The composition of the recombinant papilloma virus vaccine

【発明の詳細な説明】 組換えパピローマウイルスワクチンの組成物 発明の分野バピローマウイルスの組換え初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）タンパク質及び酸化マンナンを含むワクチン組成物、並びに前記組成物の製造及び使用方法が提供される。 発明の背景本発明は、ワクチン開発のための候補タンパク質抗原に対する強力な細胞性及び体液性免疫応答を引き出すために使用され得る新規技術を同定する。 水酸化アルミニウムは通常候補抗原に対する強力な抗体応答を引き出し、細胞性免疫応答ならば殆ど引き出さない。 Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓらは、マウスを酸化マンナン（ｏｘ−マンナン）にコンジュゲートしたムチン１（ＭＵＣ１）抗原で免疫化したとき動物においてＭＵＣ１抗原に対する強力な細胞性免疫応答が誘導されることを立証した。 これらの研究は以下の参考文献に記載されている：ｉ）「マンナンにコンジュゲートしたペプチドで免疫化後のマウスにおける抗ペプチド特異的抗体の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄ ｔｏ ｍａｎｎａｎ）」，Ｏｋａｗａ，Ｙ，Ｈｏｗａｒｄ，Ｃ． Ｒ． 及びＳ ｔｅｗａｒｄ，Ｍ． Ｗ． ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ１４９：１２７ −１３１，１９９２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｉ ｅｎｃｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ Ｔ ｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ． Ｋ． ；ｉｉ）Ａｐｏｓｔ ｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ． ，Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，Ｇ． Ａ． ，Ｌｏｖｅｌａｎｄ， Ｂ． Ｅ． ，Ｓａｎｄｒｉｎ，Ｍ． Ｓ． 及びＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉ． Ｆ． ，Ｐｒｏ ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９２：１０１２８−１０１３２（１ ９９５）． Ｔｈｅ Ａｕｔｓｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓ ｔｕｄｌｙ Ｒｏａｄ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ３０８４，Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ；及びｉｉｉ）Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ． ，Ｌｏ ｖｅｌａｎｄ，Ｂ． Ｅ． ，Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，Ｇ． Ａ． 及びＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｉ． Ｆ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，１５５：５０８９−５０９４（１９９５）． Ｔｈｅ Ａ ｕｔｓｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｕｄｌｙ Ｒｏａｄ ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ３０８４，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ。 しかしながら、ｏｘ−マンナンの、感染因子に対するワクチン開発におけるアジュバントまたは免疫調節物質としての有用性は評価されていなかった。 抗原を酸化もしくは還元マンナンにコンジュゲートすると、候補抗原に対する強い細胞性及び体液性応答を引き出すと思われる。 