诺里蛋白或诺里氏疾病蛋白(Norrin or Norrie disease protein，NDP或Ndph)中之 突变导致诺里氏疾病(Norrie disease，ND)，X连锁隐性神经系统综合征(伯格(Berger) 等人，1992自然遗传学(Nat.Genet.)1：199-203和陈(Chen)等人，1992自然遗传学 (Nat.Genet.)1：204-208；例如，对人类序列来说，NCBI寄存编号为AAH29901、 BC029901和CAA46639，且对小家鼠(Mus musculus)序列来说，为CAA58725、CAA63134 和X83794)。编码NDP的基因位于人类基因组上的Xpl1.4处。疾病特征包括视网膜发 育不良、眼盲和精神发育迟滞。NDP剔除小鼠具有眼睛表型，其类似人类诺里氏疾病(莱 姆(Rhem)等人，2002J.神经科学(Neuroscience)22：4286-4292)且展示视网膜血管 生成不足。这一基因也与寇茨氏病(Coats disease)(视网膜毛细血管扩张)、X连锁渗 出性玻璃体视网膜病(X-linked exudative vitreoretinopathy，EVRX)和晚期早产儿视网 膜病(retinopathy of prematurity，ROP)有关。
NDP突变也可引起X连锁形式的隐含一些ND症状的家族性渗出性玻璃体视网膜病 (Familial Exudative Vitreoretinopathy，FEVR)。FEVR也由编码Wnt信号转导的10种蛇 型7次跨膜受体中的一种的卷曲蛋白4(Fz4)基因中的突变引起(罗比泰(Robitaille) 等人，2002自然遗传学(Nat.Genet.)32：326-330)。
Wnt家族由19个成员组成，且其展示与10种卷曲蛋白(Fz)的高亲和力相互作用。 不同Wnt对各种卷曲蛋白具有不同亲和力且可服务于不同通路(吴(Wu)等人，2002生 物化学杂志(J.Biol.Chem.)277：41762-41769)。Wnt典型通路包括通过与卷曲蛋白 和其辅助受体脂蛋白相关受体蛋白5或6(LRP5/LRP6)相互作用的β-联蛋白稳定化。 在患者和小鼠中，LRP5中功能突变的损失除骨质疏松症外也展示血管眼部缺陷且产生 骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(osteoporosis-pseudoglioma syndrome，OPPG)(龚 (Gong)等人，2001细胞(Cell)207：513-523和加藤(Kato)等人，2002细胞生物学 杂志(J.Cell Biol.)157：303-314)。
诺里蛋白可诱导Wnt-β-联蛋白通路(许(Xu)等人，2004细胞(Cell)116：883-895)。 诺里蛋白功能与Wnt非常类似，因为两者都需要Fz受体和LRP5/LRP6辅助受体来传导 信号，且两者都主要与Fz的半胱氨酸富集域(cysteine rich domain，CRD)以纳摩尔亲 和力结合(谢(Hsieh)等人，1999国家科学研究院学报(Proc.Nat′l.Acad.Sci.)96： 3546-3551；吴(Wu)等人，2002生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277：41762-41769和 许(Xu)等人，2004细胞(Cell)116：883-895)。诺里蛋白为分泌型富半胱氨酸小蛋白 质；其形成二硫键联型寡聚物且保持与细胞表面和胞外基质关联(皮里兹·维拉 (Perez-Vilar)等人，1997生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：33410-33415)。由序列比 较和模型研究，已提出诺里蛋白与TGF-β(梅丁格(Meitinger)等人，1993自然遗传学 (Nat.Genet.)5：376-380)、冯威勒布兰德因子(von Willebrand′s factor)和粘蛋白(mucin) (梅因德尔(Meindl)等人，1992自然遗传学(Nat.Genet.)2：139-143)具有三级结构 相似性。诺里蛋白基因主要表达于脑和视网膜中(伯格(Berger)等人，1992自然遗传 学(Nat.Genet.)1：199-203和陈(Chen)等人，1992自然遗传学(Nat.Genet.)1： 204-208)。
