图,描绘了良性甲状腺结节(空心圆)或PTC组织(实心圆)的离体FNA样品中的多效生长因子和甲状腺球蛋白(PTN/Tg)的比例。图6B是柱状图,描述了良性甲状腺结节或PTC组织的离体FNA样品中的PTN/Tg的比例(平均值±SEM),其中来自患有Graves病的患者的良性结节与全部良性结节分开。

发明内容

[0014] 本发明提供了方法和试剂盒,所述方法和试剂盒用于根据生长样品中存在的中期因子水平来确定生长是良性还是恶性。
[0015] 在一个方面,本发明提供了用于诊断对象中生长的方法。所述方法包括:(a)提供获取自对象的生长样品,(b)通过免疫测定来分析所述样品以确定中期因子的水平,并且(c)将从所述样品中确定的中期因子的水平与对照比较。与所述对照比较,由所述样品中确定的中期因子的水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0016] 在另一个方面,本发明提供了用于诊断对象中生长的试剂盒。所述试剂盒包括(a)抗体,所述抗体与人中期因子特异性结合,以及(b)指导材料,所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品中的中期因子水平。与所述对照比较,由所述样品确定的所述中期因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0017] 如本申请中所用的术语“生长”是指组织的异常团。“生长”可以是固体团块、流体填充腔、或固体和流体组分的混合物。
[0018] 所有的肿瘤都是生长。肿瘤可以是实体瘤或血液肿瘤。实体瘤可以源自任何组织或器官,包括但不限于肾、肝、子宫颈皮肤、甲状腺、脑、乳腺、结肠、肺、胰腺、前列腺、胃、卵巢、睾丸、膀胱、胆管、或胆囊。实体瘤也可以源自骨。血液肿瘤包括白血病和淋巴瘤。
[0019] 在某些实施方式中,生长是结节。术语“结节”指的是在其他正常组织中存在的异常团块。在一些实施方式中,结节是甲状腺结节。在其它实施方式中,结节是肺结节。
[0020] 在其他实施方式中,生长是包括固体、流体或半固体组分的“囊肿”或“脓肿”。
[0021] 在本发明的上下文中,所述样品可以是取自对象的器官或组织中存在的生长的任何样品。所述样品可以取自所述生长的任何合适区域,例如接近生长中心的区域,或者靠近生长外围的区域。
[0022] 对于本发明中使用的样品可以通过能够收集细胞的任何合适的方法来获取。所述样品可以从外科或开放式活检获得,或者所述样品可以使用针刺活检获得。因此,所述样品可来自“钻孔”、“刮”、刮除、细针穿刺(FNA)、芯针样品、哨位淋巴结、或切除活检、或本领域中已知的任何其它活检方法。
[0023] 在某些优选的实施方式中,所述样品由FNA获得。所述样品可以是全部由FNA获得的材料,或所述样品可以是由FNA获得的材料的一部分。例如,样品可以是在针的内容物在显微镜载玻片上呈现以用于常规细胞学或组织学分析之后,留在FNA针中的所述材料的“洗脱物”或“漂洗物”。
[0024] 所述对象可以是人或任何合适的非人哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、羊、、或灵长类动物。在一些实施方式中,对象是非人的实验动物模型。在一些实施方式中,对象是灵长类动物。优选,对象是人。
[0025] 针对用于测定样品中中期因子水平的免疫测定,没有特别限定。在一些实施方式中,免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、放射免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定,原位免疫测定蛋白质印迹、免疫沉淀测定、或免疫荧光测定。在某些优选的实施方式中,所述免疫分析是“夹心ELISA”,其中涂覆有中期因子特异性的第一抗体的表面与含有样品的溶液在某种条件下接触,在所述条件中可在所述第一抗体和存在于所述样品中的中期因子之间形成稳定的复合物,并且可以用本领域中任意合适的方法使用中期因子特异性的第二抗体来检测所结合的中期因子,其中复合物的检测指示在样品中存在中期因子。执行免疫测定的方法是本领域技术人员所熟知的(参见,例如,抗体:实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),E.Harlow和D.Lane编辑,冷泉港实验室(冷泉港,纽约,1988))
[0026] “特异性结合”中期因子或者中期因子“特异性”的抗体,指的是可识别至少一种中期因子的抗原或表位并且可以在免疫测定中所用的标准的结合、洗涤、检测条件下保持稳定结合的任何抗体、或其片段或衍生物。如本申请中所用的术语“抗中期因子抗体”和“针对中期因子的抗体”指的是“特异性结合”中期因子或者中期因子“特异性”的抗体。
[0027] 中期因子特异性的抗体可以是结合中期因子的多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗体单链或Fab片段。例如,针对中期因子的抗体可以是针对单一中期因子表位的单克隆抗体,针对单个中期因子抗原组分的不同表位的单克隆抗体的组合,针对不同的中期因子抗原组分的表位的单克隆抗体,针对相同的中期因子抗原的多克隆抗体,或针对不同的中期因子抗原的多克隆抗体。
[0028] 中期因子特异性的抗体可以通过任何合适的方式来制备。