明礬は良好な体液性免疫応答を引き出し、細胞性免疫応答ならば殆ど引き出さないアジュバントとして使用されてきた。 パピローマウイルス抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を引き出すことができるアジュバントを必要とする、ヒトパピローマウイルスに対するワクチンを開発することが有用である。 本明細書では、ワタオウサギパピローマウイルスモデルで感染因子に対する防御免疫応答を引き出す際のｏｘ−マンナンの有用性を記載する。 ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はエンベロープを持たない二本鎖ＤＮＡウイルスであり、７５以上のタイプが同定されている。 ＨＰＶに感染すると生殖器コンジローマ及び頸部腫瘍物が生じ得、ＨＰ Ｖ感染は頸部癌の９０％ほどに関係し得る。 パピローマウイルスは増殖性感染に関して種特異的であり、動物がＨＰＶ感染しても病気にならない。 このため、候補ワクチンの予備テストは動物パピローマウイルスモデルで実施しなければならない。 ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）が最初に同定されたパピローマウイルスであり、癌に関係した最初のＤＮＡウイルスでもあった。 Ｌ１はウイルスキャプシドのメジャー成分であり、Ｌ１をバキュロウイルスまたは酵母において発現させるとウイルス様粒子（ＶＬＰ）が形成される。 動物をメジャーキャプシドタンパク質（Ｌ１）ＶＬＰで免疫化すると、ウイルスキャプシドタンパク質がＶＬＰまたはビリオンに組立てられたとき形成されるコンホメーション依存エピトープを認識する中和抗体が生成される。 感染性ＣＰＲＶによるチャレンジに対してＶＬＰのみの予防接種は有効であるが、感染してしまっている状態においては効果を示さない。 酸化マンナンのワクチン開発及び免疫療法のための担体として有用性を評価する研究において、本発明者らは酸化マンナンを大腸菌で発現させたＣＲＰＶ初期タンパク質（Ｅ−タンパク質）抗原にコンジュゲートし、その有効性を感染してしまった状態において評価した。 パピローマウイルス感染はヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、家兎、サル、ヘビ及びウシを含めた各種動物で起こる。 パピローマウイルスは上皮細胞を冒し、通常感染部位で良性上皮または線維上皮腫瘍を誘発する。 パピローマウイルスは種特異的感染因子であり、ヒトパピローマウイルスはヒト以外の動物を感染させ得ない。 パピローマウイルスは、感染させる宿主に基づいて別個のグループに分類され得る。 ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は更にＤＮＡ配列の相同に基づいて７ ０以上のタイプに分類される（参考のために、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅ ｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｈ．Ｐｆｉｓｔｅｒ編，ＣＲＣ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０）。 パピローマウイルスのタイプは、１つのタイプのパピローマウイルス感染に対する中和免疫は他のタイプのパピローマウイルスに対する免疫を付与しない点でタイプ特異性の免疫原であると考えられる。 ヒトにおいて、ＨＰＶタイプが異なると別の病気が引き起こされる。 ＨＰＶタイプ１、２、３、４、７、１０及び２６〜２ ９は正常なヒト及び免疫低下したヒトにおいて良性のいぼを引き起こす。 ＨＰＶ タイプ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６及び４６〜５０ は免疫低下したヒトにおいて扁平な病巣を引き起こす。 ＨＰＶタイプ６、１１、 ３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５は生殖器系または呼吸器系粘膜の非悪性コンジローマを引き起こす。 ＨＰＶタイプ１６及び１８は生殖器系粘膜の上皮異形成を引き起こし、頸部、膣、外陰部及び肛門管のｉｎ ｓｉｔｕ及び浸潤性癌腫の大部分に関係している。 ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１はすべてのコンジローマ（ 生殖器いぼ）及び喉頭乳頭腫の９０％以上に対する原因因子である。 動物での免疫学的研究で、パピローマウイルス抗原に対する中和抗体が産生されると同類抗体による感染が妨げられることが判明した。 パピローマウイルスをインビトロで培養することに伴う困難のため、有効なパピローマウイルスワクチンはゆっくりとしか開発されていない。 有効なＨＰＶワクチンの開発は適当な動物モデルが存在しないために特にゆっくりであった。 パピローマウイルスの抗体による中和はタイプ特異的であり、ウイルスの表面上のコンホメーションエピトープに依存すると考えられる。 パピローマウイルスは、最高８つの初期及び２つの後期タンパク質をコードする小さく（５０〜６０ｎｍ）、エンベロープを持たない正二十面体ＤＮＡウイルスである。 このウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１ 〜Ｅ７及びＬ１及びＬ２［ここで、Ｅは初期、Ｌは後期を指す］と呼ばれる。 Ｌ １及びＬ２はウイルスキャプシドタンパク質をコードする。 初期（Ｅ）遺伝子はウイルス複製及び細胞形質転換のような機能に関係している。 Ｌ１タンパク質は、５５〜６０ｋＤａの分子量を有するメジャーキャプシドタンパク質である。 Ｌ２タンパク質は、５５〜６０ｋＤａの予想分子量及びポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して７５〜１００ｋＤａの見かけ分子量を有するマイナーキャプシドタンパク質である。 免疫学的データから、全部ではないが多くのＬ２タンパク質はＬ１タンパク質の内部にあると示唆される。 Ｌ２タンパク質は異なるパピローマウイルスの中で高度に保存されている（特にＣ−末端の１０塩基性アミノ酸）。 Ｌ１ ＯＲＦは異なるパピローマウイルスの中で高度に保存されている。 Ｌ１及びＬ２遺伝子は、動物においてパヒローマウイルス感染を予防するためのワクチンを作成するために使用されている。 Ｚｈｏｕら（１ ９９１，１９９２）は、ＨＰＶタイプ１６ Ｌ１及びＬ２遺伝子をワクチンウイルスベクターにクローン化し、ＣＶ−１哺乳動物細胞を組換えベクターで感染させてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成した。 細菌誘導の組換えウシパピローマウイルスＬ１及びＬ２を作成した。 組換え細菌タンパク質に対する中和血清は、多分天然タンパク質と細菌誘導タンパク質のコンホメーションの違いのために低レベルで天然ウイルスと交差反応した。 ＨＰＶ６ Ｌ１、ＨＰＶ１１ Ｌ１、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｌ１、 ＨＰＶ３１ Ｌ１またはＨＰＶ１６ Ｌ２ＯＲＦを発現する組換えバキュロウイルスは昆虫ＳＦ９細胞を感染させ、Ｌ１及びＬ２タンパク質を産生するために使用されている。 ウエスタンブロット分析で、バキュロウイルス誘導Ｌ１及びＬ２ タンパク質はＨＰＶ１６に対する抗体と反応したことが判明した。 バキュロウイルス誘導Ｌ１はＶＬＰを形成する。 Ｃａｒｔｅｒら（１９９１）は、ＨＰＶ１６ Ｌ１及びＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質がサッカロミセス・セレビシエの組換え菌株により産生されることを立証した。 Ｃａｒｔｅｒらはまた、ＨＰＶ６ｂ Ｌ１及びＬ２タンパク質の産生を立証した。 ＨＰＶ６ｂ Ｌ１ タンパク質は完全長Ｌ１タンパク質でなかった。 組換えタンパク質は細胞内及び分泌タンパク質として産生された。 組換えＬ１及びＬ２タンパク質は天然タンパク質と同等の分子量を有していた。 タンパク質を細胞内で発現させると、大部分のタンパク質が細胞を変性剤の非存在下で溶解させたときには不溶性であることが判明した。 この不溶性によりタンパク質の精製が促進され得るが、不溶性のためにタンパク質の天然エピトープの分析が妨げられる。 酵母から分泌された組換えタンパク質が酵母由来の炭水化物を含むことが判明している。 これらのＮ−結合オリゴサッカライドが存在すると天然エピトープが隠される恐れがある。 更に、分泌された組換えタンパク質は例えば分泌リーダー配列の保持のような他の修飾を含み得る。 組換え酵母の培養により任意の種及びタイプのパピローマウイルスタンパク質を大量産生する方法を開発することは有用である。 