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복수의 인플루엔자 바이러스 Ａ 서브타입들과 반응할 수 있는 모노클로날 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES CAPABLE OF REACTING WITH A PLURALITY OF INFLUENZA VIRUS A SUBTYPES}
본 발명은 일반적으로 면역학 분야 내에 속한다. 더 상세하게, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 HA(헤마글루티닌) 항원에 대항하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
해마다 인플루엔자 바이러스 유행은 전 세계적으로 질병률 및 사망률의 중대한 원인이 된다. 미합중국에서는, 200,000명 이상의 사람들이 매년 인플루엔자 바이러스와 관련된 증상으로 병원에 실려가고, 거의 약 40,000명의 사람들이 이와 직접적으로 관련되어 사망하는 것으로 추정된다(문헌[Thompson 등., JAMA, 2003, 289:179-186]). 이러한 수치 이외에도, 거의 장기간 동안 집에 머무르는 감염된 피검자가 기하급수적으로 늘어나고, 작업 일수의 감소로 인한 불가피한 경제적 파문에 대한 경우도 고려해야 한다. 최근의 연구(문헌[Molinari 등., Vaccine, 2007, 25:5086-5096])는, 매년 유행병과 직접적으로 관련된 의료 비용은 104억 달러(US 달러)/년이고, 작업 일수의 감소로 인한 손실 이득에 대해 163억 달러(US 달러)/년이 추가되어야 한다. 다른 아이템(item)(예를 들어, 감염된 피검자의 사망과 관련된 경제적 손실의 금전적 평가)을 고려하면, 그 양은 믿을 수 없는 수치인 871억 달러(US 달러)로 증가한다. 인간에게 새로운 인플루엔자 바이러스의 출현으로 인해 가까운 미래의 임의의 순간에 발생할 수 있는 무서운 유행병과 함께, 매년 유행병과 관련된 경제적 데이터는, 이러한 바이러스의 확산을 방지하는 유효한 전략에 대한 연구에 상당한 관심을 갖도록 한다. 현재, 일부 방법에서 매년 인플루엔자 유행에 직면한 경우 단지 이용가능한 툴(tool)은, 다음의 인플루엔자 시즌의 유행에 원인이 될 것이라고 추정되는 바이러스성 분리주 항원(viral isolate antigen)을 방지하는 비활성화된 3가 백신(inactivated trivalent vaccine)이다. 일부 센티널 지형 지역(sentinel geographic area)에서 초기 분리주에 관련된 역학적 데이터에 기초한 종류를 예측하는 것은 항상 정확하다고 판명되지는 않는다. 따라서, 특정 인플루엔자 시즌에 개발된 3가 백신이 상당히 유효하지 않다고 판명될 수 있어서, 해마다 존재하는 무시해도 될 정도의 위험은 없다. 새로운 유행병의 경우 뿐만 아니라, 그 경우에도, 단지 이용가능한 예방/치료 보조제는 항바이러스성 약제의 2개의 이용가능한 부문으로 분류될 수 있다: M2 단백질 억제제(아만타딘(amantadine) 및 리만타딘(rimantadine)), 및 뉴라미니다아제 억제제(neuraminidase inhibitor)(오셀타미비르(oseltamivir) 및 자나미비르(zanamivir)). 그러나, 이 상황에서도, 일련의 문제들이 이미 예상될 수 있으며, 감염의 초기 단계에서 항바이러스를 관리할 필요와 관련되고, 그리고 이미 발생했던 저항력 있는 바이러스 분리주(resistant viral isolate)의 빠른 출현에 관련된다. 다른 유효한 전략은 중요한 바이러스성 단백질에 직접 대항하는 항체 제제를 중화(neutralization)하는 데에 기초될 수 있고, 인플루엔자 바이러스들의 다른 분리주 사이에서 공유되는 단백질 부분을 인식할 수 있다. 항체의 수동적인 관리를 기초로 한 접근법의 가능성을 더 이해하기 위해, 인플루엔자 바이러스의 주요 구조적인 특징을 간략히 언급하는 것이 유용하다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스과( orthomyxoviridae family)에 속하고, 약 500 스파이크(spike)가 존재하고, 프로젝션(projection)이라고 불리우는, 감염된 세포막으로부터 유래된 피막(envelope)의 존재에 의해 특징 지워진다. 이러한 프로젝션은 2개의 중요한 바이러스성 표면 단백질(surface protein)로부터 트리머(trimer) 및 테트라머(tetramer)로 이루어진다: 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA). 막관통 단백질(integral membrane protein)(M2)은 피막 표면에서 발견되고, 단백질은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제와 비교할 때 더 낮은 개수(number)로 존재하고, 또한 테트라머로 조직화된다. 인플루엔자 바이러스는, 8개의 단일 가닥 RNA 절편을 포함하는 세그먼트 게놈(segmented genome)의 코어 내에 존재함으로써 더 특징 지워진다. 비리온(virion)(NP 및 M1) 내의 일부 단백질의 특징에 기초하여, 3개의 인플루엔자 바이러스 타입이 인식될 수 있다: 타입 A, 타입 B 및 타입 C. 타입 A 및 타입 B 바이러스는 해마다 유행되고 있다. 대신에, 타입 C 바이러스는 덜 심한 증상이다. 타입 A 바이러스 내에서(단지 일부가 유행될 수 있고, 해마다 유행하는 동안에도 매우 심한 증상을 야기할 수 있음), 다른 서브타입이 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제의 항원 특징에 기초하여 인식될 수도 있다. 최근의 진행 과정에서 인간에게 영향을 주었던 서브타입은 서브타입 H1N1 및 H3N2이고(현재에는 여전히 순환되고 백신 제제에 함유됨), 뿐만 아니라 서브타입 H2N2는 1968년 이후로 더 이상 순환되지 않으며 1957년에 "Asiatic" 플루로 불리워졌다. 다른 서브타입은 인간에게 산발적으로 영향을 주었으며(H9N2, H7N7, 및 매우 두려운 최근의 H5N1 서브타입), 이들은 효과적으로 분산되지 못하였으며, 순환되는 서브타입을 대신하지 못하였다. 표면 단백질의 역할은 바이러스 복제 주기(viral replication cycle)에서 본질적이다. 특히, 헤마글루티닌은, 바이러스가 일부 세포의 표면에 존재하는 시알산(sialic acid)을 인식하도록 하고, 일부 세포들을 감염시키는 단백질이다. 대신에, 뉴라미니다아제는 바이러스 복제 주기의 말단, 즉 감염된 세포로부터 새로운 바이러스 입자를 방출하는 동안에 작동한다. 그 기능은 이들을 생산하는 세포의 표면상에 존재하는 시알산으로부터 새롭게 형성된 비리온의 헤마글루티닌의 방출을 보조하는 것이다. 이러한 2개의 단백질의 중요한 역할, 뿐만 아니라 바이러스 표면상에 이들을 디스플레이(display)하는 것은, 이러한 단백질이 면역 반응의 주요 타겟(target)을 제시하는 이유 및 이러한 단백질이 높은 비율의 돌연변이를 허용할 수 있는 이유를 설명한다. 