测定脂蛋白质的胆甾醇运载能的方法及试剂

申请号 CN201510672254.2 申请日 2015-10-16 公开(公告)号 CN105527418A 公开(公告)日 2016-04-27
申请人 希森美康株式会社; 发明人 原田周; 村上克洋; 桐山真利亚; 吉川景子; 三轮桂子;
摘要 本 发明 提供测定脂 蛋白质 的胆甾醇运载能 力 的方法。此方法包括,通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇 接触 ,使上述脂蛋白质运载上述被标记的胆甾醇的工序;通过使运载上述被标记的胆甾醇的上述脂蛋白质和与脂蛋白质结合的 抗体 接触,形成上述脂蛋白质和上述抗体的复合物的工序;测定从上述复合物发生的标记的工序。
权利要求

1.测定脂蛋白质的胆甾醇运载能的方法,其包括:
通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇接触,使上述脂蛋白质运载上述被标记的胆甾醇的工序,
通过使运载上述被标记的胆甾醇的上述脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体接触,形成上述脂蛋白质和上述抗体的复合物的工序,
测定从上述复合物发生的标记的工序。
2.权利要求1所述的方法,其中上述脂蛋白质是高比重脂蛋白质。
3.权利要求1所述的方法,其中
上述被标记的胆甾醇是被荧光标记的胆甾醇,
在上述测定工序中,测定从上述复合物发生的荧光的强度。
4.权利要求1所述的方法,其中在使上述脂蛋白质运载上述被标记的胆甾醇的工序中,上述被标记的胆甾醇通过与上述样品的接触而被酯化,酯化的被标记的胆甾醇被运载到上述脂蛋白质。
5.权利要求1所述的方法,其中使上述脂蛋白质运载上述被标记的胆甾醇的工序、形成复合物的工序、及测定标记的工序在无细胞系统中进行。
6.权利要求1所述的方法,其还包括除去未被上述脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇的工序。
7.权利要求1所述的方法,其中在复合物形成工序之后,还包括通过除去未被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇,分离上述复合物和游离的被标记的胆甾醇的工序。
8.权利要求1所述的方法,其中与上述脂蛋白质结合的抗体是抗ApoAI抗体。
9.权利要求8所述的方法,其中上述抗ApoAI抗体被固定化到固相。
10.权利要求1所述的方法,其中上述样品是血液、血清或血浆
11.权利要求1~10之任一项所述的方法,其中上述被标记的胆甾醇含荧光团,所述荧光团具有有极性结构。
12.权利要求11所述的方法,其中上述被标记的胆甾醇含有下述的式(I):
【化1】
所表示的二吡咯亚甲基骨架结构或下述的式(II):
【化2】
所表示的苯并噁二唑骨架结构的荧光团。
13.权利要求12所述的方法,其中上述含有硼二吡咯亚甲基骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇是下述的式(III):
【化3】
所表示的被荧光标记的胆甾醇。
14.权利要求12所述的方法,其中上述含有苯并噁二唑骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇是下述的式(IV):
【化4】
所表示的被荧光标记的胆甾醇。
15.脂蛋白质的胆甾醇运载能力测定用试剂盒,其含:
含被标记的胆甾醇的第1试剂,和
含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
16.权利要求15所述的试剂盒,其还含固相。
17.权利要求16所述的试剂盒,其中在上述固相固定化有抗ApoAI抗体。
18.权利要求15~17之任一项所述的试剂盒,其中上述被标记的胆甾醇是被荧光标记的胆甾醇。
19.权利要求15所述的试剂盒,其中上述被标记的胆甾醇含荧光团,所述荧光团具有有极性结构。
20.权利要求15所述的试剂盒,其中上述被标记的胆甾醇含有下述的式(I):
【化1】
所表示的硼二吡咯亚甲基骨架结构或下述的式(II):
【化2】
所表示的苯并噁二唑骨架结构的荧光团。
21.权利要求20所述的方法,其中上述含有硼二吡咯亚甲基骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇是下述的式(III):
【化3】
所表示的被荧光标记的胆甾醇。
22.权利要求20所述的方法,其中上述含有苯并噁二唑骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇是下述的式(IV):
【化4】
所表示的被荧光标记的胆甾醇。

说明书全文

测定脂蛋白质的胆甾醇运载能的方法及试剂

【技术领域】

[0001] 本发明涉及测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法。另外,本发明涉及脂蛋白质的胆甾醇运载能力的测定用试剂盒。【背景技术】
[0002] 近年、关注血中的脂蛋白质的功能的质的指标被关注。