[0029] 多克隆抗体可以通过免疫宿主动物来制备,所述免疫例如通过用中期因子多肽或其衍生物(例如片段或融合蛋白)注射来进行。合适的宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。中期因子多肽可以重组产生或通过化学合成,并且其片段或其它衍生物或类似物,包括融合蛋白,可以用作免疫原以产生识别中期因子多肽的抗体。在一个实施方式中,中期因子多肽或其片段可偶联至免疫原性载体,例如,牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。佐剂可用于增强宿主动物的免疫应答,根据宿主的物种,包括但不限于弗氏(Freund’s)(完全和不完全)、矿物凝胶(如氢氧化)、表面活性物质(如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚和人佐剂(如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))。
[0030] 单克隆抗体可以通过任何在培养中用连续细胞系提供抗体的技术来制备。这些技术包括,但不限于,最初由Kohler和Milstein(Nature,256:495-497(1975))开发的杂交瘤技术、以及三体瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等,Immunol.Today,4:72(1983);Cote等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-2030(1983)),和EBV-杂交瘤技术(Cole等,“EBV杂交瘤技术及其对人肺癌的应用(The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer)”,单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),Alan R.Liss公司,第77-96页(1985))。通过CDR移植产生单克隆抗体描述在美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,225,539中。此外,单克隆抗体可以在无菌动物中产生,如在国际专利申请公开号WO 1989/012690中所描述的。
[0031] 嵌合抗体可以通过,例如将来自于中期因子多肽特异性的小鼠抗体的基因和来自于具有合适生物活性的人抗体的基因一起剪接来制备(Morrison等,J.
Bacteriol.,159:870(1984);Neuberger 等 ,Nature,312:604-608(1984); 和 Takeda等,Nature,314:452-454(1985))。用于生产单链抗体的技术(如描述于例如美国专利号
5,476,786、5,132,405和4,946,778)可适于产生针对中期因子的抗体。
[0032] 包含针对中期因子抗体的独特型的抗体片段,可以以任何合适的方式产生,例如使用已知的技术产生。合适的抗体片段包括但不限于,F(ab’)2片段,所述F(ab’)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生;Fab’片段,所述Fab’片段可以通过还原所述F(ab’)2片段的二硫桥键来产生;以及Fab片段,所述Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体来产生。
[0033] 所述中期因子特异性的抗体也可以是在本领域中已知的抗中期因子抗体,例如得自BioVendor(捷克共和国),Abcam公司(萨诸塞州剑桥)或R&D Systems公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)的市售的抗中期因子抗体。
[0034] 在本发明的方法中,由于针对中期因子的抗体与样品中存在的中期因子结合,所以检测所述抗体以确定中期因子的水平。对针对中期因子抗体的检测可以通过在本领域中公知的任何合适的技术来完成。在一个实施方式中,抗体结合是通过检测偶联至针对中期因子抗体的标记来进行检测。在另一个实施方式中,抗体结合是通过第二抗体或试剂与针对中期因子的抗体的结合来检测,其中标记并且检测所述第二抗体。
[0035] 可以利用任何合适的标记,以确定样品中存在的中期因子的水平。合适的标记物包括,但不限于,酶(例如,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶等)、荧光分子、化学发光分子、放射性核素和染料分子。其它试剂和材料可用于简易化确定样品中存在的中期因子水平,所述试剂和材料如预处理和阻断试剂、扩增试剂(例如生物素-抗生蛋白链霉素)、洗涤缓冲液、阻断试剂、和共染色试剂。检测抗原-抗体复合物的方法是本领域技术人员所熟知的。
[0036] 在一些实施方式中,所述对照是在宿主细胞中重组生产的纯化的中期因子蛋白。在其它实施方式中,所述对照是从细胞或组织中分离的纯化中期因子蛋白,所述细胞或组织内源性地产生中期因子。因此,本发明的试剂盒可包括用作对照的一定量的纯化中期因子蛋白,例如以建立标准曲线,用于与样品中存在的中期因子的水平进行比较。对照中期因子蛋白可以与在人或其它哺乳动物的细胞或组织中发现的中期因子相同,或者对照中期因子蛋白可以是经修饰的中期因子蛋白,例如融合蛋白、截短的蛋白,或含氨基酸取代的蛋白。
