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인플루엔자에서의 위험도 계층화{RISK STRATIFICATION IN INFLUENZA}
본 발명은 인플루엔자를 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자들 내의 임상적인 위험도의 확인을 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 가지는 환자들과 증상적으로 유사한 상태를 가지는 환자들을 구별하기 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명의 방법들은 인플루엔자를 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질(interferon alpha inducible protein) 27(IFI27)의 발현의 레벨의 결정을 포함한다. 상기 방법들을 수행하기 위해 적합한 구성 요소들을 포함하는 키트들도 본 발명에서 제공된다. 본 발명은 임상적인 위험도를 정의하는 그룹들, 예를 들면, 대상의 장기간의 건강에 대한 심각한 위험도에 기초한 그룹들로 환자들의 계층화를 가능하게 한다.
인플루엔자/폐렴은 미국에서 사망을 야기하는 열 가지의 원인들에서 여덟 번째의 순위에 있는 것으로 보고되었다. 인플루엔자 바이러스 감염은 세계적으로 매년 가장 많은 수의 사람들에 영향을 미치는 가장 통상적인 전염병을 나타낸다. 인플루엔자는 계절성 유행병들로 세계적으로 급속히 확산되며, 입원 치료의 상당한 부담을 야기한다. 비록 세계적으로 평가하기는 어렵지만, 세계 보건 기구(WHO)는 심각한 질병의 케이스들의 3백만 내지 5백만 사이의 연례 유행병의 이병율(morbidity)과 매년 세계적으로 250,000 내지 500,000명의 사망자들 사이의 사망률을 추산하고 있다. 미국에서, 인플루엔자 유행성 질병들은 WHO에 의해 미국 인구의 5-15%가 상기도감염으로 입원 치료를 받으며, 사망자들은 주로 고위험군(노인성 및 만성적 질환)에서 발생하고, 미국 경제에 대해 매년 710-167억 미국 달러의 결과적인 비용이 드는 것으로 평가하고 있다. 산업화된 국가들에서 인플루엔자로부터의 대부분의 사망자들은 연령 65세 이상의 노인들에서 발생한다. 결과적인 경제적 비용으로 고통 받는 환자의 관점에서 감염의 유행과 이의 잠재적인 심각성은 건강관리 시스템에 우선하여 검출과 치료가 이루어지게 하였다. 심각한 질병을 진행시키는 보다 높은 위험성을 갖는 인플루엔자 감염이 있는 환자들을 확인하고 임상적으로 예기하는 데 실패함으로부터, 이러한 고위험 환자들에 대한 적절한 치료의 전달이 지연되며, 상기 환자의 회복과 장기간의 건강에 대해 엄청난 결과들을 초래할 수 있다. 심각한 질병으로 진행되는 환자들 중에서, 5-7일의 평균적인 지연이 문헌에서 계속적으로 보고되어 있다. 심각한 질병으로 진행되는 위험이 있는 환자들에서 치료 지연을 방지하는 것은 특별한 관리 치료의 적절한 투입이 인플루엔자로부터 사망의 위험을 감소시키는 것과 관련되기 때문에 결정적으로 중요하다. 예를 들면, 입원 허가되는 증상의 시작으로부터 하루의 지연이 (H1N1)인플루엔자로부터의 사망의 위험도를 5.5% 증가시키는 점이 최근에 보고되었다 1 . 흔히, 인플루엔자 감염은 임상적인 배경들만(예를 들면, 감기 같은 증상들의 이력)으로 의심되고, 개체가 어떠한 형식적인 실험실 시험이 없이 항바이러스 치료로 치료된다. 임상적인 판단은 이에 따라 상기 개체가 인플루엔자 바이러스를 가지는 지에 대해 필수적이지는 않고, 상기 개체가 입원되거나 안전하게 집으로 돌아가야 하는 지에 관한 것이 된다. 이러한 상황에서, 인플루엔자 바이러스의 존재에 대한 진단 시험은 필요하지 않을 수 있다. 대신, 임상의들은 이들이 궁극적으로 상기 질병의 심각도를 결정하는 어떻게 환자가 인플루엔자 감염에 충분하게 반응할 것인지를 정량화하는 데 도움이 될 수 있는 테스트의 필요성이 있다. 질병의 심각도가 커질수록, 감염된 대상이 악화될 가능성이 커지며 이에 따라 입원 허가가 필요하게 된다. 현재, 인플루엔자 감염의 삼각도를 신뢰성 있게 평가할 수 있는 일부 실험실적인 방법들이 존재한다. 인플루엔자 감염의 심각도를 평가하는 방법의 하나의 예는 인플루엔자 내의 바이러스 복제의 정도가 질병의 심각도와 상호 관련되는 것으로 생각되므로 기도 샘플 내의 바이러스 부하(viral load)를 테스트하는 과정을 수반한다. 그러나, 기도 및 혈청 샘플들에 대한 연구는 바이러스 부하들이 함께 질병의 심각도와 관련이 없는 점을 보여주었다 2,12 . 이는 인플루엔자 감염의 삼각도가 감염의 결과로서 분명해지는 질병의 심각도와 필수적으로 상호 관련되지는 않는 점을 입증한다. 이에 따라, 여러 이유들로, 비록 진단 테스트들이 인플루엔자 바이러스의 존재나 부존재를 판단할 수 있고, 이에 따라 임상의에 도움에 될 수 있지만, 상기 바이러스의 존재가 감염된 환자의 질병 진행의 실제 경우가 될 수 있는 비정상적인 면역 반응과 항상 동일시되지는 않으므로 이들은 임상의의 판단에 충분하지 않은 영향을 줄 수 있다. 인플루엔자 감염이 확인되거나 인플루엔자 감염의 증상이 있는 개체들의 시가 적절하고 적합한 치료를 제공하기 위하여, 상기 감염으로 인한 질병의 심각도 또는 잠재적인 질병의 심각도를 평가하는 특별한 테스트가 요구된다. 이러한 심각도 계층화 도구는 이와 같은 환자들의 관리에 도움이 될 것이다. 이는 임상의들이 안전하게 귀가시킬 수 있는 환자들을 확인하게 하는 반면, 보다 심각한 질병이 있는 것으로 확인되거나 심각한 질병이 진행될 보다 높은 위험도를 갖는 환자들을 추가적인 관찰과 치료를 위해 입원하게 한다. 이는 또한 의사들이 단지 가벼운 증상일 수 있지만 심각한 질병으로 진전될 가능성이 있는 환자들 내의 질병 진행을 중단시키거나 늦추도록 예방적인 측정들을 채용할 기회를 가지게 한다.
임상적인 판단을 내리는 데 도움이 되는 예방 및 진단 정보의 제공을 보조하기 위하여 인플루엔자를 가지거나 가지는 것으로 의심되는 개체들의 평가를 위한 개선된 방법들의 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 환자들이 심각한 질병의 임의의 표시를 보이기 이전에 병원에서의 의료 개입이나 임상적인 환경이 요구될 수 있는 인플루엔자 환자들(이들이 확인되었거나 및/또는 증상이 있는 지 또는 그렇지 않은 지)과 안전하게 귀가할 수 있는 환자들을 구별할 수 있고, 의사들이 보다 나은 치료 판단을 내리는 데 크게 도움이 될 수 있는 방법을 인식하였다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명자들에 의한 대상 내의 인터페론 알파 유도 단백질(interferon alpha induced protein) 27(IFI27) 유전자의 발현 레벨이 상기 대상 내의 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 질병의 심각도와 상호 관련되는 확인을 기초로 한다. 상기 상호 관련은 인플루엔자 감염 또는 심각한 질병의 증상이 있는 대상 내의 감염으로부터의 질병의 심각도를 예상하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 상기 환자에 의한 불충한 반응을 나타낼 수 있고 병원 내에서 의료 개입이나 임상적인 환경을 요구하는 심각한 질병을 진행시키는 가능성인 인플루엔자 감염 동안의 숙주 반응의 특정한 측면의 검출을 위한 방법과 관련된다. 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법들은 임상적인 위험도를 가지는 개체들이 입원 허가 또는 심지어는 생명 유지 치료와 같은 의료 개입에 대한 필요에 의해 특징지어지는 상기 감염으로부터 야기되는 심각한 질병이 진행될 가능성이 보다 높은 지를 결정하기 위하여 인플루엔자 감염이 있는 환자들을 평가하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 인플루엔자 감염의 조기 관리, 감염에 대한 환자의 면역 반응의 모니터링하는 것 및 그렇지 않으면 종래의 진단 접근법들에 의해서 놓칠 수 있는 위험이 있는 개체들에 대한 생명 구조 개입을 가능하게 하는 것과 같은 건강관리에의 적용들을 가진다. 본 발명자들은 의심되는 인플루엔자 감염으로 의사의 수술 또는 입원되는 환자들에서, IFI27 유전자 발현 레벨이 임상의가 환자가 안전하게 귀가할 수 있거나 입원 허가를 필요로 하는 지를 예상하는 데 도움이 될 수 있는 점을 상정하였다. 이러한 시나리오에 있어서, IFI27 발현의 정상 레벨은 환자가 인플루엔자를 가지지 않거나 인플루엔자를 가지지만, 심각한 질병이 진행되는 보다 높은 위험성을 가지지 않는 점을 나타낼 수 있으며, 이 경우에 이들은 돌아갈 수 있다. 그러나, IFI27 발현의 상향 조절된 레벨은 인플루엔자 감염이 있고 심각한 질병이 진행될 보다 높은 위험성이 있는 환자를 나타낼 수 있으며, 이 경우에 상기 환자에 병원 내의 의료 개입이나 임상적인 환경이 요구될 수 있다. 예를 들면, 환자는 의심되는 인플루엔자 감염으로 의사의 수술을 받을 수 있고, 대개는 최소한의 의료로 환자가 집으로 보내지는 결과가 될 수 있는 감염의 상대적으로 가벼운 증상들을 가질 수 있다. 그러나, 본 발명은 상기 환자가 임상적인 위험도를 가지는 지를 결정하는 데 이용될 수 있으며, 이 경우에 치료하는 의사는 상기 감염이 심각한 질병으로 명백하게 되기 이전에, 이의 조기 단계에서 중재할 수 있고, 모니터닝 및 치료를 위해 상기 환자에게 입원을 허가할 수 있다. 다른 예에 있어서, 환자는 병원에 있을 수 있고, 인플루엔자 감염을 가지는 것으로 인정될 수 있으며, 심각한 질병의 진전과 일치되는 일부 증상들을 보일 수 있다. 대개는, 이는 치료를 위해 병원으로 환자가 입원하는 결과가 될 수 있다. 그러나, 본 발명은 환자가 인플루엔자 감염의 결과로 심각한 질병을 실제로 진전시킬 수 있는 지를 예상하는 데 이용될 수 있으며, 이는 임상의들이 전문 인력과 자원들을 적절하게 할당하는 데 도움이 될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 상기 환자가 임상적인 위험도를 가지지 않으며 감염의 결과로서 심각한 질병을 진전시키지 않을 것이 예상되는 경우에 상기 환자의 과잉 치료를 방지할 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 본 발명자들은 개체들이 인플루엔자로 감염되는 지를 결정하는 것이 실현 가능하고, 임상적인 자원들이 임상적인 위험도에 있는 환자들을 위해 보존될 필요가 있는 때, 본 발명이 인플루엔자 유행병 또는 범유행병의 시기들에 유용한 스크리닝(screening) 도구를 제공할 수 있는 점을 상정하였다. 이들 시나리오들에 있어서, 본 발명은 이들이 인플루엔자 감염의 결과로 심각한 질병이 진행되는 임상적인 위험도를 가지는 지를 결정하기 위해 인플루엔자 감염의 임의의 징후를 나타낼 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 개체들이나 개체들의 그룹들을 선별하는(screen) 데 이용될 수 있다. 선별 동안에, IFI27 발현의 정상 레벨은 환자가 인플루엔자를 가지거나 인플루엔자를 가지지 않으며, 심각한 질병이 진행되는 임상적인 위험도에 있지 않은 지를 나타낼 수 있으며, 이 경우에 이들의 모니터링 또는 치료는 우선순위가 감소된다. 그러나, IFI27 발현의 상향 조절된 레벨은 인플루엔자 감염 및 심각한 질병의 진행의 보다 높은 위험성이 있는 환자를 나타낼 수 있고, 이에 따라 환자가 임상적인 위험도에 있으며, 이 경우에 상기 환자는 더욱 모니터 및 치료될 수 있다. 유사하게, 본 발명자들은 인플루엔자 감염으로 인해 입원이 허가된 환자들에서, IFI27 유전자-발현 레벨이 임상의가 상기 환자의 면역 반응의 정확성과 환자가 더 악화되거나 회복될 것인 지를 예상하는 데 도움이 될 수 있는 점을 상정하였다. 환자가 더 악화될 것으로 예상되는 경우에 있어서, 적절한 치료 프로토콜들(protocols)이 특별 관리 유닛에 대한 승인과 같은 환자를 위해 구현될 수 있다. 선택적으로는, 환자가 회복될 수 있는 것에 대한 결정은 상기 특별 관리 유닛 내에서 잠재적으로 차지하는 유용한 자원들에 반대되기 때문에 상기 환자가 표준 병원 구역에 남는 것을 허용할 것이다. 본 발명자들은 IFI27 유전자-발현 레벨이 또한, 예를 들면, 항바이러스 치료 또는 상기 환자의 상태의 치료와 관련되는 다른 관리 후에 상기 임상의가 환자의 계속적으로 모니터링하는 것에 이용될 수 있는 점을 상정하였다. 실시예들에 있어서, 본 발명은 인플루엔자 감염이 의심되는 개체들 내의 IFI27의 mRNA 발현의 레벨을 측정하는 유전자-발현 분석을 제공한다. IFI27 유전자 발현의 높은 레벨은 면역 대상 부전의 상당히 증가된 위험을 나타내며, 이에 따라 상기 환자의 임상적인 상태의 임박한 악화를 의사들에게 경고한다. IFI27 유전자 발현의 측정은 심각한 질병의 진행의 임상적인 위험도가 있고 입원이 허가될 필요가 있는 개체들을 안전하게 귀가시킬 수 있는 개체들과 정확하게 구별함(즉, 위험도 계층화)에 의해 의사들이 이들의 임상적인 판단을 내리는 데 있어서 도움이 된다. 본 발명은 이에 따라 인플루엔자 유행병 및 범유행병 동안에 환자들의 초기 환자 분류에서도 실제적인 용도를 가진다. 일 측면에 있어서, 본 발명은 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자 내의 임상적인 위험도를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도성 단백질 27(IFI27) 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계 및 상기 결정된 IFI27 유전자의 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 환자는 인플루엔자 A 혹은 인플루엔자 B 감염, 또는 이의 하위 형태(sub-type)를 가지거나 가지는 것으로 의심된다. 일 실시예에 있어서, 상기 하위 형태는 인플루엔자 A의 계절성 균주(seasonal strain)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 하위 형태는 인플루엔자 B의 계절 균주이다. 일 실시예에 있어서, IFI27 유전자 산물의 표준 레벨은 임상적인 위험도가 없는 것을 나타내며, 상기 표준 레벨과 비교하여 상승된 상기 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 건강한 대상들(subjects) 내의 IFI27의 레벨에 기초하여 임상적인 위험도가 없는 것을 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 증상이 없는 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상들 내의 IFI27의 레벨을 기초로 하며, 상기 표준 레벨과 비교하여 상승된 상기 환자 내의 IFI27의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물의 표준 레벨은 임상적인 위험도를 나타내며, 상기 표준 레벨과 비교하여 동일하거나 상승된 상기 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계와 동시에 제조된다. 일 실시예에 있어서, 건강한 대상들 또는 증상이 없는 인플루엔자에 감염된 대상들에 기초하는 상기 표준 레벨 보다 적어도 40배 내지 60배 높은 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 건강한 대상들 또는 증상이 없는 인플루엔자에 감염된 대상들에 기초하는 상기 표준 레벨 보다 적어도 60배 높은 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)에 상기 환자로부터의 생물 샘플과 같이 IFI27 유전자 발현 레벨을 결정하기 위한 동일한 방법을 수행하여 제조되고, 상기 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)은 소정의 양 또는 임상적인 위험도를 나타내는 양이며, 상기 표준 레벨과 비교하여 동일하거나 상승된 상기 환자 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)에 상기 환자로부터의 생물 샘플과 같이 IFI27 유전자 발현 레벨을 결정하기 위한 동일한 방법을 수행하여 제조되고, 상기 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)은 소정의 양 또는 임상적인 위험도가 없는 것을 나타내는 양이며, 상기 표준 레벨과 비교하여 상승된 상기 환자 샘플 내의 IFI27의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 인플루엔자를 가지는 환자의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 상기 환자로부터의 제1 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계 및 상기 환자로부터의 제2 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 및 제2 생물 샘플들은 다른 시간들에서 상기 환자로부터 수득되며, 상기 제1 및 제2 샘플들 내의 IFI27의 상대적인 발현 레벨들에 기초하여 상기 환자 상태를 평가하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물 샘플과 비교하여 상기 제2 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨의 증가는 상기 환자 내의 증가된 임상적인 위험도를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물 샘플과 비교하여 상기 제2 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨의 감소는 상기 환자 내의 감소된 임상적인 위험도를 나타낸다. 다른 측면에 있어서, 본 발명은 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)을 확인하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계 및 상기 결정된 IFI27 유전자 산물의 레벨을 IFI27 유전자 산물의 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물의 표준 레벨은 건강한 대상들 내의 상기 IFI27의 레벨을 기초로 하며, 상기 표준 레벨과 비교하여 상승된 상기 환자 내의 IFI27의 발현 레벨은 상기 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 환자는 바이러스성 폐렴 또는 세균성 폐렴(bacterial pneumonia)을 가지는 것으로 의심된다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴의 확인을 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 표준 레벨은 세균성 폐렴이 있는 대상들 내의 상기 IFI27 유전자 산물의 레벨을 기초로 하며, 상기 표준 레벨과 비교하여 상승된 상기 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴이 있는 환자를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 건강한 대상들 또는 세균성 폐렴을 가지는 대상들에 기초하는 표준 레벨 보다 적어도 10배 높은 IFI27 유전자 산물의 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 건강한 대상들 또는 세균성 폐렴을 가지는 대상들에 기초하는 표준 레벨 보다 적어도 40배 내지 60배 높은 IFI27 유전자 산물의 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴 및 임상적인 위험도가 있는 환자를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 건강한 대상들 또는 세균성 폐렴을 가지는 대상들에 기초하는 표준 레벨 보다 적어도 60배 높은 IFI27 유전자 산물의 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴 및 임상적인 위험도가 있는 환자를 나타낸다. 다음의 실시예들은 여기서 설명하는 본 발명의 모든 측면들에 적용된다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 생물 샘플 내의 적어도 하나의 추가적인 유전자(들)의 발현 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 유전자(들)는 발현이 구성적인(constitutive) 유전자이다. 일 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 유전자는 발현이 인플루엔자 감염에 의한 영향을 받지 않는 유전자이다. 일 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 유전자(들)는 GAPDH 유전자이다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물 샘플은 혈액 또는 혈액 세포 서브세트들(subsets)과 같은 성분이다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물 샘플은 백혈구들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 플라스마시토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell: pCDs)의 존재에 대해 농후화되도록 상기 환자로부터의 혈액 샘플을 처리하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 생물 샘플을 IFI27 유전자 산물에 결합될 수 있는 제제(agent)와 접촉시키는 단계 및 상기 제제와 상기 IFI27 유전자 산물 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물 샘플은 RNA, mRNA 또는 단백질이다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 IFI27 mRNA 또는 이의 조각(fragment)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 SEQ ID NO:1의 핵산 시퀀스 혹은 이의 조각이나 변이체(variant)를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 SEQ ID NO:2의 핵산 시퀀스(sequence) 혹은 이의 조각이나 변이체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 아이소형(isoform) 1 전사체(transcript) 변이체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 아이소형 2 전사체 변이체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 IFI27 폴리펩티드(polypeptide) 또는 이의 조각이나 변이체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 SEQ ID NO:3의 시퀀스 또는 이의 조각이나 변이체를 포함하는 아미노산 시퀀스를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물은 SEQ ID NO:4의 시퀀스 또는 이의 조각이나 변이체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 cDNA로의 mRNA의 역전사(reverse transcription)를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 cDNA 시퀀스는 SEQ ID NO:5의 시퀀스 또는 이의 조각이나 변이체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 cDNA 시퀀스는 SEQ ID NO:6의 시퀀스 또는 이의 조각이나 변이체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 생기 샘플의 cDNA 시퀀스와 같은 IFI27 핵산 시퀀스의 증식 및 증식된 시퀀스를 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 증식은 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 중합 효소 연쇄 반응은 정량적 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 중합 효소 연쇄 반응은 (i) SEQ ID NO:1, (ii) SEQ ID NO:2, (iii) SEQ ID NO:5, (iv) SEQ ID NO:6 및 (v) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6의 임의의 것의 조각이나 변이체의 시퀀스들로부터 선택도는 핵산 시퀀스를 증식시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 프라이머들(primers)을 활용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 중합 효소 연쇄 반응은 SEQ ID NO:7(acctcatcagcagtgaccagt) 및 SEQ ID NO:8(acatcatcttggctgctatgg)의 프라이머 시퀀스들의 하나 혹은 모두, 또는 이의 동일한 표적 시퀀스(target sequence)를 증식시킬 수 있는 시퀀스 변이체를 활용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 중합 효소 연쇄 반응은 SEQ ID NO:9(TGCCTCGGGCAGCCT) 및 SEQ ID NO:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)의 프라이머 시퀀스들의 하나 혹은 모두, 또는 이의 동일한 표적 시퀀스를 증식시킬 수 있는 시퀀스 변이체를 활용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 IFI27 유전자 산물 또는 이의 조각이나 변이체에 특이적으로 결합될 수 있는 하나 또는 그 이상의 프로브(probe)(들)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 프로브(들)는 (i) SEQ ID NO:1 내에 나타나는 시퀀스에 상보적인 시퀀스 혹은 (ii) SEQ ID NO:2 내에 나타나는 시퀀스에 상보적인 시퀀스, 또는 (i) 혹은 (ii)의 조각이나 변이체를 포함하는 핵산이다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 프로브(들)는 프로브(들)는 (i) SEQ ID NO:5 내에 나타나는 시퀀스에 상보적인 시퀀스 혹은 (ii) SEQ ID NO:6 내에 나타나는 시퀀스에 상보적인 시퀀스, 또는 (i) 혹은 (ii)의 조각이나 변이체를 포함하는 핵산이다. 