[0003] 作为研究高比重脂蛋白质(HDL)的功能的方法,例如,在Sankaranarayanan S.et al.,A sensitive assay for ABCA1-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol.J.Lipid Res.,vol.52,p.2332-2340(2001)中记载了使用被荧光标记的胆甾醇及培养细胞的方法。
[0004] 在此方法中,通过测定从运载被荧光标记的胆甾醇的巨噬细胞由HDL置换出的被标记的胆甾醇量,研究HDL的胆甾醇排出功能。此方法包括,(1)使巨噬细胞运载被标记的胆甾醇,(2)添加酰基CoA胆甾醇酰基转移酶的抑制剂,抑制在细胞内的胆甾醇的酯化,(3)添加HDL而刺激巨噬细胞,及(4)回收培养上清及细胞增溶液,定量这些液中的被标记的胆甾醇的4个工序。
[0005] 另一方面,在WO2012/104411中记载了不使用培养细胞,由被荧光标记的胆甾醇判断脂质异常症的方法。
[0006] 在此方法中,将含低比重脂蛋白质(LDL)或HDL等的各种的脂蛋白质的周缘的单层用被荧光标记的胆甾醇(胆甾醇芘)标记,基于测定标记的脂蛋白质而得到的荧光光谱,判断受试者是脂质异常症与否。
[0007] 再有,在此文献中记载,可将标记的脂蛋白质和游离的被荧光标记的胆甾醇由超离心分离法、透析、或者使用凝胶过滤柱的FPLC分离。【发明内容】
[0008] 【发明要解决的技术课题】
[0009] 本发明人关注脂蛋白质的胆甾醇运载能力,探讨简便地测定其的方法。于是,本发明人发现可使用被标记的胆甾醇和与脂蛋白质结合的抗体,简便地测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力,从而完成本发明。
[0010] 【解决课题的技术方案】
[0011] 从而提供包括通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇接触,使脂蛋白质运载被标记的胆甾醇的工序、通过使运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体接触,形成脂蛋白质和抗体的复合物的工序、测定从此复合物发生的标记的工序,及测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法。
[0012] 再者提供脂蛋白质的胆甾醇运载能力测定用试剂盒,其含:含被标记的胆甾醇的第1试剂,及含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
[0013] 【发明效果】
[0014] 由本发明使简便地测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力变得可能。【附图说明】
[0015] 【图1】是显示含有二吡咯亚甲基骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇由HDL酯化的照片。
[0016] 【图2】是显示含有苯并噁二唑骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇由HDL酯化的照片。
[0017] 【图3】是显示由本实施方式的方法的测定结果与由以往方法的测定结果相关的分布图。
[0018] 【图4A】是显示由夹心ELISA法,HDL被固定化到固相的抗载脂蛋白AI(ApoAI)抗体捕获的坐标图。
[0019] 【图4B】是显示被抗ApoAI抗体捕获的HDL不运载被荧光标记的胆甾醇的坐标图。
[0020] 【图5A】是显示本实施方式的试剂盒之一例的图。图中,11表示含被标记的胆甾醇的第1试剂、22表示含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
[0021] 【图5B】是显示含被标记的胆甾醇、与脂蛋白质结合的抗体和固相的本实施方式的试剂盒之一例的图。图中,11表示含被标记的胆甾醇的第1试剂、22表示含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂、33表示固相(96孔微平板)。
[0022] 【图5C】是显示含被标记的胆甾醇和固定化与脂蛋白质结合的抗体的固相的本实施方式的试剂盒之一例的图。图中,11表示含被标记的胆甾醇的第1试剂、33表示固定化与脂蛋白质结合的抗体的固相(96孔微平板)。
[0023] 【实施方式】
[0024] 以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。