[0037] 在本发明的方法中,样品中存在的中期因子的水平通常是标准化为样品中存在的蛋白或其它物质的水平。在一些实施方式中,样品中存在的中期因子的水平标准化为某种蛋白的水平,所述蛋白由样品中表达的“持家基因”编码。术语“持家基因”是指本领域熟知的、在生理学和病理生理学条件下以相对恒定的水平表达的基因。通过任何持家基因编码的蛋白可用于标准化样品中存在的中期因子水平。合适的标准化蛋白的示例包括,例如,β-肌动蛋白、Hsp90和GAPDH。在一些实施方式中,用于标准化中期因子水平的蛋白是通过组织特异性方式表达的基因来编码,所述组织特异是例如器官特异性或肿瘤特异性。例如,甲状腺球蛋白的水平可以用来标准化甲状腺结节或甲状腺肿瘤中存在的中期因子的水平。组织特异性基因及其蛋白产物是本领域技术人员所熟知的。在其他实施方式中,用于标准化的物质代表一组相关的分子,例如样品中的总蛋白。在其他实施方式中,所述物质不是蛋白质,而是存在于样品中的另一种组分,例如核酸、脂类、水化合物或小有机分子或非有机分子。
[0038] 在本领域中已知的任何合适的方法可以用来确定蛋白的水平,所述蛋白的水平用于标准化样品中的中期因子的水平。在一些实施方式中,用于测定样品中标准化蛋白的水平的方法与用于确定样品中中期因子的水平的方法相同,除了用标准化蛋白特异性的抗体来取代抗中期因子抗体。
[0039] 对照可以是任何合适的比较物。在一些实施方式中,对照是从具有生长的相同对象获取的正常组织样品,并且优选是从具有所述生长的相同器官获取。例如,如果生长是甲状腺结节,对照可以是从患有甲状腺结节的对象获取的正常甲状腺组织的样品。在其他实施方式中,对照是从与具有生长的对象的相同物种的另一个成员获取的正常组织的样品,并且优选是从具有所述生长的相同器官获取。例如,如果生长是在人对象中的甲状腺结节,所述对照可以是从另一个人对象中获取的正常甲状腺组织的样品。所述对照也可以是历史对照,如从先前的生长样品中确定的中期因子水平,所述样品与随后的生长样品是从相同的对象中获得。随后的样品可衍生自与先前的样品相同的生长,或者不同的生长。例如,如果生长是在人对象中的甲状腺结节,所述对照可以是中期因子水平,所述中期因子水平是从取自相同人对象的甲状腺结节的先前样品中确定。优选地,将用于标准化生长样品中的中期因子水平的相同方法来用于标准化对照组织样品中的中期因子水平。
[0040] 在其他实施方式中,对照是预先确定的中期因子水平或预先确定的一组中期因子水平。因此,在本发明的上下文中,没有必要对对照样品实施测定以提供对照中期因子水平。在一些实施方式中,预先确定的中期因子水平由生长样品所获取的相同物种的其他个体中的良性生长、恶性生长,和/或正常组织的预先研究来确定。
[0041] 对照可以是上述对照的任何两种或更多种的组合。本领域技术人员应理解,合适对照的确定将取决于几个因素,如组织来源和预测的生长恶性程度。
[0042] 在本发明方法的实施方式中,与对照比较,尤其是与良性对照比较,生长样品中中期因子水平的相等或降低是良性生长的诊断依据,而与已知良性对照比较,生长样品中中期因子水平的升高是恶性生长的诊断依据。术语“良性”指的是非癌性的和缺乏转移能的生长,而术语“恶性”是指癌性的并且往往有转移能力的生长。恶性生长可以是任何恶性程度,例如,恶变前的、低度的、中度的、高度的。本领域的普通技术人员应理解对每种类型的癌症分级系统各不相同。本申请所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义,除非另有明确说明。
[0043] 用于确定从样品中测定的中期因子水平是良性生长或恶性生长的指示的“临界”值或“截止”值是可变的,并且取决于多个因素,如生长的组织来源、样品数和对照数,以及免疫测定和标准化蛋白的选择。本领域的普通技术人员可基于上述因素的任何组合来凭经验确定适当的截止值。
[0044] 在某些实施方式中,本发明的方法和试剂盒用于确定甲状腺生长是良性或恶性的,标准化蛋白是甲状腺球蛋白,并且临界值是10纳克中期因子/毫克甲状腺球蛋白。良性甲状腺生长的例子包括腺瘤样/胶体结节、滤泡状腺瘤,以及与潜在的慢性淋巴细胞性甲状腺炎相关的结节。恶性甲状腺生长的例子包括乳头状甲状腺癌(PTC)、滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌。
[0045] 在其他实施方式中,本发明的方法和试剂盒用于诊断与另一癌症相关的生长,包括但不限于急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关的恶性肿瘤、肛癌、小脑星形细胞瘤、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、视路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、胃肠道类癌、癌、肾上腺皮质、胰岛细胞癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、鞘透明细胞肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤/家族肿瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌包括眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠道类癌、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头和颈癌、霍奇金病、