일 실시예에 있어서, 상기 핵산 프로브는 10 내지 50의 염기들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 핵산 프로브는 30 내지 600의 염기들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 (i) 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 혈액 샘플로부터 전체 RNA의 분리주(isolate)를 제조하는 단계; (iii) 상기 전체 RNA 분리주의 역전사에 의해 cDNA를 제조하는 단계; (iv) 중합 효소 연쇄 반응에 의해 IFI27 핵산 시퀀스를 증식시키는 단계; (v) 상기 증식된 IFI27 핵산 시퀀스의 레벨을 표준과 비교하는 단계; 및 (vi) 상기 비교하는 단계에 기초하여 상기 환자가 임상적인 위험도를 가지는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 중합 효소 연쇄 반응은 정량적 중합 효소 연쇄 반응이다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준은 임상적인 위험도를 나타내거나 임상적인 위험도를 나타내지 않는 IFI27 유전자 산물의 표준 레벨을 기초로 할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 IFI27 폴리펩티드 또는 이의 조각의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 (i) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스 혹은 (ii) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스, 또는 (i) 혹은 (ii)의 항원 조각이나 변이체를 포함하는 IFI27 폴리펩티드의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 SEQ ID NO:3 혹은 SEQ ID NO:4 내에 나타나는 아미노산 시퀀스, 또는 이의 항원 조각이나 변이체를 포함하는 IFI27 폴리펩티드에 선택적으로 결합될 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 겔 전기영동(gel electrophoresis), 핵산 시퀀싱(sequencing) 및 아미노산 시퀀싱의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 전체적으로 생체 외로( ex vivo ) 수행된다 . 일 실시예에 있어서, 생물 샘플 내의 상기 결정된 IFI27 유전자 산물의 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계는 컴퓨터 프로그램의 보조로 수행된다. 일 실시예에 있어서, 상기 비교에 기초하여 환자에 대해 임상적인 위험도를 할당하는 단계는 컴퓨터 프로그램의 보조로 수행된다. 제2 측면에 있어서, 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27)의 레벨을 결장하기 위한 키트(kit)가 제공되며, 상기 키트는 IFI27 유전자 산물의 존재를 검출하기 위한 적어도 하나의 제제를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 프라이머, 항체 또는 프로브이다. 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6에 나타나는 시퀀스들, 또는 이들의 변이체나 조각으로부터 선택되는 핵산 시퀀스에 대해 특이적이다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6에 나타나는 시퀀스들, 또는 이들의 변이체나 조각으로부터 선택되는 핵산 시퀀스를 선택적으로 증식시킬 수 있는 포워드(forward) 및 리버스(reverse) 프라이머를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 SEQ ID NO:7(acctcatcagcagtgaccagt), SEQ ID NO:8(acatcatcttggctgctatgg), SEQ ID NO:9(TGCCTCGGGCAGCCT) 및 SEQ ID NO:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 핵산 시퀀스들, 또는 이의 동일한 표적 시퀀스에 특이적으로 결합될 수 있는 시퀀스 변이체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 존재를 검출할 수 있는 다중 제제들(multiple agents)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 IFI27 유전자 시퀀스에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 이의 조각이나 변이체에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 IFI27에 대해 특이적인 접합된(conjugated) 항체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 다중클론성(polyclonal) 항체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 다중클론성 항체는 래빗(rabbit) 다중클론성 항체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 단일클론성(monoclonal) 항체이다. 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 에피토프(epitope) 시퀀스: MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY에 결합된다. 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 (i) SEQ ID NO:3 내에 나타나는 아미노산 시퀀스를 포함하는 IFI27 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO:4 내에 나타나는 아미노산 시퀀스를 포함하는 IFI27 폴리펩티드, 또는 (iii) (i) 혹은 (ii)의 항원 조각이나 변이체에 선택적으로 결합될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 상기 방법의 정규화(normalisation)를 위한 하나 또는 그 이상의 제제들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 정규화를 위한 제제(들)는 구성적으로(constitutively) 발현되는 유전자 산물의 검출을 위한 제제 또는 제제들로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 구성적으로 발현되는 유전자 산물은 GAPDH이다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 보정된 표준들을 포함하며, 상기 표준은 IFI27 유전자 산물의 알려진 농도를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 IFI27 유전자 산물의 알려진 농도는 인플루엔자 감염으로부터 심각한 질병의 무시할 수 있는 임상적인 위험도를 가지는 개체(individual)의 양, 또는 인플루엔자 감염으로부터 심각한 질병의 임상적인 위험도에서 개체의 양을 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 보정된 표준들은, 무시할 수 있는 임상적인 위험도를 나타내는 양과 같이, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 5 내지 10 폴드(fold)를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 10 내지 20 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 20 내지 40 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 30 내지 60 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 50 내지 60 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 50 내지 100 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 100 내지 200 폴드를 나타내는 양, 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 150 내지 600 폴드를 나타내는 양, 또는 건강한 개체들에 통상적인 경우 보다 큰 약 500 내지 1000 폴드를 나타내는 양의 IFI27 유전자 산물의 양들을 나타내는 범위를 포괄한다. 일 실시예에 있어서, 상기 보정된 표준은, 임상적인 위험도를 나타내는 양과 같이, 인플루엔자 감염 및 임상적인 위험도를 가지는 개체의 통상적인 경우 보다 큰 약 1 내지 2 폴드를 나타내는 양, 인플루엔자 감염 및 임상적인 위험도를 가지는 개체의 통상적인 경우 보다 큰 약 2 내지 4 폴드를 나타내는 양, 인플루엔자 감염 및 임상적인 위험도를 가지는 개체의 통상적인 경우 보다 큰 약 3 내지 6 폴드를 나타내는 양, 인플루엔자 감염 및 임상적인 위험도를 가지는 개체의 통상적인 경우 보다 큰 약 5 내지 10 폴드를 나타내는 양, 또는 인플루엔자 감염 및 임상적인 위험도를 가지는 개체의 통상적인 경우 보다 큰 약 10 내지 20 폴드를 나타내는 양의 IFI27 유전자 산물의 양들을 나타내는 범위를 포괄한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 (i) 하나 또는 그 이상의 레퍼런스(reference) 샘플(들); (ii) 하나 또는 그 이상의 검출 가능한 모이어티들(moieties); (iii) 고체 지지체 상의 IFI27 유전자 산물을 검출하기 위한 제제를 고정시키기 위한 하나 또는 그 이상의 물질(들); (iv) 고체 지지체 물질; (v) 생물 샘플의 수집 및/또는 저장을 위한 하나 또는 그 이상의 용기(들); (vi) 생물 샘플의 제조에의 사용을 위한 하나 또는 그 이상의 시약(들); (vii) 핵산 시퀀스의 증식을 위한 하나 또는 그 이상의 제제들; 그리고 (viii) 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하기 위한 방법에 상기 키트 또는 이의 구성 요소(들)의 사용을 위한 명령들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 추가적인 구성 요소들을 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 인플루엔자의 치료를 위한 제제의 효능을 평가하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 제제를 인플루엔자 감염을 가지는 개체에 투여하는 단계, 상기 개체로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 레벨을 결정하는 단계 및 상기 IFI27 유전자 산물의 결정된 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 노출된 개체 내의 질병의 심각도를 감소시키기 위한 제제의 효능을 평가하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 제제를 상기 개체에 투여하는 단계, 상기 개체로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 레벨을 결정하는 단계 및 상기 결정된 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 개체는 상기 제제의 투여 이전에 인플루엔자 바이러스에 노출된다. 일 실시예에 있어서, 상기 개체는 상기 제제가 투여되었을 때에 인플루엔자 바이러스를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 개체는 상기 제제의 투여 후에 인플루엔자 바이러스에 노출된다. 일 실시예에 있어서, 임상적인 위험도를 나타내는 표준 레벨은 임상적인 위험도를 정의하는 표준 곡선(standard curve)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명의 방법들은 무시할 수 있는 임상적인 위험도로부터 심각한 질병의 임상적인 위험도까지의 범위와 같이 IFI27의 양들의 범위를 포괄하는 표준 곡선의 사용을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 표준 레벨은 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)에 상기 개체로부터의 생물 샘플과 같이 IFI27 유전자 발현 레벨을 결정하기 위한 동일한 방법들을 수행하여 제조되며, 상기 IFI27 유전자 산물의 하나 또는 그 이상의 알려진 샘플(들)은 소정의 양 또는 임상적인 위험도를 나타내는 양들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 제제의 투여 이전에 상기 개체로부터 수득된 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 투여 이전의 레벨과 비교하여 상기 제제의 투여 후에 상기 개체로부터의 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨의 감소는 인플루엔자 바이러스에 노출되거나 인플루엔자 감염을 가지는 환자 내의 질병의 삼각도를 감소시킬 수 있는 제제를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 인플루엔자의 치료의 예방을 위한 후보 항바이러스 제제의 리서치 트레일(research trail) 또는 임상 시험의 일부로서 수행된다.
약어들 약어 RSV는 여기서 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)에 대해 사용된다. 약어 IFI27은 여기서 인터페론 알파 유도 단백질(interferon alpha inducible protein) 27에 대해 사용된다. 약어 p27도 여기서 인터페론 알파 유도 단백질 27에 대해 사용될 수 있다. 약어 GAPDH는 여기서 글리세르알데히드 인산 수소 이탈 효소(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)에 대해 사용된다. 약어 LPS는 여기서 지질다당류(lipopolysaccharide)에 대해 사용된다.
정의들 본 명세서에 사용되는 바에 있어서, 단수 형태인 "일", "하나" 및 "상기"는 본 문에서 명확하게 다르게 기술하지 않는 한 복수의 참조들을 포함한다. 본 문에서 그렇게 다르게 요구하거나 반대되게 서술되지 않는 한, 단수의 정수들, 단계들 또는 요소들로서 여기서 언급되는 본 발명의 정수들, 단계들 또는 요소들은 언급된 정수들, 단계들 또는 요소들의 단수 및 복수의 형태들을 모두 포괄한다. "적어도 하나"라는 용어는 선택 가능한 요소들의 그룹의 내용에 사용될 때에 개별적으로 선택되는 상기 그룹의 임의의 및 모든 구성 요소들을 포함하며, 상기 그룹의 구성 요소들의 임의의 조합을 포함한다. 유사하게, "적어도 둘"이라는 용어는 선택 가능한 요소들의 그룹의 내용에 사용될 때에 임의의 조합으로 상기 그룹의 둘 또는 그 이상의 구성 요소들의 임의의 선택을 포함한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "구비하는"이라는 용어는 "포함하는"을 의미한다. "구비하다" 및 "구비하여"와 같은 단어 "구비하는"의 변형들은 상응하는 변형된 의미들 가진다. 따라서, 예를 들면, 시퀀스 인코딩(sequence encoding) 단백질을 "구비하는" 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)는 이러한 시퀀스로 배타적으로 구성될 수 있거나, 하나 또는 그 이상의 추가적인 시퀀스들을 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 정해진 활성들을 "구비하는" 방법은 이들 활성들로 배타적으로 구성될 수 있거나, 하나 또는 그 이상의 추가적인 활성들을 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 정해진 구성 요소들을 "구비하는" 키트는 이들 구성 요소들로 배타적으로 구성될 수 있거나, 하나 또는 그 이상의 추가적인 구성 요소들을 포함할 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "항체(antibody)" 및 "항체들"이라는 용어들은 이들의 가장 넓은 의미들로 여기서 사용되며, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여), IgA(IgA1 및 IgA2를 포함하여), IgD, IgE 또는 IgM, 그리고 IgY, 단일 사슬의 전체 항체들 및 이들의 항원-결합 조각들을 포함하여 전체 항체들을 포함한다. 항원-결합 항체 조각들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fvs(scFv), 단일 사슬 항체들, 이황화물-연결(disulfide-linked) Fvs(sdFv) 그리고 VL 또는 VH 도인을 구비하는 조각들을 포함한다. 상기 항체들은 임의의 동물 기원일 수 있다. 단일 사슬 항체들을 포함하여 항원-결합 항체 조각들은 가변 부위(들) 단독으로 또는 다음의 전체 또는 일부와 결합을 구비할 수 있다: 힌지 부위(hinge region), CH1, CH2 및 CH3 도메인들. 또한, 가변 부위(들)와 힌지 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인들의 임의의 결합들로 포함된다. 항체들은 생물 분자에 특이적으로 결합되는 단일클론성(monoclonal), 다중클론성(polyclonal), 키메라(chimeric), 다중특이성(multispecific), 인간화(humanized) 그리고 인간 단일클론성 및 다중클론성 항체들이 될 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질"이라는 용어들은 교호적으로 사용되며, 동일한 의미를 가지는 것으로 여겨진다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequence)" 및 "폴리뉴클레오티드 시퀀스" 그리고 "핵산 시퀀스"라는 용어들은 교호적으로 사용되며, 동일한 의미를 가지는 것으로 여겨진다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "키트(kit)"라는 용어는 물질들을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 언급한다. 여기에 기재되는 검출 분석들 및 방법들의 내용에 있어서, 이러한 전달 시스템들은 하나의 위치로부터 다른 하나로의 반응 시약들(예를 들면, 적절한 용기들 내의 표지들, 레퍼런스 샘플들, 지지 물질 등) 및/또는 지지 물질들(예를 들면, 완충제들, 상기 분석의 수행을 위해 기재된 명령들 등)의 저장, 이송 또는 전달을 가능하게 하는 시스템들을 포함한다. 예를 들면, 키트들은 관련된 반응 시약들 및/또는 지지 물질들을 함유하는 박스들과 같은 하나 또는 그 이상의 엔클로저들(enclosures)을 포함한다. 본 명세서에 포함되는 문헌들, 작용들, 물질들, 장치들, 항목들 또는 유사한 것들에 대한 임의의 논의는 단지 본 발명의 내용을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이들 사항들의 임의의 것이나 모두가 종래 기술의 일부로부터 또는 본 출원의 우선일 전에 본 발명에 관련된 분야에서 공통적인 일반 지식이었던 것으로 인정되는 것은 아니다. 설명의 목적들을 위하여, 여기서 참조되는 모든 문헌들은 다르게 기술하지 않는 한 이들의 개시 사항들이 참조로 포함된다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 예시적으로만 본 발명의 바람직한 실시예를 설명한다.
도 1은 게놈-와이드 마이크로어레이(genome-wide microarray) 분석을 이용한 후보 유전자들의 스크린을 나타낸다. 말초 혈액은 인플루엔자 감염이 인정된 개체들로부터 샘플링되었다. RNA는 48,804의 프로브들을 커버하는 마이크로어레이 분석(Illumina Sentrix HT-12_v3_BeadChip 어레이들)을 위해 추출되었다. 유전자 발현 신호들은 각 축 상에서 발현 강도의 log2로 나타내었다. 대각선은 두 그룹들이 비교되었을 때(H1N1 인플루엔자 대 건강한 대조군들) 발현의 변화가 없는 것을 나타낸다. 상기 대각선 위의 선은 유전자 상향 조절에서 적어도 두 폴드 증가를 나타낸다. 상기 대각선 아래의 선은 유전자 하향 조절에서 적어도 두 폴드 증가를 나타낸다. 각각의 점은 상기 마이크로어레이 상의 개별적인 프로브를 의미한다. IFI27은 알파-유도 단백질 27을 의미한다(상기 IFI27 프로브는 적색으로 강조되어 있다).
도 2는 심각한 인플루엔자 감염에서 IFI27 발현을 나타낸다. 진행 세트(development set)(n=8) 및 검증 세트(validation set)(n=33)는 호흡 부전이 진행되고 특별 관리 유닛들에 대해 승인이 요구되는 심각한 인플루엔자 폐렴이 있는 개체들로 구성된다. 대조군 세트(control set)(n=18)는 건강한 지원자들로 구성된다. 말초 혈액 IFI27 유전자 발현은 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화(fold change) +/- SD를 도시한다. p 값들은 비모수 만-휘트니(non-parametric Mann-Whitney) U 테스트를 이용하여 계산되었다.
도 3은 IFI27 발현 및 인플루엔자 감염의 심각도를 나타낸다. 가벼운 질병과 심각한 질병을 가지는 개체들 내의 독립적인 데이터 세트들을 이용한 바이오마커의 검증. 가벼운 감염 코호트(infection cohort)는 증상이 없는(n=8) 및 증상을 나타내는 개체들(n=9)을 포함한다. 심각한 감염 코호트(n=10)는 호흡 부전이 진행되고 특별 관리 유닛들에 대해 승인이 요구되는 개체들을 포함한다. 유전자 발현 옴니버스(GEO)는 IFI27 발현의 계산을 위한 마이크로어레이 데이터 세트들을 제공한다(GSE17156-가벼운 인플루엔자, GSE21802-심각한 인플루엔자). 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다. p 값들은 비모수 만-휘트니 U 테스트를 이용하여 계산되었다.
도 4는 진행 세트 내의 인플루엔자 감염으로부터 회복 동안의 IFI27 발현을 나타낸다. 진행 세트 내의 인플루엔자 감염으로 심각한 질병이 있는 환자들(n=8)은 5일까지 관리되었고, 말초 혈액 IFI27 발현은 매일 한 번, 세 번, 다섯 번 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 5는 검증 세트 내의 인플루엔자 감염으로부터 회복 동안의 IFI27 발현을 나타낸다. 검증 세트 내의 인플루엔자 감염으로 심각한 질병이 있는 환자들(n=33)은 5일까지 관리되었고, 말초 혈액 IFI27 발현은 매일 한 번, 세 번, 다섯 번 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 6은 인플루엔자 감염으로부터 가벼운 및 심각한 질병에서 인터페론 유도 유전자들을 나타낸다. 진한 색의 막대는 인플루엔자 감염으로부터 가벼운 질병에서 유전자 발현을 의미한다. 보다 밝은 색의 막대는 인플루엔자 감염으로부터 심각한 질병에서 유전자 발현을 의미한다.
도 7은 IFI27 발현 및 증가하는 바이러스 부하(viral load)를 나타낸다. 건강한 지원자들로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포들(mononuclear cells)은 인플루엔자 바이러스(H1N12009)로 배양되었다. IFI27 발현은 각 바이러스 부하의 농도로 정량적 PCR를 통해 측정되었다(MOI는 감염의 다중성을 의미하며, 전체 세포들에 대한 바이러스의 비율을 나타낸다). 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시하며, 세 다른 대상들로부터의 독립적인 실험들을 나타낸다. SEQ ID NO:1.
도 8은 IFI27 발현 및 항바이러스제(antiviral agent)를 나타낸다. 건강한 지원자들로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)은 인플루엔자 바이러스(H1N12009)로 배양되었고, 이후에 후속하여 항바이러스제(오셀타미비르(oseltamivir))로 처리되었다. 오셀타미비르 H는 높은 농도(37ng/㎕)를 나타낸다. 오셀타미비르 L은 낮은 농도(0.3ng/㎕)를 나타낸다. IFI27 발현은 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시하며, 세 다른 대상들로부터의 독립적인 실험들을 나타낸다.
도 9는 shows IFI27 발현 및 인터페론 경로의 활성제들(activators)을 나타낸다. IFI27 발현은 IFN-알파, IFN-베타 및 IFN-람다에 의한 말초 혈액 단핵 세포들의 자극 후에 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 10은 IFI27 발현 및 인터페론 알파를 나타낸다. 건강한 지원자들로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포들은 다른 농도들에서 인터페론-알파(IFN)로 배양되었다. IFI27 발현은 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시하며, 세 다른 대상들로부터의 독립적인 실험들을 나타낸다.
도 11은 IFI27 발현 및 톨-유사 수용체 리간드들(toll-like receptor ligands)을 나타낸다. 건강한 지원자들로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포들은 톨-유사 수용체에 대한 리간드들로 배양되었다. IFI27 발현은 각 리간드로 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 다른 대상들로부터의 독립적인 실험들이 TLR1, TLR2, TLR3, TLR5, TLR6, TLR8, TLR9(n=2), TLR4(n=4), TLR7(n=10)을 포함하는 각각의 톨 유사 수용체(TLR) 리간드에 대해 수행되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다. p 값은 다중 그룹들의 비교를 위해 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트를 이용하여 계산되었다.
도 12는 톨-유사 수용체 7 상의 리간드에 의한 자극 후에 다른 면역 세포 서브세트 내의 IFI27 발현을 나타낸다. 가르디퀴모드(Gardiquimod)(TLR7 리간드)에 의한 자극 후, IFI27 발현은 CD4, CD8, 호중구들(neutrophils), B 세포들, 단핵구들(monocytes), 자연 살해 세포들(NK 세포들), 골수 수지상 세포들(myeloid dendritic cells: mDC), 플라스마시토이드 수지상 세포들(plasmacytoid dendritic cells: pDC), 단핵구 유래 대식 세포(monocytes derived macrophage: MDM) 그리고 단핵구 유래 수지상 세포들(monocytes derived dendritic cells: MDDC)을 포함하는 각 면역 세포 서브세트들 내에서 정량적 PCR을 통해 측정되었다. PBMC는 말초 혈액 단핵 세포들을 의미한다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다. p 값은 다중 그룹들의 비교를 위해 크루스칼-왈리스 테스트를 이용하여 계산되었다.
도 13은 IFI27 발현 및 바이러스 항원을 나타낸다. IFI27 발현은 바이러스 항원에 의한 자극 후에 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 면역 세포 서브세트들은 CD4, CD8, 호중구들, B 세포들, 단핵구들, 자연 살해 세포들(NK 세포들), 골수 수지상 세포들(mDC), 플라스마시토이드 수지상 세포들(pDC), 단핵구 유래 대식 세포(MDM), 그리고 단핵구 유래 수지상 세포들(MDDC)을 포함한다. PBMC 말초 혈액 단핵 세포들을 의미한다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 14는 플라스마시토이드 수지상 세포들 및 인플루엔자 바이러스들 내의 IFI27 발현을 나타낸다. 플라스마시토이드 수지상 세포들은 H1N1(캘리포니아(Carlifornia)-2009), H3N2(빅토리아(Victoria)-2011)를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스들 및 인플루엔자 B 바이러스로 배양되었다. IFI27 유전자 발현은 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다. 각각의 데이터 포인트는 두 다른 대상들로부터의 독립적인 실험들을 나타낸다.
