면역검정 표준물 및 검정내 보정 표준물을 사용한 임상 바이오마커의 측정

면역검정 표준물 및 검정내 보정 표준물을 사용한 임상 바이오마커의 측정{IMMUNOASSAY STANDARDS AND MEASUREMENT OF CLINICAL BIOMARKERS USING INTRA-ASSAY CALIBRATION STANDARDS}

본 발명은 면역검정에서 임상 바이오마커를 측정하기 위한 참조 표준물 및 캘리브레이터 (calibrator)로서 사용될 수 있는 신규한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물을 사용하는 방법 및 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

아밀로이드 베타 (Aβ) 펩티드는 베타 세크레타제 및 감마 세크레타제 효소 복합체를 통해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 절단으로부터 생성된다 (Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006)). 베타 세크레타제는 이들 아밀로이드 펩티드의 N-말단부를 생성하고, 감마 세크레타제는 C-말단부를 생성한다 (Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006)). 후속적으로 감마 세크레타제가 APP를 절단하는 위치에 따라 일반적으로 38 내지 42개 아미노산 길이의 몇몇 종의 펩티드가 생성된다. Aβ 펩티드는 세포외 도메인 (아미노산 1-28) 및 지질 이중층 내에 끼워진 막횡단 영역 (아미노산 29-42)을 갖는다. 42개 아미노산 길이의 아밀로이드 펩티드 (Aβ ₄₂ )는 단독으로 또는 응집체로서 추정 신경독성 종으로 생각된다. 이들 응집체는 알츠하이머병 및 치매를 야기하는 뇌의 신경변성에 기여하는 것으로 생각된다. Aβ ₄₂ 가 임상 치매에 기여한다는 가설은 문헌 [Hardy et al. (Science, 256:184-185 (1992))]에 설명된 바와 같이 아밀로이드 캐스케이드 가설로 불린다.

Aβ 펩티드의 특성 중의 하나는 생리학적 농도에서 올리고머로 자가조립되는 능력이다 ([Burdick et al., Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992)]; [Cerf et al., Biochemical Journal, 421:415-423 (2009)]). Aβ ₄₂ 종은 Aβ ₄₀ 및 Aβ ₃₈ 종에 비해 올리고머를 형성하는 경향이 더 크다. 올리고머 형성의 메카니즘은 역평행 방식으로 Aβ 펩티드의 결합을 매개하는 아미노산 16 내지 20에 위치하는 작은 5개의 아미노산 영역 (KLVFF)으로부터 기원하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 작은 영역은 "응집 도메인"으로 언급된다 (Tjernberg et al., Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996)). Aβ 펩티드 응집체는 특히 보다 낮은 pH 범위에서 특정 조건 하에 신속하게 (즉, 수분 내에) 조립되고, 중성 또는 더 높은 pH에서 경미하게 더 느린 속도를 보인다 (Burdick et al., Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992)). 응집체는 특히 염의 존재 하에 수용액 내에서 난용성이다. Aβ 펩티드의 C-말단부는 염 다리를 통해 이량체의 코어를 다시 접어 그의 소수도를 증가시키고 펩티드의 필라멘트 또는 피브릴로의 추가의 중합을 촉진한다. Aβ ₄₂ 종 내의 추가의 2개의 C-말단 잔기는 다른 Aβ 종에 비해 증가된 소수성을 제공한다 (Kim et al., Journal of Biological Chemistry, 280:35069-35076 (2005)).

임상 데이터는 치매 및 인지 저하의 정도가 Aβ ₄₀ 또는 Aβ ₃₈ 종보다 Aβ ₄₂ 농도에 더 높은 연관성을 갖는다는 것을 시사한다. Aβ ₄₂ 의 신속한 응집 특성과 함께 상기 관찰은 Aβ ₄₂ 응집의 억제가 임상적 이로움을 가질 수 있다는 가설을 유도하였다. Aβ ₄₂ 응집체의 형성을 억제하기 위해 사용될 수 있는 상이한 메카니즘을 보여주는 많은 연구가 존재한다. 문헌 [Tjernberg et al., Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996)]은 응집 도메인을 포함하는 펩티드가 Aβ 펩티드에 잘 결합하고 응집체의 형성을 억제함을 보여주었다. 응집 도메인에 결합하는 몇몇 다른 분자도 아밀로이드 펩티드 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌다 ([Martharu et al., Journal of Neurological Sciences, 280:49-58 (2009)]; [Kim et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 303:576-279 (2003)]). 응집 코어 도메인 내의 아미노산의 치환 또는 전체 응집 도메인의 결실도 Aβ 펩티드 응집 및 피브릴 형성을 억제한다 (Tjernberg et al., Journal of Biological Chemistry, 274:12619-12625 (1999)). 또한, Aβ ₄₂ 및 관련 펩티드 종의 양을 저하시키기 위해 감마 세크레타제 활성을 억제하는 다양한 약물이 설계되었다. 임상에서 이들 방법의 유용성은 현재 조사 중이다.

Aβ ₄₂ 의 생성을 억제하거나 그의 응집을 방지하는 분자의 효과를 평가하기 위해서, Aβ ₄₂ 의 양을 정확하게 측정하는 것이 필요하다. 면역검정 ([Olsson et al., Clinical Chemistry, 51:336-345 (2005)]; [Verwey et al., Journal of Immunological Methods, 348:57-66 (2009)]; [Sjogren et al., Journal of Neural Transmission, 107:563-679 (2000)]) 및 질량 분광측정법 (MS) 기반 방법 ([Cantone et al., Journal of Neuroscience Methods, 180:255-260 (2009)]; [Journal of Mass Spectrometry, 40:142-145 (2005)])을 모두 포함하는 생물학적 샘플 내의 Aβ ₄₂ 를 검출 및 정량하기 위해 사용되는 몇몇 기술이 존재한다. 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법과 함께 MALDI-TOF 및 SELDI-TOF를 포함하는 MS 기반 방법은 생물학적 샘플 내의 많은 아밀로이드 베타 종을 검출할 수 있지만, 현재 임상 샘플 내의 Aβ ₄₂ 측정에 필요한 충분한 정량값을 제공하지 못한다.

면역검정 방법은 N-말단에 특이적인 하나의 항체 및 Aβ ₄₂ C-말단에 고도로 특이적인 (즉, 다른 Aβ 펩티드 종을 인식하지 않는) 제2 항체를 포함하는 이중 샌드위치 면역검정을 기초로 한다. 면역검정의 2개의 기본적인 버전이 존재한다. 제1 버전은 고체 표면 고정된 N-말단부 영역 특이적 항체를 통해 생물학적 샘플 내의 Aβ 펩티드를 포획한다. 태그를 보유하는 Aβ ₄₂ 특이적 항체는 항체 샌드위치를 완성하기 위해 면역검정에 첨가된다. 제2 버전은 고체 표면 상에 고정된 Aβ ₄₂ C-말단 영역 특이적 항체를 통해 생물학적 샘플 내의 Aβ 펩티드를 포획한다. 태그를 보유하는 N-말단 영역 특이적 항체가 면역검정에 첨가된다. 어느 버전에서든, 제2 항체를 통해 통합된 태그에 의해 완전한 복합체 검출할 수 있다. 이들 검정은 생물학적 샘플 대신 첨가되는 Aβ ₄₂ 참조 표준물을 사용하여 정량적으로 수행된다. 참조 표준물로부터 측정된 생성되는 신호는 생물학적 샘플 내의 Aβ ₄₂ 의 양을 후속적으로 정량하기 위해 사용되는 표준 곡선을 생성하기 위해 사용된다.

현재까지, 면역검정에서 Aβ ₄₂ 참조 표준물의 사용은 최소의 어려움으로 일반적으로 생성되는 합성 전장 Aβ ₄₂ 펩티드에 의존하였다. 그러나, 이들 펩티드는 강한 소수성 특성을 갖고, 따라서 수용액 내에서 가용성이 아니다. 또한, Aβ ₄₂ 의 참조 표준물로서의 보관 및 사용은 많은 문제를 제시한다. 논의된 바와 같이, Aβ ₄₂ 형태는 신속하게 응집하고, 이러한 형성은 실온 및 중성 pH에서 보다 쉽게 발생한다. 저온 (-20℃ 미만) 및 낮은 pH에서의 장기 보관은 보관 동안 응집의 최소화에 도움이 되지만, 응집을 방지하지는 못한다. 또한, 면역검정에 적용될 수 있는 Aβ ₄₂ 의 완충제 내에서의 재구성은 곤란한 것으로 입증될 수 있다. 이들 용액은 거의 항상 수성이고, 중성 pH에서 완충되고, 염을 함유하고, 실온에서 사용되고; 이들 모든 조건은 Aβ ₄₂ 응집을 촉진한다. 응집된 Aβ ₄₂ 펩티드는 불용성 침전물, 및 검출 또는 포획 항체에 의해 인식되는 크기 및 이용가능성 둘 모두의 비-균일성 때문에 면역검정에서 참조 표준물로서 유용하지 않다.