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑色素瘤、卡波西氏肉瘤、喉癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、眼内黑素瘤、Merkel细胞癌、隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌,口腔和唇癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、移行细胞癌(例如肾盂和输尿管)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、软组织肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小肠癌、胃(胃部)癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、恶性胸腺瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及维尔姆斯氏瘤。
[0046] 本发明的方法和试剂盒可与其他用于诊断生长的方法结合使用。因此,在一些实施方式中,使用针刺活检或手术活检获得的样品的一部分可以用于本发明的方法中,而相同样品的另一部分可用于常规的诊断和/或预后方法中,由此降低了在对象中的昂贵和/或侵入性过程的需要。在一些实施方式中,本发明的方法和试剂盒与生长的常规组织学或细胞学检查结合使用。
[0047] 在一些实施方式中,存在于样品水平中的中期因子水平被用来评估恶性程度,预测疾病的预后,预测对治疗的响应,和/或指导针对生长的治疗的选择。
[0048] 本发明的一个优点是中期因子测定的高灵敏度,这允许在一个相对较小的样品中确定中期因子水平,所述样品如细针穿刺。在本发明的一些方面中,用于检测中期因子水平的所述免疫测定,包括将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包括(i)抗体,所述抗体与人中期因子特异性结合以及(ii)聚合物。不希望受理论的束缚,据信在抗原结合过程中,聚合物的存在增加了抗中期因子抗体对中期因子的亲和性或亲合力,和/或降低抗中期因子抗体与存在于样品中的其它组分的非特异性结合,从而增加了免疫测定的灵敏度。
[0049] 存在于溶液中的抗中期因子抗体的量没有特别的限制,可以由本领域的技术人员凭经验确定。在一些实施方式中,抗体浓度为0.01μg/mL或更高,例如,0.1μg/mL或更高、1μg/mL或更高、5μg/mL或更高、10μg/mL或更高或25μg/mL或更高。或者,或另外地,抗体浓度为100μg/mL或更低,例如50μg/mL或更低、25μg/mL或更低、10μg/mL或更低、
5μg/mL或更低、2μg/mL或更低、1μg/mL或更低或0.5μg/mL或更低。因此,抗原结合过程中存在于溶液中的抗中期因子抗体的浓度可由任意两个上述端点来限定的浓度。例如,抗体浓度可以是0.1μg/mL-5μg/mL、1μg/mL-25μg/mL、0.01μg/mL-1μg/mL或5μg/mL-10μg/mL。
[0050] 在某些实施方式中,所述免疫测定法包括使用两种或更多种不同的抗中期因子抗体。用于本发明的方法或试剂盒中的每种抗中期因子抗体的浓度可以独立地由本领域的技术人员进行选择。
[0051] 在某些实施方式中,所述聚合物是聚-L-赖氨酸或其盐或衍生物。存在于溶液中的聚-L-赖氨酸的量没有特别的限制。在一些实施方式中,在抗原结合过程中存在于溶液中的聚-L-赖氨酸的浓度为0.1μg/mL或更高,例如,0.5μg/mL或更高、1μg/mL或更高、5μg/mL或更高、10μg/mL或更高或者25μg/mL或更高。或者,或另外地,在抗原结合过程中存在于溶液中的聚L-赖氨酸的浓度为1000μg/mL或更低,例如,500μg/mL或更低、
250μg/mL或更低、100μg/mL或更低、50μg/mL或更低、20μg/mL或更低、10μg/mL或更低、或者1μg/mL或更低。因此,在抗原结合过程中存在于溶液中的聚L-赖氨酸的浓度可以是由任意两个上述端点来限定的浓度。例如,在抗原结合过程中存在于溶液中的聚-L-赖氨酸的浓度可以是0.1μg/mL-500μg/mL、0.5μg/mL-50μg/mL、1μg/mL-100μg/mL或
5μg/mL-20μg/mL。在一些实施方式中,在抗原结合过程中存在于溶液中的聚-L-赖氨酸的浓度为10μg/mL。
[0052] 所述聚-L-赖氨酸的分子量没有特别限制。在某些实施方式中,所述聚-L-赖氨酸具有的分子量为0.5kDa-2kDa、1kDa-5kDa、4kDa-15kDa、15kDa-30kDa、30kDa-70kDa、70kDa-150kDa或150kDa-300kDa。所述聚-L-赖氨酸可以是游离碱的形式,或聚-L-赖氨酸可以是盐的形式,例如聚-L-赖氨酸盐酸盐或聚-L-赖氨酸氢溴酸盐。
[0053] 在一些实施方式中,含有特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含聚合物,所述聚合物是聚-L-赖氨酸的衍生物。合适的聚-L-赖氨酸的衍生物包括,例如,聚-L-赖氨酸和聚-D-赖氨酸的共聚物,偶联到蛋白的聚-L-赖氨酸,以及聚-L-赖氨酸和聚(乙二醇)的共聚物。