도 15는 IFI27 유전자 발현에 대해 제시된 메커니즘을 나타낸다. pDC는 플라스마시토이드 수지상 세포들을 의미한다. TLR7은 톨-유사 수용체 7을 의미한다. IFN은 인터페론 알파를 의미한다. MyD88은 골수 차등 일차 반응 유전자(myeloid differentiation primary response gene)를 의미한다. IRF7은 인터페론 조절 인자(interferon regulatory factor) 7을 의미한다.
도 16은 플라스마시토이드 수지상 세포들(pDCs) 내의 IFI27 발현의 시간 경과를 나타낸다. 인플루엔자 바이러스는 플라스마시토이드 수지상 세포들로 배양되었다. IFI27 유전자 발현은 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 사멸 세포들(apoptotic cells)은 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 막혔을 때에 아넥신(Annexin) V 및 프로피디움 요오드 포지티브(Propidium Iodide positive)(아넥신 V pos, PI pos) 모두로 확인되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 17은 박테리아 및 바이러스 병원체들에 반응하는 IFI27 발현을 나타낸다. IFI27 발현은 바이러스(H1N1 인플루엔자 바이러스)에 의한 자극 및 박테리아 자극 후에 정량적 PCR을 통해 측정되었다(LPS는 지질다당류(lipopolysaccharide)를 의미한다). 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 18은 다른 질병 상태들에서 IFI27 유전자 발현을 나타낸다. SIRS는 전신 염증성 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome)을 의미한다. 말초 혈액 IFI27 유전자 발현은 인플루엔자 폐렴(n=8), 세균성 폐렴(n=16), SIRS(n=12) 및 건강한 대조군들(n=18)로 개체들 내에서 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다. p 값들은 비모수 만-휘트니 U 테스트를 이용하여 계산되었다.
도 19는 세균성 및 바이러스성 폐렴 내의 IFI27 발현을 나타낸다. IFI27 발현은 심각한 인플루엔자 폐렴(n=8) 및 세균성 폐렴(n=16)이 있는 환자들의 두 코호트들 내에서 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 막대그래프는 평균 폴드 변화 +/- SD를 도시한다.
도 20은 정신적 외상(trauma) 및 수술 환자들 내의 IFI27 발현을 나타낸다.
도 21은 정신적 외상 환자들의 큰 코호트 내의 IFI27 발현을 나타낸다. 정신적 외상 환자들(n=167)의 독립적인 코호트를 이용한 바이오마커의 검증. 유전자 발현 옴니버스(GEO)는 IFI27 발현(GSE11375)의 계산을 위한 마이크로어레이 데이터를 제공한다. 유전자 발현 데이터는 28일 이상 기록되었다. 각 데이터 포인트는 개개의 환자의 유전자 발현 레벨을 나타낸다.
도 22는 IFI27 mRNA 시퀀스, 아이소형 1(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. 호모 사피엔스 인터페론(Homo sapiens interferon), 알파-유도 단백질 27(IFI27), mRNA. NCBI 레퍼런스 시퀀스: NM_001130080.1. 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.: 7 및 SEQ ID NO.:8)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
도 23은 IFI27 mRNA 시퀀스, 아이소형 2(SEQ ID NO:2)의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.: 7 및 SEQ ID NO.:8)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
도 24는 IFI27, isoform 1(SEQ ID NO:3)의 아미노산 시퀀스를 나타낸다. 인터페론 알파 유도 단백질 27, [호모 사프엔스]. NCBI 레퍼런스 시퀀스: NP_001123552.1
도 25는 IFI27, 아이소형 2(SEQ ID NO:4)의 아마노산 시퀀스를 나타낸다.
도 26은 여기서의 실험예들의 IFI27의 표적 부위를 나타낸다. uc021sba.1__IFI27을 참조한 뉴클레오티드 시퀀스 위치들. 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.: 7 및 SEQ ID NO.:8)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
도 27은 여기서의 실험예들의 GAPDH의 표적 부위를 나타낸다. uc001qop.1__GAPDH를 참조하여 증식된 뉴클레오티드 시퀀스(SEQ ID NO.:13). 엑손들(exons)은 대문자 폰트로 나타난다. 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.:14 및 SEQ ID NO.:15)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
도 28은 호모 사피엔스 글리세르알데히드(glyceraldehyde)-3-인산 수소 이탈 효소(phosphate dehydrogenase)(GAPDH), 전사체 변이체 1, mRNA의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. NCBI 레퍼런스 시퀀스:NM_002046.4(SEQ ID NO.:12A). 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.:14 및 SEQ ID NO.:15)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
도 29는 호모 사피엔스 글리세르알데히드-3-인산 수소 이탈 효소(GAPDH), 전사체 변이체 2, mRNA의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. NCBI 레퍼런스 시퀀스:NM_001256799.1(SEQ ID NO.:12B). 프라이머 어닐링의 부위들(SEQ ID NO.:14 및 SEQ ID NO.:15)은 강조되고 밑줄이 그어진다.
여기서 참조되는 시퀀스들
SEQ ID NO:1 :IFI27 mRNA 시퀀스, 아이소형 1; 665 염기; NM_001130080.1로부터.
SEQ ID NO:2 : IFI27 mRNA 시퀀스, 아이소형 2, 656 염기.
SEQ ID NO:3: IFI27 폴리펩티드 아미노산 시퀀스, 아이소형 1; NP_001123552.1로부터.
SEQ ID NO:4: IFI27 폴리펩티드 아미노산 시퀀스, 아이소형 2.
SEQ ID NO:5: IFI27 cDNA 시퀀스, 아이소형 1; 아이소형 1 mRNA(SEQ ID NO:1)로부터 합성될 수 있는 바와 같은; NM_001130080.1로부터.
SEQ ID NO:6 : IFI27 cDNA 시퀀스, 아이소형 2 mRNA(SEQ ID NO:2) 로부터 합성될 수 있는 바와 같은.
SEQ ID NO:7 :acctcatcagcagtgaccagt(IFI27 포워드(forward) 프라이머 59.8C).
SEQ ID NO:8 :acatcatcttggctgctatgg(IFI27 리버스(reverse) 프라이머 60.1C).
SEQ ID NO:9 :TGCCTCGGGCAGCCT(IFI27 포워드 프라이머).
SEQ ID NO:10 :TTGGTCAATCCGGAGAGTCC(IFI27 리버스 프라이머).
SEQ ID NO:11 :여기서의 실험예들에 대한 IFI27 표적 핵산 시퀀스. UCSC 유전자들로부터의 시퀀스 및 좌표들, uc021sba.1_IFI27, 위치들 142-328. 187bp 표적 부위.
SEQ ID NO:12A : GAPDH 전체 길이 mRNA 시퀀스; 전사체 변이체 1, mRNA; NCBI 레퍼런스 시퀀스:NM_002046.4.
SEQ ID NO:12B : GAPDH 전체 길이 mRNA 시퀀스; 전사체 변이체 2, mRNA; NCBI 레퍼런스 시퀀스:NM_001256799.1
SEQ ID NO:13 : 여기서의 실험예들에 대한 GAPDH 표적 핵산 시퀀스. UCSC 유전자들로부터의 시퀀스 및 좌표들, uc001qop.1_GAPDH.
SEQ ID NO:14 :ACGCATTTGGTCGTATTGGG(GAPDH 포워드 프라이머).
SEQ ID NO:15 :TGATTTTGGAGGGATCTCGC(GAPDH 리버스 프라이머).
SEQ ID NO:16 :cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(Gjermandsen 등(1999)으로부터의 IFI27 포워드 프라이머(ISG12f;)).
SEQ ID NO:17: cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(Gjermandsen 등(1999)으로부터의 IFI27 리버스 프라이머(ISG12r;))
본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명자들에 의한 대상 내의 IFI27의 발현 레벨이 상기 대상 내의 인플루엔자 감염(influenza infection)에 의해 야기되는 질병의 심각도와 상호 관련되는 확인을 기초로 한다. 본 발명은 심각한 질병을 보다 진전시킬 수 있고 병원이나 임상적인 환경 내에서 의료 중재를 요구하는 것으로 정의되는 바와 같이 개체들이 임상적인 위험도를 가지는 지를 결정함에 의해 인플루엔자로 감염된 환자들을 평가하는 데 이용될 수 있다. 이러한 결정은 환자가 인플루엔자 감염의 증상을 보이기 이전에 및 환자가 심각한 질병을 나타내는 증상을 보이기 이전에 이루어질 수 있다. 상기 의료 중재는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 입원 허가 또는 생명 유지 치료를 포함할 수 있다. 본 발명은, 예를 들면, 인플루엔자 감염의 조기 관리, 감염에 대한 환자의 면역 반응의 모니터링하는 것 및 그렇지 않으면 종래의 진단 접근법들에 의해서 놓칠 수 있는 위험이 있는 개체들에 대한 생명 구조 개입을 가능하게 하는 것과 같은 건강관리에의 적용들을 가진다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자 내의 임상적인 위험도를 확인하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질(interferon alpha inducible protein) 27(IFI27) 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계 및 상기 결정된 IFI27 유전자 산물의 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 IFI27 유전자 산물의 표준 레벨은 임상적인 위험도 또는 임상적인 위험도가 없는 것의 하나가 될 수 있다. 환자들 내의 IFI27 유전자 산물들의 레벨을 표준 레벨들의 경우와 비교할 때, 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 상승된 레벨은 상기 표준 레벨에 대한 폴드 증가(fold increase)로 표현될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 건강한 대상들이나 증상이 없는 인플루엔자를 가지는 대상의 통상적인 IFI27 유전자 산물의 레벨의 적어도 40 내지 60배인 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 건강한 대상들이나 증상이 없는 인플루엔자를 가지는 대상의 통상적인 IFI27 유전자 산물의 레벨의 적어도 40배인 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 또 다른 측면에 있어서, 건강한 대상들이나 증상이 없는 인플루엔자를 가지는 대상의 통상적인 IFI27 유전자 산물의 레벨의 적어도 50배인 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 건강한 대상들이나 증상이 없는 인플루엔자를 가지는 대상의 통상적인 IFI27 유전자 산물의 레벨의 적어도 60배인 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 임상적인 위험도를 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자 내의 임상적인 위험도를 확인하기 위한 진단의 제조를 위하여 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 제제(agent)의 사용이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자 내의 임상적인 위험도를 확인하는 방법에의 사용을 위하여 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 제제의 사용이 제공된다. 예를 들면, 생물 샘플 내의 상기 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 것은 여기서는, 예를 들면, 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨을 결정하는 것으로 선택적으로 언급될 수 있는 점이 이해될 것이다. 이에 따라, 상기 IFI27 유전자 산물의 발현 레벨을 결정하는 것은 이의 가장 넓은 의미를 뜻하므로, 상기 "레벨(level)"은 may include IFI27 단백질 또는 이의 조각과 같은 임의의 IFI27 전사체(transcript) 또는 하향 산물을 포함할 수 있다. 상기 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 핵산들, 예를 들면 RNA 전사체들, 이러한 전사체들의 cDNA 유도체들 및 유사한 것들, 단백질들 그리고 폴리펩티드들(polypeptides)을 포함하는 적절한 유전자 산물이 될 수 있다. 통상적으로, 상기 유전자 산물은 mRNA 또는 이의 조각(fragment) 혹은 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 조각이다. 본 발명은 질병의 확산과 심각성을 완화시키는 인자들을 효과적인 관리하는 능력이 소실되거나 사용 불능이 되기 때문에 특히 유행병(예를 들면, 연례의 계절성 인플루엔자) 또는 범유행병(예를 들면, H1N1 2009 인플루엔자 바이러스) 동안에 감염성 질병의 이병율(morbidity), 사망률(mortality) 그리고 사회적 및 재정적인 비용을 악화시키는 감염성 질병 의학에서 위험도 계층화(risk stratification) 도구들의 결핍을 처리한다. 이러한 완화시키는 인자들은 (1) 질병 확산에 대한 조절을 위해 격리가 요구되는 환자들, (2) 질병의 심각도 및 감염의 길이를 감소시키기 위한 악화에 대한 환자들의 민감성, 그리고 (3) 고 위험 또는 조기에 어려운 경우들을 중화시키기 위한 공동의 질병 상태에 대한 환자들의 예비 처치의 결정 및 우선화를 포함한다. 여기에 기재되는 바와 같은 IFI27 바이오마커(biomarker)에 의한 위험도 계층화는 입인 허가에 대한 지연을 최소화할 수 있고, 이에 따라 잠재적으로 생명을 구할 수 있다. 환자들이 감염 또는 심각한 질병의 증상으로 되기 이전에 채용될 수 있는 인플루엔자 감염에 대한 위험도 계층화 도구를 제공함에 의해, 고 위험의 환자들이 조기에 확인될 수 있으며 이들 환자들에 대해 적절한 의료 관리의 즉각적인 전달이 보장된다. 본 발명의 방법은 또한 임상의가 인플루엔자를 가지는 환자의 진행을 모니터하는 것을 가능하게 한다. 이는 상기 임상의가 질병의 상대적으로 가벼운 징후로부터 임상적인 위험도까지 가능한 악화에 대해 환자를 모니터하거나, 임상적인 위험도로부터 회복까지 환자의 개선을 모니터하게 할 수 있다. 통상적으로, 이러한 형태의 모니터링은, 본 발명의 방법들에서, 상기 환자로부터의 제1 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하고, 상기 환자로부터의 제2 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정함에 의해 수행될 수 있으며, 상기 제1 및 제2 샘플들은 다른 시간들에서 상기 환자로부터 수득된다. 예를 들면, 상기 제1 샘플은 치료가 시작되기 이전에 얻어지고, 상기 제2 샘플은 상기 환자가 치료나 관찰을 경험하는 동안에 주어진 시한 후에 얻어진다. 가능한 한 많이 원하는 바에 따라 상기 환자를 더 모니터하기 위하여 임의의 숫자의 연속되는 샘플들이 물론 사용될 수 있다. 샘플들은 한 시간이나 수 시간 또는 하루나 일주의 간격들과 같은 적절한 간격들에서 상기 환자로부터 얻어질 수 있다. 샘플들은 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위한 치료제의 투여와 같은 특정한 치료가 수행된 후에 수득될 수 있다. 이러한 방식에 있어서, 상게 제1 샘플과 비교하여 제2(또는 후속하는) 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 증가된 레벨은 상기 환자 내의 증가된 임상적인 위험도를 나타내는 반면, 감소는 감소된 임상적인 위험도를 나타낸다. 증가된 임상적인 위험도는 상기 환자가 의료 중재를 필요로 하거나 계속적으로 필요로 하는 것에 대한 증가된 가능성으로 정의될 수 있지만, 감소된 임상적인 위험도는 상기 환자가 의료 중재를 필요로 하거나 계속적으로 필요로 하는 것에 대한 감소된 가능성이다. 이러한 모니터링의 결과들에 따라, 상기 임상의가 상기 환자의 치료를 조정할 수 있다. 상기 방법은 이에 따라 환자들의 치료 및 관리에서 임상의들을 보조한다. 본 발명자들은 상기 IFI27의 상승된 발현이 인플루엔자 감염에 특이적이고, 세균성 감염(bacterial infection)에서 증가되지 않는 생체 외의( in vitro ) 시험을 통해 입증되었다. 그 결과, 본 발명은 또한 바이러스성 폐렴(viral pneumonia)과 같은 인플루엔자 및 연관된 상태들을 가지는 환자들을 세균성 폐렴(bacterial pneumonia)과 같은 유사한 증상들을 나타낼 수 있는 다른 상태들을 가지는 환자들과 구변하는 방법들을 제공한다. 이러한 능력은 많은 상황들에서 치료하는 임상의에게 유리하며, 인플루엔자 및 세균성 감염들 모두를 나타낼 수 있는 증상들을 가질 수 있는 환자들의 과잉 관리를 회피하는 데 도움이 될 수 있다. 그 결과, 본 발명은 특히 층별 진단보다는 예방 차원에서 항생제들로 상기 인플루엔자 환자들의 "과잉 치료(over-treatment)"와 같은 일반적인 실질 레벨에서 인플루엔자 관리의 통상적인 하나 또는 그 이상의 문제들을 완화시킬 수 있다. 이러한 실질이 광범위하므로 항생제 내성의 박테리아가 출현하고 있다. 본 발명은 각기 대규모의 불필요한 이병율, 종종 사망을 야기하는 악화들 또는 내성 박테리아들의 발달을 고무시키는 항생제들의 과잉 처방을 가져오는 질병의 전체적인 부족한 관리 또는 과잉 관리의 상황들을 완화시킬 수 있다. 다른 시나리오에 있어서, 환자는 바이러스성 폐렴으로 먼저 입원이 허가될 수 있다. 상기 환자는 후속하여 세균성 폐렴과 같은 복합 증상이 진행될 수 있다. 상기 임상의들은 (1) 상기 바이러스성 폐렴이 지속되거나, (2) 세균성 폐렴이 중첩되기 때문에 상기 환자가 나아지지 않는 가를 알 필요가 있다. 본 발명은, 상기 바이러스성 폐렴이 지속되거나 임상적으로 중요한 인플루엔자가 지속되는 경우에는 상기 환자 내에서 상승되지만, 상기 환자가 세균성 폐렴을 대신 가지는 경우에는 기초 레벨 또는 부근에 있게 되는 IFI27 유전자 산물의 발현의 두 기초들을 구별하는 능력을 제공한다. 또 다른 시나리오는 상기 환자가 비통상적이거나 이상적인 증상들로 응급실에 먼저 존재하여 첫 번째 예에서 의사가 세균성 또는 바이러스성 폐렴인지를 자신 있게 진단할 수 없는 것이다. 이는 보다 통상적인 임상적인 문제이며, 지금까지 종래의 테스트들은 이러한 문제점을 해결하는 데 도움이 되지 못하였다. 예방적인 측정으로서, 이러한 환자들이 종종 항생제들로 치료될 수 있다. 환자로부터의 생물 샘플 내에서 결정된 IFI27 발현이 상승될 것으로 예상되는 바이러스성 폐렴을 가지는 환자와 IFI27 발현 레벨들이 상승되지 않을 것으로 예상되는 세균성 폐렴만을 가지는 환자를 구별하는 능력을 제공함에 의하여, 본 발명은 의사에게 종종 개선된 진단 도구를 제공하며, 이에 따라 이른 시간에 개시되는 임상적으로 관련된 치료를 가능하게 한다. 다른 측면에 있어서, 본 발명은 이에 따라 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 확인하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 IFI27 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계 및 상기 결정된 IFI27 유전자 산물의 레벨을 표준 레벨과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 표준 레벨은 건강한 환자들 또는 세균성 폐렴을 가지는 환자들 내의 IFI27 유전자 산물들의 레벨을 기초로 할 수 있으며, 여기서 상기 환자 내의 IFI27 유전자 산물의 상승된 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴이 있는 환자를 나타낸다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 표준 레벨 보다 적어도 10배 큰 환자로부터의 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨은 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 나타낸다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 확인하기 위한 진단의 제조를 위해 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 제제의 사용이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 확인하기 위한 방법에 사용을 위해 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 제제의 사용이 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 환자 내의 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴을 확인하는 방법에의 사용을 위한 키트(kit)가 제공되며, 상기 키트는 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 적어도 하나의 제제를 포함한다. IFI27 발현이 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 질병의 심각도와 상호 관련되는 본 발명자들에 의한 확인은 또한 인플루엔자의 치료나 예방에서 유용할 수 있는 제제의 또는 이를 위한 시럼에서 이점을 가진다. 이는, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스에 노출된 대상들 내의 질병의 심각도를 감소시킬 수 있는 제제가 될 수 있다. 항-바이러스(인플루엔자 바이러스)는 조사의 주요 분야이며, 임상적인 시험들이 잠재적이거나 추정적인 항바이러스 약제 또는 제제들의 효능을 조사하도록 수행된다. 통상적으로, 이들 시험들은 심박수, 혈액 중의 산소 레벨, 혈압, 사망률(치사율) 등과 같은 임상적인 변수들을 이용한다. 이들 변수들로는 상당한 한계들이 존재한다. 이는 이들이 질병의 심각도를 측정하지 못하기 때문이다(예를 들면, 심박수 및 혈압은 감염 심각도에 대해 특이적이지 않다). 또한, 사망과 간은 사건들은 인플루엔자 감염에서 드문 사건이다. 이는 상기 임상적인 시험이 치료 및 대조 그룹들 사이의 차이를 검출하는 충분한 통계적인 힘을 가지기 위하여 수천 명의 환자들을 모집할 필요가 있는 점을 의미한다. 임상적인 시험들에서 한계들을 극복하거나 경감시키는 대안은 대리 마커(surrogate marker)를 사용하는 것이다. 이상적으로는, 대리 마커는 상기 질병의 생물학적 활성을 반영하며 치료 효과와 관련된다(즉, 이의 레벨이 치료의 성공으로 감소된다). 여기서 입증되는 바와 같이, IFI27는 이와 같은 대리 마커로서 잠재성이 있다. 이는 항-바이러스 약물들의 임상적인 시험들 동안에 모니터 치료 반응을 도울 수 있다.