따라서, 본 발명은 유체 또는 조직 추출물 샘플에서 Aβ ₄₂ 펩티드의 풍부도를 정확하게 측정하기 위한 면역검정 또는 다른 포맷에서 참조 표준물 또는 캘리브레이터로서 사용될 수 있는 Aβ ₄₂ 펩티드 또는 단백질 구축물 및 그의 조성물을 생성하기 위한 유용한 방법을 제공함으로써 당업계의 요구 사항을 충족시킨다. 구체적으로, 본 발명의 조성물 및 방법의 목적은 면역검정 포맷에서 사용하기 위한 Aβ ₄₂ 에 대한 비-응집성 펩티드 참조 표준물의 생성이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 측정 및 정량하기 어려운 많은 다른 펩티드에 대한 광범한 적용가능성을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 N-말단 면역반응성 영역, C-말단 면역반응성 영역 및 링커 영역을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단 면역반응성 영역, C-말단 면역반응성 영역 및 링커 영역을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 면역검정에서 참조 표준물로서 사용된다. 한 실시양태에서, 면역검정은 샌드위치 면역검정, 단일 항체 검정, 이중 샌드위치 면역검정 및 경쟁 검정으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 단백질, 펩티드, 단편 및 변형된 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, N-말단 면역반응성 영역은 Aβ ₄₂ , Aβ ₄₀ , Aβ ₃₈ , 타우 또는 인슐린 성장 인자 수용체 1에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, C-말단 면역반응성 영역은 Aβ ₄₂ , Aβ ₄₀ , Aβ ₃₈ , 타우 또는 인슐린 성장 인자 수용체 1에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 영역은 비-면역반응성 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 링커 영역은 폴리에틸렌 글리콜, 글루타민 잔기, 알라닌 잔기, 리신 잔기, 지질, 구상 (globular) 단백질, 핵산 (비제한적으로 DNA, RNA 및 PNA 포함) 및 알킬 쇄로 이루어진 군 중에서 선택된 링커를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 갖는 단리된 펩티드 분자를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 참조 표준물을 적어도 2개의 비드에 부착시켜 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트를 형성하고, 여기서 참조 표준물은 제1 검출 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하고, 각각의 비드 세트는 상이한 농도의 참조 표준물을 포함하고; 분석물에 특이적인 포획 항체를 제3 비드 세트에 부착시키고; 모든 비드 세트를 함께 혼합하여 현탁액 어레이를 형성하고; 생물학적 샘플을 현탁액 어레이에 적용하여 분석물을 제3 비드 세트 상의 포획 항체에 결합시키고; 제1 검출 항체를 현탁액 어레이에 첨가하고, 여기서 제1 검출 항체는 포획 항체에 결합된 분석물 및 참조 표준물에 결합하고; 제1 비드 세트에서 참조 표준물에 결합된 제1 검출 항체로부터의 제1 신호를 측정하고; 제2 비드 세트에서 참조 표준물에 결합된 제1 검출 항체로부터의 제2 신호를 측정하고; 제1 및 제2 신호를 기초로 하여 표준 곡선을 생성하고; 제1 검출 항체로부터의 제3 신호를 측정하고 제3 신호를 표준 곡선 상의 제1 및 제2 신호 측정치와 비교함으로써 제3 비드 세트 내의 분석물의 양을 정량하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플 내의 분석물의 양을 측정하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 참조 표준물은 N-말단 면역반응성 영역, C-말단 면역반응성 영역 및 링커 영역을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 표준물은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 변형된 펩티드를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 말초 혈액 단핵 세포, 말초 혈액 림프구, 조직, 뇌척수액 및 세포로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 분석물은 Aβ ₄₂ , Aβ ₄₀ , Aβ ₃₈ , 타우 또는 인슐린 성장 인자 수용체 1로 이루어진 군 중에서 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 다중웰 플레이트, 니트로셀룰로스 필터, 유리 섬유에서 또는 유리 슬라이드 상에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 신호 및 제2 신호는 피코에리트린, 알렉사 (Alexa) 532, 스트렙타비딘-피코에리트린 및 스트렙타비딘-알렉사 532로 이루어진 군 중에서 선택된 신호이다. 또 다른 실시양태에서, 참조 표준물은 비드에 공유 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 항체는 비드에 공유 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 공유 부착은 카르보디이미드 결합이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ ₄₂ 펩티드를 검출하는 면역검정을 수행하기 위한, 본 발명의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

표의 간단한 설명

표 1은 Aβ 펩티드의 바람직한 물리적 특성 및 상기 특성 측정에 사용된 시험을 보여준다.

표 2는 Aβ ₄₂ 펩티드 및 변형된 펩티드 서열 및 설명을 보여준다.

표 3은 타우 펩티드 및 변형된 펩티드 서열 및 설명을 보여준다.

표 4는 3개의 인간 뇌척수액 (CSF) 샘플 내의 Aβ ₄₂ 펩티드의 측정된 농도를 보여준다.

표 5는 특징분석된 신규한 Aβ 펩티드의 목록을 보여준다.

표 6은 동적 광 산란 (DLS) 데이터의 요약을 보여준다.

도 1은 양측 (two-sided) 또는 샌드위치 가용성 표준물의 개략도를 보여준다.
도 2는 예시적인 Aβ ₄₂ 샌드위치 면역검정으로부터의 보정 곡선을 보여준다.
도 3은 변형된 Aβ ₄₂ 펩티드 표준물을 사용한 예시적인 Aβ ₄₂ 샌드위치 검정을 보여준다.
도 3a는 변형된 표준물 2 (서열 2) 및 4 (서열 4)로부터의 보정 곡선을 보여준다.
도 3b는 변형된 표준물 12 (서열 12) 및 13 (서열 13)으로부터의 보정 곡선을 보여준다.
도 3c는 변형된 표준물 14 (서열 14) 및 6 (서열 6)으로부터의 보정 곡선을 보여준다.
도 4는 Aβ ₄₂ 검정내 비드 접근법의 개략도이다.
도 5a는 상이한 농도의 Aβ 1-40 펩티드 (서열 15)를 사용하여 공유 결합된 6개의 상이한 루미넥스 (Luminex) 비드 세트의 측정된 중앙값 형광 강도 (MFI)를 보여준다.
도 5b는 도 2에 도시된 곡선과 유사한, Aβ ₄₀ 검정내 표준물 (원)로부터의 또는 가용성 표준물로서 천연 Aβ ₄₂ 펩티드 (삼각형)로부터의 4-PL 생성된 보정 곡선을 보여준다.
도 5c는 가용성 Aβ ₄₂ 펩티드로부터 또는 검정내 Aβ ₄₀ 표준물로부터 생성된 보정 곡선을 사용하여 인간 CSF 샘플에서 측정된 Aβ ₄₂ 펩티드를 보여준다.
도 6은 인간 말초 혈액 단핵 세포 용해물 내의 인산화된 인슐린 성장 인자 수용체 1 (IGF-R1)의 수준을 보여준다. 4 파라미터 보정 곡선을 상이한 비드 세트에 대한 MFI 값으로부터 생성하고 (도 6a), PBMC 용해물 내의 인산화된 IGF-R1의 상대적인 수준을 결정하기 위해 사용하였다 (도 6b).
도 7은 DLS 데이터를 보여주는 것이다.
도 8은 원편광 이색성 (circular dichroism) 분석을 보여준다.
도 9는 펩티드 안정성 데이터를 보여준다. 전장 Aβ ₄₂ 및 7개의 변형된 펩티드를 40일까지 동안 상이한 온도에서 안정성 연구에 적용하였다 (도 9a-9f).
도 10은 전장 Aβ ₄₂ 와 7개의 변형된 펩티드 사이의 표준 곡선 비교를 보여준다.
도 11은 전장 대 변형된 펩티드의 표준 곡선 분석을 보여준다.
도 12는 전장 대 변형된 펩티드를 사용한 CSF 샘플 분석을 보여준다.
도 13은 변형된 Aβ _(1-42) 펩티드 내에 통합된 폴리에틸렌 글리콜 스페이서의 구조를 보여준다.

본 발명은 본 발명의 바람직한 실시양태의 아래에서 제시된 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.

본 발명은 면역검정에서 임상 바이오마커를 측정하기 위한 참조 표준물 및 캘리브레이터로서 사용될 수 있는 신규한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물을 사용하는 방법 및 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물 및 방법은 면역검정 포맷에서 사용하기 위한 Aβ ₄₂ 또는 타우에 대한 비-응집성 펩티드 참조 표준물을 생성하는 것으로 목적으로 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Aβ"는 아밀로이드 베타를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Aβ ₄₂ "는 아밀로이드 베타 1-42를 나타낸다. "Aβ ₄₂ "는 표 2, 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 42개 아미노산 길이의 펩티드를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Aβ ₃₈ "은 아밀로이드 베타 1-38을 나타낸다. "Aβ ₃₈ "은 서열 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG (서열 17)을 갖는 38개 아미노산 길이의 펩티드를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Aβ ₄₀ "은 아밀로이드 베타 1-40을 나타낸다. "Aβ ₄₀ "은 표 2, 서열 15에 나타낸 40개 아미노산 길이의 펩티드를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "타우"는 표 3, 서열 20에 나타낸 아미노산 서열에 대응하는 천연 타우 단백질을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (즉, 이중특이적 항체), 및 선택된 항원에 대한 결합 활성 또는 친화도를 보이는 항체 단편 (즉, Fab, F(ab') ₂ 및 Fv)를 포함한다. 또한, "항체"는 단리된 항체와 동일한 특성을 갖는, 담체 단백질/유기체, 예컨대 파지 또는 다른 디스플레이 담체에 매달리거나 융합된 항체 또는 항체 단편을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상 단백질 및 단백질 복합체에 대해 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 정상적으로 단백질 또는 복합체와 함께 존재하는 (즉, 단백질 또는 복합체가 내인성으로 발견되는 세포 환경에서) 오염 단백질이 본질적으로 없는 단백질 또는 단백질 복합체의 제제를 의미한다. 따라서, 단리된 단백질 복합체는 예를 들어 그의 조절제에 대한 스크리닝 동안 단독으로 통상 복합체를 "오염"시키거나 저해하는 세포성 성분으로부터 단리된다. 그러나, 상기 "단리된" 복합체는, 그의 조절이 대상 단백질 또는 단백질 복합체에 의해 조사되는 다른 단백질을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 대해 본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 천연에서 발생하지 않는 형태의 분자를 의미한다. 또한, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연 생성되지 않고 천연 상태로 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 적절한 경우, 리보핵산 (RNA)을 의미한다. 또한, 이 용어는 뉴클레오티드 유사체로 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체, 및 설명되는 실시양태에 적용가능한 단일가닥 (예컨대 센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 동등체로서 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, "핵산"은 펩티드 핵산 "PNA" 또는 인공적으로 합성된 DNA 또는 RNA를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "정제된 단백질"은 바람직하게는 세포 또는 세포 용해물 내의 단백질(들)과 정상적으로 회합되는 다른 단백질로부터 단리되거나 이들이 실질적으로 존재하는 않는 단백질 또는 단백질들의 제제를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된 펩티드"는 펩티드의 천연 서열에 비해 변형된 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 변형은 유해한 도메인의 제거 또는 천연 펩티드 서열 내의 링커의 부가를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합"은 생리학적 조건 하에서, 예를 들어 공유, 정전기, 소수성, 이온 및/또는 수소-결합 상호작용에 의한 2개의 분자 사이의 직접적인 회합을 의미한다. 마찬가지로, 2개 이상의 폴리펩티드 사이의 "복합체 형성"은 생리학적 조건 하에서, 예를 들어 공유, 정전기, 소수성, 이온 및/또는 수소-결합 상호작용에 의한 폴리펩티드 사이의 직접적인 회합을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "도메인"은 특정 구조를 포함하고/하거나 특정 기능을 수행하는 (즉, 응집 도메인, "인산화 도메인") 단백질의 영역을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "응집 도메인"은 역평행 방식으로 Aβ 펩티드의 결합을 매개하는 아미노산 16 내지 20에 위치하는 5개 아미노산의 영역 (KLVFF (서열 18))을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역반응성 도메인"은 항체에 의해 인식될 수 있는 특정 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 영역을 의미한다. 이 영역은 변형, 예컨대 글리코실화, 메틸화, 인산화 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 번역후 변형을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 인산화될 수 있는 아미노산의 예는 티로신, 세린, 또는 트레오닌 아미노산이다. 인산화된 아미노산을 포함하는 "면역반응성 도메인"은 또한 인산화 도메인으로서 특징지을 수 있다. 또한, "면역반응성" 도메인은 함께 항체 결합 부위를 포함하는, 천연 폴딩된 (folded) 상태의 단백질 내에 서로 매우 근접하여 위치하는 단백질의 2개 이상의 영역을 포함할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "면역검정"은 생물학적 매트릭스 내의 분석물의 존재 또는 농도를 측정하기 위해 하나 이상의 항체를 이용하는 생화학적 시험을 의미한다. 상기 검정은 특이적 단백질 또는 펩티드의 면역반응성 도메인에 대한 항체의 특이적 결합에 반응하여 측정가능한 신호를 생성할 수 있다.

