微小RNA或其抑制剂在脂代谢调控中的应用 |
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| 申请号 | CN201310035358.3 | 申请日 | 2013-01-30 | 公开(公告)号 | CN103961706B | 公开(公告)日 | 2016-03-30 |
| 申请人 | 中国医学科学院医药生物技术研究所; | 发明人 | 洪斌; 王丽; 贾晓健; 姜华军; 杜郁; 杨帆; 司书毅; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及microRNA或其 抑制剂 的用途，具体涉及microRNA或其抑制剂在制备调节脂代谢的药物或制备 预防 或 治疗 脂代谢相关 疾病 的药物中的用途，所述microRNA包括miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种或数种。本发明还涉及所述microRNA或其抑制剂用于调节脂代谢相关蛋白表达 水 平的用途。本发明还涉及包含所述microRNA或其抑制剂的组合物。本发明所述的microRNA或其抑制剂可作为药物组成成分，应用于预防或治疗脂代谢紊乱导致的高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病等相关疾病。 | ||||||
| 权利要求 | 1.微小RNA(microRNA，miRNA)的抑制剂在制备调节脂代谢的产品或药物中的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 |
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| 说明书全文 | 微小RNA或其抑制剂在脂代谢调控中的应用技术领域[0001] 本发明涉及microRNA或其抑制剂的用途，具体涉及microRNA或其抑制剂在制备调节脂代谢的药物或制备预防或治疗脂代谢相关疾病的药物中的用途。另外，microRNA或其抑制剂可用于上述相关疾病或相关蛋白功能机理研究的工具药物。本发明还涉及所述microRNA或其抑制剂用于调节脂代谢相关蛋白表达水平的用途。本发明还涉及包含所述microRNA或其反义寡核苷酸抑制剂的组合物。 背景技术[0002] 动脉粥样硬化性心脑血管病是世界范围内最主要的致残和致死的疾病，血脂异常是动脉粥样硬化最重要的危险因素之一。寻找疗效显著安全可靠的血脂调节药物一直是医药工作者长期研究的课题。 [0003] 大量流行病学研究发现，动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的发病率和病死率与血浆高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平呈负相关，与血浆低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipopro-tein cholesterol,LDL-C)水平呈正相关。HDL-C浓度增加0.026mM，心血管事件的风险将减少2-3％；而LDL-C浓度减少2-3mM，心血管事件的风险将减少约40-50％。血浆高密度脂蛋白抗动脉粥样硬化功能主要通过其介导的胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)来实现的，HDL-C清除速度越快，胆固醇逆转运效率越高，动脉粥样硬化的发病率和死亡率越低。此外，HDL的心血管保护作用还与其抗炎及抗氧化活性有关。 [0004] 人B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B,member1,SR-BI)又称CD36和溶酶体整合膜蛋白II相关蛋白1(CD36and Lysosomal integral membrane protein-II Analogous-1,CLA-1)，是清道夫受体家族中的一个重要的膜整合糖蛋白。实验表明，SR-BI是参与小鼠肝细胞HDL相关胆固醇酯选择性吸收的关键分子。作为一个在肝脏中高表达的功能性高密度脂蛋白受体，SR-BI以高亲和力和高饱和度与HDL相结合介导HDL-C选择性摄取，这一过程是RCT的最后一个限速环节。肝细胞SR-BI过表达能够促进HDL-C逆转运，提高血浆HDL清除率，降低临床动脉粥样硬化及相关心血管疾病危险事件的发病率和致死率。 [0005] ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette,sub-family A,member1,ABCA1）是一个以ATP为能源转运各种底物的膜相关蛋白。巨噬细胞和肝细胞中ABCA1的功能最为突出：其以胆固醇为底物在细胞内脂质清除过程中起外排泵的作用。ABCA1基因突变与Tangier病和家族性高密度脂蛋白缺乏症有密切关系。巨噬细胞摄取的氧化型脂蛋白胆固醇以游离胆固醇的形式通过ABCA1介导外排与脂质缺乏的apoA-1结合形成前β-HDL（pre-β-HDL），这一过程是RCT的第一个限速环节，对脂质代谢和动脉粥样硬化的发生发展具有重要影响。 [0006] 低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)主要功能是通过摄取胆固醇进入细胞内，用于细胞增殖和固醇类激素及胆汁酸盐的合成等。LDL或其他含ApoB100，E的脂蛋白如VLDL、β-VLDL均可与LDL受体结合，内吞入细胞使其获得脂类，主要是胆固醇，这种代谢过程称为LDL受体途径（LDL receptor pathway），该途径依赖于LDL受体介导的细胞膜吞饮作用完成。LDLR基因的突变导致常染色体显性遗传性疾病及家族性高胆固醇血症。 [0007] 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γor PPARG)可与维甲酸X受体（retinoid X receptors,RXRs）形成异源二聚体调节多种基因的转录。PPAR-γ对脂肪细胞分化具有重要的调节作用。此外，PPAR-γ还与许多病理过程密切相关，如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和癌症。近来的研究发现，PPAR-γ可调控干预巨噬细胞内胆固醇和脂质的平衡，进而影响动脉粥样硬化的进程，这一调控过程与多个脂蛋白受体有关。研究表明，PPAR-γ可能通过抑制转录因子活化蛋白-1(activation protein-1,AP-1)的活性，抑制清道夫受体SR-A（scavenger receptor A）的表达，导致巨噬细胞摄取脂蛋白能力下降。