正不懈搜寻用于治疗与骨重塑相关的疾病的药物候选物。成人骨架处于动态中，不 断被破坏且通过破骨细胞和成骨细胞的协同作用重塑于小梁(也称为疏松)骨表面上和 哈弗斯系统(haversian system)中。骨重塑的破坏会导致疾病及病状，诸如骨质疏松症 (经绝期后骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、移植诱导的骨质疏松症和青少 年骨质疏松症)、佝偻病、骨软化、肿瘤诱导的骨软化、低磷酸酯酶症、佩吉特氏病(Paget′s disease)等等。因此，需要更透彻地阐述控制骨重塑的通路和鉴别那些级联中适用于开 发药剂的标靶，其中所述药剂调节所述标靶。

本文中所述的物质和方法提供对诺里蛋白在Wnt通路中通过其与LRP5和6和卷曲 蛋白4的相互作用参与骨重塑和脂质代谢调节的更详细阐述，且通常提供使用诺里蛋白 和与诺里蛋白相互作用的化合物(例如诺里蛋白激动剂)来筛检适用于调节骨病症和脂 质调节的化合物的检定。也涵盖用于鉴别诺里蛋白模拟物以及LRP5/卷曲蛋白4/诺里蛋 白复合物的其它模拟物的方法和物质。
因此，一方面针对鉴别调节骨或脂质的药剂的方法，其包含：(a)在存在所述药剂 的情况下，具有卷曲蛋白4或生物学活性卷曲蛋白4多肽以及LRP5蛋白或生物学活性 LRP5蛋白；和(b)确定所述药剂是否为与卷曲蛋白4和/或LRP5或卷曲蛋白4或LRP5 的生物学活性多肽相互作用且在存在所述药剂的情况下，调节骨和/或脂质的至少一个参 数的药剂。一方面为使卷曲蛋白4或生物学活性卷曲蛋白4多肽片段与LRP5蛋白或 LRP5的生物学活性多肽片段连接；其可呈融合蛋白形式。正由所述方法筛检的药剂可 为诺里蛋白模拟物以及诺里蛋白的激动剂和拮抗剂。
另一方面针对鉴别调节骨代谢或脂质代谢的药剂的方法，其包含：(a)在存在所述 药剂的情况下，使诺里蛋白或生物学活性诺里蛋白多肽片段和卷曲蛋白4或生物学活性 多肽片段与LRP5和/或LRP6蛋白或其生物学活性多肽片段融合；和(b)活体外或活 体内测量骨调节和/或脂质调节的至少一个参数以鉴别调节骨代谢或脂质代谢的药剂。
用于任何所讨论方法的骨调节参数可为骨密度、骨强度、小梁数目、骨尺寸或组织 结缔性或其任何组合中的任一或多个。任何这些筛检方法中所讨论的脂质调节参数可包 括HDL、VLDL、胆固醇、甘油三酯、apoE或LDL的含量的变化。这些方法中的筛检 剂的另一方面为了解其是否改变与脂质代谢或骨代谢相关的基因的表达模式。举例来 说，其是否改变所调节的COX-2、Jun、Fos、细胞周期素D1(cyclin D1)、Wnt1OB、 SFRP1、联接蛋白43(connexin 43)、eNOS、Wnt10B、细胞周期素D1、卷曲蛋白2和 WISP2中一或多个的表达。
所述方法可进一步包括Dkk蛋白或生物学活性Dkk多肽片段和/或克曼蛋白 (Kremen)或生物学活性克曼蛋白多肽片段和/或Wnt蛋白或生物学活性Wnt多肽片段。
另一方面，涵盖鉴别调节诺里蛋白-卷曲蛋白4活性的药剂的方法，其包含：(a)有 所述药剂、诺里蛋白或诺里蛋白的生物学活性多肽片段和卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生 物学活性多肽片段，其与LRP5和/或LRP6或LRP5和/或LRP6的生物学活性多肽片段 融合，或与含有LRP5或LRP6的多肽片段的配体结合域(ligand binding domain，LBD) 融合，和下列各物：
(i)克曼蛋白或克曼蛋白的生物学活性多肽片段；和/或
(ii)Dkk蛋白或Dkk的生物学活性多肽片段；
和
(b)确定所述药剂是否调节诺里蛋白-卷曲蛋白4活性。所述药剂可为诺里蛋白模拟 物、诺里蛋白激动剂、Dkk拮抗剂或克曼蛋白拮抗剂。其也可用于评估卷曲蛋白4激动 剂和LRP5激动剂。
对这些方法中的某些来说，可使所述蛋白质或所述蛋白质的生物学活性多肽片段附 着于诸如PVDF或硝化纤维的衬底上。
另一方面涵盖鉴别调控骨调节或脂质调节的药剂的方法，其包含：(a)向表达卷曲 蛋白4和LRP5的细胞投与所述药剂，其中卷曲蛋白4为卷曲蛋白4蛋白或卷曲蛋白4 的生物学活性多肽片段且LRP5为LRP5蛋白或LRP5的生物学活性多肽片段；(b)确 定所述测试药剂的投药是否调节LRP5-卷曲蛋白4相互作用；和(c)确定所述药剂是否 调节骨参数和/或脂质参数。这一方法的一方面涵盖细胞不表达诺里蛋白，其适用于鉴别 诺里蛋白模拟物。另一方面为表达非内源性卷曲蛋白4、LRP5、LRP6和/或诺里蛋白的 细胞且使用所述细胞(例如)来鉴别诺里蛋白激动剂。
另一方面涵盖鉴别调控骨调节或脂质调节的药剂的方法，其包含：(a)向表达 LRP5、诺里蛋白和卷曲蛋白4的细胞投与测试药剂，其中LRP5为LRP5蛋白或LRP5 的生物学活性多肽片段，诺里蛋白为诺里蛋白或生物学活性诺里蛋白多肽，且卷曲蛋白 4为卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段；(b)确定所述测试药剂的投药是 否调节诺里蛋白-卷曲蛋白4相互作用；和(c)确定所述测试药剂是否调节骨调节或脂 质调节的参数。其涵盖视情况表达非内源性诺里蛋白、LRP5和/或卷曲蛋白4的细胞。 或者所述细胞可不表达内源性诺里蛋白、LRP5、LRP6和/或卷曲蛋白4。