참조 표준물

한 측면에서, 본 발명은 임상 바이오마커를 측정하기 위해서 참조 표준물 및 캘리브레이터로서 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 참조 표준물은 펩티드를 포함한다. 펩티드는 변형된 펩티드일 수 있다. 변형된 펩티드는 비-면역반응성 도메인에 링커, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비-면역반응성 도메인은 응집 도메인 또는 인산화 도메인이다.

응집 또는 비-면역반응성 도메인 내의 변경

한 측면에서, 본 발명은 참조 표준물로서 사용될 수 있는 변형된 펩티드를 제공한다. Aβ ₄₂ 와 같은 점착성 (sticky) 펩티드와 그 자체 및 다른 분자의 자가-응집 및 비-특이적 상호작용을 유발하는 공지의 도메인 또는 아미노산 서열이 존재한다. 따라서, 이들 유해한 도메인이 결여된 표준물 또는 캘리브레이터를 구축하는 것이 가능하다. 본 발명은 유해한 도메인을 제거하기 위해서 펩티드를 변형하는 몇몇의 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 유해한 도메인을 포함하는 아미노산은 아미노산 서열로부터 제거되고, N-말단 면역반응성 도메인은, 중앙 17-20 아미노산 서열 및 Aβ ₄₂ 의 경우 다양한 길이의 인접한 C-말단 펩티드가 결여된 C-말단 면역반응성 도메인에 연결된다. 중앙 도메인이 제거된 Aβ ₄₂ 펩티드의 예는 표 2, 서열 2, 3, 및 4에 제시된다. 또 다른 실시양태에서, 중앙 응집 도메인 + 인접한 아미노산은 많은 상이한 종류의 물질로 이루어지는 링커 또는 스페이서로 교체된다.

또 다른 실시양태에서, 응집하지 않는 아미노산이 링커로서 고려된다. 한 실시양태에서, 응집하지 않는 아미노산은 친수성 스페이서 또는 아미노산 서열의 링커의 형태이거나 또는 Aβ ₄₂ 의 C-말단 37-42 서열 (서열 5) 및 Aβ ₄₂ 의 C-말단 32-42 부분 (서열 6) 둘 모두와 함께 EERP를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, Aβ ₄₂ 펩티드는 Aβ ₄₂ 의 C-말단 37-42 (서열 7) 및 C-말단 32-42 (서열 8) 부분과 함께 보다 긴 친수성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 DREPNR (서열 16)을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 일련의 하전 잔기가 N-말단과 C-말단 면역반응성 도메인 사이의 링커의 형태로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 정수 m 리신 잔기 (서열 9) 또는 정수 n 글루탐산 잔기 (서열 10)로 이루어진 링커가 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 일련의 중성 잔기가 링커로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 정수 p 알라닌 잔기 (서열 11)로 이루어진 구축물이 고려된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 다양한 형태의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 링커로서 사용된다. 바람직한 실시양태에서, PEG-6원자 및 PEG-20원자가 다양한 C-말단 부분 (서열 12-14)과 함께 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기에 연결할 수 있는 화학법과 함께 임의의 중합체가 링커 또는 스페이서로서 사용된다. 상기 중합체는 Aβ ₄₂ 의 올리고머 및 다른 유사한 점착성 또는 자가응집성 분자의 면역반응성을 자극하기 위해 선형 형태의 중합체 및 공지의 분지 형태의 중합체, 예를 들어 덴드리머 및 분지형 공중합체를 포함한다.

또한, 타우의 인산화된 영역은 참조 표준물로서 사용될 수 있는 변형된 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 비정상적으로 과다인산화된 타우는 신경섬유 매듭과 결합한다. 타우의 여러 인산화 부위가 존재하고; 이들 부위는 각각 그의 생물학적 기능에 대한 상이한 효과를 갖는다. Ser202/Thr181/Thr212/Thr231 또는 Ser262에서 인산화된 타우의 측정은 어떤 것이 MCI 대상체에서의 인지 저하와 연관성이 있는지 이해하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 변형된 타우 펩티드가 참조 표준물로서 고련된다. 변형된 타우 펩티드의 예를 표 3에 제시한다.

또 다른 실시양태에서, 링커는 다음 분자 중의 임의의 하나를 포함한다: 지질, 구상 단백질, 핵산 (비제한적으로 DNA, RNA 및 PNA 포함), 알킬 쇄, 또는 면역검정에서 관심있는 2개의 면역 에피토프의 안정성을 증가시키는 임의의 다른 연결. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 백본과 링커 사이의 결합은 공유 결합, 아비딘-비오틴 복합체 또는 임의의 다른 안정한 결합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 구축물은 자가응집 또는 관심 분석물이 측정될 수 있는 유체가 담긴 피펫 팁 (tip), 튜브, 플레이트 및 다른 용기의 실험 플라스틱, 특히 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카본 및 다른 실험 플라스틱 수지에 대한 비특이적 흡수를 유발하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 신규한 Aβ ₄₂ 또는 타우 면역검정 표준물 또는 캘리브레이터는 N-말단 특이적 항체에 의해 인식되는 N-말단 에피토프의 존재를 필요로 한다. 많은 Aβ ₄₂ N-말단 결합 항체가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 6E10은 Aβ _3-8 에피토프를 인식하는 것으로 알려진 반면, 3D6은 Aβ의 N-말단 에피토프를 인식하는 것으로 알려져 있다. 중복되는 (overlapping) 에피토프는 면역검정 요건 및 검출 시스템에 따라, 사용할 몇몇 N-말단 특이적 항체를 선택할 수 있도록 설계될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 신규한 Aβ ₄₂ 면역검정 표준물 또는 캘리브레이터는 C-말단 Aβ ₄₂ 특이적 항체에 의해 인식되는 C-말단 에피토프의 존재를 필요로 한다. 잘 특징분석된 C-말단 Aβ ₄₂ 네오-에피토프 항체의 예는 G2-11 (하이델베르크 유니버시티 (Heidelberg University)), 21F12 (아테나 다이아그노스틱스 (Athena Diagnostics)), 4D7A3 (이노제네틱스 (Innogenetics)), 및 12F4 (코방스 (Covance), 이전의 시그네트 (Signet))를 포함한다. 중복되는 C-말단 에피토프는 면역검정 요건 및 검출 시스템에 따라, 사용할 몇몇 C-말단 Aβ ₄₂ 특이적 항체를 선택할 수 있도록 설계될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 당업자에게 공지된 임의의 N-말단 결합, C-말단 결합 또는 인산화된 타우 결합 항체가 본원에서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유체 또는 조직 추출물 샘플에서 펩티드의 풍부도를 정확하게 측정하기 위한 면역검정에서 참조 표준물 또는 캘리브레이터로서 사용될 수 있는 펩티드 또는 단백질 구축물 및 그의 조성물을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 면역검정은 종종 관심있는 분석물 또는 바이오마커를 포획하기 위한 생물학상 특이적인 포획 시약, 예컨대 항체를 필요로 한다. 항체는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해, 즉 동물을 항원으로서의 바이오마커로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 바이오마커는 그의 결합 특성을 기초로 하여 샘플로부터 단리될 수 있다. 별법으로, 폴리펩티드 바이오마커의 아미노산 서열이 공지된 경우, 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 합성되고 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 바이오마커의 예에는 Aβ 펩티드 및 타우가 포함된다.

본 발명은 예를 들어 샌드위치 면역검정, 예를 들어 ELISA 또는 형광-기반 면역검정, 및 다른 효소 면역검정을 비롯한 전통적인 면역검정을 고려한다. SELDI-기반 면역검정에서, 바이오마커에 대한 생체특이적 포획 시약은 질량 분광측정법 (MS) 프로브, 예컨대 예비 활성화된 프로틴칩(PROTEINCHIP)? 어레이의 표면에 부착된다. 이어서, 바이오마커는 상기 시약을 통해 바이오칩 상에 특이적으로 포획되고, 포획된 바이오마커는 질량 분광측정법에 의해 검출된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 임상 마커를 본 발명의 참조 표준물로 측정하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 참조 표준물은 면역검정에 의해 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 면역검정은 샌드위치 면역검정이다. 또 다른 실시양태에서, 면역검정은 면역반응성 결합 부위에 대한 경쟁적 또는 "경쟁" 방식으로 종종 수행되는 단일 항체 면역검정이다. 또 다른 실시양태에서, 면역검정은 이중 샌드위치 면역검정 또는 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)이다.