在已分化的巨噬细胞，PPAR-γ配体还诱导SR-BI的表达，促进胆固醇从泡沫细胞外流。另有研究提示，PPAR-γ还可通过诱导ABCA1和SR-BI，刺激胆固醇逆向转运的关键步骤，从而促进胆固醇外流。 [0008] 微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类高度保守的单链非编码小RNA，由约20-22个单核苷酸组成，广泛存在于真核生物中，参与转录后水平或翻译水平的调控。microRNA在真核生物基因调控中起着重要作用，广泛参与了细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡等多种基本生命活动。microRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性等特征，通过与靶基因不完全互补结合，每个microRNA都具有调节多个mRNAs的潜能。microRNA表达水平的稳定对于生命体正常生理机能的发挥以及维持新陈代谢的动态平衡至关重要。 [0009] 近年研究发现，microRNA除了调控正常生理过程，对于肿瘤、糖脂代谢性疾病等众多病理过程中同样非常重要，在疾病的诊断与治疗中可能发挥关键性作用。microRNA在调控心血管系统的发育中及其病理过程中起重要作用，心肌肥厚、心脏衰竭、心肌梗死后重构和血管重塑等多种心血管疾病状态下，呈现出高度特异的microRNA表达模式。不同病理状态下，microRNA的表达谱不尽相同。肿瘤及心血管疾病等各种疾病状态下，差异表达的特异microRNA可作为生物学标记应用于各种疾病的诊断与分型。microRNA相关的疾病数据库也已经陆续建立起来。microRNA的细胞靶点与心血管疾病表型的相关性研究，阐明了新的生物学途径和病理机制。 [0010] microRNA表达量的增加或减少均能引发严重的病理后果，因此稳定靶器官中相应microRNA表达水平可能成为疾病治疗的一个新思路。在生物体内使用寡核苷酸抑制剂或microRNA，改变内源性microRNA丰度，人为控制体内单个或多个microRNA水平，使得以microRNA为基础的治疗策略应用于临床成为可能。如果这些方法能够安全有效的运用于人体，将大大促进心血管疾病等人类重大疾病问题的解决。 发明内容[0011] 本发明采用siRNA基因沉默技术将microRNA生成过程中的两个关键酶Dicer和Drosha表达抑制以后，胆固醇的逆向转运过程中的关键分子SR-BI基因mRNA水平显著上调。这提示microRNA在SR-BI表达调控中发挥重要作用。对预测的miRNAs的作用进行检测筛选，最终获得3个能够显著降低肝细胞SR-BI基因mRNA水平的miRNAs：microRNA-96（miR-96）、microRNA-185（miR-185）和microRNA-223（miR-223）。进一步对这3个miRNAs的生物学活性进行检测，证实了这三种microRNA或其抑制剂对于脂代谢过程中相关蛋白的调控作用，由此完成了本发明。 [0012] 本发明一个方面涉及微小RNA（microRNA，miRNA）的抑制剂在制备调节脂代谢的药物中的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 [0013] 本发明另一方面涉及微小RNA的抑制剂在制备预防或治疗脂代谢相关疾病的药物中的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种；其中所述脂代谢相关疾病例如为脂代谢紊乱导致的高脂血症（特别是高胆固醇血症、高甘油三酯血症等）、动脉粥样硬化、心脑血管疾病（特别是冠心病、心肌梗塞、中风等）、阿尔茨海默症、肥胖、糖尿病或代谢综合征等疾病。 [0014] 本发明另一方面涉及组合物，其含有微小RNA的抑制剂,所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种,所述组合物用于调节脂代谢，或者用于预防或治疗脂代谢相关疾病，所述脂代谢相关疾病例如为脂代谢紊乱导致的高脂血症（特别是高胆固醇血症、高甘油三酯血症等）、动脉粥样硬化、心脑血管疾病（特别是冠心病、心肌梗塞、中风等）、阿尔茨海默症、肥胖、糖尿病或代谢综合征等疾病。 [0015] 本发明另一方面涉及微小RNA用于下调细胞（例如离体的或在体的）中人B族Ⅰ型清道夫受体（SR-BI）表达水平的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 [0016] 本发明另一方面涉及微小RNA的抑制剂用于上调细胞（例如离体的或在体的）中人B族Ⅰ型清道夫受体表达水平的用途或者在制备用于上调细胞中人B族Ⅰ型清道夫受体表达水平的制剂中的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 [0017] 本发明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223用于下调细胞（例如离体的或在体的）中ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）表达水平的用途。 [0018] 本发明另一方面涉及miRNA-96和/或miRNA-223的抑制剂用于上调细胞（例如离体的或在体的）中ATP结合盒转运蛋白A1表达水平的用途或者在制备用于上调细胞中ATP结合盒转运蛋白A1表达水平的制剂中的用途。 [0019] 本发明另一方面涉及miRNA-185用于下调细胞（例如离体的或在体的）中低密度脂蛋白受体（LDLR）表达水平的用途。 [0020] 本发明另一方面涉及miRNA-185的抑制剂用于上调细胞（例如离体的或在体的）中低密度脂蛋白受体（LDLR）表达水平的用途或者在制备用于上调细胞中低密度脂蛋白受体（LDLR）表达水平的制剂中的用途。 [0021] 本发明另一方面涉及miRNA-96用于下调细胞（例如离体的或在体的）中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）表达水平的用途。 [0022] 本发明另一方面涉及miRNA-96的抑制剂用于上调细胞（例如离体的或在体的）中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）表达水平的用途或者在制备用于上调细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）表达水平的制剂中的用途。 [0023] 本发明另一方面涉及微小RNA的抑制剂在制备用于提高哺乳动物体内高密度脂蛋白（HDL）水平和/或降低血液中低密度脂蛋白（LDL）、胆固醇、甘油三酯水平的制剂或药物中的用途，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 [0024] 本发明另一方面涉及上调细胞（例如离体的或在体的）中人B族Ⅰ型清道夫受体、ATP结合盒转运蛋白A1、低密度脂蛋白受体或过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达水平的方法，所述方法包括给细胞施用微小RNA的抑制剂的步骤，或者包括将细胞与微小RNA的抑制剂相接触的步骤，所述微小RNA选自miRNA-96、miRNA-185和miRNA-223中的一种、两种或三种。 [0025] 本发明另一方面涉及一种筛选用于调节脂代谢、或者用于预防或治疗脂代谢相关疾病的药物的方法，所述方法包括筛选miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223的抑制剂的步骤；优选地，所述方法包括根据miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分别设计其反义RNA，或者将miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223分别与候选物质接触，分别检测各微小RNA的表达，并选择特异抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表达的物质。 [0026] 根据上述任一方面任一项的用途、方法或组合物，其中所述的微小RNA的抑制剂可以是能够抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223对靶基因的调控作用的任何物质,可以是在细胞中抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表达的物质，也可以是与各miRNA具有特异性相互作用，例如与各miRNA特异性结合的物质,或者抑制各miRNA与Dicer或RISC的相互作用的物质。 [0027] 根据上述任一方面任一项的用途、方法或组合物，所述的微小RNA或其抑制剂也可用于上述相关疾病或相关蛋白功能机理研究的工具药物。 [0028] 以下对本发明进行详述。 [0029] 在本发明中，所述调节脂代谢是指降低哺乳动物体内胆固醇水平、甘油三酯水平和/或低密度脂蛋白水平，和/或提高高密度脂蛋白水平。 [0030] 在本发明中，所述脂代谢相关疾病包括动脉粥样硬化、心脑血管疾病（特别是心肌梗塞、中风）、阿尔茨海默症、高脂血症（特别是高胆固醇血症、高甘油三酯血症）、肥胖、糖尿病和代谢综合征。 [0031] 在本发明中，所述微小RNA的抑制剂具有本领域公知的含义，其可以是能够特异抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223对靶基因的调控作用的任何物质,可以是在细胞中特异抑制miRNA-96、miRNA-185或miRNA-223表达的物质，也可以是与各miRNA具有特异性相互作用，例如与各miRNA特异性结合的物质,或者特异性抑制各miRNA与DICER或RISC的相互作用的物质。 [0032] 在本发明的实施方案中，所述微小RNA的抑制剂（反义寡核苷酸抑制剂，anti-miR）是指化学合成及修饰的、与特异miRNA序列（特别是核心序列，例如第2-8个核苷酸）互补、特异性抑制内生miRNAs功能的单链核酸分子，通过特异的靶向单个miRNA分子，从而削弱内源miRNA对其靶基因的调控作用，影响靶基因的表达（Stenvang J,Petri A,Lindow M,Obad S,Kauppinen S.，Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides，Silence.2012Jan9;3(1):1.doi:10.1186/1758-907X-3-1.）。反义寡核苷酸抑制剂可以有不同的长度和化学修饰，如磷酸骨架的硫代修饰，核糖的2’-O-烷基化修饰，包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基、2’-F等，以及肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）、锁核酸（locked nucleic acid,LNA）等修饰。 [0033] 当用于上述用途时，所述微小RNA或其抑制剂可以单独使用，也可以与其它分子连接后使用，例如与胆固醇、靶细胞受体等连接，或者连接入载体后使用。 [0034] 在本发明中，所述细胞是指含有miR-96、miR-185或miR-223作用位点、受miR-96、miR-185、miR-223或其抑制剂调控的细胞，特别是通过miR-96、miR-185、miR-223或其抑制剂能够调控其SR-BI蛋白或其它胆固醇或脂代谢相关蛋白的细胞。在本发明的实施方案中，所述细胞包括肝细胞（例如肝实质细胞）、单核巨噬细胞以及肝脏、肾脏、心脏、肠道、肺和脾脏组织内的细胞。 [0035] 在本发明中，所述上调或下调细胞中某蛋白的表达水平是指上调或下调细胞中某蛋白的mRNA水平或蛋白质水平；其中所述的上调或下调是与未进行干预的细胞进行比较。 [0036] 在本发明的实施方案中，结合实时定量RT-PCR和流式细胞技术，证实在肝细胞中miR-96、miR-185和miR-223均能显著下调SR-BI基因mRNA水平和蛋白水平的表达，而它们的反义寡核苷酸抑制剂则具有相反的作用。进而利用流式细胞术分析细胞对DiI-HDL的摄取发现：miR-96、miR-185和miR-223均能显著抑制肝细胞对DiI-HDL的摄取作用，而相应的反义寡核苷酸抑制剂则具有相反的作用。其中，当SR-BI基因沉默后，miR-185抑制肝细胞对DiI-HDL摄取的作用消失。证明miR-96、miR-185和miR-223能够有效调节胆固醇逆转运过程中的关键分子SR-BI。 [0037] 在本发明的实施方案中，为确定这些miRNAs的作用位点，利用PCR技术扩增获得不同长度的SR-BI基因3’非翻译区（3’UTR）片段以及相应miRNAs作用位点缺失的SR-BI基因3’UTR片段，并将这些片段构建到荧光素酶报告基因下游，通过转染HepG2细胞后荧光素酶活性检测发现，miR-96、miR-185和miR-223均能够显著抑制荧光素酶报告基因的表达，并利用核苷酸缺失的方法确定了其结合位点，miR-96、miR-185和miR-223位于SR-BI基因3’UTR片段的不同区域。联合作用结果证明，miR-96、miR-185和miR-223之间存在协同作用，共同调控SR-BI基因转录后水平的表达。 [0038] 在本发明的实施方案中，检测了小鼠不同组织中miR-96和miR-185的分布情况。miRNAs定量分析结果显示，miR-96和miR-185在小鼠肝脏中均有一定水平的分布。