사실은, 매년 유행병은 이전 해의 유행병과는 다소 상이한 바이러스에 의해 야기되며, 유행병이 자극한 면역 반응을 거의 효과적으로 피할 수 있다. 다시 말해, 헤마글루티닌(주로) 및 뉴라미니다아제(부수적으로)에서 점 돌연변이의 점진적인 축적(progressive accumulation)은, 전반적으로 보아 점진적으로 효과적이지 않으며, 이전의 유행병의 과정에서 생산된 보호성 항체를 만든다. 항-인플루엔자 면역 반응 내에서 주요 보호 역할은 체액 성분에 의해 작용을 한다. 항체는 주로 헤마글루티닌이 시알산에 바인딩(binding)되는 것을 방해하는 데에서 보호 역할을 발휘하며, 이에 의해 세포의 감염을 방지한다. 이러한 선택압(selective pressure)은 헤마글루티닌에서 높은 비율의 돌연변이를 결정한다. 1968년부터 1999년에 걸쳐서 H3 헤마글루티닌 서브타입상에서 수행된 서열 연구는, 총 101 아미노산 돌연변이(총 약 560 아미노산 중에서), 평균적으로 약 3.5 돌연변이/년을 나타내었다. 연구 기간 동안 발생했던 돌연변이의 60%는, 다음 해에서도 순환되는 바이러스에서 계속 유지되었고, 이는 면역-매개된(immune-mediated) 선택압의 지속성을 나타낸다. 이러한 돌연변이의 95%는 시알산과의 바인딩에 직접적으로 관련된 것인 HA1 헤마글루티닌 서브유닛에서 발견되었다. 그러나, 높은 가변성 내에서, 일부의 변하지 않은 아미노산 잔기들이 발견되었고, 이는 단백질의 기능에서 이들의 본질적인 역할을 나타낸다. 이러한 헤마글루티닌 단백질은 인플루엔자 바이러스의 다른 서브타입에 대한 교차-중화 반응(cross-neutralizing response)을 위한 잠재적인 타겟을 나타낸다. 그러나, 면역무반응 영역(immunosilent area)에 숨겨진 타겟이 바이러스의 유리한 진화 단계에서 분명히 나타나기 때문에, 이러한 영역은 대부분의 환자에서 효과적인 항체 반응을 유도할 수 없을 것이라고 예상될 수 있다. 사실은, 항-인플루엔자 면역이라고 할 때, 3가지 다른 타입의 면역이 상기에서 보고된 데이터의 관점에서 잘 이해될 수 있도록 고려되어야 한다: 호모로고스 면역(HOMOLOGOUS IMMUNITY) : 개체 분리와 관련됨. 이러한 타입의 면역은 감염 또는 백신접종 후에 항상 보여지나, 다른 분리주(isolate)에 대항해서는 매우 제한된 보호를 제공한다. 호모서브타입 면역(HOMOSUBTYPE IMMUNITY) : 동일한 서브타입에 속한 분리주와 관련됨. 이러한 타입의 면역은 감염 또는 백신접종 후에 종종 보여지나, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다아제에서 돌연변이 비율이 상당히 증가할 때 제거된다. 헤테로서브타입 면역(HETEROSUBTYPE IMMUNITY) : 다른 서브타입에 속한 분리주와 관련됨. 이러한 타입의 면역은 자연스런 감염의 경우 및 백신접종의 경우 둘 모두에서 매우 희귀하다. 전략적인 관점에서, 가장 중요한 면역이고, 이의 존재 및 자극은 모든 타입의 A 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 저항과 등가를 이룰 것이다. 몇 년 전까지, 헤테로서브타입 면역은 돌연변이가 덜된 바이러스 단백질(예를 들어, 코어를 구성하는 NP 단백질)에 직접 대항하는 세포성 면역 성분을 효과적으로 자극함으로써 달성될 수 있다고 간주되었다. 그러나, 최근의 연구는, 타입 B 림프구 성분이 제거된 쥐와 비교할 때 CD8 림프구가 제거된 쥐가 여전히 헤테로서브타입 면역을 디스플레이할 수 있다는 것을 보여주었다(문헌[Nguyen HH, J Inf. Dis. 2001, 183:368-376]). 더 최근의 연구는, 중화(neutralizing)에도 불구하고, 다른 서브타입 중에서 보호되는 에피토프(epitope)에 특이적으로 직접 대항하는, 중대한 역할의 항체를 집중 조명하는 데이터를 나타내었(문헌[Rangel-Moreno 등. The J of Immunol, 2008, 180:454-463]).
복수의 인플루엔자 바이러스 A 서브타입들과 반응할 수 있는 모노클로날 항체가 개시된다.
상기에서 보고된 데이터를 기초로 하여, 본 발명의 일 목적은, 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 대항하여 반응하는, 바람직하게 인간의 또는 인간화된(human or humanized) 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 다수의 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 활성을 중화시키는, 바람직하게 인간의 또는 인간화된 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 이런 항체는 위험군의 환자를 관리할 때 효과적인 예방 수단일 것이다. 나아가, 인간인 환자에 대해 인간의 또는 인간화된 모노클로날 항체를 사용하는 것은, 항체가 분명히 잘 견딜 때에는 추가적인 장점이 제공될 것이다. 부수적으로, 이러한 바이러스에 반응하는 인간의 항체의 성분을 구성함으로써, 상기에서 언급된 특징을 갖는 모노클로날 항체는, 현재 사용되고 있는 백신에 의해 유도되는 것과 비교할 때, 상당히 더 효과적이고, 보호성이고 넓은 범위의 면역을 유도할 수 있는 혁신적인 백신을 디자인하기 위한 중요한 인자를 나타낼 것이다. 그러나, 이런 성질을 갖는 모노클로날 항체의 달성은 매우 어렵다는 것이 어느 정도 증명되었다. 국제 특허 출원 제WO2007/134327호(2007.11.22. 출원됨)은, ELISA 분석에서, 인플루엔자 A 바이러스, 서브타입 H5의 다양한 분리주로부터 HA 항원에 바인딩(binding)할 수 있는 Fab 절편을 개시한다. 그러나, 이 특허 출원은 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 속하는 분리주를 인식할 수 있는 항체의 가능한 개시를 제공하지는 않으며, 다른 서브타입에 속하는 인플루엔자 A 바이러스에 대해 실제적인 중화 능력을 갖는 항체를 얻기 위한 가능한 방법을 개시하지 않는다. 따라서, 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스를 인식하고 중화하는 능력을 갖는 모노클로날 항체가 오랜 시간 동안에 고찰되었다는 사실에도 불구하고, 그러한 필요가 여전히 달성되지 않은 상태로 남아있다.
도 1은 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 2는 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 A/PC/1/73(H3N2)의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 3은 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 B/Lee/40의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다.