[0025] 测定本实施方式的脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法(以下也简称为“测定方法”),也可如后述一样,向样品中的脂蛋白质直接运载被标记的胆甾醇,所以如以往的胆甾醇排出功能的测定法(例如,Sankaranarayanan S.et al.,A sensitive assay for ABCA1-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol.J.Lipid Res.,vol.52,p.2332-2340(2001)所述的如方法)一样,不使用巨噬细胞等的蓄积胆甾醇的细胞。从而,本实施方式的测定方法,在后述的任何的工序中都可在无细胞系统中进行。其中,无细胞系统是指以脂蛋白质的胆甾醇运载能力的测定中利用的目的不添加细胞。即,本实施方式的测定方法可不为了测定添加细胞而利用其性质及功能等而实施。再有认为,在本实施方式中,即使使用的样品中含受试者来源的细胞时,其细胞自体几乎不影响脂蛋白质的被标记的胆甾醇的运载,测定方法被视为无细胞系统。
[0026] 在本实施方式的测定方法中,首先进行通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇接触,使被标记的胆甾醇运载到脂蛋白质的工序。在本实施方式中,样品是,只要是含哺乳动物的脂蛋白质、优选为人的脂蛋白质,就不特别限定。作为那样的样品,例如,可举出血液、血清及血浆等的血液样品。
[0027] 成为本实施方式的测定对象的脂蛋白质可为HDL、LDL、中间比重脂蛋白质(IDL)、超低比重脂蛋白质(VLDL)、或者乳糜微粒(CM)。HDL是有1.063g/mL以上的密度的脂蛋白质。LDL是有1.019g/mL以上、不足1.063g/mL的密度的脂蛋白质。IDL是有1.006g/mL以上、不足1.019g/mL的密度的脂蛋白质。VLDL是有0.95g/mL以上、不足1.006g/mL的密度的脂蛋白质。CM是有不足0.95glmL的密度的脂蛋白质。在优选的实施方式中,在上述的脂蛋白质之中,以HDL作为测定对象。
[0028] 在本实施方式的测定时,可由超离心分离法或聚乙二醇(PEG)沉淀法等的公知的方法分离血液样品,取得含指定的脂蛋白质的级分。
[0029] 在本实施方式中,为了调节脂蛋白质浓度,将上述的血液样品及指定的脂蛋白质级分用性介质稀释而得到的液也可作为样品使用。作为那样的水性介质,例如,可举出水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)及Tris-HCl等的缓冲液等。再有,样品中的脂蛋白质浓度,由于作为脂蛋白质的主要的构成成分的ApoAI的浓度成为指标,在本实施方式中,也可取样品的一部分,将其中所含的ApoAI的浓度由公知的免疫学测定法(例如免疫比浊法)测定。基于得到的ApoAI的浓度,可调节样品中的脂蛋白质浓度。
[0030] 在样品中,根据需要,也可添加血清白蛋白(BSA)或如脂质体一样的封闭剂等。另外,由于知脂蛋白质酯化胆甾醇而运载,也可将对于由脂蛋白质的胆甾醇的酯化反应成为必要的脂肪酸或含其的组合物(例如脂质体)添加到样品。
[0031] 在本实施方式的测定方法中,作为脂蛋白质运载的胆甾醇,使用被标记的胆甾醇。被标记的胆甾醇是在胆甾醇分子的一部分结合成为标记的分子的物质。其中,被标记的胆甾醇中的胆甾醇部分可有天然存在的胆甾醇的结构,或者,也可有从与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链除去1个以上的亚甲基及/或甲基的胆甾醇(也称为去甲胆固醇)的结构。
[0032] 如上所述,由于脂蛋白质酯化胆甾醇而运载,更优选为使用由脂蛋白质酯化的被标记的胆甾醇。再有,在本实施方式的方法中,被标记的胆甾醇,在与样品接触时,被该样品中含的活体来源的卵磷脂-胆甾醇酰基转移酶(LCAT)酯化。确认由脂蛋白质的被标记的胆甾醇的酯化的方法自体是现有技术中公知的,可由本领域技术人员常规进行。
[0033] 标记优选是发生可从标记自体检测的信号的物质。例如,可举出荧光物质、显色物质、发光物质等。这些中,特别优选为荧光物质。荧光物质优选为含荧光团,所述荧光团具有有极性结构。在现有技术领域中,含有被荧光标记的胆甾醇及具有有极性结构的荧光团的标记物质自体是公知的。
[0034] 作为那样的含荧光团,所述荧光团具有有极性结构的被荧光标记的胆甾醇,例如,可举出含有下述的式(I):
[0035] 【化1】
[0036]
[0037] 所表示的硼二吡咯亚甲基(BODIPY(注册商标))骨架结构或下述的式(II):
[0038] 【化2】
[0039]
[0040] 所表示的苯并噁二唑骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇等。
[0041] 被标记的胆甾醇可由公知的方法,通过将标记附加到胆甾醇制造。再有,胆甾醇中附加标记的位置不特别限定,可根据使用的标记适宜决定。胆甾醇和标记的结合样式不特别限定,但优选为两者经共价键直接键合。
[0042] 在本实施方式中,也可使用市售的被标记的胆甾醇。例如,作为上述的含有BODIPY骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇,可举出下述的式(III):
[0043] 【化3】
[0044]
[0045] 所表示的被荧光标记的胆甾醇(23-(二吡咯亚甲基硼二氟)-24-去甲胆固醇、商品名TopFluor Cholesterol、CAS No:878557-19-8、可获自Avanti Polar Lipids公司)。