[0054] 在其他实施方式中,含有特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含聚合物,所述聚合物具有类似于聚-L-赖氨酸的生理化学性质。因此,在本发明的某些实施方式中,含有特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含另一种带正电荷的水溶性聚合物,如聚-D-赖氨酸或聚精氨酸。
[0055] 虽然样本的精确大小没有限制,但在本发明的方法和试剂盒中使用的样品可包含少至0.1mg总蛋白,例如0.5mg总蛋白或更多、0.6mg总蛋白或更多、0.8mg总蛋白或更多、1.0mg总蛋白或更多、1.5mg总蛋白或更多、3.0mg总蛋白或更多、10mg蛋白或更多或者25mg蛋白或更多。或者,或另外地,所述样品可含有200mg蛋白或更少,例如100mg总蛋白或更少、50mg总蛋白或更少、30mg总蛋白或更少、20mg总蛋白或更少、7.5mg总蛋白或更少、
1mg总蛋白或更少或者0.75mg总蛋白或更少。因此,本发明的方法和试剂盒中使用的样品中总蛋白的量可以是由任意两个上述端点来限定的量。例如,本发明的方法和试剂盒中使用的样品中总蛋白的量可以是0.1mg-20mg、0.5mg-7.5mg、1.0mg-100mg、3.0mg-30mg或
10mg-200mg。
[0056] 根据本发明的试剂盒包括至少两个组分,即抗中期因子抗体和指导材料。在某些实施方式中,所述试剂盒包括两种或更多种不同的抗中期因子抗体。所述指导材料包括(a)用于确定样品中中期因子的水平和(b)用于解释确定的结果的指令。优选地,指导材料还包括用于确定对照中的中期因子水平的指令,和/或提供一个或多个用于中期因子的对照水平(例如,临界值)。
[0057] 在一些实施方式中,所述指导材料描述将所述样品与溶液接触的步骤,所述溶液包含抗中期因子抗体和聚合物。在某些实施方式中,聚合物是聚-L-赖氨酸,或其盐或衍生物,如在上述本发明方法的上下文中所描述的。
[0058] 在某些实施方式中,所述指导材料包括指令,所述指令用于确定从甲状腺生长获得的样品中的中期因子水平并诊断甲状腺生长是良性或恶性。
[0059] 本发明的试剂盒可用于诊断从任何对象(特别是哺乳动物)获得的生长。优选的哺乳动物是人。在其他实施方式中,所述哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、羊、牛、灵长类动物或另一哺乳动物。
[0060] 所述样品和对照可以是如上所述适用于本发明的方法的任何样品或对照。
[0061] 多效生长因子由PTN基因在人体内编码,在氨基酸序列同源性和结构相似性上与中期因子密切相关。多效生长因子也被称为肝素结合性大脑有丝分裂原(HBBM),肝素结合性生长因子8(HBGF-8),神经突生长促进因子1(NEGF1),肝素亲和性调节肽(HARP)和肝素结合性生长相关分子(HB-GAM)。同时,中期因子和多效生长因子组成的肝素结合性蛋白家族通常被称为神经突生长促进因子(NEGF)家族(Muramatsu等,Proc.Jpn.Acad.,Ser.B,86:410-425(2010))。
[0062] PTN基因表达在数种癌症中增加,所述癌症包括胰腺癌、绒毛膜癌、神经母细胞瘤和黑素瘤(Muramatsu,J.Biochem.,132:359-371(2002))。此外,多效生长因子的血清水平在具有胰腺癌和结肠癌的患者体内增加(Muramatsu,出处同上)。
[0063] 因此,本发明还提供了方法和试剂盒,所述方法和试剂盒用于根据生长样品中存在的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性。在一个方面,本发明提供了诊断对象中生长的方法。所述方法包括(a)提供获取自对象的生长样品,(b)通过免疫测定来分析所述样品以确定多效生长因子的水平,以及(c)将从所述样品确定的多效生长因子水平与对照比较。与所述对照比较,从所述样品确定的多效生长因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0064] 在另一个方面,本发明提供了诊断对象中生长的试剂盒。所述试剂盒包括(a)抗体,所述抗体与人多效生长因子特异性结合,以及(b)指导材料,所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品中的多效生长因子水平。与所述对照比较,从所述样品确定的多效生长因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0065] 用于根据存在于生长样品中的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性的所述方法和试剂盒的实施方式,和上文所述的与中期因子相关的方法和试剂盒的实施方式相似,不同的是中期因子特异性抗体被多效生长因子特异性抗体所取代。
[0066] 多效生长因子特异性抗体可以通过本领域中已知的任何合适的方式来产生,例如那些在本申请中所描述的与抗中期因子抗体的产生有关的方式。多效生长因子特异性抗体也可以是在本领域中已知的抗多效生长因子抗体,例如市售可得的来自EMD密理博(Millipore)公司(马萨诸塞州比勒利卡)或R&D系统公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)的抗多效生长因子抗体。在某些实施方式中,所述抗多效生长因子抗体是市售可得的、被称为3B10的小鼠单克隆抗多效生长因子抗体。