所测试的任何药剂可为诺里蛋白模拟物、Dkk拮抗剂或克曼蛋白拮抗剂以及卷曲蛋 白4激动剂和模拟物、诺里蛋白激动剂和LRP5激动剂。
在所涵盖的任何方法或细胞中，所述细胞可为脊椎动物细胞。脊椎动物细胞可包括 (但不限于)骨细胞、肾细胞、间叶细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞或非洲爪蟾细胞(Xenopus cell)。
在任何所讨论的方法、试剂盒、细胞/细胞系中，Dkk可为Dkk1、Dkk2、Dkk3或 Dkk4或Dkk1、Dkk2、Dkk3或Dkk4的生物学活性多肽。同样地，对克曼蛋白来说，当 在任何方面中引用克曼蛋白时，其可为克曼蛋白1或克曼蛋白2或克曼蛋白1或克曼蛋 白2的生物学活性多肽。Wnt也可为Wnt1至Wnt19中的任一者(例如，Wnt1、Wnt3、 Wnt3a或Wnt10b)或其中任一者的生物学活性片段。
用于任何所述方法和试剂盒的细胞系可包括(但不限于)KHOS/NP细胞、 KHOS-240S细胞、KHOS-321H细胞、DSDh细胞、VA-ES-BJ细胞、7F2细胞、U2OS 细胞、HOSTE85细胞、ROS细胞、MC3T3-E6细胞、UMR-106细胞、Saos2细胞、MG63 细胞、HOB细胞、间叶干细胞(例如，成人间叶干细胞)、C3H10T1/2细胞、HEK293A 细胞或HEK293T细胞。
也涵盖用于筛检调节骨代谢和脂质代谢的药剂的动物。动物模型包括转基因动物。 举例来说，所述动物可为表达LRP5或HBM的转基因动物。或者，所述动物可为基因 剔除动物，其中剔除LRP5、LRP5、诺里蛋白、Dkk、克曼蛋白、Wnt和卷曲蛋白4中 的一或多者。或者，所述动物也涵盖组合的剔除和引入基因。所述动物可为任何脊椎动 物，诸如非洲爪蟾或小鼠。
另一实施例涵盖用于鉴别调节诺里蛋白-卷曲蛋白4活性的药剂的试剂盒，其包含： (a)一系列用编码卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段和LRP5或LRP5的 生物学活性多肽片段的核酸共转染的不能表达诺里蛋白的细胞；(b)视情况用于共表达 于一系列共表达卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段和LRP5或LRP5的生 物学活性多肽片段的细胞中的Dkk核酸；(c)视情况用于共表达于一系列共表达卷曲蛋 白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段和LRP5或LRP5的生物学活性多肽片段的细 胞中和/或用于共表达于一系列共表达卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段、 LRP5或LRP5的生物学活性多肽片段和Dkk或Dkk的生物学活性片段的细胞中的克曼 蛋白核酸；(d)视情况用于共表达于一系列共表达卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活 性多肽片段和LRP5或LRP5的生物学活性多肽片段的细胞中的LRP6核酸；和(e)视 情况用于共表达于一系列共表达卷曲蛋白4或卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段和 LRP5或LRP5的生物学活性多肽片段的细胞中的Wnt核酸。
另一方面涵盖缺乏原生诺里蛋白且表达非原生LRP5和非原生卷曲蛋白4的细胞或 细胞系，其中非原生LRP5为非原生LRP5蛋白且非原生卷曲蛋白4为非原生卷曲蛋白4， 其中LRP5为完全蛋白质或LRP5的生物学活性多肽片段且卷曲蛋白4为完全蛋白质或 卷曲蛋白4的生物学活性多肽片段，且诺里蛋白为完全蛋白质或诺里蛋白的生物学活性 多肽片段。这些蛋白质的表达可为瞬时表达或稳定表达。另一方面涵盖LRP5、LRP6、 卷曲蛋白4、Dkk和/或克曼蛋白的非原生(非内源性)表达，其中这些蛋白质中的任一 者可为完整蛋白质或其生物学活性多肽片段。
另一方面涵盖单独或于具有合适医药学上可接受之赋形剂和/或载剂的医药组合物 中的由上述任一种方法所鉴别的药剂。所述药剂可用于治疗脂质病症与或骨病症或用于 调配用于治疗这些病症中的一种的药物。
应了解，上文一般性描述和下文详细描述为例示性和说明性描述，且意欲对所主张 的本发明提供进一步说明。
附图说明
包括在本文中以对所揭示的物质和方法提供进一步理解且并入并构成本说明书的 一部分的随附图式说明实施例。