본 발명자는 놀랍게도 상기에서 언급된 원하는 특징을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 것을 성공하였다. 따라서, 본 발명의 첫 번째 대상은, 다수의 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 바인딩할 수 있음을 특징으로 하는, 인플루엔자 A 바이러스의 헤마클루티닌 항원에 직접 대항하는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 두 번째 대상은, 다수의 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 대해 중화 활성(neutralizing activity)을 가짐을 특징으로 하는, 인플루엔자 A 바이러스에 직접 대항하는 모노클로날 항체이다. 바람직하게, 이러한 중화된 모노크로날 항체는 항원으로서 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(HA)을 인식한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 바람직하게 인간의 또는 인간화된 항체이다. 본 발명에 따른 인간의 모노클로날 항체를 수득하는 것 및 이들의 바인딩 성질(binding property)은 하기의 실험예 부분에서 상세하게 개시된다. 인간화된 항체는 임의의 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조되며, 예를 들어, 문헌[Baca 등, 1997 J. Biol. Chem 272:10678-84] 또는 문헌[Carter 등, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci 89:4285]에 개시된다. 이러한 서지적인 문헌은 단지 예를 위해 제공되며 제한하는 의미는 아니다. 사실은, 인간화된 항체를 제조하기 위한 다른 방법들은 이전 기술에서 공지되었으며 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다. 다수의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입과 시험관내( in vitro ) 바인딩할 수 있는 능력을 갖는 Fab 절편의 형태에서, 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 6개 클론(INF4, INF16, INF28, INF39, INF43 및 INF47이라고 명명함)의 수득은 하기의 실험예 부분에서 상세하게 개시된다. 클론 INF28(Fab28로 명명됨)에 의해 생산된 모노클로날 항체는 본 발명의 바람직한 일 실시예를 나타내며, 이러한 항체는 다수의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에 대한 중화 활성을 디스플레이한다는 것을 발명자가 실험적으로 증명하였다. 간단히 설명하기 위해, 면역학적 성질은 본원의 하기에서 "헤테로서브타입 교차-중화 활성(heterosubtype cross-neutralizing activity)"으로서 언급될 것이다. Fab28 항체는, 아미노산 서열번호1을 갖는 중쇄 가변적인 도메인(heavy chain variable domain) 및 아미노산 서열번호2를 갖는 경쇄 가변적인 도메인(light chain variable domain)에 의해 특징 지워진다. 중쇄 가변적인 도메인을 인코딩(encoding)하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호3이고, 경쇄 가변적인 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호4이다. 특히, 실험예 부분은, Fab 절편으로서 본 발명의 모노클로날 항체의 제조를 개시한다. 그러나, 다른 항체 형태 및 이들의 제조와 사용도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 전체의 면역글로불린, 또는 다른 종류의 항체 절편(예를 들어, F(ab') 2 절편 또는 Fab보다 작은 항체 절편), 또는 본 발명의 Fab에 대해 실험적으로 증명된 바와 같은 동일한 면역학적 성질을 갖는 펩티드를 예로 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 단일 사슬의 항체는, 본원에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,946,778호(Lander 등)에 개시된 방법에 따라 구성될 수 있다. 단일 사슬의 항체는 가요성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄 가변적인 영역을 포함한다. 단일 도메인 항체로서 명명된 항체 절편은 단일 사슬의 항체보다 더 작으며, 이는 단지 하나의 분리된 VH 도메인을 포함한다. 적어도 부분적으로, 전체 항체로서 동일한 바인딩 능력을 갖는 단일 도메인 항체를 얻기 위한 방법은 이전 기술 문헌[Ward 등., "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escheria coli ", Nature 341:644-646]에 개시되어 있고, 이 문헌은 분리된 형태로 바인딩한 타겟 에피토프(target epitope)에 대해 충분한 친화력을 갖는 항체의 중쇄 가변적인 영역(VH 단일 도메인 항체)을 얻기 위한 스크리닝(screening) 방법을 개시한다. 하기의 설명에서, "항체(antibody)"라는 용어는, 전체 면역글로불린, Fab 절편 또는 다른 항체 절편 타입, 단일 사슬의 항체, 단일 도메인 항체 등을 포함하는, 상기에서 언급된 모든 실시예를 설명하는 데에 사용될 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체는 자유로운 형태(free form) 또는 캐리어-컨쥬게이트 형태(carrier-conjugated form)에서 발생되고 사용될 수 있다. 캐리어는 항체와 컨쥬게이트되고, 면역성이 되거나 면역성을 증가시킬 수 있는 임의의 분자 또는 화학적이거나 생물학적 개체(entity)이다. 캐리어의 비-제한적인 예는 단백질(예를 들어, KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), 이데스틴(edestin), 티로글로불린(thyroglobulin), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 또는 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)과 같은 알부민(albumin), 양 적혈구(sheep erythrocyte, SRBC)와 같은 적혈구, 파상풍 아나톡신(tetanus anatoxin), 콜레라 아나톡신(cholera anatoxin), 폴리아미노산(예를 들어, 폴리(D-리신:D-글루탐산)) 등이다. 상기 캐리어에 항체의 바인딩을 촉진하기 위해, 항체 C-말단 또는 N-말단은, 예를 들어 추가적인 아미노산 잔기, 예를 들어 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 하기의 실험예 부분에서 상세하게 나타낼 이들의 성질 때문에, 본 발명의 모노클로날 항체(특히, 항체 Fab28)는 의료 분야에 사용되기에 더 적당하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염의 넓은 범위의 예방 또는 치료 처치를 위한 약품의 제조에 특히 적합하다. 따라서, 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의해 야기되는 병의 예방 또는 치료 처치를 위한 약품의 제조에 대한 본 발명의 모노클로날 항체, 바람직하게는 항체 Fab28의 용도는 본 발명의 범위 내에 있다. 본 명세서에서, "Fab28 항체"라는 표현은 Fab 절편 뿐만 아니라, 항체가 예를 들어 전체의 면역글로불린, 다른 종류의 항체 절편, 단일 사슬의 항체 등으로 제조될 수 있는 임의의 다른 형태를 포함한다. 실험예 부분에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 모노클로날 항체는, 교차-반응(cross-reactive) 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 EBV-변형된 림프구로부터 시작되어 분자생물학 기술에 의해 수득되었으며, 이로 인해 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스에 속하는 본원의 하기에서 언급되는 2개의 참고 분리주(reference isolate)와 감염된 MDCK 세포 용해물(cell lysate)을 인식할 수 있다: H1N1, 균주 A/PR/8/34 및 H3N2, 균주 A/PC/1/73. 환자의 말초 혈액으로부터 변형된 B 세포주를 생성하는 데에 사용되는 특정 절차는 실험예 부분에서 개시된다. 또한, 본 발명의 Fab28 항체의 중쇄 및 경쇄 가변적인 부분을 인코딩하는 유전자를 클로닝(cloning)하는 데에 사용되는 절차는 실험예 부분에서 개시되며, 뿐만 아니라 단일 펩티드 및 Fab 절편으로서 재조합적으로 이들을 제조하는 절차도 개시된다. 다른 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에 감염된 세포 용해물과 반응하는 본 발명의 모노클로날 항체의 능력은 ELISA 및 면역형광염색법에 의해 증명되었다. 또한, 중화 분석(neutralizing assay)은 항체의 시험관내 생물학적 활성을 증명하기 위해 수행되었다. 이 분석에서, Fab28 항체는 상기에서 지적한 바와 같이 참고 타입 A 바이러스 분리주에 대해 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 보여주었다. 수득된 데이터는 본 발명의 항체, 특히 항체 Fab28이 투여된 피검자들에게 인플루엔자 A 바이러스에 대해 수동적인 면역을 주는 데에 있어서 상당히 효과적임을 나타내었으며, 이로 인해 인플루엔자 A 바이러스 감염의 넓은 범위의 예방 또는 치료 처치, 또는 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 야기되는 병에서 특히 유용하다는 것을 나타내었다. 