血清中甘油三酯的循环酶测定方法专利检索- 涉及脂质的检测例如免疫测定或酶测定专利检索查询-专利查询网

血清中甘油三酯的循环酶测定方法
申请号	CN201310601423.4	申请日	2013-11-20	公开(公告)号	CN103913581A	公开(公告)日	2014-07-09
申请人	天津市宝坻区人民医院;			发明人	李立和; 郑宝永; 王彦平; 李铮; 刘果艳;
摘要	本发明公开了一种血清中甘油三酯的循环酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。技术方案是：试剂 I中含有甘油激酶、3- 磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油氧化酶、过氧化物酶、三磷酸腺苷、NADH、4- 氨基安替比林、2，4-二氯酚等有效成分；试剂II仅有脂蛋白脂肪酶有效成分。血清游离甘油在试剂I中甘油激酶，3-磷酸甘油脱氢酶，磷酸甘油氧化酶，过氧化物酶催化下与三磷酸腺苷、NADH、氧气、4-氨基安替比林、2，4-二氯酚等循环反应生成醌亚胺，加入试剂II后，甘油三酯水解生成甘油，再进行循环反应，仪器以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。
权利要求	1.一种血清中甘油三酯的循环酶测定方法，其特征在于循环酶及底物同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为：血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I进行循环反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～ 7分钟，甘油三酯水解后产生甘油再经循环反应生成醌亚胺；反应达到一定时间后，仪器在 500～520nm 波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量，计算公式为： ODTG＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)] 甘油三酯浓度＝F×ODTG 其中ODTG是甘油三酯产生的吸光度，OD1是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R1V1是试剂I的体积，R2V2是试剂II的体积，F是校正因数。 2.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法，其特征在于第一步和第二步反应均采用循环酶法测定甘油，生成红色醌亚胺进行测定。 3.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法，其特征在于试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～300mmol、2，4-二氯酚1.0mmol～3.0mmol、MgSO49.0mmol～15.0mmol、胆酸钠3.0mmol～5.0mmol、三磷酸腺苷1.5mmol～2.5mmol、甘油激酶100U～160U、磷酸甘油氧化酶1200U～2000U、过氧化物酶1000U～1400U、4-氨基安替比林1.5mmol～2.5mmol、甘油-3-磷酸脱氢酶1200U～2000U、NADH0.8mmol～ 1.2mmol、Proclin-300防腐剂100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～300mmol、脂蛋白脂肪酶1800U～2100U、Triton X-1000.08g～0.16g、Proclin-300防腐剂100μl～300μl。 4.根据权利要求3所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法，其特征在于试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6±0.2。 5.根据权利要求3所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法，其特征在于测定的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝3∶300～500∶30～70。