进一步检测了高脂饮食饲养的ApoE基因敲除小鼠肝脏中miR-96和miR-185的表达情况，结果显示，与正常饮食饲养小鼠相比，高脂饮食饲养鼠的血清总胆固醇水平和LDL胆固醇水平显著升高，呈现高脂血症特征，同时肝脏SR-BI表达显著增加，而miR-96和miR-185的表达水平显著降低。这种负相关性也进一步佐证了这些miRNAs与SR-BI之间的调控关系。 [0039] 鉴于巨噬细胞在SR-BI参与的胆固醇逆转运过程中的关键作用，在本发明的实施方案中，检测了miR-96、miR-185和miR-223在佛波酯（PMA）诱导的人单核巨噬细胞THP-1细胞中的分布和作用。结果显示，在巨噬细胞（PMA诱导的THP-1）中，miR-185和miR-96均可显著降低SR-BI的mRNA水平，而miR-223没有明显变化。 [0040] 在本发明的实施方案中，检测了miR-96、miR-185和miR-223，尤其是miR-185和miR-96对其他相关预测靶基因的调控作用。对RCT第一个限速环节的关键分子ABCA1研究表明，ABCA1基因3’UTR上存在miR-96和miR-223作用位点各一个。多物种序列比对结果证实它们具有高保守性。利用小分子RNA转染和Real-time RT-PCR技术分析表明，在肝细胞中miR-96和miR-223能显著下调ABCA1mRNA水平，它们的反义寡核苷酸抑制剂能显著上调ABCA1mRNA水平。这证实miR-96和miR-223能够有效调节ABCA1。 [0041] 在本发明的实施方案中，对LDLR的研究表明，LDLR3’UTR上存在两个miR-185作用位点，多物种序列比对结果证实此位点非常保守。利用小分子RNA转染和Real-time RT-PCR技术分析表明，在肝细胞中miR-185能显著下调LDLR mRNA水平，它们的反义寡核苷酸抑制剂能显著上调LDLRmRNA水平。这证实miR-185能够有效调节LDLR。 [0042] 在本发明的实施方案中，对于调节胆固醇和脂质代谢平衡的重要转录因子PPAR-γ的研究表明，其3’UTR上存在一个miR-96作用位点，多物种序列比对结果证实此位点非常保守。利用小分子RNA转染和Real-time RT-PCR技术分析表明，在肝细胞中miR-96能显著下调PPAR-γmRNA水平，它们的反义寡核苷酸抑制剂能显著上调PPAR-γmRNA水平。证实miR-96能够有效调节PPAR-γ。 [0043] 发明的有益效果 [0044] 本发明证实了miR-96、miR-185、miR-223作用于脂代谢过程中的一系列重要靶点，在脂代谢调节过程中发挥重要作用。可以将miR-96、miR-185、miR-223作为药物组成成分或生物标志物，或将其作为新型药物作用靶点应用其抑制剂作为药物组成成分，应用于预防或治疗脂代谢紊乱导致的高脂血症、动脉粥粥样硬化、冠心病等相关疾病。附图说明 [0045] 图1 Dicer或Drosha基因沉默对SR-BI mRNA水平的影响； [0046] 其中左图为Dicer或Drosha基因沉默后SR-BI mRNA的水平； [0047] 中图为Drosha基因沉默后Drosha mRNA的水平； [0048] 右图Dicer基因沉默后Dicer mRNA的水平； [0049] Scr-si表示siRNA对照序列（invitrogen，12935-200，12935-300，12935-400），Drosha-si（invitrogen，HSS120887）表示Drosha基因沉默组，Dicer-si（invitrogen，HSS118719）表示Dicer基因沉默组。 [0050] *P<0.05,**P<0.01，与scr-si相比。 [0051] 图2 SR-BI3’UTR上的mirR-96、miR-185、miR223的预测靶位点。 [0052] 图3 SR-BI3’UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223预测靶点在多个物种中呈现的序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml猕猴；Ssc猪；Bta牛；Eca马；Cfa犬；Fca猫；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；Ocu兔；Ete猬） [0053] 图4 miR-96、miR-185和miR-223及其拮抗剂对SR-BI mRNA和蛋白表达水平的调控作用；其中， [0054] A表示Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-185及其反义寡核苷酸抑制剂至人肝癌细胞HepG2或Bel-7402和人正常肝细胞HL-7702，作用不同时间后测定的SR-BI mRNA和蛋白水平； [0055] B表示Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-96、miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2后，SR-BI mRNA及蛋白表达水平的变化。 [0056] *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001， 与 ctl-miR(miR) 相 比 ;#P<0.05， 与ctl-miR(anti-miR)相比。（其中图A中的con miR与图B中的ctl-miR相同） [0057] 图5 miR-96、miR-185和miR-223与SR-BI3’UTR直接作用位点确证；其中，[0058] A表明当SR-BI3’UTR片段中存在miR-185的相应预测靶点时，miR-185能够显著降低荧光素酶报告基因表达活性；当SR-BI3’UTR片段中不存在miR-185的相应预测靶点时，miR-185不呈现降低荧光素酶报告基因表达活性的效应； [0059] B表明当SR-BI3’UTR片段中存在miR-96和miR-223的相应预测靶点时，miR-96和miR-223能够显著降低荧光素酶报告基因表达活性； [0060] C表明miR-96、miR-185和miR-223单独或联合作用时对荧光素酶报告基因表达活性的效应，证实这些miRNAs之间存在协同作用； [0061] 其中anti-miR表示miRNA的拮抗剂（反义寡核苷酸抑制剂），ctl-miR表示对照miRNA（5'-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'，SEQ ID NO：7），pc-luc表示不含有SR-BI3’UTR的对照质粒；U1对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段（959bp）的全长，U2对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段中第120-959bp,U3对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段中第312-959bp；U4对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段中第498-959bp；U5对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段中第664-959bp；U6对应的核苷酸序列为SR-BI3’UTR片段中第870-959bp；WT代表野生SR-BI3’UTR片段，DEL1代表缺失了miR-185结合位点1的SR-BI3’UTR片段，DEL2代表缺失了miR-185结合位点2的SR-BI3’UTR片段。 [0062] *P<0.05,**P<0.01，与ctl-miR相比;#P<0.05,##P<0.01，与野生载体相比。 [0063] 图6 miR-96、miR-185和miR-223对肝细胞Dil-HDL摄取的影响； [0064] A：Lipofectamine RNAiMAX reagent瞬时转染miR-185或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2、Bel-7402和正常肝实质细胞HL-7702，作用72小时后，在2μg/mL Dil-HDL中孵育4小时后，流式细胞检测肝细胞对Dil-HDL的摄取； [0065] B：Lipofectamine RNAiMAX reagent瞬时转染miR-96、miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2，作用72小时后，在2μg/mLDil-HDL中孵育4小时后，流式细胞检测肝细胞对Dil-HDL的摄取； [0066] ctl-miR表示对照miRNA，anti-miR表示miRNA的拮抗剂； [0067] *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001， 与 ctl-miR(miR) 相 比 ;#P<0.05， 与ctl-miR(anti-miR)相比。 [0068] 图7 SR-BI基因在miR-185介导的抑制肝细胞摄取Dil-HDL过程中的作用；其中ctl-miR表示对照miRNA，scr-si表示siRNA对照，SR-BI-si表示SR-BI基因沉默组。 [0069] **P<0.01,***P<0.001,NS,没有显著差异。 [0070] 图8 ABCA13’UTR上存在的miR-96和miR-223预测靶点。 [0071] 图9 ABCA13’UTR上存在的miR-96和miR-223预测靶点在多个物种中呈现的序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Ame大熊猫；Mmu小鼠）。 [0072] 图10 miR-96、miR-223及其拮抗剂对ABCA1mRNA水平的调节作用；其中anti-miR表示miRNA的拮抗剂，ctl-miR表示miRNA对照。 [0073] **P<0.01，与ctl-miR(miR)相比;##P<0.01，与ctl-miR(anti-miR)相比。 [0074] 图11 LDLR3’UTR上存在的两个miR-185预测靶点。 [0075] 图12 LDLR3’UTR上存在的miR-185预测靶点在多个物种中呈现的序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Bta牛）。 [0076] 图13 miR-185及其拮抗剂对LDLR mRNA水平的调节；其中anti-miR表示miRNA的拮抗剂，ctl-miR表示miRNA对照。 [0077] **P<0.01，与ctl-miR(miR)相比;#P<0.05，与ctl-miR(anti-miR)相比。 [0078] 图14 PPAR-γ3’UTR上存在的一个miR-96预测靶点。 [0079] 图15 PPAR-γ3’UTR上存在的miR-96预测靶点在多个物种中呈现的序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Ssc猪；Bta牛；Fca猫；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga鸡）。 [0080] 图16 miR-96及其拮抗剂对PPAR-γmRNA水平的调节；其中anti-miR表示miRNA的拮抗剂，ctl-miR表示miRNA对照。 [0081] **P<0.01，与ctl-miR(miR)相比;##P<0.01，与ctl-miR(anti-miR)相比。 [0082] 图17高脂饲养小鼠肝脏中miR-96和miR-185的表达水平，其中第一幅图表示小鼠体重，第二幅图表示总胆固醇水平，第三幅图表示LDL水平，第四幅图表示miR-96和miR-185的丰度，chow表示正常饮食喂养组，HFD表示高脂饮食喂养组。 [0083] *P<0.05,**P<0.01，与ctl-miR相比。 [0084] 图18 miR-96、miR-185和miR-223对巨噬细胞SR-BI mRNA水平和Dil-HDL摄取的影响，ctl-miR表示miRNA对照，chow表示正常饮食喂养组，HFD表示高脂饮食喂养组。 [0085] *P<0.05,**P<0.01,n=6(chow)and n=5(HFD)。 [0086] 图19 HDL对miR-185和SR-BI mRNA水平的调节，其中veh表示溶剂对照。 [0087] *P<0.05,**P<0.01，与veh(miR-185)相比;#P<0.05，与veh(SR-BI)相比。 [0088] 图20 miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同组织或细胞中的分布；其中 [0089] A表示miR-96、miR-185在不同组织（肝、肾、心脏、肠道、肺和脾）中的丰度，[0090] B表示miR-96、miR-185或miR-223在不同细胞（人肝癌细胞HepG2、Bel-7402、正常肝实质细胞HL-7702和PMA诱导24小时后的巨噬细胞THP-1）中的丰度。 