이러한 병의 일 예는 인플루엔자 증상이다. 또한, Fab28이 바인딩된 헤마글루티닌 형태의 에피토프의 식별이 실험예 부분에서 개시된다. 이러한 형태의 에피토프는 헤마글루티닌 HA1 영역 및 HA2 영역 사이에 놓이고, HA2 영역 상에 W357 및 T358 잔기를 포함하고, HA1 영역 상에 N336, I337 및 P338 잔기를 포함한다. 잔기들의 번호는 데이터베이스 BLAST에서 H1N1/A/PR/8/34 분리주로부터의 헤마글루티 서열(서열번호5)을 기초로 한다. 따라서, 본 발명의 추가적인 대상은 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이다. 유효량은, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키거나 바이러스 복제를 방해하기 위해 상기 조성물이 투여되는 피검자에게 유리한 효과를 유도할 수 있는 양이다. 이 명세서에서, "피검자(subject)"라는 용어는, 인간을 포함하고, 조성물이 투여될 수 있는 임의의 동물 세포주(animal host)를 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물에 대해 유용한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 제한이 없는 예는, 안정화제(예를 들어, SPGA), 카보하이드레이트(carbohydrate)(예를 들어, 소르비톨(sorbitol), 마니톨(mannitol), 녹말(starch), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 덱스트란(dextran)), 단백질(예를 들어, 알부민 또는 카세인(casein)), 단백질 함유 제제(예를 들어, 소 혈청(bovine serum) 또는 탈지 우유(skimmed milk)), 및 완충제(예를 들어, 포스페이트(phosphate) 완충제)이다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 이전에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플(예를 들어, 혈청, 혈장(plasma), 혈액 샘플 또는 임의의 다른 적당한 생물학적 물질)에서 동일하거나 또는 유사한 중화 성질을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체의 검출을 위한 시험관내 방법에서 진단상의 시약으로서 유리하게 사용될 수도 있다. "동일하거나 또는 유사한 중화 성질을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체"는 인플루엔자 A 바이러스에 비해 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 디스플레이하는 항체이다. 이러한 항체는 이전에 인플루엔자 A 바이러스에 노출된 결과로서, 또는 치료 또는 예방 또는 재조사 목적을 위해 본 발명의 모노클로날 항체가 이전에 환자에게 투여되었기 때문에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 발견될 수 있다. 환자의 생물학적 샘플에서, 상기 생물학적 샘플을 본 발명의 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체의 존재를 검출하기 위한 분석 방법은 본 발명의 범위에 포함된다. 분석은 정성적이거나 정량적일 수 있다. 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체의 검출 또는 정량화는, 예를 들어 경쟁적 ELISA 분석에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 특정 시약으로서 본 발명에 따른 모노클로날 항체를 포함하는 진단상의 키트는 본 발명의 범위 내에 있으며, 환자로부터 유래된 생물학적 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스에 대해 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체의 검출 또는 정량화를 위해 특히 디자인되었다. 유사하게, 본 발명의 모노클로날 항체(특히, 항체 Fab28)는, 이전에 제조된 면역 또는 백신 조성물에서 검출 또는 정량화를 위한 분석 방법에서 특정 시약으로서 사용될 수 있으며, 상기 조성물이 투여되는 피검자에서 본 발명의 모노클로날 항체의 중화 성질과 동일하거나 유사한 중화 성질, 즉 인플루엔자 A 바이러스에 대해 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 갖는 항-인플루엔자 A 바이러스 항체를 유발할 수 있는 에피토프로서 사용될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체에 의한 인식은, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스에 대항하여 헤테로서브타입 면역을 끌어낼 수 있는 에피토프인, 유리한 에피토프를 인식할 수 있는 항체 클론의 생산을 자극할 수 있는 하나 이상의 에피토프 중, 면역성 제제 및/또는 백신에 존재한다고 나타날 수 있기 때문에, 이러한 방법은 백신 또는 면역성 제제로서 사용되는 임의의 제제를 평가하는 데에 유용하다고 예상된다. 결국, 본 발명의 모노클로날 항체는 그 자체가 공지된 방법에 따라 항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody)를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 항-이디오타입 항체는, 이들을 제조하는 데에 사용되는 넓은-범위의 중화 항체의 이디오타입에 대해 특히 직접적으로 관련된 항체이며, 이는 항체가 인식하는 주요 에피토프를 모방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체에 직접 대항하는 항-이디오타입 항체는 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 하기의 실험예 부분은 예시의 수단으로서만 제공되며, 첨부된 청구항에서 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 의미는 아니다. 청구항은 상세한 설명과 일체로 이루어진다.
실험예 부분
1. 환자의 선택 본 연구에 등록된 환자는, 교차-반응 항-인플루엔자 항체, 즉 다른 서브타입에 속하는 인플루엔자 바이러스 분리주를 인식할 수 있고 잠재적으로 중화시킬 수 있는 항체를 클로닝하는 기회를 증가시키기 위해 선택되었다. 특히, 인플루엔자 바이러스에의 계속적인 노출에도 불구하고, 일부 개체(내과 의사, 소아과 의사, 유치원 및 학교에서 근무하는 사람들과 같이, 종종 전문적인 이유 때문임)는 질병에 걸리지 않았다는 것이 개시된다. 여전히 공지되지 않은 이유인 효과적인 헤테로서브타입 면역의 발달 때문에, 이러한 희귀한 개체는 인플루엔자 바이러스 감염에 덜 민감하다고 간주되었다. 이러한 이유 때문에, 상기 개체는 인간의 모노클로날 항체의 발생에 대해 최상의 후보로 간주되었다. 특히, 하기의 포함 기준(inclusion criteria)이 준수되어야 하였다: - 25세 및 55세 사이; - 연구 이전의 10년 동안에, 최근의 병리학적 의료 기록, 임상적인 인플루엔자 증상에 대한 음성 판정; - 연구 이전의 5년 동안에 매년 유행병을 발생시키는, 바이러스 분리주, 서브타입 H1N1 및 H3N2에 대항하여 1:1000 이상의 항체 타이터(antibody titer); - 연구 이전의 5년 동안에 매년 유행병을 발생시키는, 바이러스 분리주, 서브타입 H1N1 및 H3N2에 대항하여 높은 중화 타이터(IC50 >= 1:400); - 2개의 참고 서브타입 A 바이러스 분리주(A/PR/8/34 서브타입 H1N1; A/PC/1/73 서브타입 H3N2)에 대항하여 검출가능한 중화 타이터(IC50 >= 1:20); - 이전의 항-인플루엔자 백신이 없음; - 항-인플루엔자 백신을 받아들임.
백신에서, 약 3주 이후의 백신, 약 20 ml의 혈액은 헤파린이 첨가된 테스트 튜브(heparinized test-tube)로 각각의 환자로부터 뽑아내었다.
2. 참고 바이러스 분리주의 배양 변형된 이글 매질(Modified Eagle Medium, MEM)(GIBCO)에서 증식되고, 10% 비활성화된 태아의 소 혈청(FBS)(56℃에서 30분 동안 처리됨)(EuroClone), 50 ㎍/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO) 및 2 mM L-글루타민(EuroClone)으로 보충된 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포(ATCC® 번호 CCL-34TM)를 세포주로서 사용하였다. 세포를 37℃에서 5% CO 2 분위기 하에서 배양하였고, 일주일에 2번 1:3 비율로 통과시켰다. 본 특허 출원에서 개시된 실험에 대해, 하기의 인플루엔자 바이러스 분리주를 사용하였다: H1N1, 균주 A/PR/8/34(ATCC® 번호 VR-1469TM); H3N2, 균주 A/PC/1/73(ATCC® 번호 VR-810), 및 균주 B/Lee/40(ATCC® 번호 VR-101). 바이러스를 성장시키기는 배지(culture medium)로서, 1 ㎍/ml 무혈청(serum-free) 트립신(SIGMA)으로 보충된 MEM을 사용하였다. 바이러스 스탁(virus stock)은 세포외 바이러스로서 배양 상층액(culture supernatant)으로부터 수득되었다. 요컨대, 세포를 감염시킨 후에, 세포용해 효과가 나타나는 것을 매일 모니터링한 결과 단일층이 관찰되었다. 일반적으로, 감염된 지 4일 후에, 상층액을 수집하였고, 세포 잔해를 제거하기 위해 10분 동안 1000 RCF(relative centrifugal force, 상대원심력)에서 원심분리하였고, 0.22 ㎛ 필터(MILLIPORE)로 여과시켰다. 그런 다음, 상층액을 정제하였고 무세포(cell-free) 바이러스로서 -80℃에서 저장하였다.