图1：诺里蛋白活化U2OS成骨细胞样细胞中的TCF信号转导，但不活化HEK-293A 细胞中的TCF信号转导。在人胚肾(HEK)HEK-293A细胞和U2OS细胞中用TCF-luci 和海肾报导体进行瞬时共转染检定。条形图表现TCF-luci的发光信号与海肾信号的比 率，其正规化pcDNA载体中使用不同cDNA构筑体的各种转染之间的反应。
图2：卷曲蛋白4(Fz4)共转染在HEK-293A细胞中诱导出诺里蛋白介导的TCF 信号且在U2OS细胞中增强所述信号。条形图展示使用以cDNA的各种组合瞬时转染 HEK-293A和U2OS细胞所获得的TCF-luci反应的结果。
图3：诺里蛋白诱导的LRP5-Fz4-TCF信号在U2OS细胞中可受Dkk1和克曼蛋白2 协同抑制。
图4：使用LRP5-G171V突变(HBM表型)情况下诺里蛋白介导的TCF信号与在 Dkk1和克曼蛋白2存在下使用LRP5情况下诺里蛋白介导的TCF信号相比受到较小抑 制。

自从发现三种基因NDP、卷曲蛋白4(Fz4)和脂蛋白相关受体蛋白5(LRP5)参 与视网膜的血管形成受到关注，对这些细胞系的研究揭示其在分子水平上相互作用；且 诺里蛋白为LRP5-Fz4复合物的配体。有趣地注意到，诺里蛋白介导的LRP5/6的活化涉 及Fz4而不涉及Fz家族的其它5个成员(即，mFZ3、hFZ5、mFz6、mFz7和mFz8)。 然而，诺里蛋白对Fz4具有特异性且不与Wnt展示任何显著的序列同源性。
人类和小鼠中的LRP5突变已揭示LRP5和Wnt信号在骨代谢中所发挥的关键作用 (龚(Gong)等人，2001细胞(Cell)207：513-523；加藤(Kato)等人，2002细胞生物 学杂志(J.Cell Biol.)157：303-314；博伊登(Boyden)等人，2002新英格兰医学期刊 (N.Engl.J.Med.)346：1513-1521和利特尔(Little)等人，2002美国人类遗传学学报 (Am.J.Hum.Genet.)70：1-19)。与野生型LRP5相比，LRP5的第一螺旋桨域中的G171V (高骨质量或“HBM”类型)突变和其它此类突变导致HBM变异体对Dikkopf1(Dkk1) 蛋白的亲和力降低(博伊登(Boyden)等人，2002新英格兰医学期刊(N.Engl.J.Med.) 346和艾(Ai)等人，2005分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)25：4946-4955)。HBM 突变导致Dkk1对其的抑制降低和活体外HBM突变体介导的Wnt-β-联蛋白信号的活化。 推测这一现象为对具有HBM型突变的人类和转基因小鼠中的高骨质量(HBM)表型来 说重要的潜在分子机制(巴比基(Babij)等人，2003骨矿物质研究杂志(J.Bone Mineral Res.)18：960-974)。
Dkk1为LRP5/6-Wnt信号的分泌型拮抗剂中的一种(格林卡(Glinka)等人，1998自 然(Nature)391：357-362；川野(Kawano)等人，2003细胞科学杂志(J.Cell.Sci.)116： 2627-2634和巴菲克(Bafico)等人，2001自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)3：683-686)。 另外，在存在另一类型的单次跨膜受体克曼蛋白1/2的情况下，Dkk1通过使LRP5-Dkk1- 克曼蛋白三元复合物内化而增强对通过Wnt所介导的LRP5/6-TCF信号的抑制(毛(Mao) 等人，2002自然(Nature)417：664-667)。克曼蛋白与LRP5/6和Dkk1一起在细胞表 面上形成三元复合物以促进其内化或内吞作用。克曼蛋白促进LRP5和LRP6由细胞膜 快速内吞且进而阻断LRP5/6-Wnt信号转导。本文中所揭示的物质和方法由如下推测产 生：给定细胞类型中的这些相互作用子(interactor)的表达模式可调控Wnt信号转导或 在诸如成骨细胞的细胞中再对LRP5/6功能产生特异性。应注意，除非特定陈述，否则 在提及Dkk1的所有情况下，可用任何其它Dkk单独或组合替换。
对克曼蛋白2(Krm2)的四种剪接变异体的分析揭示一种在羧基末端缺乏44个胺 基酸的变异体，其可增强Dkk1介导的对LRP5/6的抑制(毛炳宇(B.Mao)等人，“克 曼蛋白是调控Wnt/β-联蛋白(beta-Catenin)信号转导的地可夫受体”(＂Kremen proteins are Dickkopf Receptors that Regulate Wnt/beta-Catenin Signaling＂)2002自然(Nature) 417(6889)：664-667)。使用全长Krm2克隆可见Dkk1增强的最大效应。Krm2活性通过 其与Dkk1的第二半胱氨酸富集域的相互作用来介导。Krm2也可在HEK-293A细胞中使 LRP6-Wnt信号活化剂Dkk2转变为抑制剂。应注意，除非特定陈述，否则在提及克曼蛋 白2的所有情况下，可用克曼蛋白1单独或与克曼蛋白2组合替换。