[0067] 在一些实施方式中,用于根据存在于生长样品中的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性的所述方法和试剂盒,包括如上述与根据中期因子的方法和试剂盒相关的聚合物的使用,所述聚合物如聚-L-赖氨酸。在其他实施方式中,用于根据存在于生长样品中的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性的所述方法和试剂盒不包括聚合物的使用。
[0068] 下列实施例进一步说明本发明,但是,当然,不应该被解释为以任何方式限制其范围。
[0069] 实施例1
[0070] 本实施例说明了用于诊断甲状腺结节的方法,所述诊断是通过免疫测定确定甲状腺结节样品中的中期因子水平来进行。
[0071] 从患有甲状腺结节的成年对象中获得甲状腺组织的样品,所述对象经受经皮细针穿刺(FNA)(n=41)、甲状腺切除术(n=23),或经皮FNA和甲状腺切除术(n=9)。为获得样品,将25号针反复进入结节(或者在体内经皮FNA,或者在甲状腺切除术后立即离体来模仿经皮FNA),在将一部分样品呈现到显微镜载玻片上用于常规细胞学分析之前或之后,用500μL含有1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)来漂洗针。漂洗物(也被称为“洗脱物”)被等分并贮存在-80℃直至免疫测定。
[0072] 通过修改,使用市售的试剂盒(捷克共和国BioVendor公司)进行中期因子(MK)夹心ELISA免疫测定。在200μL TBSTA(Tris-缓冲盐水,50mM Tris-HCL,pH为8,0.15M NaCl,0.5%吐温20,1%BSA)中稀释50μL甲状腺洗脱物。将100μL稀释的样品一式两份转移到96孔板中,所述96孔板由生产商预先涂布抗中期因子的捕获抗体。将板在37℃下不摇动孵育2小时,然后用每个试剂盒中提供的洗涤缓冲液以每个孔0.35mL来洗涤3次。轻敲倒置的板以除去残余的液体后,将10μg/mL聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州)的水溶液加入到试剂盒提供的生物素标记的抗体溶液中,然后100μL的这种溶液加入到各孔中。将板在室温下孵育1小时,在以300RPM的轨道式微孔板摇床上振摇。然后用在试剂盒中提供的洗涤缓冲液以每个孔0.35mL来洗涤5次。轻敲后,将随试剂盒提供的100μL链霉亲和素-HRP偶联溶液添加到每个孔中。将板在室温下孵育30分钟,在以300RPM的轨道式微孔板摇床上振摇。用洗涤液洗涤5次并轻敲后,将随试剂盒提供的底物溶液加入到每个孔中。将板用铝箔覆盖,并在室温下孵育7分钟。通过每孔加入100μL随试剂盒提供的终止溶液来终止显色。用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。批内变异系数(CV)对高浓度为3.4%,对低浓度为5.2%。检测限度为8.7pg/mL中期因子。通过与对照比较来计算样品中的中期因子的绝对浓度,所述对照由已知浓度的重组人中期因子稀释数倍组成。
[0073] 对每个洗脱的等分试样也进行甲状腺球蛋白(Tg)测定。简单地说,每个洗脱的等分试样在生理盐水中稀释10倍,甲状腺球蛋白浓度根据制造商的说明用化学发光免疫分析测定(Immulite 2000XPi,英国西门子公司)来检测。甲状腺球蛋白试剂(美国西门子医疗诊断公司)用于在需要时进一步稀释各个样品。
[0074] 对每个对象,对多次针刺的中期因子浓度或中期因子与甲状腺球蛋白的比例(MK/Tg)取平均。使用SigmaPlot软件(版本12)进行统计分析。通过回归来分析中期因子和甲状腺球蛋白浓度之间的关系。通过T-检验比较良性与恶性结节中的中期因子和MK/Tg。对于这种分析,对所有FNA样品(单独的针刺)进行平均,以对每个对象获得单一的平均值。对同时有体内和离体样品的对象,只包括体内的值,体内的值在临床上更相关。P值<0.05被认为是显著的。
[0075] 对于正常甲状腺组织样品(离体获取自远离任意结节的甲状腺),所述FNA针的洗脱物含有很低浓度的MK(0.03±0.01ng/mL)。MK浓度在离体获取自由外科病理学确定良性的结节的样品中(0.07±0.02ng/mL)和在体内获取自细胞学上良性的结节的样品中(0.02±0.01ng/mL)也很低。在患有通过外科证实的良性结节的对象中,MK浓度在腺瘤样/胶体结节(0.027±0.016ng/mL,n=12),滤泡状腺瘤(0.079±0.073ng/mL,n=3),以及患有潜在慢性淋巴细胞性甲状腺炎的良性结节(0.008±0.007ng/mL,n=5)中同样也较低。来自患有Graves病的对象的MK浓度也较低(0.062±0.013ng/mL,n=3)。与此相反,在来自乳头状甲状腺癌(PTC)的样品中MK浓度显示出比良性结节(0.72±0.27ng/mL对比0.03±0.01p=0.006)更高的水平,而不管样品是在体内还是离体获得的(图1)。相反地,在PTC的样品中的甲状腺球蛋白浓度比在良性结节样品中的低(7540±4600ng/mL对比
110000±28900ng/mL,p<0.001)(图1)。
[0076] 本实施例的结果表明,FNA洗脱样品中的中期因子蛋白水平在乳头状甲状腺癌中比在正常甲状腺组织或良性甲状腺结节中的高。
[0077] 实施例2
[0078] 本实施例说明了用于诊断甲状腺结节方法,所述诊断是通过确定甲状腺结节的样品中中期因子与甲状腺球蛋白的比例来进行。