天然タンパク質の免疫付与特性、例えば天然タンパク質のコンホメーションを有するパピローマウイルスタンパク質を大量産生することは有用である。 本発明は、天然パピローマウイルスタンパク質の免疫付与特性を有する組換えパピローマウイルスタンパク質、並びに前記タンパク質の製造及び使用方法に関する。 本発明は、パピローマウイルス感染に対する予防用及び治療用ワクチンの製造に関する。 本発明の組換え後期タンパク質はウイルス様粒子を形成し得る。 これらのＶＬＰは免疫原性であり、動物モデルでいぼの形成を防止する。 また、 組換えＥ−タンパク質は大腸菌において産生され、これらのタンパク質により細胞性免疫応答が引き出される。 本発明はワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲ ＰＶ）及びＨＰＶタイプ６（サブタイプ６ａ）をモデルシステムとして使用する。 発明の要旨パピローマウイルスの組換えた、酸化マンナンに付加させた初期（Ｅ）タンパク質及び後期（Ｌ）タンパク質、及び酸化マンナンを含むワクチン組成物、並びに前記組成物の製造及び使用方法が提供される。 図面の簡単な説明図は、ＣＲＰＶ感染により、コントロール動物のすべてのチャレンジ部位でいぼが生じたことを示す。 乳頭腫の発生が、Ｖ ＬＰを酸化マンナンにコンジュゲートしたＥ−タンパク質と一緒に用いて免疫化した第４群の動物の３／３で＞９０％抑制された。 対照的に、ＲＩＢＩ中のＶＬ Ｐ＋Ｅ−タンパク質混合物を用いて免疫化した第１群の動物の３／５のみ及びＲ ＩＢＩ中のＶＬＰ＋Ｏｘ−ｍａｎｎ−Ｅ−タンパク質混合物を用いて免疫化した第２群の動物の２／４のみで乳頭腫の発生が＞９０％抑制された。 上記した結果から、家兎をＬ１／Ｌ２ ＶＬＰと一緒に酸化マンナンにコンジュゲートしたＥ −タンパク質カクテルを用いて免疫化するとＣＲＰＶ感染細胞のいぼの発生が有意に抑制されることが示唆される。 図１：家兎をＬ１／Ｌ２ ＶＬＰと一緒にＥ−タンパク質カクテルで免疫化するとＣＲＰＶ誘導の乳頭腫発生が抑制される。 図２：ＣＲＰＶ誘導の乳頭腫発生に対する組成物の比較。 発明の詳細な説明バピローマウイルスの組換え初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）タンパク質及び酸化マンナンを含むワクチン組成物、並びに前記組成物の製造及び使用方法が提供される。 本発明は、ワクチン開発のために候補タンパク質抗原に対する強力な細胞性及び体液性免疫応答を引き出すために使用され得る新規技術を同定する。 水酸化アルミニウムは通常候補抗原に対する強力な抗体応答を引き出し、細胞性免疫応答ならば弱々しい。 Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓらは、酸化マンナン（ｏｘ−マンナン）にコンジュゲートしたムチン１（ＭＵＣ１）抗原でマウスを免疫化すると動物においてＭＵＣ１抗原に対する強力な細胞性免疫応答が誘導されることを立証した。 しかしながら、ｏｘ−マンナンの感染因子に対するワクチン開発におけるアジュバントまたは免疫調節物質としての有用性は評価されていない。 抗原を酸化もしくは還元マンナンにコンジュゲートすると、候補抗原に対する強い細胞性及び体液性応答を引き出すと思われる。 明礬は良好な体液性免疫応答を引き出し、細胞性免疫応答のときには殆ど引き出さないアジュバントとして使用されてきた。 ヒトパピローマウイルスに対するワクチンは、パピローマウイルス抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を引き出すことができるアジュバントを必要とする。 本明細書では、ワタオウサギパピローマウイルスモデルで感染因子に対する防御免疫応答を引き出す際のｏｘ−マンナンの有用性を記載する。 酸化マンナンのワクチン開発及び免疫療法のための担体としての有用性を評価する研究において、本発明者らは酸化マンナンを大腸菌発現の組換えＣＲＰＶ初期タンパク質（Ｅ−タンパク質）抗原にコンジュゲートし、その有効性を感染してしまっている状態で評価した。 パピローマウイルス（ＰＶ）感染の予防、キャラクタライゼーション、検出及び治療のための方法、組成物及びプロセスを提供する。 本発明の方法は、酵母における組換えＬ１、組換えＬ２、または組換えＬ１とＬ２タンパタ質の産生に基づく。 組換えタンパク質は天然ＰＶのコンホメーション中和エピトープを模擬することができる。 