本文中所揭示的物质和方法是针对诺里蛋白、卷曲蛋白4、LRP5或LRP5的HBM 变异体(例如G171V)之间的功能性相互作用。如本文中所述，诺里蛋白在U2OS骨细 胞中使G171V-LRP5突变体的TCF信号适当增强超过使用LRP5所观察到的信号。诺里 蛋白也导致Dkk1和/或克曼蛋白2对通路的抑制降低。本文中揭示使用诺里蛋白作为筛 检剂来寻找为诺里蛋白模拟物和诺里蛋白激动剂的试剂的物质和方法。所述诺里蛋白调 节剂和诺里蛋白模拟物可适用于骨调节。诺里蛋白调节剂和诺里蛋白模拟物包括(但不 限于)小化学分子、多肽、肽、siRNA和免疫球蛋白。
1.缩写和定义
1.1缩写
本说明书中已使用下列缩写。虽然这些简称和缩写在其它领域中可具有不同含义， 但其在本说明书中如下文所指示或单独区分。
ACP5                       酸性磷酸酶5
Akt-3                      蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)或RAC-PK
AIPASE                     碱性磷酸酶
ALPHA                      扩增发光邻近同源检定
APE                        接头相关蛋白1
AP1B1                      接头蛋白复合物AP-1，β1亚单元
AXIN                       axin
b.i.d.                     每日两次
BGN                        骨特异性双糖链蛋白聚糖(biglycan)
BMC                        骨矿物质含量
BMD                        骨矿物质密度
BMP1                       骨形态发生蛋白1
BMP4                       骨形态发生蛋白4
BMU                        骨重塑单元
BSA                        牛血清白蛋白
BTG2                       抗增生性B细胞易位基因2
CBFB                       核结合因子β
CCND1                      细胞周期素D1(cyclin D1)
CCND3                      细胞周期素D3
CCNI                       细胞周期素I
cDNA                       互补DNA
CELSR2                     钙粘附蛋白EGFLAG 7次跨膜G型受体2
CFP                        青色荧光蛋白
CHUK/IKK                   α保守型螺旋-环-螺旋泛激酶，IkB激酶α
CK1 α                      α1酪蛋白激酶l
CKB                        脑肌酸激酶
CNK1                       KSR样连接强化因子
Col1A1                     1型α 1胶原
Col3A1                     3型α 1胶原
Col6A3                     VI型α 3胶原
Connx43                    联接蛋白43
COX-2                      环氧合酶-2
CRABP2                     细胞维甲酸结合蛋白II
CRD                        半胱氨酸富集域
CSF1R                      集落刺激因子1受体
CSPG2                      硫酸软骨素蛋白聚糖
CTGF                       结缔组织生长因子
CTSK                       组织蛋白酶K(cathepsin K)
CX3CR1                     趋化因子(C-X3-C)受体1
细胞周期                   也参见CCND1