인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) IFI27은 알려지지 않은 기능의 작은 인터페론 알파 유도 유전자들의 패밀리의 하나이다. IFI27은 선택적으로는 인터페론 알파 유도 11.5kDa 단백질, 인터페론 자극(interferon-stimulated) 유전자 12a 단백질과 ISG12, ISG12(a), FAM14D 및 P27의 선택적인 축약형들로서 알려져 있다. IFI27을 위한 cDNA는 인간 상피 세포주 MCF-7 내의 에스트로겐 유도 유전자로서 초기에 복제되었고, p27 3 로 표기되었다. IFI27은 병변 건선 표피(lesional psoriatic epidermis) 내의 병변 및 비병변 건선 피부 내에서 상향 조절 4 되었을 뿐만 아니라 정량적 RT-PCR 연구 5 에서 비병변 각질 세포들(keratinocytes) 내에서 검출 가능한 것으로 보고되었다. 동일한 연구는 또한 편평태선(lichen planus), 만성 습진(chronic eczema), 피부 편평 세포암들(cutaneous squamous cell cancers) 등과 같은 다른 피부 상태들 내에서 발현되었고, 각질 세포들이 IFN-γ, TNF-α 또는 TGF-β1로 자극되었을 때에 상향 조절된 발현을 나타내었던 것으로 보고되었다. 그 결과, IFI27이 상피 증식 및 암의 마커(marker)인 것으로 상정되었다. IFI27은 또한 골관절염(osteoarthritis) 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 윤활 조직에 비하여 전신성 홍반성 루푸스(lupus erythematosus) 윤활 조직 내에서 상당히 과발현되는 것으로 보고되었다 6 . 상기 즉각적인 적용은 인플루엔자를 갖는 대상 내의 IFI27의 증가된 발현 레벨과 임상적인 위험도 사이의 상관관계의 첫 번째 기술을 제공한다. 인간 IFI27 유전자는 길이가 11,852bp이고, 14q32에 위치한다. 상이한 단백질 아이소형들(isoforms)을 야기하는 스플라이스 변이체들(splice variants)에 대한 보고들이 있다 7 . 아이소형 1(665 뉴클레오티드들) 및 아이소형 2(656 뉴클레오티드들)로 언급되는 IFI27의 두 가지의 알려진 전사 변이체들이 있다. NM_001130080.1은 아이소형 1에 대한 NCBI 레퍼런스 시퀀스이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001130080.1 참조). 이러한 변이체는 인간 집단에서 공통적으로 발견되는 대립 유전자(allele)를 나타낸다. 완전한 폴리펩티드 시퀀스는 119개의 아미노산들이다(http://www.uniprot.org/uniprot/P40305). NM_005532.3은 아이소형 2에 대한 NCBI 레퍼런스 시퀀스이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005532.3 참조). 이러한 변이체 (2)는 변이체 1에 비하여 CDS 내에 9-nt 조각이 결손된 선택적인 대립 유전자를 나타낸다. 결과적인 아이소형 (2)는 아이소형 1에 비하여 내부의 3개의 아미노산 조각들이 결손되고 두 인접하는 아미노산에서 다르다. 이러한 변이체는 인간 집단들에서 공통적으로 발견되는 제2의 대립 유전자를 나타낸다. 상기 IFI27 폴리펩티드는 인터페론 알파 유도 11.5kDa 단백질로 선택적으로 얼려져 있다. IFI27의 발현은, 예를 들면 RT-PCR 5,6,8 에 의해서와 노던(Northern) 분석 5 에 의해 뉴클레오티드 레벨에서의 조사를 주로 활용하여 다양한 보고서들에서 조사되었다. IFI27 유전자 산물의 발현 또한, 예를 들면 면역 분석이나 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 활용하여 IFI27 폴리펩티드의 레벨의 검출 및/또는 정량적 분석에 기초하여 보고되었다 6 . 종래의 공개 문헌들에 기재된 IFI27 유전자 산물의 발현의 검출 및/또는 판단 방법들은 본 발명의 방법들을 수행하기에 적절하며, 상기 문헌들에 기재된 방법들과 제제들은 여기에 참조로 포함된다.
환자들 본 발명의 방법들은 IFI27 유전자 산물의 존재와 정량화를 위한 환자 샘플의 분석을 포함한다. 이러한 방식에서, 상기 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨이 결정될 수 있으며, 이에 따라 환자 내의 임상적인 위험도의 확인이 가능해진다. 유사하게, 본 발명의 방법들은 세균성 폐렴과 같이 유사한 임상적인 표상을 가질 수 있는 상태들과 구별되는 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴의 존재에 대한 환자의 평가를 가능하게 한다. 여기서 "환자"라는 용어의 사용이 넓은 의미를 가지는 것으로 의도되는 점이 이해될 것이다. 상기 환자는 상기 방법이 수행되는 관점에서 임의의 개체이다. 통상적으로, 상기 환자는 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 개체이다. 제한적이지 않은 예로써, 상기 환자는 입원한 개체, 병원 외래 환자 또는 응급 기관에 있는 개체, 의사의 임상이나 수술 또는 의료 행위 혹은 임의의 건강 사정 또는 건강 진단 기관에 있는 개체가 될 수 있다. 상기 환자는 인플루엔자 감염의 하나 또는 그 이상의 증상들을 나타내거나 나타내지 않는 인구의 일원인 개체가 될 수 있다. 상기 환자는, 예를 들면, 노인들, 만성적인 질환이 있는 사람들, 면역 약화된 사람들, 인플루엔자 바이러스로부터 심각한 질병의 이력이 있는 사람들, 감기 같은 증상의 이력이 있는 사람들 등의 인플루엔자 감염으로 인한 심각한 질환이 잠재적으로 진행될 "위험이 있는" 것으로 간주되는 그룹이나 인구의 일원일 수 있다. 이러한 그룹들이나 인구들의 일원들은 인플루엔자 돌발, 대규모 유행 또는 급속한 확산 동안과 같은 광범위안 보건 의료의 일부로서 선별될 수 있다.
생물 샘플 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 환자로부터의 생물 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 생물 샘플은 통상적으로 혈액 샘플이다. 상기 생물 샘플은 혈액 세포 서브세트들과 같은 혈액, 단백 분획 또는 전체 RNA 또는 mRNA와 같은 핵산 분획으로부터 선택되는 성분일 수 있다. 상기 생물 샘플은 백혈구 세포들과 같은 하나 또는 그 이상의 성분들, 또는 pDCs와 같은 이의 특정성 성분의 존재를 위해 분별되거나 농후화되도록 처리될 수 있다. 환자로부터 혈액 샘플과 같은 생물 샘플을 수득하는 단계는 본 발명의 방법의 수행에서 연속되는 일련의 단계들의 일부로서 착수될 수 있다. 상기 환자로부터 혈액 샘플들 수득하는 단계는, 예를 들면, 시간, 위치 또는 작업자가 분리되는 본 발명의 방법의 하나 또는 그 이상의 남아 있는 단계들로부터 별도의 단계 또는 분리된 단계들로 수행될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 방법의 수행에서 상기 혈액 샘플을 수득하는 것은 상기 환자로부터의 혈액의 추출을 수반할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 본 발명의 방법의 수행은, 예를 들면, 용기 내에 혈액 샘플을 수용하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 혈액은 미리 본 발명의 방법의 수행으로부터 분리된 훈련으로서 상기 환자로부터 추출되었을 수 있다. 다른 예로서, 혈액 샘플을 수득하는 것은 본 발명의 방법의 수행으로부터 분리된 훈련으로서 상기 환자로부터 추출된 혈액 샘플의 일지적인 저장으로부터 회수하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 수행이 이에 따라 전체적으로 생체 외에서 수행될 수 있는 점이 이해될 것이다 . 환자로부터 얻어진 생물 샘플은 본 발명의 작업의 일부로서 또는 별도의 단계들이나 일련의 단계들로서 하나 또는 변형 단계들을 거칠 수 있다. 예를 들면, 혈액 샘플이 환자로부터 얻어지는 경우, 상기 샘플은 본 발명의 방법들이 이용되는 생물 샘플의 보다 편리한 형태를 생성하도록 더 처리될 수 있다. 이는, 예를 들면, IFI27 유전자 산물의 평가에 이용되는 다른 세포 서브세트들을 격리하도록 상기 혈액을 처리하는 것이 될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로는, 이는 간단히 상기 혈액 샘플의 수집에 이용될 수 있었던 적혈구 세포들 또는 항응고제들과 같이 상기 방법들의 효율적인 동작을 간섭할 수 있는 성분들을 제거하도록 상기 혈액을 처리하는 것이 될 수 있다. 다른 선택적이거나 추가적인 단계 또는 단계들로서, 상기 샘플은 IFI27 유전자 산물 및 부분 또는 그렇지 않은 부분들을 결정하는 데 이용되는 부분을 생성하도록 처리될 수 있다. 이러한 처리 또는 분별은, 예를 들면, 상기 샘플로부터의 전체 RNA의 분리, 또는 상기 샘플로부터 전령 RNA(mRNA)의 분리, 혹은 상기 샘플로부터 단백질이나 폴리펩티드들의 분리를 포함할 수 있고, 이들 중 임의의 것은 IFI27 유전자 산물을 판단하는 데 사용도기 위해 적합할 수 있다. 숙련된 처리자라면, 예를 들면 RNeasy 미니 키트(kit), Qiagen 및 FOCUS 멤브레인 단백질 키트, GBiosciences 프로토콜들 등의 이러한 방식으로 혈액 샘플들의 처리를 위해 존재하는 방법들을 인지할 것이다.
폴리뉴클레오티드들 폴리펩티드들 본 발명자들은 인플루엔자를 갖는 대상들 내의 IFI27 유전자의 발현의 레벨이 질병 심각도와 상호 관련되며, 이에 따라 임상적인 위험도의 표시자로 활용될 수 있는 점을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 수행에서, 샘플이 IFI27 유전자 산물의 존재를 위해 시험될 수 있다. 상기 유전자 산물은 IFI27 mRNA 또는 전사물이 될 수 있다. 상기 IFI27 mRNA의 전체 폴리뉴클레오티드 시퀀스가 결정되었고, 예를 들면, 엔셈블(Ensembl)/하바나(Havana) 병합: ENSG00000165949에서 보고되었다. 여기서 유의하는 바와 같이, 앞서 기술한 IFI27 전사물의 변이체들이 존재한다. 일 실시예에 있어서, IFI27 유전자의 존재를 위해 상기 샘플을 분석하는 것은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에서 나타나는 시퀀스와 같은 IFI27 mRNA 시퀀스, 또는 이의 조작이나 변이체의 존재를 위해 상기 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 상기 유전자 산물은 상기 IFI27 폴리펩티드가 될 수 있고, ISG12 및 상기 ISG12 폴리펩티드의 두 아이소형들이 보고되었으며, 상기 시퀀스들, 예를 들면, NP_001123552.1이 결정되었다. 일 실시예에 있어서, IFI27 유전자 산물의 존재를 위해 상기 샘플을 분석하는 것은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4에서 나타내는 바와 같은 IFI27 폴리펩티드, 또는 이의 조각들이나 변이체들의 존재를 위해 상기 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 여기서 설시되는 상기 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드 시퀀스들 이외에, 이의 변이체들과 조각들도 본 발명 및 본 발명의 방법들의 범주에 포함된다. 따라서, 샘플이 주어진 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 존재를 위해 테스트될 수 있는 것으로 기재되는 경우, 상기 기재가 상기 샘플이 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 조각이나 변이체의 존재를 위해 테스트될 수 있는 점을 의미하는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 방법들에서 사용되는 바와 같이, 여기에 기재되는 폴리뉴클레오티드들은 데옥시리보핵산들(DNA), 리보핵산들(RNA) 또는 상보적 데옥시리보핵산들(cDNA)이 될 수 있다. RNA는 DNA 시퀀스의 RNA 중합 효소-촉매 전사(polymerase-catalyzed transcription)로부터 유도될 수 있다. 상기 RNA는 대응되는 DNA 시퀀스의 전사로부터 유도되는 일차 전사물이 될 수 있다. RNA는 또한 전사후의 처리를 거칠 수 있다. 예를 들면, 일차 RNA 전사물은 성숙 RNA를 형성하도록 전사 후의 처리를 거칠 수 있다. 여기서 기술하는 바와 같이, IFI27 전사물의 적어도 두 가지 아이소형들, 665 뉴클레오티드들의 하나 및 656 뉴클레오티드들의 하나(SEQ ID NO: 1 및 2 각기 참조)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 전령 RNA(mRNA)는 세포에 의해 단백질 내로 번역될 수 있는 대응되는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 유도되는 RNA를 언급한다. cDNA는 mRNA에 상보적이고 이로부터 유도되는 단일 가닥 DNA를 언급한다. 상기 아이소형 1 및 아이소형 2 IFI27 시퀀스들에 대응되는 cDNA는 여기서는 각기 SEQ ID NO:5 및 6로 언급되었다. 센스(sense) RNA는 상기 mRNA를 포함하고 이에 따라 상기 세포에 의해 단백질 내로 번역될 수 있는 RNA 전사물을 언급한다. 안티센스(antisense) RNA는 표적 일차 전사물 또는 mRNA의 모두나 일부에 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 데 이용될 수 있는 RNA 전사물을 언급한다. 숙련된 처리자라면 여기에 기재되는 DNA 시퀀스들에 의해 암호화되는 RNA 및 cDNA 시퀀스들이 유전자 코드를 이용하여 유도될 수 있는 점이 다시 인지될 것이다. RNA 시퀀스는 특정한 DNA 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 생성함에 의해 주어진 DNA 시퀀스로부터 유도될 수 있다. 상기 상보적 시퀀스는 상기 DNA 시퀀스 내의 각각의 시토신('C') 염기를 구아닌('G') 염기로 변환하고, 상기 DNA 시퀀스 내의 각각의 구아닌('G') 염기를 시토신('C') 염기로 변환하며, 상기 DNA 시퀀스 내의 각각이 티미딘('T') 염기를 아데닌('A') 염기로 변환하고, 상기 DNA 시퀀스 내의 각각의 아데닌('A') 염기를 우라실('U') 염기로 변환하여 생성될 수 있다. 상보적 DNA(cDNA) 시퀀스는 전술한 바와 같은 상기 DNA 시퀀스로부터 RNA 시퀀스를 유도하고, 이 후에 상기 RNA 시퀀스를 cDNA 시퀀스로 변환함에 의해 DNA 시퀀스로부터 유도될 수 있다. RNA 시퀀스는 상기 RNA 시퀀스 내의 각각의 시토신('C') 염기를 구아닌('G') 염기로 변환하고, 상기 RNA 시퀀스 내의 각각의 구아닌('G') 염기를 시토신('C') 염기로 변환하며, 상기 RNA 시퀀스 내의 각각의 우라실('U') 염기를 아데닌('A') 염기로 변환하고, 상기 RNA 시퀀스 내의 각각의 아데닌('A') 염기를 티미딘('T') 염기로 변환함에 의해 cDNA 시퀀스로 변환될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 시퀀스 변이체들은 공통적으로 정성적인 생물학적 활성을 소유한다. 폴리뉴클레오티드 시퀀스 변이체들은 일반적으로 폴리펩티드들을 암호화하며, 이들은 일반적으로 정성적인 생물학적 활성을 공통적으로 소유한다. 이에 따라, 본 발명자들은 IFI27의 특정한 시퀀스 내의 변이체가 상기 암호화된 유전자의 생물학적 활성의 상당한 변경을 야기하지 않고 여기에 제공되는 시퀀스들과 비교에 의해 자연에서 존재할 수 있는 점을 상정하였다. 그 결과, 본 발명은 여기서 특정하게 기술하는 바와 같은 상기 IFI27 시퀀스에 한정되는 것이 아니라, 자연적으로 존재할 수 있는 바와 같은 IFI27의 변이체 시퀀스도 적용될 수 있다. 여기서의 이러한 시퀀스들은 여기서 입증되는 유전자 산물의 특성 발현을 유지하며, 이에 따라 인플루엔자 감염을 가지거나 가지는 것으로 의심되는 환자나 대상 내의 임상적인 위험도를 나타내는 마커들로서 동등하게 적용될 수 있는 것으로 기대될 수 있다. 그 결과, 여기서 분명하게 기술되는 것들의 변이체 시퀀스들 또한 본 발명에 포함된다. "변이체(variant)"라는 용어는 여기에 기재되는 바에서 실질적으로 유사한 시퀀스를 언급한다. 일반적으로, 두 시퀀스들은 상기 두 시퀀스들이 특정한 영역에 대해 또는 특정되지 않을 때에 전체 시퀀스에 대해 동일한("시퀀스 동일성"의 퍼센티지) 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들의 특정한 퍼센티지를 가질 경우에 "실질적으로 유사"하다. 이에 따라, 여기에 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 시퀀스의 "변이체"는 상기 레퍼런스 시퀀스와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 시퀀스 동일성을 공유할 수 있다. 또한, "변이체"라는 용어는 또한 본 발명의 폴리펩티드들의 유사체들을 포함한다. 폴리펩티드 "유사체(analogue)"는 본 발명의 폴리펩티드의 유도체인 폴리펩티드이며, 상기 유도체는 하나 또는 그 이상의 아미노산들의 첨가, 결실, 치환을 포함하므로, 상기 폴리펩티드는 실질적으로 동일한 기능을 보유한다. "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"이라는 용어는 하나의 아미노산을 폴리펩티드 사슬(단백질의 일차 시퀀스) 내의 유사한 성질들을 갖는 다른 아미노산으로의 치환 또는 대체를 언급한다. 예를 들면, 하전된 아미노산 글루탐산(Glu)의 유사한 하전된 아미노산 아스파르트산(Asp)으로의 치환은 보존적 아미노산 치환이 될 수 있다. 일반적으로, 두 시퀀스들 사이의 시퀀스 동일성의 퍼센티지는 비교 윈도우(comparison window) 상에서 두 최적으로 배열된 시퀀스들을 비교하여 결정될 수 있다. 상기 비교 원도우 내의 시퀀스의 일부는, 예를 들면, 상기 두 시퀀스들을 최적으로 배열하기 위하여 결실들이나 첨가들을 포함하지 않는 상기 레퍼런스 시퀀스(예를 들면, 여기에 개시되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 시퀀스)와 비교하여 결실들 또는 첨가들(즉, 갭들(gaps))을 포함할 수 있다. 시퀀스 동일성의 퍼센티지는 이후에 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 정합된 위치들의 숫자를 산출하도록 양 시퀀스 내에 발생되는 위치들의 숫자를 결정하고, 상기 정합된 위치들의 숫자를 상기 비교의 윈도우 내의 위치들의 전체 숫자로 나누며, 시퀀스 동일성의 퍼센티지를 산출하도록 상기 결과에 100을 곱하여 계산될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 핵산이나 폴리펩티드 시퀀스들의 상태에 있어서, 상기 시퀀스 동일성의 퍼센티지는, 비교 윈도우 상에서 최대 대응을 위해 비교되고 배열되거나, 다음의 시퀀스 비교 알고리즘들의 하나를 이용하거나 수동 배열 및 육안 검사에 의해 측정될 때, 특정화된 영역에 대해(또는 특정화되지 않은 때에 전제 시퀀스에 대해) 동일한 아미노산 잔기들이나 뉴클레오티드들의 특정화된 퍼센티지를 언급한다. 시퀀스 비교를 위하여, 통상적으로 하나의 시퀀스가 테스트 시퀀스들이 비교되는 레퍼런스 시퀀스로 작용한다. 시퀀스 비교 알고리즘을 이용할 때, 테스트 및 레퍼런스 시퀀스들이 컴퓨터로 입력되고, 필요한 경우에 부분 수열(subsequence) 좌표들이 지정되며, 시퀀스 알고리즘 프로그램 변수들이 지정된다. 디폴트 프로그램 변수들이 사용될 수 있거나, 선택적인 변수들이 지정될 수 있다. 상기 시퀀스 비교 알고리즘은 이후에 상기 프로그램 변수들에 기초하여 상기 레퍼런스 시퀀스에 대한 상기 테스트 시퀀스들의 퍼센트 시퀀스 동일성들을 계산한다. 비교를 위한 시퀀스들의 배열의 방법들을 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 비교를 위한 시퀀스들의 최적 배열은, 이에 한정되는 것은 아니지만, PC/Gene 프로그램 내의 CLUSTAL(캘리포니아의 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics)로부터 입수 가능한); ALIGN 프로그램(버전 2.0)과 GCG 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 버전 10 내의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(미국 캘리포니아의 샌디에이고 스크랜톤 로드 9685 소재의 아셀리스사(Accelrys Inc.)로부터 입수 가능한)을 포함하는 알려진 컴퓨터 프로그램들을 이용하여 전통적으로 결정될 수 있다. 상기 BESTFIT 프로그램(위스콘신주 53711 마디손, 575 사이언스 드라이브 유니버서티 리서치 파크 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 유닉스를 위한 위스콘신 사이언스 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package))는 두 시퀀스들 사이의 상동성의 가장 우수한 조각을 발견하기 위하여 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘을 이용한다(Smith 및 Waterman의 "Advances in Applied Mathematics"(2:482-489(1981)). 시퀀스들 사이의 상동성의 정도를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 시퀀스 배열 프로그램을 이용할 때, 변수들은 동일성의 퍼센티지가 상기 레퍼런스 뉴클레오티드 시퀀스의 전체 길이에 대해 계산되고, 상기 레퍼런스 시퀀스 내의 뉴클레오티드의 전체 숫자의 5%까지의 상동성 내의 갭들이 가능해지도록 설정될 수 있다. GAP는 정합들의 숫자를 최대회하고 갭들의 숫자를 최소화하는 두 완전한 시퀀스들의 배열을 발견하기 위해 Needleman 및 Wunsch의 "J. Mol. Biol."(1970) 48:443-453)에 기재된 알고리즘을 이용한다. GAP은 모든 가능한 배열들과 갭 위치들을 고려하며, 정합된 염기들의 가장 큰 숫자와 가장 적은 갭들을 갖는 배열을 생성한다. 이는 정합된 염기들의 단위들 내에 갭 생성 페널티와 갭 신장 페널티를 제공을 가능하게 한다. GAP은 가장 우수한 배열들의 패밀리의 하나의 구성원을 제시한다. 글로벌 시퀀스 배열로서도 언급되는 쿼리(query) 시퀀스와 대상 시퀀스 사이의 가장 우수한 전체적인 배열을 결정하기 위한 다른 방법은 Brutlag 및 그 동료들의 알고리즘("Comp. App. Biosci."(6:237-245) (1990))에 기초하는 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 시퀀스 배열에서, 상기 쿼리 및 대상 시퀀스들은 모두 DNA 시퀀스들이다. RNA 시퀀스는 U들을 T들로 변환함에 의해 비교될 수 있다. 상기 글로벌 시퀀스 배열의 결과는 퍼센트 동일성 내에 있다. 상기 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘들은 퍼센트 시퀀스 동일성과 시퀀스 유사성을 판단하기 위하여 이용될 수 있다. 이들은 Altschul 등의 "Nuc. Acids Res."(25:3389-3402(1977))과 Altschul 등의 "J. MoI. Biol."(215:403-4100(1990))에 각기 기재되어 있다. BLAST 분석들을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이러한 알고리즘은 데이터베이스 시퀀스 내의 동일한 길이의 워드와 배열될 때에 일부 양의 값의 임계 스코어(T)와 정합하거나 만족시키는 상기 쿼리 시퀀스 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함에 의해 하이 스코어 시퀀스 쌍들(HSPs)을 먼저 확인하는 과정을 수반한다. T는 이웃하는 워드 스코어 임계 값으로 언급된다(앞서의 Altschul 등). 이들 초기의 이웃하는 워드 적중들은 이들을 포함하는 보다 긴 HSP들을 발견하는 조사들을 개시하기 위한 시드들로서 작용한다. 상기 워드 적중들은 누적 배열 스코어가 증가될 수 있는 한 각 시퀀스를 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어들은, 뉴클레오티드 시퀀스들에 대해, 변수들 M(정합되는 잔기들의 쌍들에 대한 보상 스코어; 항상＞0) 및 N(정합되는 잔기들에 대한 페널티 스코어; 항상＜0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 시퀀스들에 대하여, 스코어링 매트릭스(scoring matrix)가 상기 누적 스코어를 계산하도록 이용된다. 각 방향으로의 상기 워드 적중들의 연장은, 상기 누적 배열 스코어가 이의 최대 구현 값으로부터 양 X로 줄어들고, 상기 누적 스코어가 하나 또는 그 이상의 음의 스코어의 잔기 비열들의 축적으로 인해 제로 또는 그 이하로 되거나, 각 시퀀스의 말단에 도달될 때에 중단된다. 상기 BLAST 알고리즘 변수들 W, T 및 X는 상기 배열의 감도와 속도를 결정한다. 상기 BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 시퀀스들을 위한)은 11의 워드 길이(W), 10의 기대(E), M=5, N=-4 및 양 가지들의 비교 등의 디폴트들을 사용한다. 아미노산 시퀀스들에 대하여, 상기 BLASTP 프로그램은 3의 워드 길이와 10의 기대(E) 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff 및 Henikoff의 "Proc. Natl, Acad. Sci USA"89:10915(1989) 참조) 배열들(B), 10의 기대(E), M=5, N=-4 그리고 양 가지들의 비교 등의 디폴트들을 사용한다. 상기 BLAST 알고리즘은 또한 두 시퀀스들 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들면, Karlin 및 Altschul의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"90:5873-5787(1993) 참조). 상기 BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정은 가장 작은 합의 가능성(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 시퀀스들 사이의 정합이 우연히 일어날 수 있는 것에 의한 가능성을 제공한다. 예를 들면, 핵산은 상기 레퍼런스 핵산 시퀀스에 대한 상기 테스트 핵산의 비교에서 상기 가장 작은 합의 가능성이 약 0.2 보다 작고, 보다 바람직하게는 약 0.01 보다 작으며, 가장 바람직하게는 약 0.001 보다 작은 경우에 레퍼런스 시퀀스와 유사한 것으로 간주된다. 또한, 여기에 개시되는 폴리뉴클레오티드들의 조각들이 고려된다. 폴리뉴클레오티드 "조각(fragment)"은 구성 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자이거나, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 혹은 이의 변이체의 구성 성분이다. 폴리뉴클레오티드의 조각들은 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드들을 필수적으로 암호화할 필요는 없다. 상기 조각은, 예를 들면, 혼성화 프로브(hybridization probe) 또는 PCR 프라이머(primer)로 유용할 수 있다. 상기 조각은 본 발명의 폴리뉴클레오티드로부터 유도될 수 있거나, 선택적으로는, 일부 다른 수단들, 예를 들면 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다. 상기 조각은, 예를 들면, 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨의 결정에서 검출될 수 있으므로, 예를 들면, 상기 프로브나 프라이머(들)은 본 발명의 수행에서 검출되는 영역인 IFI27 유전자 산물의 영역에 대해 특이적이다. 이는, 예를 들면, PCR가 이용되는 방법들에서 통상적이므로, 상기 IFI27 유전자 산물, 통상적으로 mRNA 또는 cDNA의 표적 영역이 완전한 IFI27 mRNA 또는 cDNA 시퀀스 길이 보다 적게 구성될 것이다. 예를 들면, 이는 약 50 내지 100개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 75 내지 150개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 120 내지 250개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 200 내지 300개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 250 내지 350개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 300 내지 400개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 350 내지 450개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 400 내지 500개의 염기들이나 염기쌍들의 표적 영역이 될 수 있다. 본 발명의 시퀀스들은 전체적인 시퀀스가 여기서 확인되는 IFI27 유전자의 시퀀스 또는 이의 조각만을 포함하는 별개의 시퀀스들을 포함할 수 있다. 본 발명의 시퀀스들은 대신에 이들이 상기 유전자의 일부가 아닌 시퀀스와 함께 여기서 확인되는 IFI27 유전자 또는 이의 변이체의 시퀀스 또는 이의 일부를 포함하는 구분되지 않는 시퀀스들을 포함할 수 있다. 유사한 방식에서, 상기 시퀀스들은 또한 정제나 검출 및 혼성화 목적들을 보조하기 위한 것과 같이 벡터들(vectors), 태그들(tags)과 관련된 시퀀스와 같은 연관되지 않은 시퀀스를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 복제될 수 있다. 상기 벡터는, 예를 들면, DNA, RNA 또는 상보적 DNA(cDNA) 시퀀스를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 외래의 시퀀스들의 삽입, 세포들 내로의 이들의 도입 및 도입된 시퀀스들의 발현을 위해 적용된 임의의 다른 적합한 운반체일 수 있다. 통상적으로 상기 벡터는 발현 벡터이며, 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 리보솜(ribosome) 결합 부위들, 아데닐산중합반응(polyadenylation) 신호들 및 전사 종료 시퀀스들과 같은 발현 제어 및 처리 시퀀스들을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 벡터들에 의해 변형되는 숙주 세포들을 고려한다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 박테리아 숙주 세포, 예를 들면 E. coli 내로 변형되는 벡터 내로 복제될 수 있다. 벡터들 및 숙주 세포들 내로의 이들의 변형들의 구성을 위한 방법들은 해당 기술 분야에서 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면, Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) 그리고 Ausubel FM 등의 " Current Protocols in MolecularBiology "((Eds) John Wiley and Sons, Inc)에 기재되어 있다.