[0046] 另外,作为上述的含有苯并噁二唑骨架结构的荧光团的被荧光标记的胆甾醇,可举出下述的式(IV):
[0047] 【化4】
[0048]
[0049] 所表示的被荧光标记的胆甾醇(25-[N-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)甲基]基]-27-去甲胆固醇、商品名25-NBD Cholesterol、CAS No:105539-27-3、可获自Avanti Polar Lipids公司)。
[0050] 在本实施方式中,样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇的接触,例如,可通过混合上述的样品和被标记的胆甾醇溶液进行。混合后,脂蛋白质开始运载被标记的胆甾醇。在本实施方式中,被标记的胆甾醇的添加量不特别限定,但也可略过量地添加至被标记的胆甾醇不枯渴。例如,被标记的胆甾醇可添加到样品至终浓度0.1~30μM、优选为1~10μM。此工序中的温度条件及接触时间不特别限定,但例如,可将样品和被标记的胆甾醇的混合液于25~40℃、优选为于35~38℃,温育30分钟~24小时、优选为1~4小时。温育之间、混合液可静置,也可搅拌或振荡。
[0051] 在本实施方式中,也可还进行除去不被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇的工序。例如,可由超离心分离法等,通过仅回收脂蛋白质,除去不被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇。在本实施方式中,除去游离的被标记的胆甾醇后,也可将回收的脂蛋白质用PBS等的适宜的水性介质清洗。
[0052] 接下来,在本实施方式的测定方法中,通过使运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体接触,进行形成该脂蛋白质和该抗体的复合物的工序。在本实施方式中,与脂蛋白质结合的抗体只要是可与脂蛋白质的表面的一部分特异性地结合的抗体,就不特别限定,但优选为,是可与作为脂蛋白质的构成成分的载脂蛋白特异性地结合的抗体。作为那样的抗体,例如,可举出抗ApoAI抗体、抗ApoAII抗体等,但在它们之中也特别优选为抗ApoAI抗体。在本实施方式中,也可使用市售的抗脂蛋白质抗体及抗ApoAI抗体。
[0053] 与脂蛋白质结合的抗体可为单克隆抗体,也可为多克隆抗体。抗体的来源不特别限定,也可为小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、、骆驼等之任何的哺乳动物来源的抗体。另外,抗体的同种型也可为IgG、IgM、IgE、IgA等之任何,优选为IgG。再有,在抗体中也含抗体的片段及其衍生物,例如,可举出Fab片段、F(ab')2片段等。
[0054] 再有,作为与脂蛋白质结合的抗体,使用抗ApoAI抗体时,在使该抗体与运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质接触之前,也可将该脂蛋白质用化剂处理。由氧化剂的作用,抗ApoAI抗体和脂蛋白质的反应性可改善。作为那样的氧化剂,例如,可举出过氧化氢、过氧化亚硝酸、二氧化氯等。
[0055] 在本实施方式中,使运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体的接触,例如,可通过混合含该脂蛋白质的液和该抗体的溶液进行。混合后,脂蛋白质和抗体结合而形成复合物。其中,与脂蛋白质结合的抗体的添加量不特别限定,可根据抗体的种类等由本领域技术人员适宜设定。此工序中的温度条件及接触时间不特别限定,但例如,可将脂蛋白质和抗体的混合液于20~40℃、优选为于22~28℃,温育30分钟~8小时、优选为1~2小时。温育之间、混合液可静置,也可搅拌或振荡。
[0056] 在本实施方式中,优选在上述的脂蛋白质和抗体的复合物的形成工序之后,通过除去不被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇,还进行分离脂蛋白质和游离的被标记的胆甾醇的工序。例如,可由超离心分离法等,通过仅回收复合物,除去不被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇,分离脂蛋白质和游离的被标记的胆甾醇。或者,也可在上述的复合物形成工序之后,使复合物和用于捕获该复合物的固相接触。通过回收捕获复合物的固相,除去不被脂蛋白质运载的游离的被标记的胆甾醇,可分离该复合物和游离的被标记的胆甾醇。在本实施方式中,除去游离的被标记的胆甾醇后,也可将回收的复合物用PBS等的适宜的水性介质清洗。