素D1
DELTEX                     deltex同源物2(果蝇(Drosophila))，参见EphB2
Dkk                        Dikkopf
Dkk1              Dikkopf1
Dkk2              Dikkopf2
Dkk3              Dikkopf3
Dkk4              Dikkopf4
DMSO              二甲亚砜
dsRNA             双链RNA
DVL1              散乱蛋白(disheveled)，dsh同源物(果蝇)
DXA               双重X射线吸光测定法
EDTA              乙二胺四乙酸
EGTA              乙二醇-O-O′-双(2-氨基-乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸
eNOS              敏感型氧化氮合成酶
EPHB2             KSR样连接强化因子(ras的果蝇激酶抑制因子)
EPHB6             Eph受体B6
ERBB3             GRO1致癌基因
ERK               也称为经有丝分裂原活化的蛋白激酶p44/42(MAPK)
EVRX              X连锁渗出性玻璃体视网膜病
FAP               成纤维细胞活化蛋白α
FBLN1             纤维丝蛋白1(fibulin1)
FBS               胎牛血清
FEVR              家族性渗出性玻璃体视网膜病
FGF-2             成纤维细胞生长因子2(基本)
FGF-7             成纤维细胞生长因子7(角化细胞生长因子)
FOS               FBJ 鼠类骨肉瘤病毒致癌基因同源物
FOSL1             Fos 样抗原1
FRET              荧光共振能量传递
卷曲蛋白2         卷曲蛋白(果蝇)同源物2，也称为FZD2
Fz                卷曲蛋白
Fz4               卷曲蛋白4
FZD2              卷曲蛋白(果蝇)同源物2
FZD4              卷曲蛋白同源物4
G171V             人类LRP5位置171处甘氨酸至缬氨酸的突变
GADD45A           生长停滞和DNA损伤可诱导α
GADD45B           生长停滞和DNA损伤可诱导45β
GADD45G           生长停滞和DNA损伤可诱导45γ
GAS6              生长停滞特异性6
GFP               绿色荧光蛋白
GJA1              间隙联接膜通道蛋白α1(也称为联接蛋白43)
GJB3              间隙联接膜通道蛋白β3
GSK-3             肝糖合成酶激酶-3
GSK-3α            肝糖合成酶激酶-3，α同功异型物
GSK-3β            肝糖合成酶激酶-3，β同功异型物
HBM               高骨质量表型
HDL               高密度脂蛋白
HEK               人胚肾
HERPUD1           高半胱氨酸可诱导、内质网压力可诱导的泛素样域成员1
HRT               激素替代疗法
i.m.              肌肉内
i.v.              静脉内
IDB2              DNA结合抑制剂2
IDB3              胰岛素样生长因子2(生长调节素A(somatomedin A))
IGF2R             胰岛素样生长因子2受体
IGFBP6            胰岛素样生长因子结合蛋白6
iGSK              GSK抑制剂
iGSK-3            GSK-3抑制剂
IL-1              介白素-1
IL1R1             介白素-1受体，I型
IL1RL1            介白素-1受体样1
IL4RA             介白素4受体α
IL-6              介白素-6
ITGA5             整合素α 5(纤维连接蛋白受体α)
ITGB5             整合素β
ITGBL1            整合素β样1