바람직한 실시양태에서, 임상 마커의 측정 방법은 참조 표준물을 적어도 2개의 비드에 부착시켜 제1 비드 세트 및 제2 비드 세트를 형성하고, 여기서 참조 표준물은 제1 검출 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하고, 각각의 비드 세트는 상이한 농도의 참조 표준물을 포함하고; 분석물에 특이적인 포획 항체를 제3 비드 세트에 부착시키고; 모든 비드 세트를 함께 혼합하여 현탁액 어레이를 형성하고; 생물학적 샘플을 현탁액 어레이에 적용하여 분석물을 제3 비드 세트 상의 포획 항체에 결합시키고; 제1 검출 항체를 현탁액 어레이에 첨가하고, 여기서 제1 검출 항체는 포획 항체에 결합된 분석물 및 참조 표준물에 결합하고; 제1 비드 세트에서 참조 표준물에 결합된 제1 검출 항체로부터의 제1 신호를 측정하고; 제2 비드 세트에서 참조 표준물에 결합된 제1 검출 항체로부터의 제2 신호를 측정하고; 제1 및 제2 신호를 기초로 하여 표준 곡선을 생성하고; 제1 검출 항체로부터의 제3 신호를 측정하고 제3 신호를 표준 곡선 상의 제1 및 제2 신호 측정치와 비교함으로써 제3 비드 세트 내의 분석물의 양을 정량하는 단계를 포함하는 면역검정을 사용하여 수행된다. 비드 세트는 복합 (multiplexed) 정보가 특정 검출 기술 또는 기기로 독립적으로 측정될 수 있는 임의의 다른 고체 상으로 교체될 수 있음이 본 발명에의 제한없이 이해된다.

한 실시양태에서, 참조 표준물은 본원에서 설명되는 조성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 말초 혈액 단핵 세포, 말초 혈액 림프구 조직, 뇌척수액 및 세포로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 분석물은 Aβ ₄₂ , Aβ ₄₀ , Aβ ₃₈ , 타우 또는 인슐린 성장 인자 수용체 1이다.

분석물 및/또는 참조 표준물은 다양한 표면에 결합될 수 있다. 표면은 항체 또는 참조 표준물이 공유 연결, 수동 흡수 (passive absorbance), 비오틴-스트렙타비딘 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 연결에 의해 고정될 수 있는 임의의 고체 상 표면일 수 있다. 예를 들어, 표면은 비드, 플레이트, 슬라이드, 섬유, 표면 플라스몬 공명 센서 또는 임의의 고체 표면일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 다중웰 플레이트, 니트로셀룰로스 필터 내에서 또는 유리 슬라이드 상에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 신호는 형광에 의해 검출된다. 예를 들어, 제1 신호 및 제2 신호는 피코에리트린, 알렉사 532, 스트렙타비딘-피코에리트린 및 스트렙타비딘-알렉사 532로 이루어진 군 중에서 선택된 신호일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 신호는 효소 활성 (즉, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 화학발광, 방사성, 적외선 방출, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 검출된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 참조 표준물을 포함하는, Aβ ₄₂ 또는 타우 펩티드를 검출하는 면역검정을 수행하기 위한 키트를 포함한다.

신규한 면역검정 표준물 또는 캘리브레이터와 천연 Aβ ₄₂ 의 성능 비교

신규한 면역검정 표준물 또는 캘리브레이터의 성능은 면역검정에서 천연 Aβ ₄₂ 와 대등한 성능을 가져야 한다. 천연 전장 Aβ ₄₂ 펩티드는 표준 고체 상 기법을 사용하여 합성될 수 있거나 또는 카탈로그 품목으로서 많은 판매처로부터 상업적으로 구입할 수 있다 (아나스펙 인크. (Anaspec Inc.), 어메리칸 펩티드 컴퍼니 (American Peptide Company), 또는 인비트로젠 인크. (Invitrogen Inc.)). 표준 방법은 질량 분광측정 기법, 예를 들어 당업계에 공지된 아미노산 분석을 사용하여 말단절단된 종으로부터 전장 구축물의 풍부도를 확인하기 위해 사용될 수 있다 ([Kanu et al., Journal of Mass Spectrometry, 43:1-22 (2008)]; [Bernstein et al., Journal of American Chemical Society, 127:2075-2084 (2005)]; [Li et al., Encyclopedia of Analytical Chemistry, Meyers, RA, ed., John Wiley & Sons Ltd. (2009)]).

예로서, 표 1은 Aβ ₄₂ 펩티드의 바람직한 물리적 특성 및 이들 특성을 시험하기 위해 사용된 다양한 방법을 제시한다. 이들 방법은 참조 표준물의 특성이 천연 Aβ ₄₂ 펩티드의 것에 필적하는지 결정하기 위해 사용될 수 있다.

항체 기반 면역검정에서 변형된 참조 표준물 또는 캘리브레이터의 용도

본 발명의 또 다른 측면에서, 변형된 참조 표준물이 단일 항체 기반 검정에서 사용된다. 한 실시양태에서, 단일 항체를 포함하는 면역검정은 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 샘플에서 Aβ ₄₂ 또는 타우를 측정하기 위해 사용될 수 있다. Aβ ₄₂ 또는 타우에 특이적인 단일 항체는 고체 표면, 예컨대 마이크로타이터 플레이트의 웰, 비드, 또는 다른 면역검정 관련 표면에 고정된다. 항체는 많은 상이한 방법, 예컨대 카르복실 및 아민 기의 EDC 매개 연결을 통해, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 계면을 통한 수동 흡수를 통해 공유 연결될 수 있다. 이어서, Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자는 전장 Aβ ₄₂ 또는 타우 펩티드 또는 포획 항체의 에피토프를 보유하는 변형된 버전을 함유하는 Aβ ₄₂ 또는 타우 표준물 또는 캘리브레이터로부터 생성된다. Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자는 생물학적 샘플 내의 천연 Aβ ₄₂ 또는 타우와 고정된 항체 상의 결합 부위 (파라토프 (paratope)) 간의 경쟁을 생성하기 위해 사용된다. 파라토프는 분석물 상의 에피토프 또는 면역반응성 도메인을 인식하는 항체 상의 결합 영역을 설명하기 위해 사용되는 용어이다. Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자는 검출 목적을 위해 태깅된다. 한 실시양태에서, 태그는 효소, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제이다. 또 다른 실시양태에서, 태그는 플루오레세인, 예컨대 피코에리트린이다. 또 다른 실시양태에서, 태그는 또 다른 태그, 예컨대 비오틴 또는 루테늄이다. 또 다른 실시양태에서, 태그는 핵산, 예컨대 DNA, RNA 또는 PNA이고, 이에 의해 항체의 검출은 핵산 플래그를 검출하기 위한 민감한 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 정량된다. 단일 농도의 Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자가 검정에 사용되고, 생물학적 샘플에서 발견되는 천연 수준의 Aβ ₄₂ 또는 타우와 경쟁하는 능력을 기초로 하여 결정될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 검정은 보정 곡선을 확립함으로써 정량적으로 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 정량은 전장 Aβ ₄₂ 또는 타우 펩티드 또는 포획 항체의 에피토프를 보유하는 변형된 버전인 Aβ ₄₂ 또는 타우 표준물 또는 캘리브레이터의 세트를 제조함으로써 수행한다. 이들 태깅되지 않은 표준물 또는 캘리브레이터는 Aβ ₄₂ 또는 타우를 함유하지 않는 완충제 또는 생물학적 매트릭스 내에 제조된다. 한 실시양태에서, 보정 곡선은 태깅되지 않은 표준물 또는 캘리브레이터의 농축물의 하나를 고정된 항체에 대한 태깅된 Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자와 혼합함으로써 확립된다. 각각의 시험된 농도의 태깅되지 않은 표준물 또는 캘리브레이터로부터 생성되는 신호 값을 사용하여, 태깅되지 않은 Aβ ₄₂ 또는 타우 표준물 또는 캘리브레이터의 농도 대 생성되는 신호 값을 플로팅 (plotting)한 표준 곡선을 생성한다. 표준 정량 곡선이 확립되면, 검정은 동일한 고정된 농도의 태깅된 Aβ ₄₂ 또는 타우 경쟁자를 생물학적 샘플과 혼합함으로써 생물학적 샘플 내의 천연 Aβ ₄₂ 또는 타우의 수준을 결정하기 위해 사용된다. 생성되는 신호 값은 생물학적 샘플 내의 Aβ ₄₂ 또는 타우의 수준을 결정하기 위해 표준 곡선 상에 플로팅된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 변형된 참조 표준물은 샌드위치 기반 면역검정에 사용된다.

검정내 참조 표준물 기반 면역검정에서 변형된 표준물 또는 캘리브레이터의 용도

본 발명의 또 다른 측면에서, Aβ ₄₂ 또는 타우 펩티드는 검정내 보정 시스템에 도입된다. 상기 접근법에서, 다양한 면역검정 포맷, 예컨대 루미넥스 비드 기반 시스템 또는 메조-스케일 디스커버리 (Meso-Scale Discovery) ECL 플레이트 기반 시스템이 사용될 수 있다. 검출 항체의 항체 결합 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드가 생성된다. 한 실시양태에서, 이들 펩티드는 이들이 고체 상에 공유 연결될 수 있도록 하는 변형 또는 수성 면역검정에서 그의 용해도 및 용도를 증가시키는 변형을 포함한다. 이들 펩티드는, 그로부터 표준 곡선을 생성하는 잘 규정된 표준물 세트를 생성하기 위해 복합 면역검정 시스템에 의해 규정된 관련 고체 상에 상이한 농도로 고정된다.