組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１とＬ２タンパク質はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することもできる。 本発明の組成物には、Ｌ１、 Ｌ２、またはＬ１とＬ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、単独でまたは他の組換えタンパク質と組合わされる組換えタンパク質、少なくとも１つの組換えタンパク質を含むＶＬＰ、組換えタンパク質の断片、組換えタンパク質を含む医薬組成物、組換えタンパク質を含むワクチン組成物、組換えタンパク質またはＶＬＰ に対する抗体、少なくとも１つの組換えタンパク質を含む免疫原性組成物、及び組換えＤＮＡ分子または組換えタンパク質を含む診断キットが含まれるが、これらに限定されない。 本発明のプロセスには、適当な酵母宿主細胞を組換えＤＮＡ 分子で形質転換し、組換えタンパク質をコードするＤＮＡを発現し得る条件下で形質転換した酵母を培養し、組換えタンパク質を精製することからなる組換えタンパク質の産生方法が含まれるが、これに限定されない。 本発明のプロセスには、組換えタンパク質、組換えタンパク質組成物またはＶＬＰを動物（非限定的に、ヒトを含む）に投与することも含まれる。 適当な宿主細胞には、Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母菌株が含まれるが、これらに限定されない。 動物での免疫学的研究で、パピローマウイルスキャプシドタンパク質に対する中和抗体が産生されると同類抗体による感染が予防されることが判明した。 パピローマウイルスをインビトロで培養することに伴う困難のため、有効なパピローマウイルスワクチンはゆっくりとしか開発されていない。 有効なＨＰＶ ワクチンの開発は適当な動物モデルが存在しないために特にゆっくりであった。 パピローマウイルスの抗体による中和はタイプ特異的であり、ウイルスの表面上のコンホメーションエピトープに依存すると考えられる。 タンパク質またはＶＬＰを含む医薬的に有用な組成物は、医薬的に許容され得る担体を混合する等の公知方法に従って製造され得る。 前記担体及び製造方法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓに記載されている。 有効投与に好適な医薬的に許容され得る組成物を形成するために、前記組成物は有効量のタンパク質またはＶＬＰを含む。 前記組成物は１ タイプ以上のＨＰＶに由来のタンパク質またはＶＬＰを含み得る。 本発明の治療または診断組成物はＰＶ感染を治療または診断するのに十分な量患者に投与される。 有効量は患者の状態、体重、性別及び年齢等の各種要因によって異ない得る。 他の要因には投与モードが含まれる。 通常、組成物は約１μｇ 〜約２５０μｇの用量で投与される。 医薬組成物は、皮下、局所、経口、粘膜または筋肉内のような各種経路で患者に与えられ得る。 本発明のワクチンは、宿主において中和抗体の形成を誘導するのに必要な抗原決定基を含む組換えタンパク質またはＶＬＰを含む。 前記ワクチンは臨床感染の危険を伴うことなく投与するのに十分に安全であり、毒性副作用を持たず、有効経路で投与することができ、安定であり、ワクチン担体と相容性である。 本発明のワクチンは、経口、非経口、皮下、粘膜または筋肉内のような各種経路で投与され得る。 投与量は患者の状態、性別、体重及び年齢、投与経路及びワクチンのＰＶのタイプによって異なり得る。 ワクチンはカプセル、懸濁剤、エリキシルまたは液剤のような剤型で使用され得る。 ワクチンは免疫学的に許容され得る担体とともに処方され得る。 ワクチンは治療有効量で、すなわち免疫学的防御応答を生ずるのに十分量で投与される。 治療有効量はＰＶのタイプにより異なり得る。 ワクチンは１回もしくは複数回投与され得る。 本発明の方法により、ＰＶ感染を予防するためのサブウイルスワクチンを製造することができる。 この方法を用いて、単価または多価ＰＶワクチンが製造され得る。 例えば、単価ＨＰＶタイプ１６は組換えＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、Ｌ ２タンパク質、またはＬ１とＬ２タンパク質を使用することにより製造され得る。 或いは、多価ＨＰＶワクチンは異なるＨＰＶタイプ由来のＬ１、Ｌ２、またはＬ１とＬ ２タンパク質またはＶＬＰを混合することにより製造され得る。 