说明书全文	血清中甘油三酯的循环酶测定方法技术领域 [0001] 本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的循环酶测定方法。背景技术 [0002] 血清中甘油三脂(TG)的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。本发明介绍一种循环酶法测定血清中的甘油三酯，甘油三酯(TG)在脂蛋白脂肪酶(LPL)催化下生成甘油和脂肪酸，甘油和ATP在甘油激酶(GK)催化下生成甘油-3-磷酸(G-3P)，被带入循环反应中，通过磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化为磷酸二羟丙酮(DHAP)，DHAP被甘油-3磷酸+脱氢酶(G-3PDH)又还原为G-3P，同时伴有NADH向NAD 的转化，在反复循环中G-3P和DHAP的量不变，而产物H2O2累积的量决定于反应时间和每分钟循环次数，因此，其灵敏度大大超过一般的酶法分析，检测产物H2O2可偶联过氧化物酶(POD)，可通过Trinder反应比色测定。 [0003] 其理论推导如下： [0004] 测定反应如图2。 [0005] [0006] 设SV＝1.5μl，R1＝200μl，R2＝50μl，t1＝3min，t2＝5min，甘油三酯线性范围11.00mmol/L，血清中游离甘油病理高值为0.60mmol/L。 [0007] 根据公式推导： [0008] [0009] [0010] [0011] 已知若TG线性范围为11.0mmol/L，SV＝1.5μl，R1＝200μl，R2＝50μl，t1＝3min，t2＝5min。 [0012] [0013] Vmax＝381.6U/L [0014] 在试剂I中的LPL的浓度为：643.9U/L×251.5/50＝1919.45U/L [0015] [0016] 已知： [0017] 在第一步反应中：-6 [0018] [FG]＝11.6mmol/L×1.5/1.5+200+50＝65.606×10 mol/L-3 [0019] [ATP]＝2×200/1.5+200+50＝1.59×10 mol/L [0020] 约为122倍 [0021] 则公式可变为： [0022] [0023] [0024] 根据公式： [0025] Vmax＝100.4U/L [0026] 甘油激酶的用量为：100.4U/L×251.5/200＝126.29U/L [0027] 磷酸甘油氧化酶用量： [0028] [G-3-P]＝[FG]＝65.606×10-6mol/L [0029] 根据公式： [0030] Vmax＝1211U/L [0031] 磷酸甘油氧化酶在试剂I中的浓度应为：1211U/L×251.5/200＝1523U/L[0032] 3-磷酸甘油脱氢酶的用量：-3 [0033] [NADH]在试剂I中的配置浓度为1.0mmol/L，在反应液的浓度为1.59×10 mol，远大于公式可按单底物反应进行计算，根据公式 [0034] [0035] 3-磷酸甘油脱氢酶的用量为：428U/L [0036] 在试剂I中浓度为：428U/L×251.5/200＝538.2U/L，在循环酶法中为使得DHAP迅速转化为甘油-3磷酸，工具酶用量应为3×538.2U/L＝1615U/L [0037] 过氧化物酶的用量为： [0038] 在试剂I中2，4-二氯酚的配置浓度为2.0mmol/L，4-氨基安替比林的浓度为2.0mmol/L，由于反应体系中远大于米氏常数，故上式可变为： [0039] [0040] [0041] [0042] 已知其中[H2O2]＝69.18×10-6mol/L [0043] 大于[H2O2]为终点法测定，反应时间为2min [0044] [0045] 工具酶过氧化物酶的用量为： [0046] Vmax＝120.56μmol/min.L＝103.19U/L [0047] 在试剂I中浓度为：103.19U/L×251.5/200＝389U/L，在循环酶法中为使得H2O2迅速转化为醌类化合物，应使工具酶用量达到3倍，所以，工具酶用量应为3×389U/L＝1167U/L。 [0048] 根据反应式及酶动力学方程计算出工具酶及底物用量，酶类激活剂及防腐剂，该试剂盒的配方为：试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～300mmol、2，4-二氯酚1.0mmol～3.0mmol、MgSO49.0mmol～15.0mmol、胆酸钠3.0mmol～5.0mmol、三磷酸腺苷 1.5mmol～2.5mmol、甘油激酶100U～160U、磷酸甘油氧化酶1200U～2000U、过氧化物酶 1000U～1400U、4-氨基安替比林1.5mmol～2.5mmol、甘油-3-磷酸脱氢酶1200U～2000U、NADH0.8mmol～1.2mmol、Proclin-300防腐剂100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～300mmol、脂蛋白脂肪酶1800U～2100U、TritonX-1000.08g～ 0.16g、Proclin-300防腐剂100μl～300μl。 [0049] 生化分析仪检测血清中TG采用的是酶法，一般采用LPL、GPO、POD、4-氨基安替比林和酚等试剂的方法(GPO-PAP法)。本发明采用甘油循环酶法进行测定，首先血清内游离甘油进行甘油循环酶法进行测定，产生红色醌亚胺，加入第二试剂后，脂蛋白脂肪酶水解甘油三酯产生甘油，甘油与反应体系中循环酶和底物反应，在适当的时间内测定，以第一步产生的醌亚胺为空白，以第二步反应产生的醌亚胺为测定反应，计算出甘油三酯的浓度，本发明的技术特点是更适合微量检测，受脂血、黄疸、溶血影响小。