具体实施方式[0091] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0092] 材料和方法 [0093] 1材料 [0094] 1.1质粒、细胞株和动物真核细胞表达载体pGL3-Basic和pcDNA3.1均为美国Promega公司产品；人肝癌细胞株HepG2、Bel-7402和HL-7702为本实验室保存（其中HepG2购自ATCC，HB-8065，后两者购自中国医学科学院基础研究所）；ApoE敲除小鼠购自北京大学医学部。 [0095] 1.2主要试剂DNA细胞裂解液及荧光素酶检测系统（Luciferase Assay System）、RNA提取试剂盒（SV Total RNA Isolation System）均购自美国Promega公司；转染试TM剂（Lipofectamine 2000）、逆转录试剂盒（SuperScript III First-Strand）均购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量RT-PCR试剂盒（FastStart Universal SYBR Green PCR Master）购自Roche公司；小RNA提取试剂盒（miRNeasy Mini Kit）、小RNA逆转录试剂盒（miScript II RT Kit）、荧光定量检测试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均购自美国Qiagen公司；MEM细胞培养基购自美国Thermo公司；胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸和G418抗生素购自美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。 [0096] 1.3仪器MiniCycle PTC-200型PCR仪为美国MJ Research公司产品；EnVision多功能微孔板检测仪为美国PerkinElmer公司产品；实时荧光定量PCR仪iQ5Multicolor Real-Time PCR为Bio-Rad公司产品。 [0097] 2方法 [0098] 2.1pc-luc-3'UTR重组质粒的构建将通过PCR获得的CLA-13'UTR 序列（NM_005505）克隆至pc-luc质粒（将荧光素酶报告基因插入pcDNA3.1质粒载体多克隆位点中，构建质粒pc-luc）荧光素酶报告基因下游，获得重组质粒pc-luc-3'UTR。测序鉴定。 [0099] 2.2细胞培养及转染HepG2等细胞培养于含10%胎牛血清、1mmol/L丙酮酸钠和1%非必需氨基酸的MEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。转染用质粒的提取TM 5方法按PureYield Plasmid Midiprep System试剂盒说明书进行。将1×10个HepG2细胞接种于30mm培养皿中，待细胞贴壁生长汇聚程度达到80%左右时，利用脂质体TM Lipofectamine 2000或Lipofectamine RNAiMAX将pc-luc-3’UTR或miRNAs瞬时转染至HepG2细胞，转染相应时间后后进行检测。 [0100] 2.3实时荧光定量PCR提取细胞的总RNA，采用试剂盒SuperScript III First-Strand(Invitrogen)或miScript II RT Kit合成cDNA，采用 GeneExpression Master Mix或miScript SYBR Green PCR Kit进行荧光定量PCR反应，利用数据分析软件分析并计算Ct值。以GAPDH或U6为内参，采用相对Ct的方法对荧光素酶基因的转录水平进行定量。 [0101] 2.4细胞表面蛋白表达水平检测将细胞以1×105个/ml的密度接种于24孔细胞培养板中，处理后消化收集细胞，4%多聚甲醛固定细胞4h，以1ml含5%FBS的PBS将细胞重悬并于4°C静置15min，分别加入一抗（1:500）、FITC标记二抗（1:1000）各孵育50min，PBS漂洗后于300目尼龙膜过滤，经流式细胞仪检测。各组细胞样品的平均检测细胞数为10,000个，每组细胞的相对荧光强度以对数积分图表示。 [0102] 2.5细胞摄取DiI-HDL功能检测利用流式细胞仪检测化合物对细胞摄取DiI-HDL5 的影响。HepG2等细胞传代后以1×10个/ml的细胞密度接种于24孔细胞培养板上，处理后，加入2μg/ml DiI-HDL于37°C孵育4h。消化收集细胞并重悬于700μl PBS中，过 300目尼龙网后经流式细胞仪检测细胞荧光值。每个样品平均检测10,000个细胞，每组细胞的相对荧光强度用对数积分图表示。 [0103] miRNA的筛选过程 [0104] 预测miRNA分别转染HepG2细胞，利用实时荧光定量RT-PCR检测miRNA对SR-BI表达的影响。 [0105] 筛选到的miRNA为miR-96、miR-185和miR-223，其序列分别为： [0106] hsa-miR-96 [0107] 5’–uuuggcacuagcacauuuuugcu-3’（SEQ ID NO：1） [0108] hsa-miR-185 [0109] 5’-uggagagaaaggcaguuccuga-3’（SEQ ID NO：2） [0110] hsa-miR-223 [0111] 5’-ugucaguuugucaaauacccca-3’（SEQ ID NO：3） [0112] 本 发 明 的 miRNA购 自 QIAGEN 公 司，hsa-miR-96 为 Cat.no.MSY0000095，hsa-miR-185为Cat.no.MSY0000455，hsa-miR-223为Cat.no.MSY0004570。 [0113] 实施例1，miR-96、miR-185和miR-223调节胆固醇逆转运的重要靶点SR-BI。 [0114] 1.1、Dicer和Drosha基因沉默对SR-BI mRNA水平的影响 [0115] 用siRNA基因沉默技术敲除microRNA生物合成过程中的两个关键酶Dicer和Drosha后，Real-time RT-PCR法检测SR-BI mRNA水平。 [0116] 实验结果表明，Dicer或Drosha基因沉默后，SR-BI mRNA水平显著上调，说明microRNA参与了SR-BI的调控（如图1所示）。 [0117] 1.2、miR-96、miR-185和miR-223及其拮抗剂对SR-BI mRNA和蛋白表达水平的调控作用。 [0118] 本发明的miRNA拮抗剂（anti-miR）购自QIAGEN公司，其序列和货号分别为： [0119] anti-miR-96（Cat.no.MIN0000095） [0120] 5’–agcaaaaaugugcuagugccaaa–3’（SEQ ID NO：4） [0121] anti-miR-185（Cat.no.MIN0000455） [0122] 5’–ucaggaacugccuuucucucca–3’（SEQ ID NO：5） [0123] anti-miR-223（Cat.no.MIN0004570） [0124] 5’–ugggguauuugacaaacugaca–3’（SEQ ID NO：6） [0125] miRNA拮抗剂对照购自QIAGEN公司，其货号为Cat.no.1027271。 [0126] Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-96、miR-185、miR-223及其反义寡核苷酸抑制剂至人肝癌细胞HepG2或Bel-7402和人正常肝细胞HL-7702，作用48或72小时后，RNA小量提取试剂盒（Promega）提取细胞总RNA，cDNA合成试剂盒(Invitrogen)逆转录，Real-time RT-PCR法测定SR-BI mRNA水平。Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-96、miR-185、miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2、Bel-7402和正常肝实质细胞HL-7702，作用48或72小时后，流式细胞仪检测SR-BI蛋白表达水平变化。 [0127] 实验结果表明，肝细胞中miR-96、miR-185和miR-223均能显著下调SR-BI mRNA和蛋白表达水平（如图5所示）。 [0128] 1.3、靶向SR-BI基因3’UTR的miRNA预测及靶位点同源性分析 [0129] MicroRNA.org(http://www.microrna.org) 和 TargetScan(http://www.targetscan.org)等在线软件预测miR-96、miR-185和miR-223等miRNAs直接作用于SR-BI3’UTR（NM_005505）。利用Clustal X2软件对多个物种的SR-BI3’UTR序列进行比对。 [0130] 预测结果如图2所示，SR-BI3’UTR上存在miR-96和miR-223预测靶位点各一个，存在miR-185预测靶位点两个。序列比对结果如图3所示，SR-BI3’UTR上存在的miR-96、miR-185和miR-223预测靶点在多个物种中呈现序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Mml猕猴；Ssc猪；Bta牛；Eca马；Cfa犬；Fca猫；Mmu小鼠；Cpo豚鼠；Rno褐家鼠；Ocu兔；Ete猬）。 [0131] 1.4、miR-96、miR-185和miR-223与SR-BI3’UTR直接作用位点确证。 [0132] 将荧光素酶报告基因插入pcDNA3.1质粒载体多克隆位点中，构建质粒pc-luc。按miR-96、miR-185和miR-223预测靶点的位置，PCR法分段扩增不同长度的SR-BI3’UTR片段或者使用overlap PCR法将SR-BI3’UTR上miR-185预测靶点删除，得到的一系列不同长度的SR-BI3’UTR片段插入至pc-luc质粒载体荧光素酶报告基因下游。瞬时转染法，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将所构建的含有一系列SR-BI3’UTR片段的pc-luc质粒载体与miR-96、miR-185和miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂转染至HepG2细胞，作用48小时后，荧光素酶报告基因分析技术检测荧光素酶报告基因表达活性。 [0133] 如图4所示的实验结果表明：当SR-BI3’UTR片段中存在miR-96、miR-185和miR-223的相应预测靶点时，miR-96、miR-185和miR-223能够显著降低荧光素酶报告基因表达活性；当SR-BI3’UTR片段中不存在miR-96、miR-185和miR-223的相应预测靶点时，miR-96、miR-185和miR-223不呈现降低荧光素酶报告基因表达活性的效应。实验结果确证了miR-96、miR-185和miR-223在SR-BI基因3’UTR上的作用靶位点。进一步实验证实这些miRNAs之间存在协同作用。 [0134] 1.5、miR-96、miR-185和miR-223对肝细胞摄取Dil-HDL（Dil荧光标记的高密度脂蛋白）的影响。 [0135] Lipofectamine RNAiMAX reagent(Invitrogen)瞬 时 转 染 miR-96、miR-185、miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2、Bel-7402和正常肝实质细胞HL-7702，作用72小时后，在2μg/mL Dil-HDL中孵育4小时后，流式细胞检测肝细胞对Dil-HDL的摄取。 [0136] 实验结果显示：转染miR-96、miR-185、miR-223后，肝细胞Dil-HDL摄取明显降低；转染miR-96、miR-185、miR-223的反义寡核苷酸抑制剂后，三种肝细胞的Dil-HDL摄取明显升高。表明miR-96、miR-185、miR-223能够抑制肝细胞对HDL的摄取，而miR-96、miR-185、miR-223的反义寡核苷酸抑制剂能够增加肝细胞对HDL的摄取（如图6所示）。 [0137] 1.6、SR-BI基因在miR-185介导的抑制肝细胞摄取Dil-HDL过程中的作用。 [0138] 用siRNA基因沉默技术敲除SR-BI基因后，HepG2细胞SR-BI蛋白表达显著降低。瞬时转染miR-18572小时后，2μg/mL Dil-HDL中孵育4小时后，流式细胞术检测肝细胞Dil-HDL摄取。 [0139] 如图7所示实验结果表明，SR-BI基因沉默后，miR-185下调Dil-HDL摄取的作用消失，证明miR-185通过SR-BI基因发挥抑制肝细胞摄取Dil-HDL的作用。 [0140] 实施例2，miR-96和miR-223对胆固醇逆转运的重要靶点ABCA1的调节。 [0141] 2.1、miR-96、miR-223与ABCA13’UTR作用靶点预测及同源性分析。 [0142] MicroRNA.org和TargetScan预测miR-96和miR-223与ABCA13’UTR的作用位点。利用Clustal X2软件对多个物种的ABCA13’UTR的miR-96和miR-223预测靶点序列进行比对。 [0143] 预测结果如图8所示，ABCA13’UTR上存在miR-96和miR-223预测靶点各一个。序列比对结果如图9所示，ABCA13’UTR上存在的miR-96和miR-223预测靶点在多个物种中呈现序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Ame大熊猫；Mmu小鼠）。 [0144] 2.2、miR-96、miR-223及其拮抗剂对ABCA1mRNA水平的调节作用 [0145] Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-96和miR-223或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2，作用72小时后，RNA小量提取试剂盒（Promega）提取细胞总RNA，cDNA合成试剂盒(Invitrogen)逆转录，Real-time RT-PCR法测定mRNA水平。 [0146] 实验结果如图10所示，miR-96和miR-223能显著降低HepG2细胞ABCA1mRNA水平，而其反义寡核苷酸抑制剂能显著提高HepG2细胞ABCA1mRNA水平。 [0147] 实施例3，miR-185及其拮抗剂对LDLR的调节。 [0148] 3.1、miR-185与LDLR3’UTR直接作用靶点预测及同源性分析。 [0149] MicroRNA.org和TargetScan预测miR-185与LDLR3’UTR的作用位点。利用Clustal X2软件对多个物种的LDLR3’UTR的miR-185预测靶点序列进行比对。 [0150] 预测结果如图11所示，LDLR3’UTR上存在miR-185预测靶点两个。序列比对结果如图12所示，LDLR3’UTR上存在的miR-185预测靶点在多个物种中呈现序列保守性（Hsa人；Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Bta牛）。 [0151] 3.2、miR-185及其拮抗剂对LDLR mRNA水平的调节 [0152] Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-185或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2，作用72小时后，RNA小量提取试剂盒（Promega）提取细胞总RNA，cDNA合成试剂盒(Invitrogen)逆转录，Real-time RT-PCR法测定mRNA水平。 [0153] 实验结果如图13所示，miR-185能显著降低HepG2细胞LDLR mRNA水平，而其反义寡核苷酸抑制剂能显著提高HepG2细胞LDLR mRNA水平。 [0154] 实施例4，miR-96及其拮抗剂对PPAR-γ的调节。 [0155] 4.1、miR-96与PPAR-γ3’UTR直接作用靶点预测及同源性分析。 [0156] MicroRNA.org和TargetScan预测miR-96与PPAR-γ3’UTR作用位点。Clustal X2软件对多个物种的PPAR-γ3’UTR的miR-96预测靶点序列进行比对。 [0157] 预测结果如图14所示，PPAR-γ3’UTR上存在miR-96预测靶点。序列比对结果如图15所示，PPAR-γ3’UTR上存在的miR-96预测靶点在多个物种中呈现序列保守性（Hsa人； Ptr黑猩猩；Pab苏门答腊黑猩猩；Ssc猪；Bta牛；Fca猫；Mmu小鼠；Rno褐家鼠；Gga鸡）。 [0158] 4.2、miR-96及其拮抗剂对PPAR-γmRNA水平的调节 [0159] Lipofectamine RNAiMAX转染试剂瞬时转染miR-96或其反义寡核苷酸抑制剂至肝癌细胞HepG2，作用72小时后，RNA小量提取试剂盒（Promega）提取细胞总RNA，cDNA合成试剂盒(Invitrogen)逆转录，Real-time RT-PCR法测定mRNA水平。 [0160] 实验结果如图16所示，miR-96能显著降低HepG2细胞PPAR-γmRNA水平，而其反义寡核苷酸抑制剂能显著提高HepG2细胞PPAR-γmRNA水平 [0161] 实施例5，miR-96、miR-185和miR-223在脂代谢调节中的作用。 [0162] 5.1、HDL对miR-185和SR-BI mRNA水平的调节。 [0163] HDL孵育肝癌细胞HepG2后，Real-time RT-PCR法测定miR-185的丰度和SR-BI mRNA水平。 [0164] 实验结果表明，miR-185的丰度呈现明显的剂量依赖性下调效应，而SR-BI mRNA水平呈现明显的剂量依赖性上调效应（如图19所示）。说明miR-185和SR-BI均参与到HDL介导的脂质调节过程。 [0165] 5.2、miR-96、miR-185或miR-223在ApoE基因敲除小鼠不同组织或细胞中的分布。 [0166] 取ApoE基因敲除小鼠的肝脏、肾脏、心脏、肠道、肺和脾等器官以及人肝癌细胞HepG2、Bel-7402、正常肝实质细胞HL-7702和PMA诱导24小时后的巨噬细胞THP-1等细胞系，Real-time RT-PCR法测定miR-96、miR-185和miR-223在不同组织或细胞中的丰度。 [0167] 实验结果显示，miR-185和miR-96在小鼠肝脏、肾脏和心脏等器官及人肝细胞和巨噬细胞等细胞系中均呈现高表达，而miR-223在人巨噬细胞中呈现高表达（如图20所示）。 [0168] 5.3、高脂饲养小鼠肝脏中miR-96和miR-185的表达水平。 [0169] ApoE基因敲除小鼠高脂饲料喂养8周，眼眶取血测定其血清总胆固醇水平和LDL胆固醇水平。同时取肝脏，Real-time RT-PCR法（Qiagen）测定miR-96和miR-185的丰度。 [0170] ApoE基因敲除小鼠高脂饲料喂养8周后，血清总胆固醇水平和LDL胆固醇水平明显升高，肝脏miR-96和miR-185的表达明显下调，而SR-BI的表达水平显著升高（如图17所示）。 [0171] 5.4、miR-96、miR-185和miR-223对巨噬细胞SR-BI mRNA水平和Dil-HDL摄取的影响。 [0172] Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)瞬时转染miR-96、miR-185、miR-223至PMA诱导24小时的巨噬细胞THP-1，作用72小时。Real-time RT-PCR法检测SR-BI mRNA水平，或在2μg/mL Dil-HDL中孵育4小时后，流式细胞检测巨噬细胞对Dil-HDL的摄取。 [0173] 实验结果显示：转染miR-96、miR-185和miR-223后，巨噬细胞SR-BImRNA水平均下调。转染miR-185后，Dil-HDL摄取显著降低，而转染miR-96后，Dil-HDL摄取显著升高（如图18所示）。 |
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