[0057] 作为上述的固相,优选为可捕获与复合物中的脂蛋白质结合的抗体的固相。固相的种类不特别限定,例如,可举出物理吸附抗体的材质的固相、固定化到与抗体特异性地结合的分子的固相等。作为与抗体特异性地结合的分子,可举出特异性地识别蛋白A或G、该抗体的抗体(即第二抗体)等。另外,也可使用介于抗体和固相之间的物质的组合,使两者结合。作为那样的物质的组合,可举出生物素和亲和素(或者链霉亲和素)、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶、半抗原和抗半抗原抗体等的组合。例如,预先生物素修饰与脂蛋白质结合的抗体时,可由固定了亲和素或链霉亲和素的固相捕获该抗体。
[0058] 作为固相的原料,可选自有机高分子化合物、无机化合物、活体高分子等。作为有机高分子化合物,可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物,可举出磁性体(氧化、氧化铬、钴及铁素体等)、氧化、氧化、玻璃等。作为活体高分子,可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可组合这些中的2种以上使用。固相的形状不特别限定,例如,可举出粒子、微平板、微管、试管等。
[0059] 在别的实施方式中,也可将与脂蛋白质结合的抗体、优选为抗ApoAI抗体预先固定化到固相,使固定化到该固相的抗体和运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质接触。
[0060] 然后,在本实施方式的测定方法中,进行测定从上述的复合物发生的标记的工序。可根据在测定标记的种类使用以往公知的方法。在测定工序中,可测定标记来源的信号的强度或波长的变化等。由于测定结果反映被脂蛋白质运载的被标记的胆甾醇的量,所以成为脂蛋白质的运载能力的指标。从而,上述的测定方法也可称为基于自运载被标记的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体的复合物发生的标记,评价脂蛋白质的运载能力的方法。
[0061] 使用被荧光标记的胆甾醇时,可测定荧光强度。测定荧光强度的方法自体是现有技术中公知的,例如,可使用分光荧光光度计及荧光平板读数仪等的公知的测定装置,测定从复合物发生的荧光强度。再有,激发波长及荧光波长可根据使用的被荧光标记的胆甾醇的种类适宜决定。例如,使用上述的式(III)及式(IV)的被荧光标记的胆甾醇时,激发波长可在470~490nm、荧光波长可在525~550nm的范围确定。
[0062] 在本实施方式中,也可制备浓度已知的被标记的胆甾醇的稀释系列,测定这些标记,制成标准曲线。可基于此标准曲线,定量样品中的被脂蛋白质运载的被标记的胆甾醇。
[0063] 在本实施方式中,也可将有脱脂作用的试剂、例如,环糊精、CHAPS等的表面活性剂等添加到复合物之后,测定标记。通过添加这样的试剂,运载的被标记的胆甾醇自脂蛋白质漏出,所以可更正确地测定。
[0064] 在别的实施方式中,也可将用上述的测定方法得到的脂蛋白质的胆甾醇运载能力的结果用于受试者是脂质异常症与否的判断。即,提供辅助脂质异常症的判断的方法,其包括以下的工序:
[0065] 通过使自受试者得到的样品中的脂蛋白质和被标记的胆甾醇接触,使脂蛋白质运载被标记的胆甾醇的工序、
[0066] 通过使运载上述的被标记的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体接触,形成脂蛋白质和上述的抗体的复合物的工序、
[0067] 测定从上述的复合物发生的标记的工序、及
[0068] 基于测定结果,取得上述的受试者的脂质异常常关的信息的工序。
[0069] 通过由上述的测定方法蓄积自健康者及脂质异常症患者的样品得到的标记的测定结果的数据,可定关于脂蛋白质的胆甾醇运载能力的阈值或基准范围。然后,通过比较该阈值或基准范围和使用受试者的待测样品时的测定结果,可取得与该受试者的脂质异常相关的信息、即受试者的脂蛋白质的胆甾醇运载能力在正常或基准的范围内与否的信息。基于此信息,可辅助受试者是脂质异常症与否的判断。
[0070] 在别的实施方式中,提供用于在上述的测定方法中使用的试剂盒。即,提供脂蛋白质的胆甾醇运载能力测定用试剂盒(以下也简称为“试剂盒”),其含:含被标记的胆甾醇的第1试剂,及含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
[0071] 含被标记的胆甾醇的第1试剂的形态可为粉末,也可为溶液。另外,含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂的形态可为溶液,也可为冷冻干燥品。在本实施方式中,第1试剂和第2试剂优选各自保存在别的容器或个别地包装。再有,样品、被标记的胆甾醇、与脂蛋白质结合的抗体及这些的处理等的细节与对上述的测定方法的说明中描述的一样。在图5A显示本实施方式的试剂盒之一例。
[0072] 上述的试剂盒也可还含用于固定化与脂蛋白质结合的抗体的固相。此时,含被标记的胆甾醇的第1试剂及含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂和固相优选各自储存在别的容器或个别地包装。在图5B显示含固相的试剂盒之一例。再有,对固相的细节与对上述的测定方法的说明中描述的一样。