发明内容： [0050] 为了解决现有技术中血清中TG的测定方法存在内源性甘油干扰的问题，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、能够消除内源性甘油影响的血清甘油三酯测定方法。 [0051] 解决该技术问题采用的技术方案是：双色原物质及循环酶同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为：血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后经一系列反应生成红色的醌亚胺。仪器在500nm 波长处检测，以试剂I反应的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。 [0052] 上述试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、2，4-二氯酚2.0mmol、MgSO412.0mmol、胆酸钠4.0mmol、三磷酸腺苷2.0mmol、甘油激酶130U、磷酸甘油氧化酶1600U、过氧化物酶1200U、4-氨基安替比林2.0mmol、甘油-3-磷酸脱氢酶1600U、NADH1.0mmol、Proclin300防腐剂200μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、脂蛋白脂肪酶1950U、Triton X-1000.12g、Proclin300防腐剂200μl。 [0053] 上述试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6±0.2。 [0054] 上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝3∶300～500∶30～70。 [0055] 本发明试剂I中含有甘油激酶、3-磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油氧化酶、过氧化物酶、三磷酸腺苷、NADH、4-氨基安替比林、2，4-二氯酚等有效成分；试剂II仅有脂蛋白脂肪酶有效成分。血清中游离甘油在试剂I中甘油激酶，3-磷酸甘油脱氢酶，磷酸甘油氧化酶，过氧化物酶催化下与三磷酸腺苷、NADH、氧气、4-氨基安替比林、2，4-二氯酚等循环反应生成红色醌亚胺，加入试剂II后，甘油三酯水解后生成甘油，再进行循环反应生成红色醌亚胺，仪器在500～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。本发明检测时不受内源性甘油影响，其使用方法和范围与原有酶法相同，是一种更适宜微量检测的甘油三酯检测方法。 [0056] 本发明与现有技术相比有如下优点：不受内源性甘油影响，线性范围可达11.0mmol/L。其使用方法和范围与原有酶法相同，不会增加实验人员的负担，不增加试剂成本，经济方便易行，受脂血、黄疸、溶血等影响小，是一种准确性更高的TG检测方法。附图说明 [0057] 附图是本发明测定健康人体TG的反应曲线图。图2是甘油三酯分解及甘油循环反应图。具体实施方式： [0058] 下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。 [0059] 实施例1 [0060] 试剂的组成： [0061] a.试剂I： [0062] 试剂 I每升Tris-HCl缓冲液内含 Tris200mmol、2，4-二氯酚 2.0mmol、MgSO412.0mmol、胆酸钠4.0mmol、三磷酸腺苷2.0mmol、甘油激酶130U、磷酸甘油氧化酶1600U、过氧化物酶1200U、4-氨基安替比林2.0mmol、甘油-3-磷酸脱氢酶1600U、NADH1.0mmol、Proclin300防腐剂200μl。 [0063] b.试剂II： [0064] 试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、脂蛋白脂肪酶1950U、Triton X-1000.12g、Proclin300防腐剂200μl。 [0065] 上述试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6±0.2。 [0066] c.标准液：2.0mmol/L三油酸酯水溶液。 [0067] 其中，MgSO4为甘油激酶的激活剂，Triton X-100为表面活性剂，Proclin-300为液体高效防腐剂，胆酸钠为抑菌剂。 [0068] 实施例2. [0069] 测定程序 [0070] 在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将1.5μl样品加入到200μl试剂I中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂II混匀，37℃孵育5分钟，全自动分析仪在500nm波长处检测，仪器自动计算出TG结果，具体见表1。 [0071] 表1 本发明自动化生化分析仪测试条件 [0072] [0073] 反应ODTG计算值＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)] [0074] 甘油三酯浓度＝F×ODTG [0075] 其中ODTG是甘油三酯产生的吸光度。