[0079] 根据实施例1中所描述的测定结果来计算中期因子与甲状腺球蛋白的(MK/Tg)比例。MK浓度与来自良性结节和恶性结节的FNA洗脱样品中甲状腺球蛋白的浓度成正相关2 2
(分别为R=0.09,p<0.001和R =0.53,p<0.001)。因为在洗脱流体中的MK和甲状腺球蛋白浓度都依赖于样品中存在的甲状腺组织的量,所以可能存在这种相关性。因此,为校正甲状腺组织的量,通过计算MK/Tg的比例来将中期因子水平标准化为甲状腺球蛋白水平。
同时有体内和离体样品的患者中,MK/Tg的比例在两种类型的样品中是相似的(分别针对良性结节是1.81±0.95ng/mg对比1.74±0.70ng/mg,p=NS)。
[0080] 来自正常甲状腺组织和Graves病的样品显示较低的中期因子与甲状腺球蛋白的比例。同样地,良性结节也显示低的值,所述良性结节包括腺瘤样/胶体结节、滤泡性腺瘤和在受慢性淋巴细胞性甲状腺炎影响的甲状腺中的良性结节。与此相反,MK/Tg的比例在乳头状甲状腺癌(PTC)的样品中比良性结节中高得多(对于具有组织学诊断的对象403±285ng/mg对比1.51±0.55ng/mg,P<0.001)(图2)。MK/Tg的比例随着PTC中结节尺
2
寸有增加的趋势,但这种关系没有达到统计学显著性(R=0.51,P=0.09)。
[0081] 对于前面的分析中,所有FNA样品(独立针刺)对每个对象取平均值。为了评估MK/Tg比例的抽样变化性,对来自同一恶性病变的单个FNA样品进行了比较。单个样品的数据之间合理地吻合,并且所有的单个样品的MK/Tg比例比确定自良性病变的MK/Tg比例高很多(图3)。
[0082] 本实施例的结果表明,在FNA洗脱样品中的中期因子与甲状腺球蛋白的比例在乳头状甲状腺癌中比在正常甲状腺组织或良性甲状腺结节中高。
[0083] 实施例3
[0084] 本实施例说明增加免疫测定的灵敏度的方法,所述免疫测定用于确定样品中中期因子的水平。
[0085] 如实施例1中所述,使用市售试剂盒(捷克共和国BioVendor公司)进行中期因子夹心ELISA免疫测定,不同的是在200μL的TBSTA中而不是甲状腺洗脱物中制备浓度为0、0.033、0.1、0.3、0.9ng/mL的重组人中期因子。增加重组人中期因子浓度会增强在夹心ELISA中的信号(图4)。将10μg/mL聚-L-赖氨酸(PLL)加入到检测抗体溶液会显著增强每个中期因子浓度的总吸光度值以及响应曲线的斜率(图4)。
[0086] 本实施例的结果表明,将聚-L-赖氨酸加入到包含中期因子特异性抗体的溶液中增加了免疫测定的灵敏度。
[0087] 实施例4
[0088] 本实施例说明了用于诊断甲状腺结节的方法,所述诊断是通过免疫测定确定甲状腺结节的样品中多效生长因子的水平来进行。
[0089] 从患有甲状腺结节的成年对象获得甲状腺组织样品,所述对象经受了甲状腺切除术(n=31)。切除甲状腺后,由外科医生和病理学家对感兴趣的结节进行鉴定,并且将所选择的带有周围组织的结节进行二等分以获得样品。通过组织学分析鉴定来自23个对象的25个良性结节和来自8个对象的10个患有PTC的结节。通过组织学分析鉴定无滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌或甲状腺未分化癌。2个对象患有潜在的Graves病。1个具有良性结节的对象患有潜在的慢性淋巴细胞性甲状腺炎。
[0090] 通过重复地将25号针进入结节以模仿经皮FNA来进行离体细针穿刺(FNA)。用500μL含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗针以得到洗脱样品,将所述洗脱样品进行等分并储存在-80℃,直至免疫测定。每个结节获得多个离体FNA样品(平均3.0次)。通过在临近良性结节或恶性结节的正常甲状腺组织上进行离体FNA,从11个对象获得正常甲状腺组织样品。
[0091] 使用小鼠抗多效生长因子的单克隆抗体(3B10,购自马萨诸塞州比勒利卡的EMD密理博公司)和生物素化的抗人多效生长因子山羊IgG(购自明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)进行多效生长因子夹心ELISA免疫测定。3B10抗体在PBS中稀释至0.5μg/TMmL,在96孔板中以100μL/孔,4℃下孵育过夜。用每孔250μL PBST(PBS,0.05%吐温 20)将孔洗涤3次。每孔用250μL PBS在4℃下终止所述孔2小时,所述PBS含有3%BSA和TM
0.2%吐温 20。不经洗涤,将板倒置,并对着纸巾用力敲击来使板干燥。将100μL的甲状TM
腺洗脱样品在200μL PBSTA(PBS,1%BSA,0.5%吐温 20)中稀释。将100μL稀释样品一式两份转移至板中。将所述板在室温下温和搅拌孵育2小时,然后用每孔250μL PBST洗涤3次。轻敲倒置的板以除去残余的液体后,将生物素化的抗人多效生长因子山羊IgG以
500ng/mL的浓度加入,并稀释在含5.7mEq/L氯化和0.5%BSA pH为6的0.9%的生理盐水中。将所述板在室温下温和搅拌孵育1小时。用每孔250μL PBST将孔洗涤5次。轻敲倒置的板以除去残余的液体后,将100μL链霉亲和HRP偶联物溶液(伊利诺伊州罗克福德的赛默科技公司(Thermo Scientific))以PBS中25ng/mL的浓度加入至每个孔中,将板在室温下温和搅拌孵育30分钟。用PBST洗涤5次后,将100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)加入到每个孔中。将板用铝箔覆盖,并在室温下孵育7分钟。加入100μL终止液终止显色。用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。批内变异系数对高浓度为5.1%,对低浓度为7.3%。批间变异系数为6.4%。通过与对照比较,计算样品中的多效生长因子的绝对浓度,所述对照由已知浓度的重组人多效生长因子稀释数倍组成。