[0073] 在固相,与脂蛋白质结合的抗体、优选为也可抗ApoAI抗体被预先固定化。此时,试剂盒成为含有含被标记的胆甾醇的第1试剂,及固定化与脂蛋白质结合的抗体的固相的构成。在图5C显示本实施方式的试剂盒之一例。
[0074] 上述的试剂盒,根据需要也可还含用于稀释样品的水性介质、封闭剂、用于胆甾醇的酯化的脂肪酸或含其的组合物、及氧化剂等作为各自个别的试剂。再有,对这些的细节与对上述的测定方法的说明中描述的一样。
[0075] 接下来,由实施例详细地说明本发明,本发明不限于这些实施例。【实施例】
[0076] 【实施例1:由HDL的硼二吡咯亚甲基被标记的胆甾醇的酯化的探讨】[0077] 在活体内,HDL酯化胆甾醇而运载,所以在此实施例中,探讨BODIPY被标记的胆甾醇被HDL的LCAT活性依赖性地酯化与否。
[0078] 【(1-1)HDL级分的运载】
[0079] 向健康者来源的血清(0.1ml)添加等量的22%聚乙二醇4000(和光纯药工业株式会社),进行悬浮。将得到的悬浮液以室温静置20分钟后,以3000rpm以室温离心分离15分钟。然后,将上清作为HDL级分回收,将其于4℃保存。
[0080] 【(1-2)BODIPY被标记的胆甾醇的酯化】
[0081] 向上述得到的HDL级分(20μl)添加0.4μl作为LCAT抑制剂的100mM碘乙酰胺(IAA)(和光纯药工业株式会社)(终浓度2mM)或添加0.4μL100mM 5,5'-二硫代双(2-硝基安息香酸)(DTNB)(株式会社同仁化学研究所)(终浓度2mM)或添加等量的水,于37℃以800rpm振荡1小时。然后,取得到的含有HDL的液的一部分,使用ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)测定ApoAI浓度。再有,具体性的操作根据该试剂盒附带的手册进行。测定后,将含有HDL的液用反应缓冲液(含2%BSA及2mM脂质体(日本精化株式会社制)的PBS)稀释至ApoAI浓度成100μg/ml。再有,反应缓冲液中含的脂质体的组成是2mM二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、2mM胆甾醇及4mM氢加成大豆磷脂酰胆(HSPC)。另外,PBS是将磷酸缓冲盐片(Sigma-Aldrich公司)溶解于水而制备。向得到的稀释液(50μl)添加0.5μl的0.5mM BODIPY被标记的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids公司)(终浓度5μM)、于37℃以800rpm振荡一晚。然后,将得到的液在包被了硅胶的玻璃基板上用巴斯德移液器点斑,进行薄层层析(TLC)。作为展开溶剂,使用四氢呋喃(THF):己烷:醋酸=3:7:0.2的混合溶剂。将在基板上展开的被荧光标记的胆甾醇由荧光成像仪(PharosFX、Bio-Rad公司制)用488nm的激发波长进行检测。结果示于图1。
[0082] 【(1-3)结果】
[0083] 如图1所示,在使HDL和BODIPY被标记的胆甾醇接触的泳道(泳道No.2)中,检测到显示与BODIPY被标记的胆甾醇自体的移动距离不同的移动距离的条带,但在添加LCAT抑制剂的泳道(泳道No.3及No.4)中,检测不到那样的条带。此条带被认为是由HDL的LCAT酯化的BODIPY被标记的胆甾醇的条带。从而确认,BODIPY被标记的胆甾醇被健康者来源HDL的LCAT活性依赖性地酯化。
[0084] 【实施例2:由HDL的硝基苯并噁二唑(NBD)被标记的胆甾醇的酯化的探讨】[0085] 在此实施例中,探讨NBD被标记的胆甾醇是否被HDL的LCAT活性依赖性地酯化。
[0086] 【(2-1)NBD被标记的胆甾醇的酯化】
[0087] 向与实施例1同样自健康者来源的血清待测样品得到的HDL级分(20μl)添加0.4μl作为LCAT抑制剂的100mM IAA(终浓度2mM)或添加0.4μL 100mM DTNB(终浓度
2mM)或添加等量的水,于37℃以800rpm振荡1小时。然后,取得到的含有HDL的液的一部分,与实施例1同样测定ApoAI浓度。测定后,将含有HDL的液用反应缓冲液稀释至ApoAI浓度成100μg/ml。向得到的稀释液(50μl)添加1μl的1mM NBD被标记的胆甾醇(25-NBD Cholesterol、Avanti Polar Lipids公司)(终浓度20μM)、于37℃以800rpm振荡2小时。
然后,将得到的液在包被了硅胶的玻璃基板上用巴斯德移液器点斑,进行TLC。在展开溶剂,与实施例1使用相同的混合溶剂。将在基板上展开的被荧光标记的胆甾醇,由荧光成像仪(PharosFX、Bio-Rad公司制)用488nm的激发波长进行检测。结果示于图2。
[0088] 【(2-2)结果】
[0089] 如图2所示,在使HDL和NBD被标记的胆甾醇接触的泳道(泳道No.2)中,检测到显示与NBD被标记的胆甾醇自体的移动距离不同的移动距离的条带,但在添加LCAT抑制剂的泳道(泳道No.3及No.4)中,检测不到那样的条带。此条带被认为是由HDL的LCAT酯化的NBD被标记的胆甾醇的条带。从而确认,NBD被标记的胆甾醇被健康者来源HDL的LCAT活性依赖性地酯化。