3. 말초 혈액 B 림프구로부터 모노클로날 항-인플루엔자 바이러스 항체의 선택 환자로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것은, 문헌[Cole 등, 1984 Cancer Research 22:2750-2753]에 의해 이전에 개시된 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)를 갖는 B 림프구의 감염을 통한 변형 방법을 사용함으로써 수행하였다. 수득된 다른 클론으로부터 얻은 상층액을 ELISA에 의한 항체의 존재에 대해 평가하였다. 2개의 참고 분리주인 서브타입 H1N1 및 H3N2로 감염된 세포 용해물에 대항하여 ELISA에서 반응할 수 있는 상층액에서 IgG 항체를 생산할 수 있는 클론은, 이후의 특징화를 위해 선택되었다. 특히, MDCK 세포는 많은 다수의 감염에서 상기에서 언급된 분리주로 감염되었다. 약 48 시간 감염 후에, 세포를 플라스크로부터 분리하였고, PBS에서 2번 세척하였다. 그런 다음, 세포 펠릿(cell pellet)을 300 ㎕의 세포용해 용액(100 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8 및 0.5% Triton-X)에서 부유하였고, 20분 동안 냉동으로 저장하였다. 세포 잔해를 5분 동안 10000g 원심분리하였고, 상층액을 단백질 추출물(protein extract)로서 -20℃에서 저장하였다. 조절 항원(control antigen)의 제제에 대해서, 비-감염된 세포를 동일한 방식으로 처리하였다. 상층액 단백질 농도를 BCA TM Protein Assay Kit(Pierce)를 사용하여 2번 측정하였다. 요컨대, 단백질 샘플의 투여량은 소 혈청 알부민(BSA)의 일련의 공지된 농도 희석에 의해 수득된 표준 곡선(standard curve)에 의해 결정되었다. 모든 샘플의 흡광도를 540 nm의 파장에서 분광광도계로 측정하였다. 수득된 용해물을, 4℃에서 밤새도록 배양된 ELISA 플레이트(COSTAR)를 코팅하는 데에 사용하였다(300 ng/웰(well)). 다음 날, 플레이트를 증류수로 세척하고, 37℃에서 45분 동안 PBS/1% BSA(Sigma)로 블록(block)하였다. 이때, 각각의 클론으로부터 얻은 40 ㎕의 상층액을 37℃에서 1시간 동안 배양된 각각의 웰(well)에 첨가하였다. PBS/0.5% Tween-20(Sigma)로 5회 세척(WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin)한 후에, 40 ㎕의 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된(peroxidase-conjugated) 항-인간 Fc(PBS/1% BSA에서 1:4000임, Sigma)를 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS/0.5% Tween-20으로 5회 이상 세척한 후에, 40 ㎕의 TMB 퍼옥시다아제 기질(Pierce)을 각각의 웰에 첨가하였다. 약 15분 후에, 효소의 활성이 40 ㎕의 H 2 SO 4 를 첨가함으로써 블록되었고, 신호를 450 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 교차-반응 항체를 생산할 수 있는, 즉 서브타입 H1N1에 속하는 균주로 감염된 세포 용해물 및 서브타입 H3N2에 속하는 균주로 감염된 세포 용해물 둘 모두를 인식할 수 있는 6개의 추정 클론(각각 cINF4, cINF16, cINF28, cINF39, cINF43 및 cINF47로 명명됨)의 상층액에 대해 상당한 주의가 요구된다.
4. 교차-반응 클론으로부터 Fab 절편의 제조 인플루엔자 바이러스와 반응할 수 있는 1가의 Fab 사슬을 인코딩하는 유전자는 원핵 발현 벡터(prokaryotic expression vector)로 클로닝되었다. 이는, 각각의 개체의 항체의 양을 증가시킬 뿐만 아니라 처분 가능한 모노클로날인 분자를 갖기 위해, 분자 관점에서 볼 때 인코딩 유전자를 더 특성화하는 항체-생성 세포 클론의 불안정성 때문에 문제점을 피할 수 있게 한다. 전령 RNA(mRNA)는 배양된 클론으로부터 추출되었고, 그 자체로 공지된 방법에 따라 올리고-dT(oligo-dT)를 사용하여 역 전사되었다. 경쇄 및 Fd 절편(즉, 중쇄 부분은 Fab 절편 내에 존재함)을 인코딩하는 cDNA는 설명된 방법(문헌[CSH press, Phage display manual, ed. DRBurton, p. A1.6])에 의해 증폭되었다. 수득된 cDNA는 그 자체로 공지된 발현 벡터(pCb3/CAF)(문헌[Burioni 등, J. Imm. Meth, 1988])로 클로닝되었다. 요컨대, 각각의 Fab의 중쇄 Fd 부분을 인코딩하는 유전자(증폭된 DNA)는 37℃에서 1.5시간 동안 제한 효소 XhoI 및 SpeI(Roche)로 인해 분해되었고, 이후에 중쇄에 대한 벡터의 클로닝 부위로 삽입되었으며, 결국 동일한 효소로 인해 분해되었다. 대신에, 경쇄(증폭된 DNA)는 효소 SacI 및 XbaI(Roche)로 인해 분해되었고, 유사하게 분해된 벡터로 클로닝되었다. 각각의 클론에 대해 수득된 재조합 구조물(recombinant construct)은, 0.2 cm의 큐벳(cuvette)을 사용한 표준화된 프로토콜(standardized protocol)(전압: 2500 V; 정전용량: 25 ㎌; 저항: 200 Ω)에 따라, 대장균( E. Coli ) 균주 XL1Blue(글리세롤에서 차가운 세척(cold washing)에 의해 경쟁적으로 만들어짐)를 전자-변형(electron-transform)시키는 데에 사용되었다. 이와 동시에, 선택적인 클론의 경쇄 가변적인 부분 및 중쇄 가변적인 부분의 DNA 서열이 분석되었다. 서열은 서열 목록으로 제공된다. 돌연변이 패턴의 분자 분석은 각각의 클론에 대해 항원-유도된 체세포 돌연변이 과정에 기인한 사진으로 도시하였다.
5. PCb3 / CAF 로 클로님함으로써 수득된 모노클로날 Fab 의 ELISA 평가 클로닝을 완료한 결과, 각각의 모노클로날 항체에 대해 40개의 재조합 박테리아 클론이, 열 충격(heat shock)에 의해 수득된 박테리아 배양물로부터 얻는 가공되지 않은 용해물을 사용하여 ELISA에 의해 분석되었다. 특히, 구조물 PCb3/CAF로 변형된 박테리아의 클론은, 각각 50 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml인 암피실린(ampicillin) 및 테트라시클린(tetracycline)을 함유하는 10 ml의 SB 매질로 접종되었고, OD600 = 1에 도달할 때까지 37℃에서 교반 하에서(under shaking) 성장되었다. 이후에, 특정 유도물질(IPTG - 이소프로필β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG - isopropylβ-D-thiogalactopyranoside))이 1 mM의 최종 농도로 첨가되었고, 배양액은 30℃에서 밤새도록 교반하여 남겨두었다. 세포는 열 충격(각각 -80℃ 및 37℃에서, 3회 냉동/해동)에 의해 용해되었고, Fab-함유 상층액으로부터 세포 잔해를 분리하기 위해 원심분리되었다. 용해될 수 있는 수득된 Fab는 ELISA에 의해 분석되었다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-Well microtiter plate)(Nunc)는, 상기에서 언급된 참고 바이러스 분리주로 감염된 세포로부터의 용해물로 코팅되었다. 감염되지 않은 세로로부터 얻는 용해물을 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다. 설명된 바와 같이 수득된 300 ng의 용해물로 코팅된 ELISA 플레이트는 4℃에서 밤새도록 남겨두었다. 다음 날, 바인딩되지 않은 항원을 제거한 후에, 플레이트를 PBS로 5회 세척하였고, 비특이적인 결합 부위(unspecific binding site)는 37℃에서 1시간 동안 PBS에서 3% 알부민으로 블록되었다. 블록킹 용액(blocking solution)을 제거한 후에, 상기에서 설명된 바와 같이 처리된 세포 배양액의 상층액 및 용해될 수 있는 Fab를 함유하는 상층액을 첨가하였고, 그런 다음 37℃에서 2시간 동안 배양 단계를 거쳤다. PBS/0.05% Tween 20으로 10회 세척한 후에, PBS/1% BSA에서 래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 염소(radish peroxidase-conjugated goat) 항-인간 Fab 면역글로불린(Sigma)의 폴리클로날 제제의 1:700 희석액의 40 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 배양하고 추가적으로 10회 세척한 후에, 기질(OPD-o-페닐렌디아민)을 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 암실에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 반응을 1N 황산으로 퀀칭(quenching)하였고, 광학 밀도를 450 nm에서 분광광도계 판독으로 평가하였다. 분석된 모든 클론들은 감염된 세포로부터 수득된 용해물에 대해 반응성을 나타내었다. 1개의 박테리아 클론은 인간 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자 쌍을 함유하는 발현 벡터로 변형되었고, 따라서 중쇄 Fd 절편은 각각의 교차-반응 모노클로날에 대해 선택되었다. 이러한 박테리아 클론은 분리주 A/PR/8/34(H1N1) 및 분리주 A/PC/1/73(H3N2) 둘 모두를 바인딩할 수 있는 인간 Fab를 생성할 수 있다. 이러한 클론(상대적인 유전자 쌍을 가짐)은 INF4, INF16, INF28, INF39, INF43 및 INF47로 명명되었다.