本発明の組換えタンパク質及びＶＬＰは免疫原性組成物を製造する際に使用され得る。 前記組成物は適当な宿主に導入されると、宿主において免疫応答を誘導することができる。 組換えタンパク質及びＶＬＰは抗体を作成するために使用され得る。 本明細書中、用語「抗体」はモノクローナル及びポリクローナル抗体、及び抗原またはハプテンと結合し得るその断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片を含む。 本発明の組換えタンパク質、ＶＬＰ及び抗体はＨＰＶ感染の血清型分類及びＨ ＰＶスクリーニングのために使用され得る。 組換えタンパク質、ＶＬＰ及び抗体を用いてＨＰＶの検出及び血清型分類のために適当なキットが製造される。 前記キットは閉鎖空間内に少なくとも１つの容器を保持するのに適した区画化された担体を含む。 前記担体は更に、各種ＨＰＶタイプを検出するために好適な組換えＨＰＶ、タンパク質、ＶＬＰまたは抗−ＨＰＶ抗体のような試薬を含む。 前記担体はまた標識抗原、 酵素基質等を検出するための手段を含み得る。 本発明の組換えタンパク質及びＶＬＰは分子量及び分子サイズマーカーとしても有用である。 下記実施例に基づいて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 実施例１ 大腸菌におけるＣＲＰＶ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７の発現完全長ＣＲＰＶ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ＣＲＰＶの公表されている配列（Ｙａｎｉｖ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１５８０−１５８４，１９ ８５）に基づくＰＣＲプライマーを使用した。 ＣＲＰＶ Ｅ４タンパク質の発現を増強するために、ＰＣＲを用いてＣＲＰＶ Ｅ１タンパク質の最初の４個のアミノ酸コドンをＥ４のアミノ末端部分に融合した（Ｅ１＾４）。 ＰＣＲを用いてＥ６及びＥ７遺伝子のオープンリーディングフレームをＥ６のカルボキシ末端でＥ７のアミノ末端と融合した。 すべてのＰＣＲ増幅産物をベクターｐＥＱ３０（ カリフォルニア州サンジェゴに所在のＱｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）にサブクローニングし、配列決定した。 所望タンパク質の発現を所望のＥ−タンパク質を発現する大腸菌ＳＧ−１３００の１リッター培養物をＬＢ培地にて３７℃で８時間増殖することにより実施し、その後１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で一晩誘導した。 次いで、細胞を５０００ｒｐｍで１５分間遠心することにより集め、ＰＢＳ５００ｍｌで洗浄し、Ｅタンパク質を製造業者（Ｑｉａ ｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の指示に従って精製した。 実施例２ ＣＰＲＶ Ｅ−タンパク質の精製 （培地１リッターからの）大腸菌培養物ペーストを、抽出緩衝液（６．０Ｍグアニジン塩酸塩、２ｍＭイミダゾール、０．３５ｍＭ２β−メルカプトエタノール及び０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中に室温で３０分間可溶化した。 可溶性画分を１８０００×ｇで３０分間遠心することにより単離し、抽出緩衝液で平衡化した充填Ｎｉ樹脂８．０ｍｌと混合した。 樹脂スラリーを室温で２時間または４℃で１６時間回転させた。 非結合タンパク質を２００×ｇ で遠心して除去した。 樹脂を室温において４．０容量ずつの抽出緩衝液及び緩衝液Ａ（８．０Ｍ尿素及び０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で洗浄した。 樹脂を緩衝液Ａ（ｐＨ６．３）に再懸濁し、カラムに移し、４容量ずつの緩衝液Ｂ（８．０Ｍ尿素、１０ｍＭイミダゾール及び０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６．３）、緩衝液Ｃ（８．０Ｍ尿素、２００ｍＭイミダゾール及び０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．３）、緩衝液Ｄ（８．０Ｍ尿素、５００ｍＭイミダゾール及びリン酸ナトリウム、ｐＨ５．