임상 샘플 내의 가용성 바이오마커의 측정은 종종 이중 항체 샌드위치 검정을 사용하여 수행된다. 이들 검정은 바이오마커에 특이적인 2개의 항체, 및 제2 "리포터" 또는 "검출" 항체를 사용하여 포획된 바이오마커를 검출하는 기술을 필요로 한다. 단백질 참조 표준물은 검정을 정량적으로 수행하기 위해 필요하다. 이들 표준물은 종종 재조합 단백질의 형태이지만; 이들은 또한 생물학적 샘플로부터 얻을 수 있다. 이들 검정을 위한 전통적인 검정 포맷은 임상 샘플의 분석에 적합한 정량을 제공하는 ELISA 기법을 포함한다. 그러나, 이들은 종종 하나의 바이오마커 검정/웰로 제한된다. 단일 웰 또는 반응 용기에서 여러 바이오마커의 분석을 허용하는 보다 새로운 기술이 개발되었다. 몇몇의 복합 기술은 고체 표면, 예를 들어 유리 슬라이드 또는 특화된 (specialized) 마이크로타이터 플레이트에 배치된 항체를 이용한다. 또 다른 접근법은 어레이를 형성하기 위해 함께 용액 내에 혼합된 라텍스 비드에 항체가 결합된 현탁액 어레이를 통해 수행된다.

한 실시양태에서, 현탁액 어레이 기술이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 현탁액 어레이 기술은 루미넥스 xMAP 기술이다. 루미넥스 xMAP 기술은 특정 비율의 2가지 형광 염료를 함유하는 라텍스 비드를 사용한다. 상이한 비드 '세트'는 이들 2가지 염료의 비율을 변경함으로써 생성된다. 비드는 함께 혼합되어 현탁액 어레이를 형성한다. 비드 혼합물은 레이저 앞을 통과할 때의 형광 비에 의해 각각의 비드를 확인하는 기기에 의해 분석된다. 이들 비드 세트는 단백질, 펩티드, 항체 등과 같은 분자의 공유 부착을 위해 사용되는 상이한 변형을 그의 표면 상에 갖는다. 이에 의해, 이들 비드의 표면에 대한 검정이 수행될 수 있다. 검정은 관심있는 분석물에 대해 작용하는 리포터 항체에 대한 제3 형광 표지, 예컨대 피코에리트린의 혼입을 통해 정량된다. 기기 내의 제2 레이저는 비드가 기기를 통해 이동할 때 상기 리포터 표지의 형광을 측정한다.

실시예

실시예 1 - Aβ ₄₂ 를 측정하기 위해 사용될 수 있는 샌드위치 기반 검정

양측 또는 샌드위치 가용성 표준물의 개략도가 도 1에 제시된다. 간단히 설명하면, Aβ ₄₂ 의 C-말단에 특이적인 포획 항체를 고체 표면에 고정하였다. 생물학적 샘플을 첨가하여, Aβ ₄₂ 가 고정된 항체에 의해 포획되도록 하였다. Aβ ₄₂ 의 N-말단에 특이적인 제2의 태깅된 검출 항체를 첨가하였다. 태깅된 검출 항체에 의해 생성된 측정된 신호를 정량을 위해 사용하였다.

Aβ ₄₂ 를 측정하기 위해 사용될 수 있는 샌드위치 검정의 예를 도 2에 제시한다. 간단히 설명하면, 비오틴 표지된 항-C-말단 Aβ ₄₂ 항체 (565)를 96웰 메조-스케일 디스커버리 스트렙타비딘 코팅 플레이트 (메조스케일 디스커버리 인크. (MesoScale Discovery Inc., 미국 메릴랜드주 게이터스버그) (MSD))에 고정하였다. 참조 표준물 Aβ ₄₂ 펩티드 (천연 서열을 갖는 전장)를 상이한 웰에 첨가하였다. Aβ ₄₂ 펩티드를 고정된 포획 항체에 의해 포획하였다. Aβ ₄₂ 의 N-말단에 대한 제2 루테늄 태깅된 (Ru) 항체 (26D6)를 첨가하여 샌드위치를 완성하였다. 복합체는 ECL을 이용한 MSD 섹터 6000 기기를 사용하여 검출하였다. 기기에 의해 측정된 원 형광 단위 (RFU)를 4-파라미터 로지스틱 (logistic) 모델에 피팅하여 표준 곡선을 생성하였다. 또 다른 예에서, 몇몇의 변형된 Aβ ₄₂ 펩티드가 참조 표준물로서 사용된다 (표 2, 서열 2, 4, 6, 12, 13, 및 14). 이들 변형된 캘리브레이터에 의해 생성된 표준 곡선을 도 3에 제시한다.

또한, 면역검정은 타우를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 참조 표준물로서 사용될 수 있는 변형된 타우 펩티드 서열의 예는 아래 표 3에 제시된다.

실시예 2 - 생물학적 샘플에서 Aβ ₄₂ 를 측정하는 샌드위치 Aβ ₄₂ 검정

생물학적 샘플에서 Aβ ₄₂ 를 측정하는 샌드위치 Aβ ₄₂ 검정의 예를 표 3에 제시한다. 비오틴 표지된 항-C-말단 Aβ ₄₂ 항체 (565)를 96웰 MSD 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 고정하였다. 참조 표준물 Aβ ₄₂ 펩티드 (천연 서열을 갖는 전장) 또는 변형된 Aβ ₄₂ 참조 표준물 (서열 2)을 상이한 웰에 첨가하였다. 상이한 희석률의 인간 CSF 샘플을 상이한 웰에 넣었다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 Aβ ₄₂ 펩티드가 고정된 포획 항체에 포획되도록 하였다. Aβ ₄₂ 의 N-말단에 대한 제2 루테늄 태깅된 (Ru) 항체 (26D6)를 첨가하여 샌드위치를 완성하였다. 복합체는 ECL을 이용한 MSD 섹터 6000 기기를 사용하여 검출하였다. 기기에 의해 측정된 원 형광 단위 (RFU)를 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅하여 표준 곡선을 생성하였다. 인간 CSF 샘플 내의 Aβ ₄₂ 의 측정된 농도를 표 3에 제시한다.

실시예 3 - Aβ 펩티드 기반 검정내 루미넥스 검정

도 4는 Aβ ₄₂ 검정내 비드 접근법의 개략도를 보여준다. 상이한 농도의 Aβ ₄₂ 표준물 펩티드 (또는 다른 천연 또는 변형된 Aβ 펩티드)와 커플링된 비드 세트는 항-Aβ ₄₂ -C-말단 특이적 포획 항체와 커플링된 비드 세트와 조합되어 현탁액 어레이를 형성한다. 어레이를 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션하고, 여기서 생물학적 샘플 내의 Aβ ₄₂ 펩티드는 항-Aβ ₄₂ 포획 항체와 커플링된 비드에 의해 포획된다. Aβ ₄₂ 펩티드의 N-말단에 특이적인 태깅된 검출 항체를 현탁액 어레이에 첨가하여, 포획된 Aβ ₄₂ 펩티드에 대한 결합 및 또한 그의 표면에 Aβ ₄₂ 펩티드가 커플링된 비드에 대한 결합을 유도한다. Aβ ₄₂ 펩티드가 그의 표면에 커플링된 비드로부터 얻은 MFI 값을 사용하여 검정내 보정 곡선을 생성한다. 생물학적 샘플 내의 Aβ ₄₂ 의 양은 검정내 표준 곡선을 사용하여 항-Aβ ₄₂ 포획 항체와 커플링된 비드 상의 포획된 Aβ ₄₂ 의 양으로부터 결정된다.

항체 및 참조 표준물

천연 전장 Aβ ₄₂ 및 전장 Aβ ₄₀ 펩티드 (각각 서열 1 및 15)를 어메리칸 펩티드 컴퍼니로부터 얻었다. 116B565.1 마우스 항-인간 Aβ ₄₂ C-말단 항체 및 26D6-B2-B3 마우스 항-인간 Aβ ₄₂ N-말단 항체는 관련 BMS 소유 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 배양 상청액의 단백질-G 정제를 통해 얻었다.

피코에리트린-스트렙타비딘 접합체를 잭슨 이뮤노리써치 (Jackson Immunoresearch, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 얻었다. 트윈(Tween)-20, 1-에틸-3-[3 디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 나트륨 아지드, IgG 비함유 소 혈청 알부민 (BSA), 및 인산나트륨은 시그마-알드리치 코포레이션 (Sigma-Aldrich Corporation, 미국 미주리주 세인트루이스)으로부터 구입하였다. 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 미디어테크 인코포레이티드 (Mediatech Incorporated, 미국 버지니아주 헌돈))로부터 얻었다. 카르복실화 루미넥스 비드는 바이오-라드 인코포레이티드 (Bio-Rad Incorporated, 미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 구입하였다. 피코에리트린 표지 염소 항-마우스 IgG 항체를 잭슨 이뮤노리써치 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 얻었다.

항-Aβ ₄₂ 포획 항체의 루미넥스 비드에 대한 공유 결합

116B565.1 마우스 항-인간 Aβ ₄₂ C-말단 항체를 2-단계 카르보디이미드 절차를 사용하여 카르복실화 비드의 표면에 공유 커플링시켰다. 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 에펜도르프 (Eppendorf) 5415D 원심분리기 (미국 뉴욕주 웨스트베리)에서 원심분리함으로써 비드를 세척하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 또 다른 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 넣고, 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 다시 조심스럽게 제거하고, 800 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 4.8) (활성화 완충제) 내에 재현탁시켰다. 이어서, 비드를 15초 동안 볼텍싱하고, 스퍼 사이언티픽(SPER SCIENTIFIC)? LTD 울트라소닉 클리너(Ultrasonic Cleaner) (미국 애리조나주 스코츠데일)를 사용하여 15초 동안 초음파 처리하였다. 비드를 추가로 활성화 완충제로 2회 세척하고, 활성화 완충제 내에 제조된 200 ㎕의 새로 제조한 5 mg/ml EDC 내에 재현탁시켰다. 비드를 광으로부터 보호된 회전배양기 (rotator) 내에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. EDC 단계의 끝에, 비드를 세척하고, PBS 내에 제조된 1000 ㎕의 250 ㎍/ml 포획 항체에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비드를 세척하고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1시간 동안 RT에서 1 ml의 차단 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 비드를 혈구계수기로 계수하고, 차단 완충제 내에 2 x 10 ⁶ 개 비드/ml로 재현탁시키고, 사용을 위해 준비시까지 4℃에서 광으로부터 보호된 상태로 보관하였다.