[0092] 对每个洗脱的等分试样也进行甲状腺球蛋白(Tg)测定。简单地说,50μL甲状腺洗脱样品在生理盐水中稀释10倍,甲状腺球蛋白浓度根据制造商的说明用化学发光免疫分析测定(Immulite 2000XPi,英国西门子公司)来检测。甲状腺球蛋白试剂(美国西门子医疗诊断公司)用于在需要时进一步稀释各个样品。
[0093] 对每个结节,对多针刺的多效生长因子(PTN)浓度或者多效生长因子与甲状腺球蛋白的比值(PTN/Tg)取平均以获得单一的平均值。使用SigmaPlot软件(版本12)进行统计分析。在将多效生长因子浓度和甲状腺球蛋白浓度这两个变量作对数变换后,通过Pearson相关来分析两者之间的关系。通过T-检验比较良性结节对恶性结节中的多效生长因子和PTN/Tg。P值<0.05被认为是显著的。
[0094] PTN在正常甲状腺组织的平均浓度为29±13pg/mL。来自PTC组织的样品中的PTN浓度比来自良性结节的样品中的高(85±25pg/mL对比35±11pg/mL,平均值±SEM,p=0.01)(表和图5)。相反地,来自PTC组织的样品中的甲状腺球蛋白浓度比来自良性结节的样品中的低(59.4±24μg/mL对比664±146μg/mL,p=0.008)(表和图5)。
[0095] PTN和PTN/Tg值以及病理结果列于下表中。
[0096] 表.具有病理学结果的多效生长因子和多效生长因子/甲状腺球蛋白的比例[0097]
[0098] 本实施例的结果表明,FNA洗脱样品中的多效生长因子水平在乳头状甲状腺癌组织中比在正常甲状腺组织或良性甲状腺结节中的高。
[0099] 实施例5
[0100] 本实施例说明了用于诊断甲状腺结节的方法,所述诊断是通过确定甲状腺结节的样品中的多效生长因子与甲状腺球蛋白的比例。
[0101] 根据实施例4中所描述的测定结果计算多效生长因子与甲状腺球蛋白的比例(PTN/Tg)。在正常甲状腺组织中的平均PTN/Tg比例为2950±888pg/mg。PTN/Tg的比值在良性结节中较低,所述良性结节包括腺瘤样/胶体结节、滤泡性腺瘤和在受慢性淋巴细胞性甲状腺炎影响的甲状腺中的良性结节(图6A和6B)。在乳头状甲状腺癌组织中的PTN/Tg比值高于在良性结节中的比值(9490±4730pg/mg对比357±145pg/mg,P<0.001)(图6A和6B)。PTN/Tg比例并未显现出与结节大小有关联。获取自患有Graves病患者的良性结节的样品表现出较高的多效生长因子与甲状腺球蛋白比例(图6B)。
[0102] 本实施例的结果表明,在FNA洗脱样品中的多效生长因子与甲状腺球蛋白的比例在乳头状甲状腺癌组织中比在良性甲状腺结节中高。
[0103] 在本申请中引用的所有参考文献,包括出版物、专利申请和专利,通过引用并入本申请,如同每个参考文献被单独并具体地指出以通过引用被并入本申请并且在本申请中全部阐述。
[0104] 在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中),使用术语“一”和“一个”和“该”和“至少一个”和类似指代被解释为同时包括单数和复数,除非本申请另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一个”连有一个或多个项目的列表(例如,“A和B的至少一个”),该术语的使用应被解释为是指从列出的项目中选出的一个项目(A或B)或所列项目(A和B)两个或更多个的任意组合,除非在此另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明,术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”将被理解为开放式术语(即,意思是“包括但不限于”)。除非在此另有说明,本文数值范围的描述仅旨在用作在该范围内单独参考各个分别数值的速记方法,并且各个分别的值被并入说明书中,如同在本申请中单独列举一样。可以以任何合适的顺序进行本申请所描述的所有方法,除非在此另外指出或另外与上下文明显矛盾。本申请中所提供任何和所有实施例,或示例性语言的使用(例如,“如”),仅仅是为了更好地阐明本发明,而不会构成对本发明范围的限制,除非另有说明。说明书中的任何语言不应被解释为表示任何未要求保护的元素作为实践本发明的必需元素。
[0105] 在本申请中描述了本发明的优选实施方式,包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前面的描述后,这些优选实施方式的变化对于本领域的普通技术人员可以是明显的。发明人期望技术人员酌情采用这些变化,并且发明人希望本发明也可以以不同于这里具体描述的方式来实践。因此,本发明包括本申请所附的权利要求中所述主题的由适用法律所允许的所有修改和等同物。此外,本发明包括在所有可能的变化中的上述元素的任何组合,除非本申请中另外指出或与上下文明显矛盾。
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