７）、最後に緩衝液Ｅ（８．０Ｍ尿素、１ ．０Ｍイミダゾール及び０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５．７）で順次洗浄した。 精製タンパク質を緩衝液Ｃ、Ｄ及びＦに溶離させた。 タンパク質をＢｒａｄ ｆｏｒｄまたはＢＣＡタンパク質アッセイで定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。 精製タンパク質を脱イオン水で十分に透析してコンジュゲート前の尿素または他の成分（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．マニュアル）を除去した。 実施例３ ＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２遺伝子のウイルス様粒子（ＶＬＰ）としての発現完全長ＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子及び最初の３７個のコドン（１１１ｂｐ）を欠失させたＣＲＰＶ Ｌ２遺伝子をＰＣＲ増幅するために、Ｃ ＲＰＶの公表されている配列（Ｙａｎｉｖ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１５８０−１５８４，１９８５）に基づくＰＣＲプライマーを使用した。 前記遺伝子を、バキュロウイルス発現系において同時発現させるために２カセットベクターｐＡｃＵＷ５１（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｉｎｃ．）に、また酵母において発現させるために２カセットベクターｐＬＳ１１０（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．Ｊ．ら， Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２０９：５０６−５１８，１９９５）にサブクローニングした。 ＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質をコードする遺伝子を含むｐＡｃＵＷ５１ ベクターをＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｂｅｃｕｌｏｇｏｌｄ発現キットを用いてＳ Ｆ９細胞にトランスフェクションした。 このトランスフェクション由来の上清を、５日間増殖させたＳｆ９細胞の大量培養物（１リッター）を感染させるために使用し、細胞を収集し、Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰを精製した。 ＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質をコードする遺伝子を含有するｐＬＳ１１ ０ベクターを、標準のスフェロプラスト形質転換プロトコルを用いて酵母に形質転換した。 ポジティブクローンを同定し、大規模培養物を増殖させた。 Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰを発現する酵母の培養物２００ｍ ｌを３０℃で２日間増殖させた。次いで、この培養物２００ｍｌを用いて、３０ ℃で５日間増殖させた誘導培地（２％酵母抽出物、１％大豆ペプトン、１．６％ グルコース及び４％ガラクトース）１Ｌを接種した。遠心して細胞を収集し、Ｌ １／Ｌ２ ＶＬＰを精製した。 実施例４ マンナンのＥ−タンパク質へのコンジュゲーション大腸菌発現させたＣＲＰＶ Ｅ−タンパタ質をＮｉカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、脱イオン水を用いて十分に透析した。 Ｃ ＲＰＶ Ｅ−タンパク質を混合し（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６＾７各１５０ｕｇ；Ｅ１＾ ４ １００ｕｇ及びＥ５ ５０ｕｇ／投与量）、凍結乾燥した。 （サッカロミセス、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から精製した）マンナン１４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．