루미넥스 비드에 대한 Aβ ₄₂ 포획 항체의 공유 커플링 효율의 표면 시험

비드 표면 상의 포획 항체의 존재는 표면 시험을 이용하여 확인하였다. 2500개 비드를 함유하는 50 ㎕의 검정 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.05% (w/v) 트윈 20, 0.05% (w/v) 아지드)를 밀리포어 필터 저변 플레이트 웰 (미국 매사추세츠주 베드포드)에 첨가하였다. 플레이트를 밀리포어 진공 다기관 (manifold) (미국 매사추세츠주 베드포드) 상에 두어 비드를 세척하여 액체를 제거한 후, 100 ㎕/웰의 PBST 세척 완충제 내에 재현탁시켰다. 마지막으로, 진공을 통해 세척 완충제를 웰로부터 제거하고, 비드를 검정 완충제 내에 1/100 희석시킨 100 ㎕/웰의 PE-염소 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 광으로부터 보호된 96-웰 플레이트 진탕기 (랩 라인 인스트러먼츠 (Lab Line Instruments, 미국 일리노이주 멜로스 파크)) 상에서 300 rpm에서 30 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 100 ㎕/웰의 세척 완충제를 사용하여 진공 여과를 통해 비드를 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 (Bioplex manager) 4.1.1 소프트웨어를 구동하는, 바이오-라드 래보래토리즈 (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 루미넥스 ¹⁰⁰ 기기를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다. 비드 표면 상의 유용한 양의 항체의 존재를 확인하기 위해 적어도 20,000의 MFI를 사용하였다.

루미넥스 비드에 대한 검정내 Aβ ₄₀ 펩티드의 공유 커플링

Aβ ₄₀ 천연 전장 펩티드 (서열 15)는 동결건조된 펩티드를 2.5 ml PBS에 최종 농도 10 mg/ml로 재구성함으로써 제조하였다. Aβ ₄₀ 펩티드는 이들이 26D6 항체의 결합에 필요한 N-말단 Aβ ₄₂ 에피토프를 계속 발현하고 Aβ ₄₀ 펩티드가 접합에 필요한 수성 완충제 내에서 보다 안정하기 때문에 Aβ ₄₂ 펩티드 대신에 상기 검정을 위해 선택되었다. Aβ ₄₀ 펩티드를 희석제 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)를 사용하여 상이한 농도 (도 5a에 제시된)로 희석하였다. Aβ ₄₀ 펩티드의 각각의 제제를 2-단계 카르보디이미드 절차를 사용하여 선택된 비드 세트 (각각의 농도에 대해 상이한 비드 세트)의 표면에 공유 커플링시켰다. 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 에펜도르프 5415D 원심분리기 (미국 뉴욕주 웨스트베리)에서 원심분리함으로써 각각의 비드 세트를 세척하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 800 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 4.8) (활성화 완충제)를 첨가하였다. 이어서, 비드를 15초 동안 볼텍싱하고, 스퍼 사이언티픽? LTD 울트라소닉 클리너 (미국 애리조나주 스코츠데일)를 사용하여 15초 동안 초음파 처리하였다. 비드를 추가로 활성화 완충제로 1회 세척하고, 활성화 완충제 내에 제조된 200 ㎕의 새로 제조한 5 mg/ml EDC 내에 재현탁시켰다. 비드를 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. EDC 단계의 끝에, 각각의 비드 세트를 세척하고, 소정 농도의 Aβ ₄₀ 펩티드와 함께 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비드 세트를 세척하고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1시간 동안 RT에서 1 ml의 차단 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 각각의 비드 세트 제제의 농도를 비드를 혈구계수기로 계수함으로써 평가하였다. 이어서, 각각의 비드 세트를 차단 완충제 내에 2 x 10 ⁶ 개 비드/ml로 재현탁시키고, 사용을 위해 준비시까지 4℃에서 광으로부터 보호된 상태로 보관하였다.

Aβ ₄₀ 펩티드 커플링된 루미넥스 비드의 시험

비드 표면 상의, Aβ ₄₂ N-말단 특이적 항체에 대한 N-말단 에피토프를 함유하는 Aβ ₄₀ 펩티드의 존재는 표면 시험을 이용하여 확인하였다. 2500개 비드를 함유하는 50 ㎕의 검정 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.05% (w/v) 트윈 20, 0.05% (w/v) 아지드)를 밀리포어 필터 저변 플레이트 웰 (미국 매사추세츠주 베드포드)에 첨가하였다. 플레이트를 밀리포어 진공 다기관 (미국 매사추세츠주 베드포드) 상에 두어 비드를 세척하여 액체를 제거한 후, 비드를 100 ㎕/웰의 PBST 세척 완충제 내에 재현탁시켰다. 마지막으로, 진공을 통해 세척 완충제를 웰로부터 제거하고, 비드를 검정 완충제 내에 희석시킨 100 ㎕/웰의 비오틴 표지된 26D6-B2-B3 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 광으로부터 보호된 96-웰 플레이트 진탕기 (랩 라인 인스트러먼츠, 미국 일리노이주 멜로스 파크) 상에서 300 rpm에서 30 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 후에, 비드를 4회 세척하고, 50 ㎕/웰의 1 ㎍/ml의 피코에리트린-스트렙타비딘 접합체 내에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 100 ㎕/웰의 세척 완충제를 사용하여 진공 여과를 통해 비드를 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 4.1.1 소프트웨어를 구동하는, 바이오-라드 래보래토리즈 (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 루미넥스 ¹⁰⁰ 기기를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다. 각각의 비드 세트에 대해 측정된 MFI를 도 5a에 제시한다.

생물학적 샘플의 Aβ ₄₂ 검정내 분석

검정내 루미넥스 기반 검정을 사용한 샘플 분석은 먼저 항-C-말단 특이적 Aβ ₄₂ 565 포획 항체와 커플링된 비드 세트를 상이한 농도의 Aβ ₄₀ 펩티드 (도 5a에 제시됨)와 커플링된 비드 세트와 혼합함으로써 수행하였다. 검정 완충제 내에 제조된 50,000개 비드/ml(현탁액)의 50 ㎕/웰의 모든 비드 세트의 조합된 혼합물을 예비 습윤 필터 저변 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 진공 여과를 통해 비드를 100 ㎕/웰의 검정 완충제로 세척하였다. 포획 비드를 이중 웰 내의 50 ㎕의 희석된 인간 CSF 샘플, 품질 대조군 샘플 (QC), 참조 표준물로서의 상이한 농도의 전장 천연 Aβ ₄₂ 펩티드, 또는 상이한 농도의 변형된 Aβ ₄₂ 펩티드 표준물에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비오틴으로 표지된 1.0 ㎍/ml 항-Aβ ₄₂ 26D6 리포터 항체를 첨가한 후, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 0.5 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 후에, 비드를 4회 세척하고, 50 ㎕/웰의 1 ㎍/ml의 피코에리트린-스트렙타비딘 접합체 내에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 비드를 4회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 5.1 소프트웨어를 구동하는 바이오플렉스 루미넥스 기기 (바이오-라드 래보래토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다. 표준 곡선은 가중 4-파라미터 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 가용성 Aβ ₄₂ 펩티드로부터 또는 상이한 농도의 Aβ ₄₀ 펩티드 (표준물내)로 코팅된 비드 세트로부터 생성된 신호로부터 생성되었다 (도 5b). CSF 또는 QC 샘플 내의 Aβ ₄₂ 펩티드의 농도를 관련 표준 곡선으로부터 계산하고, 도 5c에 제시한다.

실시예 4 - 루미넥스 비드를 사용한 IGFR1에 대한 펩티드 기반 검정내 검정

아래는 인간 IGF-R1 수용체 상의 인산화된 티로신 잔기 1162 및 1163의 검출을 위한 펩티드 검정내 기반 검정의 또 다른 예이다. 또한, 타우의 인산화 영역도 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

항체 및 참조 표준물

주문 제작한 IGF1R [PYPY ^{1162 /1163} ] 펩티드는 캠브리지 리써치 바이오케미칼스 엘티디 (Cambridge Research Biochemicals Ltd, 영국)에 의해 제공받았다. 마우스 항-IGF1R 포획 항체는 칼바이오켐 (Calbiochem, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)으로부터 얻었고, 토끼 항-포스포-티로신 (1162/1163) - IGF1R 리포터 항체는 밀리포어 (미국 매사추세츠주 빌러리카)로부터 구입하였다. 피코에리트린 표지 염소 항-토끼 항체는 잭슨 이뮤노리써치 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 얻었다. 트윈-20, 1-에틸-3-[3 디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 나트륨 아지드, IgG 비함유 소 혈청 알부민 (BSA), 및 인산나트륨은 시그마-알드리치 코포레이션 (미국 미주리주 세인트루이스)으로부터 구입하였다. 포스페이트 완충 염수 (PBS)는 미디어테크 인코포레이티드 (미국 버지니아주 헌돈)로부터 얻었다. 카르복실화 루미넥스 비드는 바이오-라드 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 구입하였다. 정상의 건강한 PBMC 샘플은 사내 공여자 (BMS, 미국 뉴저지주)로부터 얻었다. PBMC 샘플을 세포 상에 존재하는 IGFR의 인산화를 유도하기 위해 PBS 또는 100 ng/ml의 정제된 인간 IGF1 (제네텍스 인크 (Genetex Inc, 미국 텍사스주))로 10 min 동안 37℃에서 처리하였다. 세포를 세척하고, 변형된 RIPA 완충제로 용해시키고, -80℃에서 보관하였다.