[0090] 【实施例3:本实施方式的方法和以往方法的比较】
[0091] 在此实施例中,比较使用BODIPY被标记的胆甾醇及HDL捕获用抗体的本实施方式的方法和使用培养细胞的以往方法的测定结果,评价本实施方式的方法的性能。
[0092] 【(3-1)HDL级分的运载】
[0093] 与实施例1同样,使用PEG4000从人血清待测样品(n=12)得到HDL级分。将这些的HDL级分作为样品,在以下的操作中使用。
[0094] 【(3-2)由本实施方式的方法的测定】
[0095] 【(i)测定用板的准备】
[0096] 向作为固相的96孔微平板(荧光测定用黑色板H、住友Bakelite株式会社制)的各孔各添加200μl的50mM Tris-HCl(pH 7.5)而进行清洗。合计进行2次此清洗操作。向各孔各添加100μl用50mM Tris-HCl(pH 7.5)稀释至10μg/ml的浓度的抗ApoAI抗体(MONO5030、SANBIO公司)的溶液,于4℃静置一晚以上。除去抗体溶液,向各孔各添加
200μl的PBS而进行清洗。合计进行3次此清洗操作。向各孔各添加200μl的4%BSA/PBS,于25℃以500rpm振荡3小时。
[0097] 【(ii)测定用样品的制备(HDL和被标记的胆甾醇的接触)】
[0098] 取上述得到的各HDL级分的一部分,与实施例1同样测定ApoAI浓度。测定后,向各HDL级分添加等量的反应缓冲液至ApoAI浓度成0.1μg/ml以下进行稀释。向得到的各稀释液(300μl)各添加3μl的0.5mM BODIPY被标记的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids公司)(终浓度5μM),于37℃以800rpm振荡2小时。向得到的各液(303μl)各添加34μl氧化剂(8.8M过氧化氢、1.76mM亚硝酸钠及0.86mM DTPA)(各终浓度1M、0.2mM、0.1mM)。将这些于37℃以800rpm振荡1小时,得到含运载被标记的胆甾醇的HDL的测定用样品。
[0099] 【(iii)HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成及荧光强度的测定】
[0100] 从96孔微平板除去BSA溶液,向各孔各添加100μl各测定用样品。然后,将板于25℃以600rpm振荡1小时,使HDL和抗ApoAI抗体的复合物形成。从板除去测定用样品,向各孔各添加100μl的10mM环糊精/PBS,于25℃以600rpm振荡15分钟。然后,将荧光强度用荧光平板读数仪(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)测定(激发光485nm/荧光535nm)。
[0101] 【(3-3)由以往方法的测定】
[0102] 【(i)样品的制备】
[0103] 将小鼠巨噬细胞样细胞株J774A.1使用含有10%FBS的DMEM培养基(400μl培养基/孔),以70,000细胞/孔的浓度接种到48孔板(IWAKI制)。培养1天后,除去培养基,向孔各添加200μl含10mM甲基-β-环糊精、10%FBS、0.9μM BODIPY被标记的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids公司)及酚红的DMEM培养基。另外,作为对照,向别的孔各添加200μl含10mM甲基-β-环糊精、10%FBS、DMSO(900倍稀释)及酚红的DMEM培养基。然后,将细胞于37℃5%CO2的气氛下温育2.5小时。吸除培养基,将不含血清及酚红的DMEM培养基各400μl添加到各孔而进行清洗。然后,向各孔各添加200μl以HDL浓度0.78μg/ml含上述得到的HDL级分的不含血清及酚红的DMEM培养基。
另外,作为对照,向别的孔各添加200μl以6μg/ml的浓度含ApoAI重组蛋白质的不含血清及酚红的DMEM培养基。将板于37℃5%CO2的气氛下温育24小时。
[0104] 【(ii)荧光强度的测定】
[0105] 将各孔的培养上清移到新的96孔V底板,以室温以1600rpm离心分离2分钟。将得到的上清(180μl/孔)移到新的96孔平底黑色板(corning公司制或SUMILON公司制)。将上清的荧光强度用荧光平板读数仪(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)测定(激发光485nm/荧光535nm)。另一方面,向除去培养上清的48孔板的各孔各添加500μl的PBS而进行清洗。向各孔各添加500μl增溶缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1%CHAPS、
5mM EDTA(pH 8.0)及150mM NaCl)。然后,将板于25℃以450rpm振荡15分钟,使细胞溶解。从各孔各回收200μl细胞增溶液,添加到移了上清的96孔平底黑色板的对应的孔。将上清和细胞增溶液的混合物的荧光强度用荧光平板读数仪(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)测定(激发光485nm/荧光535nm)。