０ｍｌに溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム２０ｕｌと混合し、４℃で１時間インキュベートした。エタンジオール２０ｕｌを添加し、４℃で更に３０分間インキュベートし、混合物を重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０カラムに流した（ Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｖ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，９２：１０１２８−１０１３２，１９９５）。空隙容量に溶離した酸化マンナンを凍結乾燥したＥ−タンパク質混合物と混合し、室温で一晩インキュベートし、使用した。 実施例５ マンナンのＥ−タンパク質へのコンジュゲーション大腸菌発現させたＣＲＰＶ Ｅ−タンパク質をＮｉカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、脱イオン水を用いて十分に透析した。 Ｃ ＲＰＶ Ｅ−タンパク質を混合し（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６＾７各１５０ｕｇ；Ｅ１＾ ４ １００ｕｇ及びＥ５ ５０ｕｇ／投与量）、凍結乾燥した。 （サッカロミセス、ＳＩＧＭＡから精製した）マンナン１４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）１．０ｍｌに溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム２０ｕｌと混合し、４℃で１時間インキュベートした。エタンジオール２０ｕｌを添加し、４℃で更に３０分間インキュベートし、混合物を重炭酸塩緩衝液（０．０２Ｍ，ｐＨ８ ．０）で平衡化したＰＤ−１０カラムに流した。空隙容量に溶離した酸化マンナンを凍結乾燥したＥ−タンパク質混合物と混合し、 室温で一晩インキュベートした。 実施例６ Ｏｘ−マンナン−Ｅ−タンパク質ワクチンのＣＲＰＶモデルでの評価 ５羽の家兎を、ＲＩＢＩ中の酵母−誘導Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ２５ｕｇとＥ１、 Ｅ２、Ｅ１＾４、Ｅ６＾７各１５０ｕｇ及びＥ５ ＣＲＰＶ Ｅ−タンパク質５ ０ｇを用いて免疫化した（第１群）。 ４羽の家兎を、Ｅ−タンパク質を酸化多糖類マンナンにコンジュゲートした（Ｏｘ−ｍａｎｎ−Ｅ−タンパク質）以外は同一混合物を用いて免疫化した（第２群）。 ３羽の家兎にＲＩＢＩのみ（第３群） 、またはＲＩＢＩなしでＬ１／Ｌ２ ＶＬＰ＋Ｏｘ−ｍａｎｎ−Ｅ−タンパク質のみ（第４群）を与えた。各家兎に対して所望の組成物を、各後肢に０．３ｍｌ ずつ筋肉内注射し、６ヶ所に０．０５ｍｌずつ皮内注射し、頸に０．１ｍｌ皮下注射した。最初の免疫化から４日目に家兎にワタオウサギパピローマウイルス（ ＣＲＰＶ）で感染させ、２１日目及び４２日目に同一組成物中の同一量の抗原を用いて追加刺激した。後感染から３５日目及び４７日目に乳頭腫の大きさを測定した。 実施例７ 結果 ＣＲＰＶ感染により、コントロール動物のすべてのチャレンジ部位でいぼが生じた。乳頭腫の発生が、ＲＩＢＩなしでＶＬＰ＋Ｏｘ−ｍａｎｎ−Ｅ−タンパク質混合物を用いて免疫化した第４群の動物の３／３で＞９０％抑制された。対照的に、ＲＩＢＩ中のＶＬＰ＋Ｅ−タンパク質混合物を用いて免疫化した第１群の動物の３／５のみ及びＲＩＢＩ中のＶＬＰ＋Ｏｘ−ｍａｎｎ−Ｅ−タンパク質混合物を用いて免疫化した第２群の動物の２／４のみで乳頭腫の発生が＞９０％抑制された。第１群の残りの２羽の家兎では乳頭腫の発生の抑制率は８０％であり、第２群の残りの２羽の家兎では乳頭腫の発生の抑制率は１０〜５０％であった。上記した結果から、家兎をＲＩＢＩ中のＬ１／Ｌ２ ＶＬＰと一緒にＥ−タンパク質カクテルを用いて免疫化するといぼの発生が有意に（８０〜９０％）抑制されることが示唆される。興味深いことに、ＶＬＰと酸化マンナンにコンジュゲートしたＥ−タンパク質カクテルを含む組成物を用いて免疫化した動物でもいぼの発生が同様に抑制されることが観察された（図１）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 マーク，ジヨージ・イー，ザ・サード アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126