루미넥스 비드에 대한 항-IGF-R1 포획 항체의 공유 커플링

마우스 항-인간 IGF1R 포획 항체를 2-단계 카르보디이미드 절차를 사용하여 카르복실화 비드의 표면에 공유 커플링시켰다. 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 에펜도르프 5415D 원심분리기 (미국 뉴욕주 웨스트베리)에서 원심분리함으로써 비드를 세척하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 또 다른 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 넣고, 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 다시 조심스럽게 제거하고, 800 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 4.8) (활성화 완충제) 내에 재현탁시켰다. 이어서, 비드를 15초 동안 볼텍싱하고, 스퍼 사이언티픽? LTD 울트라소닉 클리너 (미국 애리조나주 스코츠데일)를 사용하여 15초 동안 초음파 처리하였다. 비드를 추가로 활성화 완충제로 2회 세척하고, 활성화 완충제 내에 제조된 200 ㎕의 새로 제조한 5 mg/ml EDC 내에 재현탁시켰다. 비드를 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. EDC 단계의 끝에, 비드를 세척하고, PBS 내에 제조된 1000 ㎕의 250 ㎍/ml 포획 항체에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비드를 세척하고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1시간 동안 RT에서 1 ml의 차단 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 비드를 혈구계수기로 계수하고, 차단 완충제 내에 2 x 10 ⁶ 개 비드/ml로 재현탁시키고, 사용을 위해 준비시까지 4℃에서 광으로부터 보호된 상태로 보관하였다

루미넥스 비드에 공유 커플링된 IGF-R1 포획 항체의 시험

비드 표면 상의 포획 항체의 존재는 표면 시험을 이용하여 확인하였다. 2500개 비드를 함유하는 50 ㎕의 검정 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.05% (w/v) 트윈 20, 0.05% (w/v) 아지드)를 밀리포어 필터 저변 플레이트 웰 (미국 매사추세츠주 베드포드)에 첨가하였다. 플레이트를 밀리포어 진공 다기관 (미국 매사추세츠주 베드포드) 상에 두어 비드를 세척하여 액체를 제거한 후, 비드를 100 ㎕/웰의 PBST 세척 완충제 내에 재현탁시켰다. 마지막으로, 진공을 통해 세척 완충제를 웰로부터 제거하고, 비드를 검정 완충제 내에 1/100 희석시킨 100 ㎕/웰의 PE-GAM과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 광으로부터 보호된 96-웰 플레이트 진탕기 (랩 라인 인스트러먼츠, 미국 일리노이주 멜로스 파크) 상에서 300 rpm에서 30 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 100 ㎕/웰의 세척 완충제를 사용하여 진공 여과를 통해 비드를 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 4.1.1 소프트웨어를 구동하는, 바이오-라드 래보래토리즈 (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 루미넥스 ¹⁰⁰ 기기를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다. 비드 표면 상의 유용한 양의 항체의 존재를 확인하기 위해 적어도 20,000의 MFI를 사용하였다.

루미넥스 비드에 대한 검정내 IGF-R1 펩티드 표준물의 공유 커플링

IGF1R [PYPY1162/1163] 참조 표준물 펩티드는 동결건조된 펩티드를 2.5 ml PBS에 최종 농도 10 mg/ml로 재구성함으로써 제조하였다. 초기 10배 희석액 (후속적으로 10배 희석됨)은 희석제 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)를 사용하여 제조하였다. 2-단계 카르보디이미드 절차를 사용하여 4가지 상이한 농도의 4개의 상이한 세트의 카르복실화 비드의 표면에 포스포-IGF1R 펩티드를 공유 커플링시켰다. 1.25 x 10 ⁷ 개 비드를 5 min 동안 14000 xg 및 4℃에서 에펜도르프 5415D 원심분리기 (미국 뉴욕주 웨스트베리)에서 원심분리함으로써 비드 세트를 세척하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 800 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 4.8) (활성화 완충제)를 첨가하였다. 이어서, 비드를 15초 동안 볼텍싱하고, 스퍼 사이언티픽? LTD 울트라소닉 클리너 (미국 애리조나주 스코츠데일)를 사용하여 15초 동안 초음파 처리하였다. 비드를 추가로 활성화 완충제로 1회 세척하고, 활성화 완충제 내에 제조된 200 ㎕의 새로 제조한 5 mg/ml EDC 내에 재현탁시켰다. 비드를 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. EDC 단계의 끝에, 각각의 비드를 세척하고, PBS 내에 제조된 10 mg/ml의 10배 연속 희석액으로 제조된 개개의 농도의 1000, 100, 10 및 1 ng/ml의 포스포-IGF1R 펩티드와 함께 재현탁시켰다. 이어서, 비드를 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비드를 세척하고, 광으로부터 보호된 회전배양기 내에서 1시간 동안 RT에서 1 ml의 차단 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) 트윈-20)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 비드를 혈구계수기로 계수하고, 차단 완충제 내에 2 x 10 ⁶ 개 비드/ml로 재현탁시키고, 사용을 위해 준비시까지 4℃에서 광으로부터 보호된 상태로 보관하였다.

IGF-R1 펩티드 결합된 루미넥스 비드의 시험

비드 표면 상의 포스포-IGF1R 펩티드의 존재를 표면 시험을 이용하여 확인하였다. 2500개 비드를 함유하는 50 ㎕의 검정 완충제 (PBS, 1% (w/v) BSA, 0.05% (w/v) 트윈 20, 0.05% (w/v) 아지드)를 밀리포어 필터 저변 플레이트 웰 (미국 매사추세츠주 베드포드)에 첨가하였다. 플레이트를 밀리포어 진공 다기관 (미국 매사추세츠주 베드포드) 상에 두어 비드를 세척하여 액체를 제거한 후, 비드를 100 ㎕/웰의 PBST 세척 완충제 내에 재현탁시켰다. 마지막으로, 진공을 통해 세척 완충제를 웰로부터 제거하고, 비드를 검정 완충제 내에 희석시킨 100 ㎕/웰의 토끼 항-포스포-IGF-R1 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 광으로부터 보호된 96-웰 플레이트 진탕기 (랩 라인 인스트러먼츠, 미국 일리노이주 멜로스 파크) 상에서 300 rpm에서 30 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 후에, 비드를 4회 세척하고, 50 ㎕/웰의 1 ㎍/ml의 피코에리트린 표지된 염소 항-토끼 IgG 접합체 내에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 100 ㎕/웰의 세척 완충제를 사용하여 진공 여과를 통해 비드를 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 4.1.1 소프트웨어를 구동하는, 바이오-라드 래보래토리즈 (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 루미넥스 ¹⁰⁰ 기기를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다.

생물학적 샘플의 IGF-R1 검정내 분석

루미넥스 기반 검정을 사용한 샘플 분석은 검정 완충제 내에 제조된 50 ㎕의 50,000개 비드/ml의 포획 항체 현탁액을 예비 습윤 필터 저변 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가함으로써 수행하였다. 진공 여과를 통해 비드를 100 ㎕/웰의 검정 완충제로 세척하였다. 포획 비드를 이중 웰 내의 50 ㎕의 희석된 샘플 또는 품질 대조군 샘플 (QC)에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 비드를 4회 세척하고, 50 ㎕의 섹션 2.2.3에서 언급된 펩티드에 대한 4개의 상이한 비드 세트의 50,000개 비드/ml로 재현탁시켰다. 비드를 여과하고, 50 ㎕/웰의 1.0 ㎍/ml 항-포스포 IGF1R 리포터 항체에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 0.5 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 후에, 비드를 4회 세척하고, 50 ㎕/웰의 1 ㎍/ml의 PE-염소 항 토끼 IgG 내에 재현탁시키고, 광으로부터 보호된 플레이트 진탕기 상에서 20 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 비드를 4회 세척하고, 100 ㎕/웰의 검정 완충제 내에 재현탁시켰다. 바이오플렉스 매니저 4.1 소프트웨어를 구동하는 바이오플렉스 루미넥스 기기 (바이오-라드 래보래토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 적어도 50개 비드/웰의 MFI를 측정하였다. 포스포-IGF-R1 표준내 곡선으로부터 생성된 표준 곡선을 도 6a에 제시한다. 검정내 4-파라미터 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 각각의 PBMC 용해물 샘플 내의 포스포-IGF1R 농도를 도 6b에 제시한다.

실시예 5 - Aβ 펩티드의 특징분석

펩티드

모든 펩티드는 동결건조된 분말로 입수하였다. 변형된 펩티드는 젠스크립트 (GenScript (GS)) 및 아나스펙 (AN)으로부터 얻었다. 이들 펩티드는 당업자에게 공지된 고체 상 방법을 사용하여 합성되었다 (예를 들어, 문헌 [Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology - Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Vol. 2, pp. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, New York, publ. (1980)]; 및 [Stewart, JM et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, publ. (1984)] 참조).

GS1-6 및 AN7 펩티드를 입수하고, ddH20 내에 1 mg/ml의 농도로 재구성하였다. 이어서, 이를 1.4 ml 블랭크 (blank) 튜브 PP, 둥근 매트릭스 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific), cat#4249, 로트 1030509) 내로 100 ㎕ 분취액으로 분취하였다. 전장 Aβ ₄₂ 펩티드는 MSD (로트 # T03080X1)로부터 구입하였다. 상기 펩티드를 DMSO 내에 희석하여 0.1 mg/ml의 용액을 제조하였다. 이를 1.4 ml 블랭크 튜브 내에 100 ㎕ 분취액으로 분취하였다. 이들 펩티드를 보관을 위해 -70℃에서 동결 상태로 유지하였다. 도 13은 변형된 Aβ _(1-42) 펩티드 내로 통합된 폴리에틸렌 글리콜 스페이서의 구조를 보여준다.

동적 광 산란

신규한 펩티드 (젠스크립트)를 무수 분말로서 입수하고, 원액 샘플의 2개의 세트를 1.8 ml 폴리프로필렌 튜브 내에 소량 (각각 약 0.5 mg) 칭량함으로써 제조하고, 간단한 포스페이트 완충제 (99.9% D ₂ O 내에 제조된 10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.4, 10 mM NaCl; 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과됨) 내에 용해시켰다. 1 세트는 1.0 mg/ml로 제조하고, 제2 세트는 0.10 mg/ml로 제조하고, 실온에서 보관하였다. 펩티드를 1 min 동안 볼텍싱함으로써 용해시키고, 미세원심분리기 내에서 5 min 동안 14,000 rpm 및 실온에서 원심분리하였다. Aβ ₄₂ 샘플 (MSD)에 대해, 바이알에 담긴 0.1 mg 펩티드를 1.0 ml 완충제 내에 현탁시키고, 상기와 같이 처리하였다. 각각의 원심분리한 1.0 mg/ml 원액의 부피 (200 ㎕)를 0.5 ml 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, NMR 분석을 위해 제공하였다.