뉴클레오티드 프로브들, 프라이머들 및 항체들 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명자들에 의한 대상 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자의 발현이 상기 대상 내의 인플루엔자의 심각도와 상호 관련되는 점을 확인함에 기초한다. 본 발명은 이에 따라 관심의 대상으로부터 수득된 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27)의 발현의 레벨의 검출과 결정을 통해 인플루엔자 감염 동안에 숙주 반응의 검출을 위한 방법들과 관련된다. 상기 방법의 수행에 있어서, IFI27 폴리뉴클레오티드 또는 이의 조각들이나 변이체들의 시퀀스에 기초하는 뉴클레오티드들 및 조각들은 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 레벨의 검출과 결정을 위한 프라이머들 및 프로브들로 사용될 수 있다. 상기 뉴클레오티드들과 조각들은 올리고뉴클레오티드들(oligonucleotides)의 형태가 될 수 있다. 올리고뉴클레오티드들은 통상적으로 길이가 적어도 약 5인 뉴클레오티드들 내지 약 80인 뉴클레오티드들, 보다 통상적으로는 길이가 약 10인 뉴클레오티드들 내지 길이가 약 50인 뉴클레오티드들, 그리고 심지어 더욱 통상적으로 길이가 약 15인 뉴클레오티드들 내지 길이가 약 30인 뉴클레오티드들인 PCR와 같은 핵산 증식 반응들에 사용을 위해 적합한 뉴클레오티드 잔기들의 짧은 신장들이다. 숙련된 처리자라면 시퀀스의 임의의 적절한 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드들 또는 그 이상과 같이 될 수 있는 점이 이해될 것이다. 프로브들은 통상적으로 혼성화에 의해 상동 시퀀스들의 검출에 사용을 위한, 예를 들면, 약 10의 뉴클레오티드들 내지 수천의 뉴클레오티드들 사이의 가변적인 길이의 뉴클레오티드 시퀀스이다. 예를 들면, 혼성화에 사용을 위한 프로브는 약 10 내지 25개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 20 내지 40개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 30 내지 50개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 50 내지 100개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 75 내지 150개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 120 내지 250개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 200 내지 300개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 250 내지 350개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 300 내지 400개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 350 내지 450개의 염기들이나 염기쌍들, 또는 약 400 내지 500개의 염기들이나 염기쌍들이 될 수 있다. 혼성화 프로브들은 게놈 DNA 조각들, cDNA 조각들, RNA 조각들, 또는 다른 올리고뉴클레오티드들이 될 수 있다. 뉴클레오티드 프로브들 및/또는 프라이머들의 설계 및/또는 재조를 위한 방법들은 일반적으로 해당 기술 분야에 알려져 있으며, Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012); Itakura K. 등의 "Annu. Rev. Biochem."(53:323, (1984)); Innis 등의 " PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications "(Eds)(1990)(Academic Press, New York); Innis 및 Gelfand의 " PCR Strategies "(Eds)(1995)(Academic Press, New York); 그리고 Innis 및 Gelfand의 " PCR Methods Manual "(Eds)(1999)(Academic Press, New York)에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 프라이머들 및 프로브들은, 예를 들면 화학적 합성 기술들, 예를 들면, 포스포디에스테르(phosphodiester) 및 포스포트리에스테르(phosphotriester) 방법들(예를 들면, Narang SA 등의 "Meth. Enzymol."(1979)(68:90); Brown, EL 등의 "Meth. Enzymol."(1979)(68:109); 및 미국 특허 제4,356,270호 참조), 디에틸포스포라미디트(diethylphosphoramidite) 방법(Beaucage SL 등의 "Tetrahedron Letters'(1981)(22:1859-1862) 참조)에 의해 제조될 수 있다. 변형된 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드들을 합성하기 위한 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기재되어 있다. 여기서 언급되는 것들을 포함하여 본 발명의 핵산들은 이들의 검출을 용이하게 하도록 마커의 통합에 의해 표기될 수 있다. 핵산들을 표기하고 검출하기 위한 기술들은, 예를 들면, Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc.) 그리고 Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012)에 기재되어 있다. 적합한 마커들의 예들은 형광 분자들(예를 들면, 아세틸아미노플루오렌(acetylaminofluorene), 5-브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine), 디곡시게닌(digoxigenin), 플루오로세인(fluorescein)) 및 방사성 동위 원소들(예를 들면, 32P, 35S, 3H, 33P)를 포함한다. 상기 마커의 검출은, 예를 들면, 화학적, 광화학적, 면역화학적, 생화학적 또는 스펙트럼 기술들에 의해 구현될 수 있다. 혼성화 기술들에 있어서, 알려진 뉴클레오티드 시퀀스의 전부 또는 일부가 주어진 샘플 내에 존재하는 대응되는 핵산 시퀀스들에 선택적으로 혼성화되는 프로브를 생성하도록 사용된다. 상기 혼성화 프로브는 게놈 DNA 조각들, cDNA 조각들, RNA 조각들 또는 다른 올리고뉴클레오티드들이 될 수 있고, 검출 가능한 마커로 표시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 혼성화를 위한 프로브들은 본 발명의 시퀀스들에 기초하여 합성 올리고뉴클레오티드들을 표시함에 의해 만들어질 수 있다. 프로브와 표적 시퀀스 사이의 상동성(시퀀스 동일성)의 레벨은 혼성화 조건들의 엄격함에 의해 대체로 결정될 것이다. 특히, 프로브로 사용되는 뉴클레오티드 시퀀스는 낮은 엄격함, 중간의 엄격함 또는 높은 엄격함의 조건들 하에서 여기에 개시되는 폴리뉴클레오티드의 동족체(homologue) 또는 다른 변이체에 혼성화될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 혼성화의 엄격함을 변경시키도록 적용될 수 있는 수많은 조건들과 인자들이 있다. 예를 들면, 특정화된 핵산에 혼성화되는 핵산의 길이와 성질(DNA, RNA, 염기 조성); 포름아미드(formamide), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의 존재 또는 부존재와 같은 염들 및 다른 성분들의 농도; 그리고 상기 혼성화 및/또는 세척 단계들의 온도를 변경하는 것 . 통상적으로, 엄격한 혼성화 조건들은 상기 염의 농도가 약 1.5M의 Na 이온 보다 작은, pH 7.0 내지 8.3에서 통상적으로 약 0.01 내지 1.0M의 Na 이온 농도(또는 다른 염들)이고, 상기 온도가 짧은 프로브들(예를 들면, 10 내지 50의 뉴클레오티드들)에 대해 적어도 약 30℃이며, 긴 프로브들(예를 들면, 50의 뉴클레오티드들 보다 큰)에 대해 적어도 약 60℃인 것들이 될 것이다. 엄격한 조건들은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제들(destabilizing agents)의 첨가로 구현될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격함의 조건들은 37℃에서 30% 내지 35%의 포름아미드, 1M의 NaCl, 1%의 SDS(도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulfate))의 완충 용액으로의 혼성화 및 50℃ 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC(20X SSC=3.0M의 NaCl/0.3M의 시트르산 삼나트륨(trisodium citrate)) 내의 세척을 포함한다. 예시적인 중간의 엄격함의 조건들은 37℃에서 40% 내지 45%의 포름아미드, 1.0M의 NaCl, 1%의 SDS 내의 혼성화 및 55℃ 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC 내의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격함의 조건들은 37℃에서 50%의 포름아미드, 1M의 NaCl, 1%의 SDS 내의 혼성화 및 60℃ 내지 65℃에서 적어도 약 20분 동안의 0.1X SSC 내의 최종 세척을 포함한다. 선택적으로는, 세척 완충제들은 약 0.1% 내지 약 1%의 SDS를 포함할 수 있다. 상기 혼성화의 지속은 대체로 약 24시간 보다 작고, 보통은 약 4 내지 약 12시간이다. PCR 접근 하에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 관심의 대상인 임의의 조직으로부터 추출되는 cDNA 또는 게놈 DNA 로부터의 대응되는 RNA 시퀀스들을 증식하도록 PCR 반응들 내의 사용을 위해 설계될 수 있다. PCR 프라이머들을 설계하고 PCR을 복제하기 위한 방법들은 일반적으로 해당 기술 분야에 알려져 있으며, Sambrook 등의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(1989)(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012); Maniatis 등의 " Molecular Cloning "(1982, 280-281); Innis 등의 " PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications "(Eds)(1990)(Academic Press, New York); Innis 및 Gelfand의 " PCR Strategies "(Eds)(1995)(Academic Press, New York); 그리고 Innis 및 Gelfand의 " PCR Methods Manual "(Eds)(1999)(Academic Press, New York)에 기재되어 있다. 알려진 PCR의 방법들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 쌍으로 된 프라이머들, 내포된 프라이머들, 단일의 특이적 프라이머들, 디제너레이트(degenerate) 프라이머들, 유전자 특이적 프라이머들, 벡터 특이적 프라이머들, 부분적으로 오정합된 프라이머들 및 유사한 것들을 이용하는 방법들을 포함한다. 숙련된 처리자라면 PCR 또는 RT-PCR 내의 사용을 위한 여기에 개시된 프라이머들이 또한 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 검출을 위한 것과 같은 관심의 대상인 시퀀스들의 검출을 위한 프로브들로서 사용될 수 있는 점을 다시 인지할 것이다. 특정한 실시예에 있어서, 조각 또는 프로브는 상기 IFI27 유전자의 조각, 예를 들면, 노던 분석과 같은 혼성화 분석에 이용될 수 있는 조각이다. 특정한 예로서, Suomela 등(2004)은 전체 RNA 내의 IFI27 RNA 전사체들을 검출하는 데 사용되는 인간 IFI27 cDNA의 482bp 조각이 배양된 인간 세포들로부터 분리되는 점을 기술하고 있다. IFI27 핵산 시퀀스 또는 이의 변이체의 임의의 적절한 길이의 조각이 본 발명의 방법들에 사용될 수 있다. 숙련된 처리자라면 여기에 제공되는 정보에 기초하고 해당 분야에서 알려진 방법들, 예를 들면 원자는 조건들 하에서 표적 시퀀스와 선택적으로 결합하는 시퀀스의 선택들 위한 방법들에 따라 적절한 시퀀스를 결정할 수 있을 것이다. 특정한 실시예에 있어서, 조각, 프로브 또는 프라이머는 상기 IFI27 유전자의 조각, 예를 들면, 시퀀스 ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(포워드 프라이머(forward primer); SEQ ID NO:7) 또는 시퀀스 ACATCATCTTGGCTGCTATGG(리버스 프라이머(reverse primer); SEQ ID NO:8)이다. 본 발명의 방법의 특정한 실시예에서, PCR은 프라이머 쌍 ACCTCATCAGCAGTGACCAGT( SEQ ID NO:7 ) 및 시퀀스 ACATCATCTTGGCTGCTATGG( SEQ ID NO:8 )를 이용하여 수행될 수 있고, 이는 187bp의 시퀀스(SEQ ID NO:11)를 증식시킨다. 특정한 실시예에 있어서, 조각, 프로브 또는 프라이머는 상기 IFI27 유전자의 조각, 예를 들면, IFI27 유전자 또는 이의 조각이나 변이체에 대해 특이적으로 해당 기술 분야에서 알려진 시퀀스이다. 숙련된 처리자라면 본 발명의 방법들에 이러한 핵산 시퀀스의 사용을 위한 적절한 조건들을 결정할 수 있을 것이다. 특정한 실시예에 있어서, 조각, 프로브 또는 프라이머는 상기 IFI27 유전자의 조각, 예를 들면, 시퀀스 TGC CTC GGG CAG CCT(SEQ ID NO:9) 또는 시퀀스 TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(SEQ ID NO:10)이다. 본 발명의 방법의 특정한 실시예에 있어서, PCR은 상기 프라이머 쌍 TGC CTC GGG CAG CCT(포워드 프라이머; SEQ ID NO:9) 및 상기 시퀀스 TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(리버스 프라이머; SEQ ID NO:10)를 이용하여 수행될 수 있다 5 . 숙련된 처리자라면 본 발명의 방법들에 이러한 핵산 시퀀스의 사용을 위한 적절한 조건들을 결정할 수 있을 것이다. 숙련된 처리자라면 또한 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 Suomela 등 5 에서의 IFI27 유전자 산물의 증식과 검출을 위한 이러한 핵산 시퀀스들의 이용에 대한 지침을 발견할 것이다. 특정한 실시예에 있어서, 조각, 프로브 또는 프라이머는 상기 IFI27 유전자의 조각, 예를 들면, 시퀀스 cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f; SEQ ID NO:16 ) 또는 시퀀스 cac gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r; SEQ ID NO:17 )이다. 본 발명의 방법의 특정한 실시예에 있어서, PCR은 상기 프라이머 쌍 cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f; SEQ ID NO:16 ) 및 상기 시퀀스 cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r; SEQ ID NO:17 )를 이용하여 수행될 수 있다 8 . ISG12f 및 ISG12r로 기재되는 상기 시퀀스들에 있어서, 대문자의 문자들은 cDNA 시퀀스들에 대응된다. 숙련된 처리자라면 본 발명의 방법들에 이러한 핵산 시퀀스의 사용을 위한 적절한 조건들을 결정할 수 있을 것이다. 숙련된 처리자라면 또한 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 Gjermandsen 등(1999) 8 에서의 IFI27 유전자 산물의 증식과 검출을 위한 이러한 핵산 시퀀스들의 이용에 대한 지침을 발견할 것이다.