JNK               c-jun 氨基激酶通路
JUN               v-jun 禽类肉瘤病毒17致癌基因同源物
JUND1             Jun 原癌基因相关基因 d1
克曼蛋白          产生眼睛和鼻子的Kringle编码基因
Krml              克曼蛋白1
Krm2              克曼蛋白2
LBD               LRP5、LRP6、HBM的配体结合域
LDL               低密度脂蛋白
LDLR              低密度脂蛋白受体
LOX               赖氨酰基氧化酶
LRP5              低密度脂蛋白受体相关蛋白5
LRP6              低密度脂蛋白受体相关蛋白6
LSP1              淋巴细胞特异性蛋白1
LUM               基膜聚糖(lumican)
mAb               单克隆抗体
MAPK              经有丝分裂原活化的蛋白激酶(p42、44)(ERK)
MAPKAPK           经有丝分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶2，也称为MK2
2
MCC               结肠直肠癌中的突变
MDSC              间叶来源干细胞
MET               met原癌基因(肝细胞生长因子受体)
MMP-14            基质金属蛋白酶14
MMP-9             基质金属蛋白酶9
MSX1              msh样同源异型盒1
MYBL1             v-myb成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物(禽类)样1
MYC               v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因同源物
MYCS              Myc样致癌基因，s-myc蛋白
NCAM1             神经细胞粘附分子1
ND                诺里氏疾病
NDP               诺里氏疾病蛋白(也称为Ndph)
NFATC1              细胞质型活化T细胞核因子1
NFKB1               B细胞中的κ轻链基因强化子核因子1，p105
Non-TG              非转基因
NOS3                氧化氮合成酶3，也称为eNOS
NR4A1               核受体亚族4，组A，成员1
OGN                 骨甘氨酸(osteoglycin)
OPG                 骨保护素(osteoprotegerin)
OPPG                骨质疏松症假神经胶质瘤综合征
OSMR                制瘤素M受体
PCOLCE              前胶原c-蛋白酶强化子蛋白
PDGFA               簇Tncl.M29464：血小板来源生长因子α
PDGFRA              血小板来源生长因子受体α多肽
PKA                 蛋白激酶A
PKC                 蛋白激酶C
PLAT                组织型纤溶酶原活化因子，t-PA
PNA                 肽核酸
PRDC                与DAC和Cerberus相关的蛋白质
PTGIS               前列腺素合成酶
PTGS                转录后基因沉默
PTGS1               前列腺素-内过氧化物合成酶1，也称为COX-1
PTGS2               前列腺素-内过氧化物合成酶2(前列腺素G/H合成酶或环氧
                    合酶2)或COX-2
PTH                 副甲状腺激素
RAMP3               受体(降钙素)活性改性蛋白3
RANK                NF-kB的受体活化因子
RANKL               NF-kB配体的受体活化因子
RLU                 相对荧光素酶单元
RNAi                RNA干扰
ROP                 早产儿视网膜病
RUNX1               runt相关转录因子1