OD1是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R1V1是试剂I的体积，R2V2是试剂II的体积。F是校正因数。 [0076] 加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由甘油三酯产生的醌亚胺的吸光度为：ODTG＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即ODTG＝OD2-(1.5+200)/(1.5+200+50)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出甘油三酯的浓度。 [0077] 下面通过采用三种不同的方法检测血清中的甘油回收率，来进一步说明本发明的积极效果。甘油回收率是反应后测定的甘油数值与加入的甘油数值的比值的百分率，在本反应中甘油为甘油三酯的等比产物，甘油测定回收率以加入的甘油不影响甘油三酯测定为最好，即甘油回收率越低，说明甘油对甘油三酯测定影响越低，甘油未计入甘油三酯测定值内。 [0078] 1.检测对象：健康体检人员86人，其中男性52人，平均年龄42.5岁；女性34人，平均年龄39.5岁，空腹采血。 [0079] 2.采用方法及试剂 [0080] 2.1 试剂： [0081] (1)方法A：试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、2，4-二氯酚2.0mmol、MgSO412.0mmol、胆酸钠4.0mmol、三磷酸腺苷2.0mmol、甘油激酶130U、磷酸甘油氧化酶1600U、过氧化物酶1200U、4-氨基安替比林2.0mmol、甘油-3-磷酸脱氢酶1600U、NADH1.0mmol、Proclin300防腐剂200μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、脂蛋白脂肪酶1950U、Triton X-1000.12g、Proclin300防腐剂200μl。 [0082] (2)方法B：试剂I与试剂II按4∶1配置成单一试剂进行测定，测定波长500nm，反应时间8.1min。 [0083] (3)方法C：高效液相色谱法采用岛津LC-10A高效液相色谱仪，流动相为含1％异丙醇和0.5％乙腈的正己烷，流速1.2mL/min，检测波长230nm。 [0084] (4)甘油(分析纯，sigma公司，分子量92.09，密度为1.2613mg/dl，25℃)。 [0085] 2.2.仪器：日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪；岛津LC-10A高[0086] 效液相色谱仪。 [0087] 2.3.方法 [0088] 2.3.1 分别用试剂A、B、C三种方法测定86份健康人群甘油三脂水平，[0089] 并进行结果比较。 [0090] 2.3.2 将上述血清混合配制成混合血清，分别加入0、0.85、1.70、3.40mmol/L甘油，分别用试剂A、B两种方法测定，比较两种方法的回收试验。 [0091] 2.3.3 测定方法 [0092] 方法A：样品∶试剂I∶试剂II＝1.5∶200∶50，37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5分钟，500nm波长处终点法测定。 [0093] 试剂B：样品∶试剂＝1∶100，37℃，反应时间8.1分钟，500nm波长处终点法测定。 [0094] 方法C 流动相为含1％异丙醇和0.5％乙腈的正己烷，流速1.2ml/min，检测波长230nm。取样品制备中的正己烷层直接进样，测定总甘油(TTG)时进样体积5μl，测定游离甘油时10μl。将标准溶液的浓度对甘油/内标峰面积比进行线性回归，得回归方程，用于样品甘油浓度计算，总甘油与游离甘油之差即为真正甘油三酯的值。 [0095] 3.三种方法测定TG比较： [0096] 通过统计学分析：采用方法A与C测定结果无显著性差异，t＝0.97，P＝0.4215，相关性良好，r＝0.9701，Y方法A＝1.2031+0.9620X方法C；方法A可以消除游离甘油干扰，而方法B不能消除游离甘油影响，见表2；采用方法A与B测定结果有显著性差异，t＝9.65，P＝0.0031。 [0097] 表2.回收实验数据表 [0098] [0099] 本发明方法中，在第一步预孵育期，游离甘油转化为醌亚胺，在加入试剂II后，启动TG水解反应，TG转化为醌亚胺，反应曲线见图1，仪器将第一步反应产生的红色醌亚胺为空白，以第二步反应产生的醌亚胺计算出TG的含量，为真正TG含量。 [0100] 方法B单一试剂中，游离甘油和TG同时反应生成醌亚胺，计算结果为游离甘油和TG之和。高效液相色谱法可分别测定出总甘油和游离甘油的值，不受游离甘油影响。 [0101] 经过以上比较可看出，本发明试剂II仅有脂蛋白脂肪酶，其它为试剂I，通过改变试剂I、II的组分能够保证血清中甘油三酯检测的准确性。

意见反馈