항체들 또한, IFI27 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 이의 조각이나 변이체에 특이적으로 결합될 수 있는 항체들이 본 발명의 방법들에 의해 고려된다. 항체 또는 항체들은 주어진 샘플 내의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들, 특히 IFI27 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드들 또는 조각들을 정량적으로 또는 정성적으로 검출하고 분석하는 데 사용될 수 있다. 분석의 조절 또는 표준화의 목적을 위한 항체 검출 및 추가적인 폴리펩티드들의 수량화도 수행될 수 있다. "특이적으로 결합하는 것(binding specifically)"에 의해, 상기 항체가 표적 폴리펩티드 또는 이의 조각에 연관되지 않은 단백질에 결합되는 것 보다 높은 친화도로 결합될 수 있는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 상기 항체는 적어도 약 10 -4 M 내지 약 10 -10 M의 범위 내의 결합 상수(binding constant)로 폴리펩티드나 이의 조각에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 상수는 적어도 약10 -5 M, 또는 적어도 약 10 -6 M이고, 보다 바람직하게는 관심의 대상인 폴리펩티드 또는 이의 조각에 대한 상기 항체의 결합 상수는 적어도 약 10 -7 M, 적어도 약 10 -8 M, 또는 적어도 약 10 -9 M 또는 그 이상이다. 상기 항체들은, 예를 들면, 전체적인 항체로서 또는 항체 조각으로서 혹은 상보성 결정 부위들과 같은 이의 다른 면역적으로 활성인 조각을 포함하여 다양한 형태들로 존재할 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 기능적 항원 결합 도메인들, 즉, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들을 갖는 항체 조각으로 존재할 수 있다. 또한, 상기 항체 조각은, 이에 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, F(ab) 2 , scFv(단일 사슬 Fv), dAb(단일 도메인 항체), 키메라 항체들(chimeric antibodies), 이중 특이성 항체들(bi-specific antibodies), 디아바디들(diabodies) 및 트리아바디들(triabodies)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 형태로 존재할 수 있다. 항체 "조각"은 전체 항체의 변형에 의하거나 원하는 항체 조각의 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체 조각들을 포함하여 항체들을 생성하는 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 재조합 DNA 기술에 의한 합성을 포함한다. 숙련된 처리자라면, 예를 들면, 미국 특허 제5,296,348호 및 Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)((2007, John Wiley and Sons, Inc.)에 기재된 바들과 같은 항체들을 합성하는 방법들을 인지할 것이다. 바람직하게는, 항체들은 관심의 대상인 폴리펩티드의 분리된 부위들이나 조각들로부터 제조된다. 관심의 대상인 폴리펩티드의 항체 부분은 약 5로부터 약 15개의 아미노산들과 같이 임의의 적절한 길이가 될 수 있다. 바람직하게는, 항체 부분은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산 잔기들을 포함한다. 본 명세서의 내용에 있어서, IFI27 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체에 대한 레퍼런스는 또한 관심의 대상인 폴리펩티드의 조각이나 변이체에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 항체들은, 예를 들면, 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 방법들을 이용하여 IFI27 유전자에 의해 암호화되는 정제된 폴리펩티드를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 Fab 부분들을 포함하는 단일클론 항체(monoclonal antibody)는 Harlow 및 Lane의 " Antibodies-A Laboratory Manual "(Eds)(1988, Cold Spring Harbor Laboratory, NY); Coligan의 " Current Protocols in Immunology "(1991); Goding의 " Monoclonal Antibodies: Principles and Practice "(1986)(2nd ed); 그리고 Kohler & Milstein의 "Nature"(1975)(256: 495-497)에 기재된 하이브리도마(hybridoma) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 파지(phage)나 유사한 벡터들 내의 재조합 항체들의 라이브러리들로부터 항체들을 선택함에 의한 항체 제조뿐만 아니라 래빗들(rabbits) 또는 마우스들(mice)을 면역화시킴에 의한 다중클론 및 단일클론 항체들의 제조(예를 들면, Huse 등의 "Science"(1989)(246: 1275-1281); Ward 등의 "Nature"(1989)(341: 544-546) 참조)를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체들이 인간화 항체들(humanised antibodies), 키메라 항체들 및 완전한 인간 항체들을 포함하는 점이 이해될 것이다. 본 발명의 항체는 하나 이상의 항원이나 에피토프(epitope)에 대한 결합 특이성을 갖는 이중 특이성 항체가 될 수 있다. 인간화 항체들, 키메라 항체들, 완전한 인간 항체들 및 이중 특이성 항체들의 제조를 위한 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 2006년 2월 7일에 등록된 Garabedian 등의 미국 특허 제6,995,243호(발명의 명칭: "Antibodies that recognize and bind phosphorylated human glucocorticoid receptor and methods of using same")에 기재되어 있다. 일반적으로, IFI27 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 잠재적으로 포함하는 샘플은 상기 폴리펩티드 또는 이의 조각에 특이적으로 결합되는 항체와 접촉될 수 있다. 선택적으로는, 상기 항체는 상기 항체를 샘플과 접촉시키기 이전에 세척과 후속하는 복합체의 분리를 용이하게 하도록 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체들의 예들은, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트들(microtitre plates), 비드들(beads), 트릭들(ticks) 또는 마이크로비드들을 포함한다. 항체들은 또한 전술한 바와 같은 프로테인칩 어레이(ProteinChip array) 또는 프로브 기판에 부착될 수 있다. 관심의 대상인 폴리펩티드에 결합되는 항체들의 확인을 위한 검출 가능한 표지들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 형광 색소들, 형광 염료들, 방사성 표지들, 양고추냉이 과산화물(horse radish peroxide), 알칼리성 인산 가수 분해 효소(alkaline phosphatase) 및 해당 기술 분야에서 공통적으로 이용되는 다른 것들과 같은 효소들, 그리고 콜로이드성 금 또는 착색 유리 혹은 플라스틱 비드들을 포함하는 비색 표지들을 포함한다. 선택적으로는, 상기 샘플 내의 마커는 직접적인 분석을 이용하여 걸출될 수 있고, 여기서, 예를 들면, 제2의 표기된 항체가 결합된 마커 특이성 항체를 검출하는 데 이용된다. 항체-마커 복합체의 존재를 검출하거나 그 양을 측정하기 위한 방법들은, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 바이오센서, 엘립소미트리(ellipsometry), 공명 거울(resonant mirror)법, 그레이팅 커플러 웨이브 가이드(grating coupler wave guide)법 또는 간섭계법과 같은 형광, 화학발광, 발광, 흡수도, 복굴절, 투과도, 반사도 또는 굴절률의 검출을 포함한다. 무선 주파수 방법들은 다극 공명 분광법(multipolar resonance spectroscopy)을 포함한다. 전기화학적 방법들은 전류 적정 및 전압 적정 방법들을 포함한다. 광학적 방법들은 영상화 방법들과 비영상화 방법들 및 현미경 관찰법을 포함한다. 항체-마커 복합체의 존재를 검출하거나 그 양을 측정하기 위한 유용한 방법들은, 예를 들면, 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA), 방사성 면역 분석(RIA) 또는 웨스턴 블로트(Western blot) 분석을 포함한다. 이러한 방법들은, 예를 들면, Stites & Terr의 "Clinical Immunology: Methods in Cell Biology "(eds., 7th ed. 1991); Asai의 "Antibodies in Cell Biology"(volume 37)(ed. 1993); 그리고 앞서의 Harlow & Lane에 기재되어 있다. 본 발명의 방법의 특정한 실시예에 있어서, 해당 기술 분야에서 알려진 하나 또는 그 이상의 항체들이 활용될 수 있다. IFI27 폴리펩티드들에 결합될 수 있는 항체들은 해당 기술 분야에 알려져 있고, 항-IFI27 다중클론성 항체 카탈로그 번호: LS-C70809, LSBio; IFI27 다중클론성 항체(A01) 카탈로그 번호: H00003429-A01, 압노바사(Abnova Corporation); IFI27 다중클론성 항체 카탈로그 번호: PAB8961, 압노바사; IFI27 항체 카탈로그 번호: H00003429-A01, 노버스 바이올로지칼스(Novus Biologicals); IFI27 항체 카탈로그 번호: H00003429-D01P, 노버스 바이올로지칼스; IFI27 래빗 다중클론성 항체(미국의 사파이어 바이오사이언스(Sapphire Bioscience)), IFI27 MaxPab 래빗 다중클론성 항체를 포함한다. 여기서 주목하는 바와 같이, 면역 분석 및 관련된 방법들에 의한 IFI27 발현의 조사는 Nzeusseu Toukap 등(2007)(여기에 개시 사항들이 참조로 포함된)과 같은 문헌에서 보고되었고, 본 발명의 방법들, 시약들, 장치들 및 키트들이 IFI27의 조사를 위해 이전에 보고된 항체들의 사용을 포함할 수 있는 점이 인지될 것이다. 본 발명과 이에 따라 본 발명의 방법들, 시약들, 장치들 및 키트들이 여기에 기재되는 바에 따른 임의의 적합한 항체를 포함하며, 여기에 특별하게 언급되는 항체들에만 한정되지는 않는 점이 인지될 것이다. 숙련된 처리자라면 적합한 항체들이 문헌 조사, 일상적인 시험을 통해 확인될 수 있고, www.antibodies-online.com와 같은 온라인 데이터베이스들에 열거될 수 있는 점을 알 수 있을 것이다.
검출을 위한 방법들 및 키트들 여기에 사용되는 바에 있어서, 상기 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 레벨을 결정하는 것은 다양한 실시예들에서 샘플 내의 유전자 산물의 존재, 부존재 또는 양을 결정하는 과정을 포함할 수 있으며, 샘플 내의 유전자 산물의 양을 정량화하는 과정을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법의 모든 단계들은 대상인 인간의 몸이나 동물의 몸과 같은 대상체 외부에서 일어나므로, 상기 방법이 몸에 대해 수행되지 않는다. 이와 같이, 바람직한 실시예들에서, 본 발명은 인간의 몸이나 동물의 몸에 대해 수행되는 어떠한 물리적인 간섭을 수반하지 않는다. 상기 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 것은 주어진 샘플이 다른 샘플이나 레퍼런스에 대한 비교에 의해 IFI27 유전자 산물의 존재를 위해 평가되는 경우, 예를 들면, 상기 테스트 샘플이 레퍼런스에 비하여 유전자 산물의 양이 크거나, 적거나 또는 동일한 것으로 발견되는 경우와 같이 상대적인 정량화를 포함한다. 정성화 및 이에 따라 상기 레벨을 결정하는 것은 또한 상기 샘플에 특이적인 분석 내에서 차이들을 설명하기 위해 상기 샘플이나 방법의 정규화를 포함할 수 있다. 통상적으로, 이는 상기 샘플 내에서 검출 가능한 다른 성분의 레벨을 결정하는 과정을 포함한다. 예를 들면, 상기 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 것이 IFI27 mRNA 전사체의 레벨의 결정을 포함하는 경우, 샘플들은 본 발명의 수행에서 중간 샘플 차이들을 설명하기 위해 정규화될 수 있다. 내부 레퍼런스 마커는 유전자 산물과 같은 상기 샘플 내의 임의의 적절한 성분이 될 수 있고, 통상적으로 건강한 대상들로부터의 샘플들 및 건장하기 않은 대상들 내의 균일한 존재의 성분, 또는 인플루엔자에 감염되지 않은 대상들로부터의 샘플들 및 인플루엔자로 감염된 대상들 내의 균일한 존재의 성분이 될 수 있다. 특정한 예로서, 글리세르알데히드(glyceraldehyde) 3-인산 디하이드로게나아제(phosphate dehydrogenase)(GAPDH) 유전자 산물이 내부 레퍼런스로 사용된다. 이에 따라, 본 발명의 방법들은 임상적인 위험도를 나타내는 레퍼런스 표준에 대한 환자로부터의 생물 샘플 내의 상기 IFI27 유전자 산물의 레벨의 비교를 포함한다. 임의의 적절한 레퍼런스 표준이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 레퍼런스 표준은 건강한 대상으로부터의 샘플이 될 수 있거나, 건강한 대상 내에서 발견되는 통상적인 IFI27 유전자 산물의 양이 될 수 있다. 이 경우, 상기 표준과 비교하여 상기 환자 샘플 내의 상승된 IFI27의 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 또 다른 예로서, 상기 레퍼런스 표준은 증상을 보이는 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상으로부터의 샘플이 될 수 있거나, 심각한 질병의 진전이 없는 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상 내에서 발견되는 통상적인 IFI27 유전자 산물의 양이 될 수 있으며, 이러한 레퍼런스 표준과 비교하여 환자 샘플 내의 IFI27의 상승된 레벨은 상기 환자 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 상기 레퍼런스 표준은 임상적인 위험도를 나타낼 수 있으며, 이 경우에 이와 같은 레퍼런스와 비교하여 환자 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 동일하거나 상승된 레벨은 대상 내의 임상적인 위험도를 나타낸다. 또 다른 예로서, 상기 레퍼런스 표준은 임상적인 위험도를 정의하는 표준 곡선이 될 수 있다. 이 경우, 상기 레퍼런스 표준은 상기 환자 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨의 결정과는 독립적이 될 수 있으며, 예를 들면, 상기 표준 곡선이 임상적인 위험도를 정의하는 제공된 레퍼런스 곡선의 형태가 될 수 있다. 상기 레퍼런스 표준은 상기 환자로부터의 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 과정과 동시에 제조될 수 있다. 예를 들면, 이는 하나 또는 그 이상의 알려진 IFI27 유전자 산물의 샘플(들)에 상기 환자로부터의 생물 샘플로서 IFI27 유전자 산물 레벨을 결정하기 위한 상기 방법들을 수행함에 의해 상기 표준의 제조를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 알려진 IFI27 유전자 산물의 샘플(들)은 소정의 양이나 임상적인 위험성 또는 임상적인 위험성이 없는 것을 나타내는 양이거나, 5 폴드(fold), 10 폴드, 20 폴드, 30 폴드, 40 폴드, 50 폴드, 60 폴드, 100 폴드, 200 폴드, 300 폴드, 500 폴드 또는 1000 폴드와 같이 임상적인 위험성을 갖지 않거나 무시할 정도로 갖는 대상의 통상적인 양 이상의 선택된 폴드 증가를 나타낸다. 여기에 본 발명의 특정한 실시예들 및 특히 실험예들에 예시되는 바와 같이, IFI27 유전자 산물의 정량적인 검출이 착수되었을 경우, 건강하거나 증상이 없어 보이는 개체들에 비하여 인플루엔자 감염으로부터의 심각한 질병의 진전이 있는 환자들로부터의 샘플들 내의 검출된 IFI27 유전자 산물 내에서 적어도 대략 40-폴드 내지 60-폴드 증가가 있었다. 건강하거나 증상이 없어 보이는 개체들과의 비교에 의해, 인플루엔자 또는 바이러스성 폐렴이 있는 환자들로부터의 샘플들 내의 검출된 IFI27 유전자 산물에서 적어도 대략 10-폴드의 증가가 있었다. IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하는 것은 또한 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 양이 적절한 단위들로 표현될 수 있는 바와 같이 결정되는 경우, 예를 들면, 양이 폴드, 밀리리터, 마이크로리터, 나노리터 및 유사한 것 당 그램, 마이크로그램, 나노그램, 피코그램, 펨토그램 및 유사한 것들과 같이 샘플의 단위들/부피의 변화로 표현될 수 있는 경우와 같은 절대적인 정량화를 포함할 수 있다. 임계치(cut-off value)는 본 발명의 다양한 실시예들에서 구현될 수 있다. 예를 들면, 일 실시예에서, 임계치는 샘플의 양/㎖의 측면에서의 측정과 같이 샘플 내의 상기 IFI27 유전자 산물의 실제 양의 정량적인 측정에 의해 구현될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 임계치는 하한이나 원하는 임계치에서의 검출 가능성의 한계를 설정함에 의해 구현될 수 있다. 이러한 방식에 있어서, 샘플 내의 상기 IFI27 유전자 산물의 검출(본 문에서 양의 신호로 언급될 수 있다)은 상기 샘플을 제공하는 대상 내의 인플루엔자 감염으로 인한 심각한 질병을 나타내는 반면, 샘플 내에 검출 가능한 IFI27 유전자 산물이 없는 것(본 문에서 음의 신호로 언급될 수 있다)은 인플루엔자를 갖지 않거나 증상이 없어 보이는 샘플을 제공하는 대상을 나타낸다. 이와 같은 실시예는 임의의 적절한 양의/음의 임계치에서 상대적으로 신속한 진단이 바람직한 경우나 상대적으로 정교한 시험 장비가 항상 이용 가능하지 않을 경우의 상황들에서 특정한 이용을 발견할 수 있다. 이는, 예를 들면, 진료 시점이나 의사의 방들 내에서가 될 수 있다. 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들의 검출은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드와 같은 IFI27 유전자 산물의 검출을 위한 방법들은 상기 IFI27 유전자 산물에 대해 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체의 사용을 수반할 수 있다. 숙련된 처리자가 프라이머, 프로브 또는 항체를 활용할 수 있는 적합한 기술들과 분석들은, 예를 들면, 중합 효소(polymerase) 연쇄 반응(및 이러한 기술의 연관된 변형들), ELISA 및 유세포 분석기(flow cytometry)와 같은 항체계 분석들, 그리고 형광 현미경을 포함한다. 여기에 개시된 특징적인 폴리펩티드들이 확인될 수 있는 것에 의한 방법들은 일반적으로 해당 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들면, Coligan JE 등의 " Current Protocols in Protein Science "(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Walker, JM의 " New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology "(Ed)(1988)(Humana Press, Clifton, NJ); 및 Scopes, RK의 " Protein Purification: Principles and Practice "(1987)(3rd. Ed., Springer-Verlag, New York, NY)에 기재되어 있다. 예를 들면, IFI27에 의해 암호화된 폴리펩티드들은 웨스턴 블로트 또는 분광 측색(spectrophotometric) 분석에 의해 검출될 수 있다. 폴리펩티드들의 검출을 위해 적합한 방법들의 다른 예들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제6,228,578호, 미국 특허 제7,282,355호, 미국 특허 제7,348,147호 및 PCT 공개 특허 제W0/2007/056723호에 기재되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, IFI27 유전자 산물의 레벨의 검출 및 결정은 상기 IFI27 유전자 산물의 시퀀스 또는 이의 변이체나 조각에 특이적으로 혼성화되는 프라이머들을 이용하고, 증식된 시퀀스를 검출하는 중합 효소 연쇄 반응에 의한 관심의 대상인 샘플로부터의 뉴클레오티드 시퀀스의 증식에 의하여 구현된다. 이 경우, 통상적인 표적 시퀀스는 SEQ ID NO:1 혹은 SEQ ID NO:2 내에 나타나는 시퀀스를 갖는 것과 같은 IFI27 mRNA, 또는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6 내에 나타나는 시퀀스를 갖는 것과 같은 IFI27의 cDNA 시퀀스, 또는 이의 임의의 것의 조각이나 변이체이다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 다중 표적 시퀀스, 이의 조각들 또는 변이체들이 적용될 수 있다. 상기 방법은 다중 시퀀스들, 이의 조각들 또는 변이체들의 검출을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 방법의 정확하거나 일관된 수행을 위한 것과 같거나 mRNA 발현 레벨들을 샘플들 사이에서 정규화되도록 조절들의 내포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 GAPDH와 같이 구성적으로 발현되는 것으로 알려지거나 인플루엔자에 감염된 대상들 및 인플루엔자에 감염되지 않은 대상들 내의 일정한 레벨에서 발현되는 것으로 알려진 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드들, 또는 이의 조각이나 변이체의 검출을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법들과 키트들을 이용하여 분석을 위해 핵산들을 필수적이거나 원하는 정도까지의 추출 및 정제를 위한 적합한 방법들은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면, Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); 그리고 Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012)에 기재되어 있다. 숙련된 처리자라면 본 발명이 여기에 개시되는 핵산 분리를 위한 특정한 방법들에 한정되는 것은 아니며 다른 적합한 방법들도 본 발명에 포괄되는 점을 용이하게 인식할 수 있을 것이다. 본 발명은 핵산의 분석 이전에 핵산 분리 없이 수행될 수 있다. 본 발명의 목적들을 위한 폴리펩티드들의 핵산들을 필수적이거나 원하는 정도까지의 추출 및 정제를 위한 적합한 방법들은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들면, Coligan JE 등의 " Current Protocols in Protein Science "(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Walker, JM의 " New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology "(Ed)(1988)(Humana Press, Clifton, NJ); 및 Scopes, RK의 " Protein Purification: Principles and Practice "(1987)(3rd. Ed., Springer-Verlag, New York, NY)에 기재되어 있다. 단백질 추출을 위해 적합한 기술들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 투석, 초미세여과 및 침전을 포함한다. 사용을 위해 적합한 단백질 정제 기술들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 원심 분리, 겔(gel) 여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환을 포함한다. 본 발명의 방법들과 키트들에 따르면, 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 변이체들이나 조각들은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 수단으로 검출될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드들은 PCR 증식에 의해 검출된다. 상기 PCR 접근 하에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 IFI27 유전자 산물을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 증식하도록 PCR 반응들 내에 사용을 위해 설계될 수 있다. 통상적으로 상기 PCR은 연관된 시퀀스들의 역전사(RT-PCR)에 의한 전령 RNA(mRNA)로부터 제조되는 상보성 DNA(cDNA)의 정량적인 증식을 포함한다. PCR의 알려진 방법들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 짝지어진 프라이머들, 내포된 프라이머들, 단일 특이적 프라이머들, 디제너레이트 프라이머들, 유전자 특이적 프라이머들, 벡터 특이적 프라이머들, 부분적으로 오정합된 프라이머들 및 유사한 것들을 이용하는 방법들을 포함한다. PCR 및 RT-PCR 프라이머들을 설계하기 위한 방법들은 해당 기술 분야에서 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면, Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Maniatis 등의 " Molecular Cloning "(1982)(280-281); Innis 등의 " PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications "(Eds)(1990)(Academic Press, New York); Innis 및 Gelfand의 " PCR Strategies "(Eds)(1995)(Academic Press, New York); Innis 및 Gelfand의 " PCR Methods Manual "(Eds)(1999)(Academic Press, New York); Sambrook 등의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(1989)(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); 그리고 Green 및 Sambrook의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(4th ed., 2012)에 기재되어 있다. 