6. Fab 의 정제 상기에서 열거된 교차-반응 클론으로부터 생성된 Fab(여기에서는 중립적으로 "클론" 또는 "Fab"라고 함)는, 개시된 발현 벡터로 변형된 박테리아에 걸쳐서 생성되었고, 이때 면역친화성은, 인간의 Fab(PIERCE, 일리노이주)와 바인딩할 수 있는 염소 항체의 폴리클로날 제조에 대해 공유적으로 연결된, 단백질 G(~ 2 mg/ml)를 함유하는 세파로오스 수지(sepharose resin)로 구성된 컬럼(column)으로 정제되었다. 요컨대, 각각의 클론의 단일 콜로니(colony)는, 각각 50 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml인 암피실린 및 테트라시클린을 함유하는 10 ml의 SB 매질로 접종되었다. 37℃에서 밤새도록 성장된 배양액은, 이전과 같이 동일한 농도의 항생물질과 함께 첨가된 500 ml의 SB를 갖는 플라스크에서 서브-접종(sub-inoculate)되었다. 이후에 1 mM IPTG에 의해 유도된 세포는 30℃에서 밤새도록 교반하여 남겨두었다. 배양액을 25분 동안 5000 rpm에서 원심분리하였고, PBS에서 재부유된(resuspended) 펠릿을 초음파 처리하였다. 세포 잔해를 제거하기 위해, 25분 동안 18,000 rpm에서 추가적인 원심분리가 필요하다. 상층액을 여과하였고, 그런 다음 상기에서 설명된 세파로오스 컬럼으로 천천히 통과시켰다. 이후에, 수지를 10 PBS 부피로 세척하였고, 최종적으로 바인딩된 Fab가 산성 용액(용리 완충액 - H 2 O/HCl pH 2.2)으로 인해 용리되었다. 수집된 다양한 부분이 적당한 용액(1M Tris pH 9)으로 중화되었고 한외여과(ultrafiltration)(Centricon, Millipore)에 의해 농축되었다. 12%의 폴리아크릴아미드/소듐 도데실 설페이트 겔(polyacrylamide/sodium dodecyl sulfate gel)(SDS-PAGE) 상에서 1개의 부분 표본을 시험함으로써 정제된 Fab의 순도를 평가하였다. 결국, 정제된 Fab의 순차적인 희석은 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 분석되었다. 각각의 플레이트에서, HCV E2 당단백질(glycoprotein)에 직접 대항하는 모노클로날 Fab의 제제는 음성 대조군으로 포함되었다. 이 실험의 결과는 박테리아 용해물로 이전에 수득된 결과를 확신하게 하였다.
7. PCb3 / CAF 로 클로님함으로써 수득된 모노클로날 Fab 의 면역 형광 염색법 평가 ELISA에 의해 수득된 데이터를 확실하게 하기 위해, 교차-반응 항-인플루엔자 Fab를 면역 형광 염색법 분석에 의해 분석하였다. 요약하면, 감염된 배양액으로부터 얻은 세포는 트립신으로 처리되었고, PBS에서 2회의 세척 후에, 혈구계산기(hematocytometer)로 현미경 하에서 계산되었다. 세포 현탁액(cell suspension)은 3분 동안 90g으로 세포원심분리기(Cytospin4, Shandon Southern Products)에서 원심분리함으로써 슬라이드를 제조하는 데에 사용되었다. 제조된 슬라이드 각각은 총 2×10 5 세포를 함유하였다. 대조군 슬라이드는 감염되지 않은 세포로 유사하게 제조되었다. 그런 다음, 세포는 고정되었고, 실온에서 10분 동안 메탄올-아세톤 용액(-20℃ 온도에서 사용됨)으로 투과되었다. PBS에서 3회 세척한 후에, 세포는 습한 챔버(humid chamber)에서 37℃에서 30분 동안 다른 클론(100 ㎍/ml)으로 배양되었고, 이후에 PBS에서 3회 세척되었다. 그런 다음, 세포는, 에반스 블루(Evans Blue)에서 1:200으로 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트-컨쥬게이트된 염소 Fab(fluoresceine isothiocyanate-conjugated goat Fab)와 함께 형광 암실에서 습한 챔버에서 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 슬라이드는 형광 현미경(Olympus) 하에서 검사되었다. M1 인플루엔자 바이러스 단백질에 특이적인 상업적인 쥐의 모노클로날(Argene)은 양성 대조군(positive control)으로 사용되었다. C형 간염 바이러스의 E2 당단백질에 직접 대항하는 항체(문헌[e509; Burioni 등, Hepatology, 1998])는 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 재조합 Fab는, 면역 형광 염색법에 의해, 균주 A/PR/8/34(H1N1)로 감염된 세포 및 균주 A/PC/1/73(H3N2)으로 감염된 세포 둘 모두에 특이적인 반응성을 나타내었다. 대신에, 감염되지 않은 세포, B 타입 균수-감염된 세포 또는 음성 대조군 항체로 감염된 세포에서는 형광성이 나타나지 않았다.
8. 중화 분석 선택된 클론의 시험관내 생물학적 활성을 특성화하기 위해, 본 연구에 사용된 3개의 참고 바이러스 분리주에 대해 중화 분석이 디자인되었다. 요컨대, MDCK 세포는 96-웰 플레이트(2×10 4 세포/웰)에서 MEM-10% FBS로 성장되었다. 상기에서 설명된 바와 같이 수득된, 바이러스 스탁(virus stock)의 순차적인 희석액(10 -1 내지 10 -8 )은 유지 매질(maintenance medium)(2% FBS를 갖는 MEM)에서 제조되었다. 각각의 희석은 6회 반복되었다. 배양된 세포가 융합된 경우에, 성장 매질이 제거되고 각각의 바이러스 희석액 100 ㎕가 각각의 웰에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 후에, 접종물은 제거되었고 1 ㎍/ml 트립신과 함께 첨가된 200 ㎕의 MEM 매질이 각각의 웰에 놓여졌다. (세포 배양액의 50%를 감염시키는 양)으로 표현되는 바이러스 타이터(viral titer)는 Reed-Muench's 식을 적용함으로써 계산되었다:
수득된 데이터를 살펴보면, 중화 실험에서 약 0.01(1 바이러스 입자/100 세포)의 다수의 감염(MOI)을 사용하기 위해 바이러스 스탁이 희석되었다. 실제적인 중화 분석에서, MDCK 세포는 살균된 슬라이드를 함유하는 각각의 웰과 함께, 24-웰 플레이트에서 성장되었다. 중화 실험은 80% 내지 90%의 융합 세포 상에서, 즉 이들을 성장시킨 후 약 48 시간에서 수행되었다. 각각의 항체에 대해 최종 농도가 2.5 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml이 되도록, 정제된 Fab 절편을 희석하였다. e509 항-HCV 항체에 대응되는 희석액을 음성 대조군으로 준비하였다. 다양한 Fab 농도는 37℃에서 1시간 동안 동일한 부피의 희석된 바이러스 스탁(MOI:0.01)으로 배양되었다. 250 ㎕의 바이러스-Fab 혼합물은 세포를 함유하는 웰에 이후에 첨가되었다. 감염에 대한 양성 대조군은 바이러스 스탁에 배지만을 첨가함으로써 달성되었다. 중화되지 않은 바이러스가 흡착되기 위해, 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 접종물이 제거되었고, 세포는 PBS로 2회 세척되었다. 1 ㎍/ml의 트립신을 갖는 1.5 ml의 무혈청 매질이 각각의 웰에 첨가되었다. 37℃에서 6시간 배양 후에, 세포 단일층은 PBS로 세척되었고, 실온에서 10분 동안 차가운 메탄올-아세톤 용액(1:2 비율, -20℃에서 저장됨)으로 고정되었다. 고정된 세포는 세척되었고, 습한 챔버에서 37℃에서 30분 동안 250 ㎕의 상업적인 모노클로날 항-M1 항체(Argene)로 배양되었다. 세포는 PBS로 세척되었고, 결국, 암실에서 습한 챔버에서 37℃에서 30분 동안 에반스 블루(Evans Blue)에서 희석된, 플루오레세인-컨쥬게이트된 염소 항-쥐 항체(fluoresceine-conjugated goat anti-mouse antibody)로 배양되었다. PBS에서 3회 세척한 후에, 결국 슬라이드는 형광 현미경 하에서 검사되었다. 바이러스만으로 감염된 양성 대조군과 비교할 때, Fab의 중화 활성은 단일의 양성 세포를 계산하고 감염된 세포의 수에서 백분율 감소(percentage decrease)를 계산함으로써 결정되었다. 중화 분석은 각각의 Fab에 대해 3개의 분리된 시간에서 수행되었다. 특히, 각각의 클론은, 이전에 언급된 2개의 다른 참고 타입 A 인플루엔자 균주 및 참고 타입 B 균주에 대항하여 분석되었다. 각각의 실험에서, 다른 Fab 희석이 3회 반복되었고, 유사하게 감염의 음성 대조군(Fab e509 항-E2/HCV) 및 양성 대조군(Fab가 없는 바이러스 및 매질)에 대해 수행되었다. 6개의 분석된 교차-반응 Fab 중에서, 클론 INF28에 의해 생성된 Fab는 타입 A 바이러스 분리주에 대항하여 헤테로타입 교차-중화 활성을 나타내었다. 대신에, 본 연구에서 사용된 타입 B 바이러스의 감염 능력에 관하여는 아무런 환원도 검출되지 않아서, 관찰된 중화 활성의 특이성을 확신하였다. 특히, 클론 INF28(Fab 28이라고 칭함)에 의해 생성된 Fab는, 서브타입 H1N1의 경우에 5 ㎍/ml 이하 및 서브타입 H3N2의 경우에 약 10 ㎍/ml의 IC 50 (분석된 바이러스 분리주에 의해 50%의 감염을 억제하는 Fab 농도)을 나타내었으며, 이는 Fab가 본 발명의 범위 내에 포함되는 가능한 약학적 제형 중 하나인 전체 면역글로불린 형태로 변환될 때 일반적으로 관찰된 중화 생물학적 활성에서 상당한 증가를 설명하지 못하는 당해 분자의 생체내 투여에 의해 쉽게 수득될 수 있는 농도이다. 도 1 내지 도 3은, 본 연구에서 사용된 다양한 인플루엔자 바이러스 분리주 상에서 수행된 다른 중화 시간에서, 클론 INF28에 의해 생성된, Fab 28로 수득된 결과를 요약한다. 특히, 도 1은 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다. 인간의 e509 항-HCV Fab로 수득된 결과는 음성 대조군으로 보고되었다. 도 2는 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 A/PC/1/73(H3N2)의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다. 인간의 e509 항-HCV Fab로 수득된 결과는 음성 대조군으로 보고되었다. 도 3은 다른 Fab 28 농도에 의한 바이러스 B/Lee/40의 중화 백분율을 도시하는 그래프이다. 인간의 e509 항-HCV Fab로 수득된 결과는 음성 대조군으로 보고되었다.
9. Fab 28에 의해 인식된 항원의 특성화 : 감염된 세포로부터 얻는 용해물 상에서의 웨스턴 블랏( Western blot ) 이전에 설명된 바와 같이 제조된, 균주 A/PR/8/34(H1N1)으로 감염된 10 ㎍의 세포 용해물이 10% 폴리아크릴아미드 겔 상의 자연 조건하에서 시험되었다. 이러한 목적을 위해, 샘플은 적당한 냉동 탱크(BIORAD)에서 1시간 동안 100V에서 시험되었다. 이후에, 겔은 전기영동 장치로부터 제거되었고 이동 완충액(transfer buffer)(트리스 염기(Tris base) 3g; 글리신 14.41g, dH 2 O 800 ml, 메탄올 200 ml)에서 10분 동안 배양되어, 임의의 세척 잔류물이 제거되었다. 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond-ECL; Amersham Biosciences)으로의 이동은 30V 및 90mA에서 밤새도록 수행되었다. 멤브레인은 1X PBS에서 용해된 5%의 분유(dried milk)로 1시간 동안 블록되었고, 이후에 1X PBS - 0.1% Tween에서 3회 세척되었다. 각각의 세척 동안에, 멤브레인은 10분 동안 진동하는 플랫폼(swinging platform) 상에서 교반하여 남겨두었다. 이후에, 5% 분유로 PBS에서 희석된 다른 Fab는 5 ㎍/ml의 농도로 첨가되었다. Fab 28 이외에도, 하기의 대조군들이 첨가되었다: 음성 대조군으로서 e509; 상업용 쥐의 항-HA 전체 IgG1(COVANCE); 상업용 쥐의 항-M1 전체 IgG1(ARGENE); 쥐의 항-M2 전체 IgG1(ABCAM); 1:200으로 희석된 인간의 혈청. 각각의 항체는 실온에서 1시간 동안 교반하여 남겨두었다. 이후에, 이전에 설명한 바와 같이, 멤브레인을 PBS에서 다시 세척하였다. 검출된 항체의 소스에 따라, ELISA 분석에 대해 설명한 바와 같이 동일한 2차 쥐(1:1000) 또는 인간(1:2000) 항체가 첨가되었다. 신호의 검출을 위해, 작업 용액이 2개의 기질(SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce)을 1:1 비율로 혼합함으로써 제조되었고, 특히 광원에 노출되지 않도록 주의하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 작업 용액으로 5분 동안 배양되었고, 그런 다음 제거되었고 HyperCassette(AMERSHAM)에 장착되었다. 이는, 필요한 노출 시간 후에 암실에서 코닥 X-선 필름 상에서 현상되었다. 설명된 분석은 2개의 다른 시간에서 수행되었고, 이들 각각에서 Fab 28로 배양된 멤브레인 부분은 바이러스 헤마글루티닌의 미성숙한 형태(HA0)의 중량과 일치하는, 약 80 KDa 이하의 중량을 갖는 밴드(band)를 나타내었다. 이는, 항-헤마글루티닌 조절 항체로 배양된 스트립(strip) 상에서 디스플레이된 동일한 밴드에 의해 확신하게 되었다. 다른 것들보다 더 강한 유사한 밴드가 또한 인간의 혈청으로 배양된 멤브레인 부분에서 검출되었다. 헤마글루티닌이 면역 중화 항체 반응의 타겟으로 공지되었기 때문에, 이 실험의 결과는 항체가 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 직접 대항한다, 바람직하게는 중화 데이터와 일치한다는 것을 나타낸다.