[0106] 【(3-4)比较】
[0107] 将由本实施方式的方法的测定结果取为横轴,将由以往方法的测定结果取为纵轴,标绘各血清待测样品的数据,则得到可近似直线的分布图。其示于图3。另外,由2
EXCEL(微软公司)求出决定系数R,是0.7602。从而确认,使用BODIPY被标记的胆甾醇及HDL捕获用抗体的HDL的胆甾醇运载功能的测定的结果与由使用培养细胞的以往方法的测定结果相关,本实施方式的方法显示与以往方法同程度的性能。
[0108] 【比较例:测定用样品的制备顺序的探讨】
[0109] 在此比较例中,对于由抗体的HDL的捕获后,以运载被荧光标记的胆甾醇的顺序进行测定的情况进行探讨。
[0110] 【(4-1)HDL级分的运载】
[0111] 与实施例1同样地,使用PEG4000从人血清待测样品(待测样品1及待测样品2)得到HDL级分。
[0112] 【(4-2)测定用板的准备】
[0113] 与实施例3的本实施方式的方法同样地,将抗ApoAI抗体(MONO5030、SANBIO公司)固相化到96孔微平板的各孔,用BSA溶液封闭,准备测定用板。
[0114] 【(4-3)荧光强度的测定】
[0115] 【(i)HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成】
[0116] 取上述得到的各HDL级分的一部分,与实施例1同样地测定ApoAI浓度。测定后,将各HDL级分用反应缓冲液稀释至ApoAI浓度成0.1μg/ml。向得到的各稀释液(300μl)各添加34μl氧化剂(1M过氧化氢、200μM亚硝酸钠及100μM DTPA),于37℃以800rpm振荡1小时。从上述的测定用板除去BSA溶液,向孔各添加100μl与氧化剂反应的HDL级分。另外,作为阴性对照,也准备未添加HDL级分的孔。然后,将板于25℃以600rpm振荡1小时,使HDL和抗ApoAI抗体的复合物形成。从板除去HDL级分,与实施例3同样地将各孔用PBS清洗3次。
[0117] 【(ii)HDL和被荧光标记的胆甾醇的接触及荧光强度的测定】
[0118] 混合3μl的0.5mM BODIPY被标记的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids公司)和300μl的反应缓冲液。混合得到的混合液(303μl)和氧化剂(34μl)。将得到的被标记的胆甾醇溶液各100μl添加到上述的板的各孔,于37℃以800rpm振荡1小时。从板除去被标记的胆甾醇溶液,将各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加
100μl的10mM环糊精/PBS,于25℃以600rpm振荡15分钟。然后,将荧光强度用荧光平板读数仪(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)测定(激发光485nm/荧光535nm)。
[0119] 【(iii)由夹心ELISA法的HDL的检测】
[0120] 从上述的测定后的板除去环糊精溶液,将各孔用PBS清洗3次。将ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)的山羊抗ApoAI血清用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍,向各孔各添加100μl得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时后,除去稀释液,将各孔用PBS清洗3次。将HRP标记兔抗山羊IgG多克隆抗体(P 0449、Dako公司)用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍,向各孔各添加100μl得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时后,除去稀释液,将各孔用PBS清洗3次。向各孔各添加100μl化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)。将板于25℃以600rpm振荡2分钟后,将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)进行测定。
[0121] 【(4-4)测定结果及考察】
[0122] 由ELISA法的HDL检测和荧光强度的测定的结果示于各自图4A及4B。如图4A所示确认,血清待测样品中的HDL被固定在板上的抗ApoAI抗体捕获。另一方面,如图4B所示,无关于使HDL级分和被荧光标记的胆甾醇接触,荧光强度是与未添加HDL的阴性对照同程度。从而知,由抗ApoAI抗体捕获HDL后,与被标记的胆甾醇接触,被标记的胆甾醇也不被HDL运载。
[0123] 【符号的说明】
[0124] 11:含被标记的胆甾醇的第1试剂
[0125] 22:含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂
[0126] 33:固相(96孔微平板)
QQ群二维码
意见反馈