숙련된 처리자라면 PCR 및 RT-PCR 과정들의 다양한 변수들이 원하는 산물을 구현하기 위한 능력에 영향을 미치지 않고 변경될 수 있는 점을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들면, 염 농도가 변화될 수 있고, 변성, 어닐링 및 신장 단계들의 하나 또는 그 이상의 시간 및/또는 온도가 변화될 수 있다. 유사하게, DNA, cDNA 또는 RNA 템플레이트(template)의 양 또한 이용 가능한 핵산의 양 또는 효율적인 증식을 위해 요구되는 템플레이트의 최적의 양에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 방법들과 키트들에 사용을 위한 프라이머들은 일반적으로 통상적으로 길이가 적어도 약 5인 뉴클레오티드들 내지 약 80인 뉴클레오티드들, 보다 통상적으로는 길이가 약 10, 11, 12, 13 또는 14인 뉴클레오티드들 내지 길이가 약 50인 뉴클레오티드들, 심지어 보다 통상적으로는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30인 뉴클레오티드들의 임의의 것과 같이 길이가 약 15인 뉴클레오티드들 내지 길이가 약 30인 뉴클레오티드들인 올리고뉴클레오티드들이다. 숙련된 처리자라면 여기에 개시되는 프라이머들이, 이에 한정되는 것은 아니지만. PCR, RT-PCR을 포함하는 다른 많은 응용들 그리고 극히 침습성인 균주들의 특성으로 여기서 확인되는 시퀀스들의 검출을 위한 프로브들의 용도로 유용할 수 있는 점이 다시 인지될 수 있을 것이다. 이러한 프라이머들은, 예를 들면, 적절한 시퀀스들의 직접 화학 합성 또는 복제 및 제한을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 프라이머 내의 모든 염기들이 상기 프라이머가 혼성화되는 템플레이트 분자의 시퀀스를 반영할 필요는 없으며, 상기 프라이머는 상기 프라이머가 상기 템플레이트에 혼성화되게 하는 충분한 상보성 염기들을 포함할 필요만이 있다. 프라이머는 또한 하나 또는 그 이상의 위치들에서 상기 템플레이트 내의 염기들에 상보적이 아니고, 오히려 염기 신장이나 증식에 따라 DNA 내로 통합되게 설계된 염기들인 오정합 염기들을 포함할 수 있다. 프라이머는, 예를 들면 증식된 DNA의 복제를 용이하게 하도록 5' 말단에서 제한 효소 인식 시퀀스의 형태로 추가적인 염기들을 포함할 수 있다. 숙련된 처리자라면 IFI27 mRNA 시퀀스를 나타내는 시퀀스 또는 이의 조각을 증식시킬 수 있는 임의의 프라이머들이 본 발명의 방법들에의 사용을 위해 적합할 수 있는 점이 다시 인지할 수 있을 것이다. IFI27 mRNA 시퀀스는 SEQ ID NO:1 및 2 내에 나타난다. SEQ ID NO:1 및 2 의 시퀀스 또는 이의 조각이나 변이체를 포함하는 핵산의 증식을 위해 적합한 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍들이 사용될 수 있다. 숙련된 처리자라면 적합한 프라이머들 및 프라이머 쌍들이 PCR 증식을 통해서와 같이 IFI27 mRNA 전사체를 나타내는 시퀀스의 검출을 위한 통상적인 방법들을 통하여 선택될 수 있는 점을 알 수 있을 것이다. 특정한 예들로서, 상기 PCR 증식은 (i) ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(포워드 프라이머; SEQ ID NO:7) 및 ACATCATCTTGGCTGCTATGG(리버스 프라이머; SEQ ID NO:8); (ii) TGC CTC GGG CAG CCT(포워드 프라이머; SEQ ID NO:9) 및 TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(리버스 프라이머; SEQ ID NO:10); (iii) cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f; SEQ ID NO:16) 및 cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r; SEQ ID NO:17)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 활용할 수 있다. 또한, 상기 증식된 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 변이체들 및 조각들은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 숙련된 처리자라면 또한 본 발명이 예시된 특정한 프라이머들의 사용에 한정되는 것은 아니며, 상기 프라이머들이 관심의 대상인 특성의 시퀀스들의 증식을 가능하게 하도록 적절하게 설계되는 점이 제공되는 선택적인 프라이머 시퀀스들도 사용될 수 있는 것을 다시 인식할 수 있을 것이다. 적합한 프라이머 시퀀스들은 과도한 실험이 없이 통상적인 과정들을 이용하여 해당 기술 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 원하는 시퀀스들의 증식을 위한 적합한 프라이머들의 위치는 G+C 함량 및 원치 않는 이차적인 구조들을 형성하는 시퀀스에 대한 능력과 같은 인자들에 의해 결정될 수 있다. 증식된 핵산들의 분석을 위한 적합한 방법들은 해당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, Sambrook 등의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(1989)(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); 그리고 Maniatis 등의 " Molecular Cloning "(1982)(280-281)에 기재되어 있다. 상기 증식된 핵산들의 분석을 위한 적합한 방법들은, 예를 들면, 제한 효소 소화 및/또는 핵산 시퀀싱(sequencing)에 의해 진행될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 포함한다. 겔 전기영동은 염기의 사이즈에 따라 DNA 조각들의 분리를 위해 해당 기술 분야의 숙련자에 의해 공통적으로 이용되는 기술들인 아가로오스(agarose) 갤 전기영동 또는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동을 포함할 수 있다. 거대한 부분 내에서 겔 내의 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드의 농도는 상기 겔의 해상력을 결정하며, 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드의 적절한 농도는 이에 따라 구별되는 상기 DNA 조각들의 크기에 의존할 것이다. 본 발명의 다른 실시예들에 있어서, 폴리뉴클레오티드 및 이의 변이체들 또는 조각들인 IFI27 유전자 산물은 적합한 프로브들의 사용에 의해 검출될 수 있다. 프로브는 mRNA 또는 이의 증식된 유도체와 같은 IFI27 유전자 산물에 대해 선택적인 혼성화가 가능한 임의의 적합한 프로브가 될 수 있다. 프로브들은 통상적으로 혼성화에 의해 상동의 시퀀스들의 검출에 사용을 위한, 예를 들면, 약 10의 뉴클레오티드들 내지 수천의 뉴클레오티드들 사이의 가변적인 길이의 뉴클레오티드 시퀀스들이다. IFI27 mRNA 전사체를 나타내는 시퀀스의 검출을 위하여, 프로브는 통상적으로 상기 전사체의 길이 보다 작거나 동일한 크기일 수 있다. 본 발명의 혼성화 프로브들은 게놈 DNA 조각들, cDNA 조각들, RNA 조각들 또는 다른 올리고뉴클레오티드들이 될 수 있다. 뉴클레오티드 프로브들을 설계 및/또는 생산하기 위한 방법들은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들면, Robinson PJ 등의 " Current Protocols in Cytometry "(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc); Sambrook 등의 " Molecular Cloning: A Laboratory Manual "(1989)(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); 그리고 Maniatis 등의 " Molecular Cloning "(1982)(280-281)에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 프로브들은, 예를 들면, 화학적 합성 기술들, 예를 들면 포스포디에스테르 및 포르포트리에스테르 방법(예를 들면, Narang SA 등의 "Meth. Enzymol."(1979)(68:90); Brown, EL 등의 "Meth. Enzymol."(1979)(68:109); 및 미국 특허 제4,356,270호 참조), 디에틸포스포라미디트 방법(Beaucage SL 등의 "Tetrahedron Letters"(1981)(22:1859-1862) 참조)에 의해 제조될 수 있다. 변형된 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드들을 합성하기 위한 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기재되어 있다. 본 발명의 방법들과 키트들에 사용을 위한 본 발명의 프로브들은 이들의 검출을 용이하게 하도록 마커의 통합에 의해 표시될 수 있다. 핵산들을 표시하고 검출하기 위한 기술들은, 예를 들면, Ausubel FM 등의 " Current Protocols in Molecular Biology"(Eds)(2007)(John Wiley and Sons, Inc)에 기재되어 있다. 적합한 마커들의 예들은 형광 분자들(예를 들면, 아세틸아미노플루오렌, 5-브로모데옥시우리딘, 디곡시게닌, 플루오레세인) 및 방사성 동위 원소들(예를 들면, 32P, 35S, 3H, 33P)을 포함한다. 상기 마커의 검출은, 예를 들면, 화학적, 광화학적, 면역화학적, 생화학적 또는 분광분석 기술들에 의해 구현될 수 있다. 본 발명의 방법들과 키트들은 또한 본 발명의 폴리펩티드들에 특이적으로 결합될 수 있는 항체들의 사용을 포괄한다. 상기 항체들은 주어진 샘플 내의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들을 정량적으로 또는 정성적으로 검출하고 분석하는 데 사용될 수 있다. 항체들의 생성 및 사용을 위한 방법들은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려져 있고, 예를 들면, Harlow 및 Lane의 " Antibodies-A Laboratory Manual "(Eds)(1988)(Cold Spring Harbor Laboratory, NY): Coligan의 " Current Protocols in Immunology "(1991); Goding의 " Monoclonal Antibodies: Principles and Practice "(1986)(2nd ed); 그리고 Kohler 및 Milstein의 "Nature"(1975)(256:495-497)에 기재되어 있다. 상기 항체들은, 예를 들면, 유세포 분석기, 면역조직화학 또는 해당 기술 분야에서 알려진 다른 수단들에 의한 검출을 가능하게 하는 형광색소에 접합될 수 있다. 선택적으로는, 상기 항체는 비색 또는 화학발광 검출을 가능하게 하는 기질에 결합될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드들에 특이적으로 결합될 수 있는 하나 또는 그 이상의 항체들과 결합할 수 있는 이차적인 항체들의 사용을 고려한다. 본 발명의 방법들에 있어서, 샘플의 이용 또는 제조에 대한 기재가, 예를 들면, 상황들에서 적절하게 숙련된 처리자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 사용 가능한 전체적인 양보다 적은 양의 이용을 포함하는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 환자로부터 수득되는 혈액 샘플로부터의 전체 RNA의 분리주를 제조하는 것에 대한 기재에서, 숙련된 처리자가 적절한 것으로 간주할 경우에 전체적인 혈액 샘플이 사용될 필요는 없고 상기 샘플의 표본이 대신 사용될 수 있다. 다른 예로서, 전체 RNA 분리주의 역전사에 의한 cDNA의 제조에서, 숙련된 처리자가 충분한 것으로 간주할 경우에 전체적으로 전체 RNA 분리주가 사용될 필요는 없고 전체 RNA의 표본이 대신 사용될 수 있다.
키트들 본 발명은 또한 생물 샘플 내의 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27) 유전자 산물의 레벨을 결정하기 위한 키트들을 제공하며, 상기 키트는 IFI27 유전자 산물의 존재를 검출하기 위한 적어도 하나의 제제(agent)를 포함한다. 상기 제제는 IFI27 유전자 산물을 검출할 수 있는 제제가 될 수 있으며, 여기서 상기 유전자 산물은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 여기에 기재되는 시퀀스들을 검출할 수 있는 임의의 적합한 제제가 상기 키트 내에 포함될 수 있다. 제한적이지 않은 예들은 프라이머들, 프로브들 및 항체들을 포함한다. 상기 키트는 프라이머, 프로브 또는 항체인 적어도 하나의 제제를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 나타내는 바와 같은 핵산 시퀀스, 또는 이의 변이체나 조각에 대해 특이적일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로부터 선택될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 (i) ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(포워드 프라이머; SEQ ID NO:7) 및 ACATCATCTTGGCTGCTATGG(리버스 프라이머; SEQ ID NO:8); (ii) TGC CTC GGG CAG CCT(포워드 프라이머; SEQ ID NO:9) 및 TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(리버스 프라이머; SEQ ID NO:10); (iii) cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f; SEQ ID NO:16) 및 cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r; SEQ ID NO:17)로 이루어진 그룹의 시퀀스들의 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 상기 키트는 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 존재를 검출할 수 있는 다중 제제들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 IFI27 유전자 시퀀스에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 이의 항원 조각이나 변이체에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 상기 키트는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 내에 나타내는 아미노산 시퀀스 또는 이의 항원 조각이나 변이체를 포함하는 IFI27 폴리펩티드에 선택적으로 결합될 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 상기 키트는 본 발명의 방법의 정규화를 위하여 하나 또는 그 이상의 제제들을 포함할 수 있다. 정규화를 위한 상기 제제(들)는 GAPDH와 같은 구성적으로 발현된 유전자 산물의 검출을 위한 제제로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 GAPDH 뉴클레오티드 시퀀스에 선택적으로 결합될 수 있는 하나 또는 그 이상의 핵산 시퀀스들을 포함할 수 있다. GAPDH 뉴클레오티드 시퀀스에 선택적으로 결합될 수 있는 상기 하나 또는 그 이상의 핵산 시퀀스들은 SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:16에 나타내는 시퀀스들, 혹은 이의 조각이나 변이체의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 교정된 표준들을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 표준은 IFI27 유전자 산물의 알려진 농도를 포함한다. 상기 키트는 (i) 하나 또는 그 이상의 레퍼런스 샘플(들); (ii) 하나 또는 그 이상의 검출 가능한 모이어티들(moieties); (iii) 고체 지지체 상에 IFI27 유전자 산물의 검출을 위한 제제를 고정시키기 위한 하나 또는 그 이상의 물질(들); (iv) 고체 지지체 물질; (v) 생물 샘플의 수집 및/또는 저장을 위한 하나 또는 그 이상의 용기(들); (vi) 생물 샘플의 제조에의 사용을 위한 하나 또는 그 이상의 시약(들); (vii) 핵산 시퀀스의 증식을 위한 하나 또는 그 이상의 제제들; 그리고 (viii) 생물 샘플 내의 IFI27 유전자 산물의 레벨을 결정하기 위한 방법에 상기 키트 또는 이의 성분(들)의 사용을 위한 명령들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 추가적인 구성 요소들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 키트들은 임의의 숫자의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제한적이지 않은 예들로서, 상기 추가적인 성분들은 세포 배양을 위한 시약들, 레퍼런스 샘플들, 완충제들, 표지들 및 검출 분석을 수행하기 위해 기재된 명령들을 포함할 수 있다.
실험예들 이하, 특정한 실험예들을 참조하여 본 발명을 설명하며, 이들이 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
실험예 1: 물질들 및 방법들 연구 참가자들 실험들은 진행 세트(development set) 및 검증 세트(validation set)로 구성되는 연구 샘플에 기초하여 수행되었다. 상기 진행 세트(n=54)는 인플루엔자 감염에 대한 후보 바이오마커를 확인하는 데 이용되었다. 이는 환자들을 몇몇 코호트들(cohorts); 인플루엔자 감염(n=8), 박테리아 감염(n=16), 비전염성 상태들을 가지는 임상적으로 질병이 있는 환자들(n=12) 및 건강한 지원자들(n=18)을 포함하였다. 상기 검증 세트(n=33)는 상기 진행 세트로부터 생성된 바이오마커를 테스트하는 데 이용되었다. 모든 연구 참가자들은 통지된 서면 동의 및 표 1에서 입수될 수 있는 연구 참가자들의 세부 사항들을 수령하였다. [표 1] 진행 및 검증 세트들 내의 개인들의 인구 통계 및 임상적인 특징들 (COPD: 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease); APACHE II: 급성 생리 및 만성 건강 평가 점수(acute physiology and chronic health evaluation score); SIRS: 전신 염증성 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrom). 플러스-마이너스 값들은 평균 ± 표준 편차이다.)
유전자 발현 분석 잠재적인 후보 마커들에 대해 선별하기 위하여, 전사체 마이크로어레이(transcriptome microarray) 분석이 인플루엔자 감염이 확인된 개체들로부터의 전체 혈액에 대해 수행되었다. RNA 추출은 was performed using the 표준 프로토콜(PAXgene TM Blood RNA 키트-독일의 퀴아젠(Qiagen)). RNA 품질은 아질런트 바이오어날리저(Agilent Bioanalyser)를 이용하여 분석되었고, 모든 샘플들은 샘플들의 높은 품질을 나타내는 6.5 이상의 RNA 안정화수(integrity numbers)를 가졌다. 샘플 증식 및 라벨링은 일루미나 토탈프렙 앰플리케이션(Illumina TotalPrep Amplification) 키트를 사용하여 동시에 24개의 샘플들의 배치(텍사스주 오스틴시의 암비온(Ambion))에서 200ng의 전체 RNA에 대해 수행되었다. 증식된 cRNA는 충분한 증식이 보장되게 상기 아질런트 바이오어날리저를 사용하여 평가되었다. 상기 샘플들(750ng의 각 샘플)은 즉시 HT-12_v3_BeadChips 상으로 혼성화되었다. 혼성화(hybridization) 및 세척 과정은 처리된 어레이들의 각 세트에 대해 동일하였으며, 정규화(normalization) 후에 중요한 배치 효과들을 확인되지 않았다. 실험적 인공물들을 최소화하기 위하여, RNA 추출, 샘플 증식과 라벨링, 혼성화와 세척 그리고 스크리닝은 하루의 동일한 시간에서 동일한 작업자에 의해 수행되었다. 모든 마이크로어레이 데이터는 마이크로어레이 실험(MIAME) 기준들에 대한 최소 정보에 따라 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus: GEO)(GSE40012) 상에서 입수 가능하다. 분석 이전에, 상기 어레이 상의 각각의 프로브는 임의의 다른 분석들에 포함되는 적어도 하나의 샘플 내에서 0.0050 보다 작은 p-값 검출을 요구하는 필터를 통과하였다. 상기 일루미나(Illumina) HT 12 어레이 상에 존재하는 48,804의 프로브들 중에서, 24840의 프로브들(이하에서 유전자들로 언급함)이 이러한 기준을 통과하였다. 상기 필터링을 통과한 유전자들은 데이터의 분위 정규화(quantile normalisation) 및 로그 변환이 적용되었던 BRB 어레이툴스(ArrayTools) 내로 적재되었다. 상기 마이크로어레이 실험의 검증은 qRT-PCR을 이용하여 유전자들의 서브세트들을 위한 GAPDH에 대한 발현을 측정하여 수행되었다. qRT-PCR과 마이크로어레이 상대적 폴드-변화들을 비교할 때에 수득된 R-제곱 값들(squared values)은 두 유전자-발현 플랫폼들 사이의 강한 일치를 나타내는 0.67부터 0.83까지의 범위였다. 중앙값 보다 적게 정의된 모든 샘플들에 걸쳐 낮은 변화를 갖는 유전자들은 상기 데이터세트로부터 제거되었다. P-값들은 벤자마니(Benjamani) 및 호이베르크(Hochberg) FDR(False Discovery Rate) 방법을 이용하여 다중 시험을 위해 조절되었다(R 라이브러리 다중 테스트). FDR의 5%가 두 클래스들 사이에 차등적으로 발현되는 것으로 여겨진 유전자들에 대한 컷-오프(cut-off)로 이용되었다.
정량적 실시간 PCR 정량적 실시간 PCR은 상기 진행 및 검증 샘플 세트들 내의 모든 샘플들에 대해 수행되었다. 전체 RNA들은 제조업자(독일의 퀴아젠)의 지시들에 따라 퀴아젠 알엔이지(Qiagen RNeasy) 미니 키트로 제조되었다. RNA 수율은 UV 흡수에 의해 결정되었다. 첫 번째 가닥 cDNA들은 슈퍼스크립트(Superscript) III, RN아제아웃(RNaseOut), 올리고(Oligo)(dT) 및 마스터사이클러 ® 그라디언트(Mastercycler ® gradient) 5331(독일 함부르크의 에펜도르프(Eppendorf)사) 내의 랜덤 프라이머(인비트로젠(Invitrogen))를 이용하여 제조되었다. RT-PCR 반응들을 위하여, 샘플들은 반복적으로 처리되었다. 상기 PCR 반응 부피는 5㎕의 cDNA 샘플, 1㎕의 각 프라이머, 12.5㎕의 파워(POWER) SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(master mix)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 5.5㎕의 RN아제(RNase)가 없는 물을 포함하여 25㎕이었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))은 PCR 산물이 인트론(intron)을 포괄하였고, UCSC 가상 실험( in silico ) PCR 웹사이트(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command? command=start) 상에서 확인되도록 설계되었다. IFI27의 증식을 위해 사용된 프라이머들은 5'-ACCTCATCAGCAGTGACCAGT-3'(포워드)(SEQ ID NO.:7) 및 5'-ACATCATCTTGGCTGCTATGG-3'(리버스)(SEQ ID NO.:8)이었다. PCR 사이클링 조건들은 다음과 같았다: 95℃에서 10분 동안 유지, 95℃에서 30초 동안 5 사이클, 64℃에서 30초, 이 후에 72℃에서 30초, 95℃에서 30초 동안 35 사이클, 59℃에서 30초, 이 후에 72℃에서 30초, 75℃로부터 99℃까지 용해. IFI27의 발현 레벨은 인간 항존 유전자(human housekeeping gene), GAPDH 5'-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3'(포워드)(SEQ ID NO.:14) 및 5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'(리버스)(SEQ ID NO.:15)을 사용하여 정규화되었다. 분석들은 로터-젠(Rotor-Gene) 2000 실시간 PCR 머신(오스트레일리아 NSW의 코르벳 리서치(Corbett Research)) 상에서 수행되었다. 단일 PCR 산물들은 브롬화 에티늄(ethidium bromide) 염색된 2%의 아가로오스 겔(agarose gel)(시그마-알드리치) 상에서 수행되었고, UV-투과에 의해 가시화되었을 때에 용융 곡선(melt curve analysis) 및 단일 산물의 관찰 모두에 의해 확인되었다. 유전자 발현 데이터의 가시화는 그라프패드(GraphPad) PRISM(버전 6)을 사용하여 생성되었다.
세포 배양 인간 면역 세포들 내에서 수행된 실험들을 위하여, 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum)(FBS)(오스트레일리아 빅토리아의 SAFC 바이오사이언스즈(Biosciences)), 50IU/㎖ 페니실린(penicillin), 50㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin) 및 2mM의 L-글루타민(glutamine)이 보충된 집코(Gibco) RPMI 1640 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 오스트레일리아 지사)로 구성된 배양 배지가 사용되었다. 모든 배양된 세포들은 5% CO 2 의 가습된 분위기 내의 37℃에서 유지되었다.