10. 플라크 환원 분석( plaque reduction assay )에 의한 중화 분석 Fab 28의 중화 활성을 더 정확하게 평가하기 위해, 중화 분석은 플라크 분석 기술을 사용함으로써 수행되었다. 먼저, 서브타입 H1N1 및 H3N2인 바이러스 분리주의 제제는 하기의 프로토콜을 갖는 플라크 분석에 의해 정량화되었다. MDCK 세포는 페니실린 및 스트렙토마이신(pen/strep)으로 보충되고, 10%의 태아의 소 혈청(FBS)로 강화된 MEM 매질에서 6개의-웰 플레이트(Costar)에서 배양되었다. 세포 단일층이 100% 융합에 도달한 후에, 웰은 PBS로 세척되었고, 동일한 항생물질(pen/strep) 및 트립신(1 ㎍/ml)로 보충된 신선한 MEM 배지가 첨가되었다. 바이러스 스탁은 동일한 웰에서 순차적으로 희석되었으며, 바이러스는 5% CO 2 분위기 하에서 34℃에서 1시간 동안 흡착되도록 남겨졌다. 그런 다음, 매질은 흡입되었고 PBS로 2회 세척되었다. 항생물질, 트립신(1 ㎍/ml) 및 0.8% 아가로스(agarose)로 더 보충된 MEM은 42℃를 넘지 않은 온도에서 천천히 첨가되었다. 감염 후에, 건강한 상태의 세포 단일층이 위상차 현미경(phase contrast light microscope) 하에서 검사되었고, 플레이트는 5% CO 2 분위기 하에서 34℃에서 배양되었다. 감염 후 48시간에, 세포 단일층이 손상되지 않도록 매우 조심스럽게 아가로스 층을 제거하였다. 이후에, 크리스털 바이올렛(crystal violet)(1% w/v)과 함께 첨가된 물 중의 70% 메탄올이 웰에 첨가되었다. 플레이트는 5분 동안 실온에서 투과제/염료(permeabilizer/dye)로 배양되었다. 배양 후에, 플레이트는 실온에서 증류수로 세척되었고, 5분 동안 층류 흐름(laminar flow) 하에서 건조된 채로 남겨졌다. 결국, PFU(플라크 형성 단위) 수는 4X 크기에서 위상차 현미경하에서 평가되었다. 바이러스 타이터가 PFU로서 계산된 경우에, 대응되는 TCID50이 계산되었고, 동일한 타이터가 종점 한계 희석법(end-point limiting-dilution technique)에 의해 유사한 바이러스 스탁의 타이터와 비교되었다. 상기 적정은 Fab 28의 활성을 상세하게 평가하기 위해 바이러스를 정량화하였다. 일부 플레이트는 플라크 분석에 의한 적정을 위해 상기에서-언급된 절차와 유사하게 설정되었다. 따라서, 중화 혼합물이, 바이러스(100 TCID50/웰) 및 사용된 Fab(Fab 28 및 대조군 Fab)의 다른 농도를 포함하도록 제조되었다. 특히, 다양한 인플루엔자 바이러스 균주의 100 TCID 50 에 대항한 다른 농도의 Fab(20, 10, 5 및 2.5 ㎍/ml)를 테스트함으로써 분석되었다. 바이러스/Fab 혼합물은 5% CO 2 분위기 하에서 34℃에서 1시간 동안 배양되었다. PBS로 MDCK 세포는 세척된 후에, 100% 융합 세포 단일층을 갖는 웰에 미리-배양된 제제가 이동되었고, 그런 다음 5% CO 2 분위기 하에서 34℃에서 1시간 동안 배양되었다. 분석을 하였고, Fab 28의 존재에서 수득된 플라크의 수를 대조군 Fab의 동일한 농도의 존재에서 수득된 수와 비교함으로써, 이전에 설명된 바와 같이 해석하였다. 서브타입 H1N1 및 H3N2에 속하는 하기의 인플루엔자 분리주를 사용하여 분석하였다: H1N1: A/Malaya/302/54 A/PR/8/34 H3N2: A/Aichi/68 A/Victoria/3/75 A/Port Chalmers/1/73
그 결과 인플루엔자 바이러스 H1N1 A/Malaya/302/54 및 A/PR/8/34에 대해 Fab 28의 중화 활성을 확신하였고, 2.5 ㎍/ml 이하의 IC 50 값으로도 확신하였다. 헤테로서브타입 중화 활성은 인플루엔자 바이러스 H3N2 A/Aichi/68, A/Victoria/3/75 및 A/Port Chalmers/1/73(IC 50 은 약 20 ㎍/ml임)에 대항하여 확신하였다.
11. Fab 28에 의해 인식된 에피토프의 식별 일부 접근법은, 형태가 이전의 실험에 의해 이미 나타내졌다고 하더라도 에피토프를 인식하는 능력인, Fab 28에 의해 인식된 헤마글루티닌 영역을 식별하도록 한다. 게다가, Fab 28은, 반-자연 상태의 조건(0.1% SDS) 하에서 수행된 웨스턴 블랏 분석만으로 단백질을 인식할 수 있는 결과를 초래한다. 또한, 동일한 실험이 단백질의 미성숙한 형태(HA0)만을 인식하나 개별의 서브유닛(HA1 및 HA2)은 인식하지 못하는 Fab의 능력을 지적하였다. 헤마글루티네이션 억제 분석(hemagglutination inhibition assay, HAI)은 닭의 적혈구 및 인간의 적혈구 둘 모두와 함께 동시에 수행되었다. 주목할만한 중화 활성에도 불구하고, Fab 28은 HAI 활성이 없다는 것이 증명되었으며, 이는 헤마글루티닌 및 시알산 사이에서의 바인딩을 보여주는 잔기들이 바인딩되지 않는다는 것을 나타낸다. 에피토프의 우수한 특성화에 대해, 2개의 상보적인 전략은 하기와 같다: Fab 28 모노클로날을 바인딩할 수 있는, 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)에 함유된, 임의의 펩티드 서열의 선택; 및 항체의 중화 활성을 벗어날 수 있는 바이러스 변이체(돌연변이를 벗어남)의 Fab 28에 걸쳐서 선택압에 의한 시험관내 유도. 패닝 기술(panning technique)에 의한 펩티드 라이브러리로부터의 선택은 Fab 28 이디오타입을 특이적으로 바인딩할 수 있는 펩티드 수의 식별을 허용하였다. 공통 서열을 생성하기 위해 식별된 모든 펩티드가 분석되었다. 공통 서열은 서브타입 H1N1에 속하는 헤마글루티닌 크리스탈의 인실리코( in silico ) 분석에 사용되었다. 이 분석에 의해, Fab 28에 의해 잠재적으로 인식된 영역을 드러내는 것이 가능하였다. 특히, 1개의 에피토프는, 이전에 발견된 결과, 및 도피 변종(escape mutant)에 의한 접근법과 함께 동시에 발생된 결과와의 양립가능성 관점에서 추가적인 분석의 대상이 되었다. 에피토프는 헤마글루티닌의 스템 영역(stem region) 상에, 즉 HA1 및 HA2 영역 사이의 부분에 국한된다(데이터는 웨스턴 블랏 및 HAI 분석에서 얻은 결과와 완벽히 일치함). 식별되었던 바인딩을 위한 잔기 크리스탈(residue crystal)은 하기와 같다: H2 영역 상의 W357 및 T358; N336; I337; HA1 영역 상의 P338(잔기들의 번호는 BLAST 데이터베이스에 존재하는 분리주 H1N1/A/PR/8/34로부터의 헤마글루티닌 서열을 의미함)(서열번호5). 도피 변종에 의한 분석은, 10 ㎍/ml의 Fab 28, 즉 당해 분리주에 대항한 IC90과 동등한 Fab 농도의 존재에서 H1N1/A/PR/8/34 바이러스의 100 TCID50을 갖는 MDCK 세포의 순차적인 감염에 의해 수행되었다. 수많은 계대(passage) 후에, 바이러스 게놈에서 발생한 돌연변이를 나타내는, Fab의 존재에서 세포의 감염을 검출하는 것이 가능하였다. 사실은, I361 및 D362인, HA2 영역에서 2개의 잔기에서 변이된 도피 변종이 인실리코 접근법에 의해 식별된 영역에 인접하여 선택되었으며, ㅇ이로 인해 Fab 28에 의해 인식된 영역이 있다는 추정을 확신하였다.
SEQUENCE LISTING <110> POMONA BIOTECHNOLOGIES LLC <120> Monoclonal antibodies capable of reacting with a plurality of subtypes of the influenza A virus <130> PC895EC <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Val 35 40 45 Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro 85 90 95 Ser Ala Ile Phe Gly Ile Tyr Ile Ile Leu Asn Gly Leu Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Gly Ile Ser 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560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 |