모든 샘플의 흡수 스펙트럼을 나노드롭(NANODROP)? ND-1000 기기를 사용하여 기록하고 (220-750 nm), 완충제에 대해 블랭크 처리하였다. 동적 광 산란 분석을 와이어트 (Wyatt) DLS 다이나프로(DynaPro) 플레이트 판독기를 사용하여 384 웰 폴리스티렌 플레이트 (코닝(CORNING)?, 타입 3540)에서 펩티드에 대해 수행하였다. 데이터 수집 및 분석은 제조자의 소프트웨어 (다이나믹스(DYNAMICS), 버전 7.0.0.94 및 7.0.1.12)를 사용하여 완료하였다. 각각의 펩티드를 웰당 30 ㎕를 로딩하고 증발을 최소화하기 위해 5 ㎕ 미네랄 오일로 덮고 삼중으로 평가하였다. 또한, 비교를 위해 완충제 블랭크를 분석에 포함시켰다. 플레이트에 로딩한 후, 투명 접착 밀봉 테이프 커버를 플레이트에 적용하고, 플레이트를 2 min 동안 1000 rpm에서 원심분리하였다. 플레이트 상의 각각의 샘플을 25℃의 온도에서 유지하면서 획득당 5초로 30회 판독하였다. 데이터 세트를 27일의 경과에 걸쳐 1.0 mg/ml 및 0.10 mg/ml 샘플 모두에 대해 수집하였다. 접착 커버는 샘플을 플레이트 판독기로 판독하기 위해 제거하고, 27일 시간 경과에 걸쳐 판독 사이에 플레이트를 덮기 위해 사용하였다.

도 7a 내지 7f는 동적 광 산란 데이터를 보여준다. 도 7에서, 전장 Aβ ₄₂ 펩티드를 DLS 분석으로 처리하고, 4개의 대표적인 변형된 펩티드에 비교하였다. 전장 펩티드는 응집되는 것으로 밝혀졌으며, 상이한 응집체 종의 반경은 82 내지 231 nm의 길이로 계산된 결과가 나타났다. 이것은 결국 용액 내의 큰 분자량의 응집체가 된다. 그러나, 변형된 펩티드는 분자량 및 반경 모두에 의해 결정될 때 단량체로 유지된다. GS#3은 일부의 응집을 보유하기 때문에 다른 펩티드와 비교된다 (도 7e). 이들 결과는 응집 도메인이 결여된 변형된 펩티드가 실제로 용액 내에 단량체로 유지됨을 입증한다. 도 7a는 모든 5개의 펩티드에 대해 축적된 원 데이터를 제시한다. 시간에 대한 강도의 자기연관성이 제시된다. 강도 자기연관성 수치가 높을수록 용액 내의 펩티드의 직경이 보다 큼을 나타낸다. 도 7b-7f는 펩티드의 % 질량 대 반경을 도시한 것이다. 단량체 펩티드는 보다 작은 반경 크기에서 보다 큰 % 질량에 의해 제시될 것이다. 보다 큰 응집된 펩티드는 보다 큰 반경 크기에서 보다 작은 % 질량을 갖는다.

원편광 이색성

원편광 이색성 (CD) 스펙트럼은 아비브 (Aviv) 모델 202 원편광 이색성 분광측정계를 사용하여 수집하였다. 샘플을 피펫을 사용하여 1 mm 경로 (path) 길이 석영 큐벳에 넣고, 260-185 nm에서 스캐닝하였다. 데이터를 수집하기 위한 파라미터는 스펙트럼 밴드폭 1.00 nm, 스텝 (step) 크기 1.0 nm, 평균 시간 20초/포인트, 및 설정 온도 25℃를 포함한다. 샘플을 실온에서 석영 큐벳에 보관하고, 23일의 시간 경과에 걸쳐 스캐닝하였다. 원 데이터를 블랭크 완충제 기여도에 대해 보정하고, mdeg 대 파장의 포맷으로 제시하였다.

도 8은 원편광 이색성 분석을 보여준다. 원편광 이색성 분석을 펩티드의 정렬 (order) 및 2차 구조를 결정하기 위해 전장 Aβ ₄₂ 및 4개의 대표적인 펩티드에 대해 수행하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 전장 펩티드는 다른 펩티드보다 보다 많은 규칙적인 구조를 보여준다. 4개의 대표적인 펩티드는 전장 펩티드에 비해 불규칙적인 CD 스펙트럼을 보인다. 이들 데이터는 변형된 펩티드가 전장 펩티드와 달리 응집하거나 임의의 고차 구조를 형성하지 않음을 시사한다.

MSD ELISA

비오틴 표지된 항-C-말단 Aβ ₄₂ 항체 (565-20 ㎍/ml)를 30 ㎕/웰로 첨가함으로써 96 웰 MSD 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 고정하였다. 이어서, 플레이트를 덮고, 500 rpm에서 진탕하면서 25℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 300 ㎕/웰의 세척 완충제 (R&D 시스템 cat# WA126)로 3x 세척하였다. 세척 후에, 225 ㎕/웰의 차단 완충제 (PBS 내의 1% BSA + 0.1% 트윈-20)를 플레이트에 첨가하고, 500 rpm에서 진탕하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 차단 단계를 수행한 후, 플레이트를 이전에 설명한 바와 같이 세척하였다. 참조 표준물 Aβ ₄₂ 펩티드 (전장 또는 변형된 펩티드)를 웰에 첨가하였다. Aβ ₄₂ 펩티드를 고정된 포획 항체에 의해 포획하였다. Aβ ₄₂ 의 N-말단에 대한 제2 루테늄 태깅된 (Ru) 항체 (26D6)를 첨가하여 샌드위치를 완성하였다. 복합체는 ECL을 이용한 MSD 섹터 6000 기기를 사용하여 검출하였다. 기기에 의해 측정된 원 형광 단위 (RFU)를 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅하여 표준 곡선을 생성하였다.

도 9는 펩티드 안정성 데이터를 보여준다. 전장 Aβ ₄₂ 및 7개의 변형된 펩티드를 40일 이하 동안 상이한 온도에서 안정성 연구에 적용하였다 (도 9a-9f). 이들 펩티드를 특정된 시간 동안 4℃, 25℃, 및 37℃에서 유지시킨 후, 검정이 실시될 때까지 동결하였다. 이어서, 펩티드를 수집하고, MSD Elisa 포맷으로 분석하였다. 결과는 시간 0에서 측정된 각각의 펩티드의 기준선 신호에 대한 비율로서 제시된다. 실제로, 37℃에서의 단기 인큐베이션은 4℃ 및 실온에서 분자의 장기 안정성을 추정하기 위해 사용되었다 (Anderson et al., Clinical Chemistry, 37(3):398-402 (1991)). 따라서, 단기 분석을 위한 37℃에서 펩티드의 인큐베이션은 펩티드의 장기 안정성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 도 9에 제시된 바와 같이, 전장 Aβ ₄₂ 펩티드 신호는 37℃에서 16 hr 인큐베이션에서 출발한 후 크게 저하된다. 이와 대조적으로, 변형된 펩티드는 측정된 모든 온도에서 안정한 상태를 유지한다. 상기 데이터는 이들 변형된 펩티드가 전장 Aβ ₄₂ 보다 더 안정함을 시사한다.

도 10a-10i는 전장 Aβ ₄₂ 및 7개의 변형된 펩티드가 60일 이하 동안 상이한 온도에서 안정성 연구에 적용된 것을 보여준다. 이들 펩티드를 특정된 시간 동안 25℃ 및 37℃에서 유지시킨 후, 검정이 실시될 때까지 동결하였다. 이어서, 펩티드를 수집하고, MSD Elisa 포맷으로 분석하였다. 결과를 신호 대 펩티드 농도를 플로팅한 표준 곡선으로서 제시한다. 도 10에 제시된 바와 같이, 전장 펩티드는 25℃ 및 37℃에서 감소하는 표준 곡선을 제시하였다. 이에 반해, 분석된 7개의 모든 펩티드는 모든 시점 및 온도 범위에 걸쳐 유사한 곡선을 제시하였다 (37℃만 제시됨). 결과는 변형된 펩티드가 검정 재현성을 위한 표준물로서 사용될 때 전장 Aβ ₄₂ 펩티드보다 더 일관된 신호를 생성할 것임을 제시한다.

도 11은 전장 대 변형된 펩티드의 표준 곡선 분석을 보여준다. 전장 Aβ ₄₂ 및 7개의 변형된 펩티드를 8개의 점 보정 곡선을 위해 희석하고, MSD Elisa 포맷으로 분석하였다. 도 11에 제시된 바와 같이, 모든 펩티드가 거의 동일한 표준 곡선을 생성하였다. 상기 결과는 변형된 펩티드가 샘플 매트릭스에서 Aβ의 계산을 위해 전장 펩티드 대신 사용될 수 있음을 시사한다.

도 12는 전장 대 변형된 펩티드를 사용한 CSF 샘플 분석을 보여준다. 전장 Aβ ₄₂ 및 7개의 변형된 펩티드를 8개의 점 보정 곡선을 위해 희석하고, 13개의 CSF 샘플을 사용하여 MSD Elisa 포맷으로 분석하였다. 각각의 CSF 샘플 내의 Aβ의 농도를 각각의 펩티드에 대한 표준 곡선을 기초로 하여 계산하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, CSF 샘플 내의 역 계산된 Aβ 농도는 동등하였고, 어떤 Aβ 펩티드가 표준 곡선을 위해 사용되었는지와 무관하였다. 이것은 이들 변형된 펩티드가 이들 검정에서 Aβ 수준의 계산에 영향을 주지 않으면서 전장 Aβ ₄₂ 펩티드 대신 사용될 수 있음을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company Rhyne, Paul <120> IMMUNOASSAY STANDARDS AND MEASUREMENT OF CLINICAL BIOMARKERS USING INTRA-ASSAY CALIBRATION STANDARDS <130> 11513 PCT <150> 61/302835 <151> 2010-02-09 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Peptide <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His Met Val Gly 1 5 10 15 Gly Val Val Ile Ala 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Peptide <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Gly Gly Val Val Ile Ala 20 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Peptide <400> 4 As 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