면역 세포 서브세트들의 분리 인간 세포 형태들(단핵구들, NK 세포들, B 세포들, pDCs, mDCs, CD4 + , CD8 + T-세포들 및 호중구들)은 전체 말초 혈액 단핵 세포들(Peripheral blood mononuclear cells: PBMCs)로부터 정제되었다. PBMC들을 분리하기 위하여, 35㎖의 전체 혈액이 50㎖ 팔콘(Falcon) 튜브들 내에서 15㎖의 피코일(Ficoll) 상에 적재되었고, 자동 운전 모드로 30분 동안 20℃에서 400 xg로 원심 분리되었다. 계면 내에 위치하는 백색 층이 새로운 팔콘 튜브들 내로 조심스럽게 추출되었다. 분리된 PBMC들은 Ca 2+ 또는 Mg 2+ 없는 둘베코(Dulbecco)의 인산 완충 식염수(Phosphate Buffer Saline)(DPBS)(미국 메릴랜드주 위커스빌의 론자(Lonza))로 2회 세척되었다. 핵이 있는 세포들의 숫자는 크리스탈바이올렛(crystalviolet)으로 염색하여 결정되었다. 단핵구들은 제조압자의 지시에 따라 이지셉(EasySep) 인간 단핵구 농후화(enrichment) 키트(음성적 선택-오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로지즈(Technologies))를 사용하여 신선한 인간 PBMC들로부터 분리되었다. 상기 키트는 CD+16 단핵구들의 작은 서브세트를 대폭 감소시킨다. 세포들은 CD14-FITC로 형광으로 염색되었고, 유세포 분석기에 의해 분석되었다. 순도는 항상 92% 이상이었다. 자연 살해(NK) 세포들은 이지셉 인간 NK 세포 농후화 키트(음성적 선택-오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로지즈)를 사용하여 인간 PBMC들로부터 분리되었다. 상기 키트는 비-NK 세포들을 대폭 감소시켜 NK 세포들을 농후화시킨다. NK 세포들의 순도는 CD56-PE.Cy7 및 CD3-FITC로 염색한 후에 유세포 분석기에 의해 측정되었다. 순도는 항상 94% 이상이었다. B 세포들은 인간 B 세포 농후화 키트(오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로지즈)를 이용하여 자기 세포 분리(음성 선택)에 의해 >98% 순도(CD19+)까지 농후화되었다. 순도는 항상 90% 이상이었다. 골수 수지상 세포들(Myeloid Dendritic Cells: mDCs)은 골수 수지장 세포 분리 키트(음성적 선택, 오스트레일리아의 밀테닐 바이오테크(Miltenyi Biotec), NSW)를 사용하여 인간 PBMC들로부터 분리되었다. mDC들은 비-mDC들의 대폭 감소에 의해 분리되었다. 비-mDC들은 제2의 라벨링 시약으로서 항바이오틴-접합 마이크로비드들(microbeads)의 첨가 전에 바이오틴(biotin)-접합 항체들의 칵테일(cocktail)로 간접적으로 자기적으로 표시되었다. 상기 자기적으로 표시된 비-mDC들은 이들 세포들을 MACS 상에 유지시킴에 의해 대폭 감소되었다. 표시되지 않은 mDC들은 상기 칼럼을 통과한다. 세포들은 CD141 (BDCA-3)-FITC, CD1c(BDCA-1)-APC로 형광으로 염색되었고, 유세포 분석기로 분석되었다. 순도는 항상 90% 이상이었다. 플라스마시토이드 수지상 세포들(Plasmacytoid Dendritic Cells: pDCs)은 이지셉 인간 플라스마시토이드 DC 농후화 키트(음성적 선택-오스트레일리아 빅토리아의 STEMCELL 테크놀로지즈)를 사용하여 인간 PBMC들로부터 분리되었다. 상기 키트는 비-pDC들을 대폭 감소시켜 PBMC들로부터 pDC들을 농후화시킨다. 세포들은 CD304(BDCA-4)-APC 및 HLA-DR-PerCP로 형광으로 염색되었고, 유세포 분석기에 의해 분석되었다. 순도는 항상 92% 이상이었다. 단핵구 유래 수지상 세포들(Monocyte derived dendritic cells: MDDC)(>90% CD14+)은 플라스틱 부착 세포들의 수집에 의하거나, PBMC들을 로세테셉(RosetteSep) CD14+ 농후화 키트(오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로지즈)로 처리함에 의해 수득되었다. 분리된 단핵구들은 적절한 농도의 재조합 인간 IL-4 및 GM-CSF로 보충된 완전 배지들(미국 캘리포니아주 산디에고의 이바이오사이언스(eBioscience)) 내에서 6일 동안 후속하여 배양되었다 . CD4+ T 세포들은 제조업자에 의해 제공되는 지시에 따라 음성적 선택(오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로리즈)에 의해 신선하게 분리되었다. CD3+/CD4+ T 세포들의 순도는 ≥96% 이었다. CD8 + T 세포들은 상기 이지셉 CD8 농후화 키트(오스트레일리아의 STEMCELL 테크놀로지즈)을 이용하여 CD8 음성적 선택에 의해 분리되었다. 상기 CD3+/CD8 + T 세포들의 순도는 유세포 분석기에 의해 확인되었다(>95%). 호중구들은 응고를 방지하도록 헤파린(heparin)을 사용하여 건강한 제공자들로부터 수득한 전체 10 내지 20㎖의 인간 혈액으로부터 분리되었다. 모든 후속하는 단계들은 4℃ 또는 얼음 상에서 수행되었다. 상기 혈액은 행크(Hank)의 평형 염액(Balanced Salt Solution: HBSS)(오스트레일리아 빅토리아의 라이프(Life) 테크놀로지즈)으로와 2%의 텍스트란(Dextran) T500(파마시아(Pharmacia))으로 1:1로 희석되었고, 적혈구들을 침전시키도록 30분 동안 배양되었다. 상부의 상(phase)은 새로운 튜브로 이송되었고, 피코일-파퀴 TM 플러스(Ficoll-Paque TM PLUS)(오스트레일리아의 GE 헬스케어(HealthCare))를 이용하여 밀도 분별되었다. 호중구들은 펠렛으로부터 회수되었고, 단핵 세포들은 계면으로부터 회수되었다. 상기 펠렛은 새로운 튜브로 이송되었고, RBC 세포용해 완충액(lysis buffer)(150mM의 염화암모늄, 1mM의 중탄산칼륨, 0.1mM의 EDTA, pH 7.2) 내에 재현탁되었으며, 이후에 10%의 낮은-엔도톡신(endotoxin) 소태아 혈청(FBS) 및 항체들이 보충된 RPMI 1640으로 세척되었다. 통상적인 회수는 수집된 혈액의 밀리리터 당 3백만 내지 5백만의 호중구들이었다. 순도는 92% 이상이었다. 호중구들은 각각의 농후화 전에 분리되었고 즉시 사용되었다. 대식세포들(macrophages)은 건강한 혈액 제공자들로부터의 PBMC들로부터 마련되었고, 전술한 바와 같이 정제되었다. 대식세포들은 10%의 소태아 혈청, 2mM의 L-클루타민과 50IU/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 내의 1.5 x 10 6 세포/웰의 밀도에서 10ng/㎖의 대식세포-콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimulating factor:M-CSF(96-웰 플레이트들 내의 R&D 시스템들)(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크의 벡톤 디킨손(Becton Dickinson))로 정제된 단핵구들로부터 생성되었다. 2일 및 5일에, 상기 배지의 반이 리프레시되었고, 6일에서 단핵구-유래 대식세포들이 수확되었다. 얻어진 세포 오염물들은 >90%의 대식세포들을 함유하였다.
면역 세포 분리 및 FACS 분석 세포들은 표 2에 나타낸 표면 마커들의 차등 발현에 기초하여 구분되었다. 각각의 실험에 있어서, 세포들(샘플 당 >10 4 세포들)은 상기 배지 내에 현탁되었고, 새롭게 분리된 세포들(세포 표면 표현형)의 순도는 즉시 결정되었거나, 유세포 분석기 BD LSR-II(BD 바이오사이언스)에 의한 이후의 분석을 위해 1%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)내에 고정되었다. 분석은 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 프로그램(미국의 트리스타(TreeStar))을 이용하여 수행되었다. [표 2] 면역 세포 서브세트들을 정제하는 유세포 분석기에 대해 사용된 항체들 세포 자극 분석 분리된 면역 세포들은 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인플루엔자 바이러스 항원, agonists of 톨-유사 수용체들(toll-like receptors)(TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9)의 대항자들(agonists) 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스들(H1N1, H3N2, 인플루엔자 B)을 포함하는 내생 리간드들(endogenous ligands)에 의해 자극되었다. 순수한 세포 오염물들은 ㎖ 당 1-2x10 6 세포들의 농도에서 10%의 FBS, 2mM의 L-글루타민, 50IU/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 내에 현탁되었다. IFI27 발현에 대한 자극자들의 다른 농도의 영향을 결정하기 위하여, 세포들은 배지들 내의 나타낸 자극자들의 농도들로 37℃에서 6, 12 및 24시간 동안 배양되었다. 모든 처리들에 대하여, 용량 반응(dose response)이 최적의 자극 조건들을 한정하도록 수행되었다. 자극 전후의 세포 생존 능력은 트리판 블루(Trypan blue) 배제(미국 미조리주 세인트루이스의 시그마-알드리치)의 방법으로 측정되었다.
통계적 분석 두 그룹들 사이의 비교는 짝지어지지 않은 두 말단의(two-tailed) 적절한 경우에 스튜던트의 t-검정(Student's t -test) 또는 비모수(non-parametric) 만-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트를 이용하여 계산되었다. 다중 그룹들 사이의 비교는 적절한 경우에 일방 ANOVA 또는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트를 이용하여 계산되었다. 유전자-발현 데이터는 건강한 대조군에 대한 폴드 변화로 나타낸다(평균 +/- SD). 모든 통계적인 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6(캘리포니아주 라 호야의 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 이용하여 수행되었다. 모든 p 값들은 p <0.05로 간주되는 유의 수준을 갖는 양면적이다.
실험예 2: IFI27이 심각한 인플루엔자 감염에서 높게 발현된다 잠재적인 후보 마커들을 선별하기 위하여, 인플루엔자 감염이 있는 것으로 확인된 환자들의 모든 혈액에 대해 전사체 마이크로어레이(transcriptome microarray) 분석이 수행되었다. 이러한 분석은 심각한 인플루엔자 감염의 마커로서 인터페론-자극 유전자, 인터페론 알파 유도 단백질 27(IFI27)을 확인하였다(도 1). 상기 진행 세트에서, 상기 IFI27 유전자는 인플루엔자 감염으로부터 심각한 질병이 있는 개인들 내에서 높게 발현되었다. 이러한 발견은 상기 검증 세트 내에서 확인되었다(도 2). IFI27 발현 레벨 및 질병의 심각도 사이의 상호 관련은 두 독립적인 유전자-발현 데이터세트들(GSE17156, GSE21802) 내에서 더 확인되었고, 여기서 IFI27 발현은 증상이 없는 감염을 가지는 개인들에서 최소였고, 증상이 있는 감염 내에서 가볍게 증가되었으며, 감염으로부터 심각한 질병이 있는 개인들에서 상당히 증가되었다(도 3). 심각한 질병이 진행된 개인들의 코호트들 중에서, 보다 높은 평균 IFI27 발현(>90 폴드 변화)은 기계적 환기(mechanical ventilation)를 요구하는 개인들의 보다 높은 비율과 관련되었다(표 3). [표 3] 심각한 인플루엔자 폐렴이 있는 환자들 내에서의 IFI27 발현 환자들이 심각한 질병으로부터 회복하면서, IFI27 발현은 베이스라인(baseline) 레벨들을 향해 돌아간다(도 4 및 도 5). 심각도 바이오마커로서, IFI27은 다른 모든 인터페론-유도 유전자들을 능가하였다. 다른 유전자들과 비교하여, IFI27은 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 가벼운 질병과 심각한 질별 사이에서 가장 큰 차등 발현을 나타내었다(도 6). 생체 외의( In vitro ) 실험들은 말초 혈액 내의 바이러스 부하가 IFI27 발현과 상호 관련되는 점을 확인하였다. 건강한 지원자들로부터 분리된 PBMC를 이용하여, 인플루엔자 바이러스가 IFI27 유전자 발현에 용량-의존형(dose-dependent) 증가를 야기하는 점이 발견되었다(도 7). 상향조절은 상기 세포들이 항바이러스제 오셀타비르 포스페이트(oseltamivir phosphate)로 처리된 후에 폐기되었다(도 8). 실험예 3: IFI27 발현의 메커니즘 IFI27 발현의 메커니즘을 기술하기 위하여, 실험들이 말초 혈액 세포들 내의 인터페론 경로를 자극하도록 내재 리간드들(인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-람다)을 이용하여 수행되었다. 인터페론 알파(IFNα)가 IFI27 발현에서 가장 큰 증가를 생성하였고(도 9), 이러한 증가가 용량-의존형 방식으로 일어났던 점(도 10)이 관찰되었다. 말초 혈액이 면역 세포들의 이종 혼합을 함유하기 때문에, 단계들은 IFI27 신호를 발생시켰던 특정 면역 세포를 확인하도록 수행되었다. 톨-유사 수용체들(TLR)이 IFNα 경로의 주요 활성자들이기 때문에, 혈액 세포들에 대해 다른 TLR 리간드들을 적용하는 효과들이 평가되었다. 모든 TLR 리간드들 중에서, 상기 TLR7 리간드가 가장 큰 IFI27 발현을 생성하는 점이 발견되었다(도 11). TLR7은 일반적으로 플라스마시토이드 수지상 세포들(pDCs) 및 B 세포들 내에서 주로 발견되며 9 , 이에 따라 pDC들 또는 B 세포들이 말초 혈액 내에서 관찰되는 IFI27 신호의 가능한 소스가 되었던 점이 가정되었다. 상기 가정을 시험하기 위하여, 8의 면역 세포 세브세트들(CD4, CD8, 호중구들, B 세포들, 단핵구들, 자연 살해 세포들, 골수 수지상 세포들 및 플라스마시토이드 수지상 세포들)이 건강한 지원자들의 전체 혈액으로부터 정제되었다. 또한, 단핵구들로부터의 생체 외로 분화된 면역 세포들의 서브세트들(단핵구 유래 대식세포들 및 단핵구 유래 수지상 세포들)이 생성되었다. 이들 실험들은, 모든 다른 세포 유형들과 비교하여, pDC들이 TLR7 리간드에 반응하여 IFI27 유전자 발현에서 가장 큰 증가를 생성하였던 점을 보여주었다(도 12). B 세포들을 포함하여 다른 면역 세포 서브세트들은 최소한이거나 무시할 수 있는 IFI27 신호들을 발생시켰다. 바이러스성 항원을 이용하는 다른 실험들은 pDC가 가장 큰 IFI27 상향조절을 생성하였던 점들 확인하였다(도 13). 중요하게는, 인플루엔자 A 바이러스들(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B 바이러스을 이용하여, it was found 모든 보통의 계절성 인플루엔자 바이러스 균주들이 pDC들 내에 상향 조절된 IFI27 발현을 야기하는 점이 발견되었다(도 14). 함께 고려하면, 전술한 발견들은 순환하는 pDC들이 감염된 환자들의 전체 말초 혈액 내에서 관찰된 상기 IFI27 신호들을 야기하였던 점이 제시되었다. 이러한 발현은 TLR7 수용체, 단일 가닥의 RNA 바이러스들에 대한 매우 특이적인 내재 수용체를 통해 중재될 수 있다 10 . 인플루엔자 바이러스에 대한 노출은 TLR7의 활성화를 가져올 수 있으며, 이는 결국 상기 IFNα 경로를 통한 용량-의존형 IFI27 상향 조절의 결과로 된다(IFN-α의 생성이 전사 인자 IRF7과 복합체를 형성하는 톨-인터류킨(interleukin)-1 수용체 도메인을 포함하는 어댑터(adaptor) MyD88에 의존한다)(도 15).
실험예 4: IFI27 발현의 시간 경과 IFI27 발현의 시간 경과를 조사하기 위하여, pDC들 내의 IFI27 발현의 종단 분석이 수행되었다. pDC은 인플루엔자 바이러스에 노출되었고, 상기 IFI27 유전자-발현이 4일에 걸쳐 측정되었다(도 16). 이러한 실험은 pDC들이 48시간 및 72시간에서 감소를 수반하는 24시간 이내에 IFI27 발현을 신속하게 증가시키는 점을 보여주었다. 유전자 발현의 감소는 사멸세포 분석에 의해 입증되는 바와 같이 생존하는 세포들의 숫자가 48시간 및 72시간에서 상대적으로 일정하기 때문에 pDC들의 숫자의 감소에 기안하는 것은 아니었다(도 16). 이러한 관찰은 IFI27이 감염의 이른 상황에서 일어나는 신속한 상향 조절을 가지는 점을 입증하였다.
실험예 5: 세균성 감염에서 IFI27 발현 다른 병원체들(예를 들면, 박테리아)도 IFI27 발현을 증가시킬 수 있었던 지도 조사되었다. 이를 위하여, PBMC는 지질다당류(LPS)로 배양되었다. LPS가 무시할 수 있는 IFI27 유전자 발현을 야기하였던 점이 관찰되었다(도 17). 이는 세균성 폐렴이 있는 환자들의 코호트 내에서 확인되었고, 여기서 IFI27 발현은 인플루엔자 폐렴을 갖는 환자들에 비하여 상당히 적었다(도 18). 이는 바이러스성 및 세균성 폐렴 환자들 모두(n=37)로 구성되는 독립적인 데이터세트(GSE6269) 내에서 더 확인되었다. 다시 말하면, 이러한 분석은 IFI27 발현이 세균성 폐렴과 비교하여 인플루엔자 감염에서 상당히 높았던 점을 보여주었다(도 19).
실험예 6: 전신 염증에서 IFI27 발현 심각한 병들은 숙주 내에서 일반화된 전신 염증성 반응을 끌어내며, 심각한 병들도 IFI27 발현을 증가시킬 수 있었던 지가 조사되었다. 전신 염증성 반응(정신적 외상, 췌장염(pancreatitis) 및 고 위험의 수술에 의해 유발된)이 있는 환자들의 코호트에서, IFI27 유전자-발현이 상당히 증가되지 않았던 점이 발견되었다(도 20). 이는 SIRS 환자들(n=167)의 독립적인 데이터세트(GSE11375) 내에서 확인되었고, 여기서 IFI27 발현은 최소한이었다(도 21). 실험예 7: 논의 인플루엔자 범유행병은 민감한 인구들을 통한 새로운 바이러스 균주의 신속한 전파에 의해 특징지어진다. 발생 동안에 감염된 개체들의 기하급수적인 증가는 매 감염된 경우를 테스트하고 격리시키는 것을 수송적으로 불가능하게 만든다. 공중 위생 반응은 가장 임계적인 환자들에 대해 발생 방지로부터 건강관리 자원들의 배분으로 빠르게 이동할 것이다. 이에 따라, 많은 숫자의 감염된 개체들을 신속하게 분류하고 이들이 악화의 높은 위험에 있는 지를 확인하는 역량은 범유행병 관리를 위해서 결정적이다. 이를 위하여, IFI27은 인플루엔자 감염과 관련된 신뢰성 있는 질병의 심각도 바이오마커로서 구현된다. 데이터는IFI27이 인플루엔자 감염으로부터의 심각한 질병의 세 독립적인 코호트들 내에서 질병의 심각도와 상호 관련되는 점을 입증하였다. 다른 코호트들 내의 추가적인 검증은 IFI27이 인플루엔자 감염에 특이적인 점을 확인하였다. 더욱이, 모든 통상적인 인플루엔자 바이러스 균주들(H1N1, H3N2, 인플루엔자 B)이 증가된 IFI27 발현 및 상당한 IFI27 상향 조절을 야기하고, 이는 또한 혼성화(>50 폴드 변화) 혹은 호흡 부전(>90 폴드 변화)과 관련되는 점이 발견되었다. 함께 고려하면, 이들 발견들은 IFI27 발현이 진행성인 질병이 있는 개체들을 확인하는 유용한 혈액 특징이며, 귀중한 임상적인 응용 들을 가지는 점을 증명한다. IFI27은 바이오마커로서 바람직한 운동학적 프로파일을 가진다. IFI27 상형 조절은 인플루엔자 바이러스에 대한 노출의 24시간 이내에 신속하게 일어난다. 이러한 특징은 임상의들이 고 위험의 환자들에서 지연을 최소화하는 데 도움이 될 수 있다. 2009 H1N1 인플루엔자 범유행병 동안에, 5-7일의 평균적인 지연이 진행성의 질병이 있는 환자들 중에서 공통적으로 보고되었다 11 -13 . IFI27은 이들의 임상적인 악화 이전에 이들 환자들을 확인하는 데 도움이 될 수 있다. 통상적으로, 범유행병 발생 동안의 위험도 계층화는 알려진 위험 인자들(예를 들면, 연령, 임신, 비만 또는 면역억제)에 의존한다. 그러나, 2009 H1N1 인플루엔자 범유행병 동안의 불균형적으로 큰 숫자의 감염된 환자들은 확인될 수 있는 위험 인자들을 갖지 않았다 14 . 종래의 바이러스 분석들은 원인이 되는 바이러스 균주들을 확인할 수 있다. 그러나 이들은 질병 진행의 주요 결정 요인인 숙주 반응에 대한 정보는 제공하지 못한다. IFI27과 같은 숙주 반응 바이오마커는 진단 및 숙주 반응 모두에 대한 정보를 제공함에 의해 전술한 한계점을 극복한다. 특히, 본 발명의 데이터는 IFI27이 질병의 심각도를 반영함에서 모든 다른 알려진 인터페론-유도 숙주 반응 바이오마커들(예를 들면, MxA, OAS)을 능가하는 점을 보여준다. 숙주 반응 바이오마커들의 공통적인 한계는 이들의 특이성의 결핍이다. 예를 들면, 조류 독감(H5N1) 감염에서, 감염성 시토킨들(예를 들면, TNF-α, IL-6)의 높은 레벨이 질병의 심각도의 마커이다 15 . 그러나, 동일한 바이오마커들은 또한 세균성 패혈증, 정신적 외상 및 수술을 포함하는 많은 비-바이러스성 상태들에서 상승된다. 이러한 특이성의 결핍은 이들 바이오마커들이 다양한 면역 세포들(예를 들면, 단핵구들 및 림프구들)에 의해 생성되기 때문에 일어난다. 대조적으로, IFI27은 보다 병원체 및 세포 특이적이다. 이러한 특이성은 TLR7-IFNα 경로에 기인할 수 있으며, 이는 단일 사슬 RNA(예를 들면, 인플루엔자 바이러스)만을 인식한다 10 . 중요하게는, 이러한 경로는 현재는 pDC들 내에 존재하는 것으로만 알려져 있고, 다른 면역 세포들 내에는 존재하지 않으며, 이에 따라 상기 바이오마커 문헌과 평등하지 않은 우수한 진단 특이성을 갖는 IFI27이 제공된다. 인플루엔자 범유행병과의 싸움에서 특유한 난점은 새로운 바이러스 균주의 유전자 구성에서 예상치 않은 변화이다. IFI27과 같은 숙주 반응 바이오마커는 잠재적으로 이러한 난점을 피할 수 있다. 여기서의 데이터는 IFI27 발현이 범유행성 H1N1, 계절성 H3N2 및 인플루엔자 B를 포함하는 모든 통상적인 인플루엔자 균주들에 의해 증가되는 점을 제시한다. 상기 IFI27 유전자는 세포의 내부 미토콘드리아 막 내에 위치하는 단백질(ISG12)을 암호화한다 8 . 세포 또는 혈청 IFI27 단백질을 측정하는 것은 인플루엔자 감염을 검출하는 것에 대한 대안적인 진단 접근법을 제공할 수 있다. 유전자-발현 분석은 반면에 IFI27 발현을 측정하는 보다 신속하고 비용 측면에서 경제적인 수단들을 제공한다. 2.5㎖의 말초 혈맥 샘플을 수득함에 의해, IFI27 발현 레벨은 수 시간 내에 종래의 RT-PCR에 의해 빠르게 분석될 수 있으며, 통상적인 임상 시험에서 활성화된 pDC들을 모니터하는 것을 실현 가능하게 한다. 본 발명은 중요한 치료적 및 임상적인 영향들을 가진다. 면역학에서 최근의 진보들은 바이러스 감염에 대한 면역 반응의 다중 암들을 조화시키는 pDC들을 포함하여 몇몇의 수지상 세포 서브세트들을 갖는 수지상 세포들이 숙주 반응의 중심 단계에 있는 점을 보여준다 17 , 18 . 이러한 복합 수지상 세포 네트워크는 숙주 방어를 위하여 본질적이지만, 이는 또한 면역 병리의 소스가 될 수 있다 19 . 새로운 증거는 비정상적인 pDC 반응이 바이러스 전파를 지지할 수 있고 치명적인 인플루엔자 감염과 관련되는 점을 보여준다 20 -22 . 바이러스 감염으로부터의 질병과 싸우기 위하여, 약물 표적화 수지상 세포들이 최근에 개발되었다 23 -24 . 그러나, pDC-방향성 치료를 위해 적합한 환자들을 확인하는 현재 이용한 가능한 분석은 존재하지 않는다. 그렇지만, 여기서는 새로운 바이오마커와 pDC 반응 및 임상적인 심각도를 연계시키는 첫 번째 데이터가 제공된다. 동반 진단으로 적용함으로써, IFI27 발현은 또한 pDC-방향성 치료로부터 유익할 수 있는 환자들의 하위 그룹들을 확인하는 데 도움이 될 수 있다.
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