RUNX2/C             runt相关转录因子2
BFA1
S100A10             与依钙蛋白(calpactin)类似的钙结合蛋白
SDC1                粘连蛋白聚糖1(syndecan1)
SDF1                基质来源因子1
SERM                选择性雌激素受体调节剂
SERPINE1            丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，E亚型(连接蛋白(nexin)，
                    纤溶酶原活化因子抑制剂1型)，成员1
SFRP1               分泌型卷曲蛋白相关蛋白1
SFRP4               分泌型卷曲蛋白相关蛋白4
shRNA               短发夹状RNA
siRNA               短干扰RNA
SPARC               sparc/骨粘连蛋白
SPARCL1             SPARC样1(mast9，hevin)
SPP1                分泌型磷蛋白1
SPR                 表面等离子体共振
STAT1          信号转导因子和转录活化因子1
STAT3          RIKEN cDNA 1110034C02基因
TANK           TRAF家族成员相关Nf-κ B活化因子
TCF            T细胞因子
TG             转基因
TGFB1          转化生长因子β1
TGFBR2         转化生长因子β受体11
TGF-β          肿瘤生长因子β
THBD           血栓调节蛋白(thrombomodulin)
THBS1          血小板反应蛋白1(thrombospondin1)
TIEG           TGFB可诱导早期基因
TIMP1          金属蛋白酶组织抑制剂
TIMP2          金属蛋白酶组织抑制剂2
TIMP3          金属蛋白酶组织抑制剂3
TNF            肿瘤坏死因子
TNFRSF10       肿瘤坏死因子受体超家族，成员10b
B
TNFRSF11       肿瘤坏死因子受体超家族，成员11b(骨保护素)
B
TNFSF11        肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员11(参见RANKL)
TOB1           ErbB-2.1的转导因子
TRAF3          TNF受体相关因子3
TUNEL          末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记
UNK_D834       前列腺素I2(前列腺环素(prostacyclin))合成酶
02
VCAM1          血管细胞粘附分子1
VEH            媒剂
VLDL           极低密度脂蛋白
WIF            Wnt抑制因子
WISP1          WNT1可诱导通路蛋白1
WISP2          WNT1可诱导信号转导通路蛋白2
Wnt3A          无翅型MMTV整合位点家族成员
Wnt            无翅型MMTV整合位点家族(例如，Wnt1至Wnt19)
Wnt10B         无翅型MMTV整合位点家族成员10B
Wnt6           无翅型MMTV整合位点家族成员6
YFP            黄色荧光蛋白
1.2定义
根据这一详细描述，应用下列缩写和定义。须注意，除非上下文另有明确规定，否 则如本文中所使用，单数形式“一”包括复数参考物。因此，例如，提及“一模拟物” 包括多个这种模拟物，且提及“一剂量”包括提及一或多个剂量和所属领域的技术人员 已知的其等效物等。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与所属领域的一般技 术人员通常所了解的相同含义。下列术语提供如下。本文中提及的基因打算包括所引用 的寄存编号以及未指定的其它序列。
“动物”意谓任何脊椎动物。“动物”包括“哺乳动物”。优选哺乳动物包括家畜动 物(例如，有蹄类，诸如牛、水牛、马、绵羊、猪和山羊)以及啮齿类(例如，小鼠、 仓鼠、大鼠和天竺鼠)、犬类、猫类、灵长类(例如，黑猩猩、猩猩、人类)、狼类、骆 驼类和鹿科动物。其他脊椎动物包括禽类(例如，鸡、鸭、鹅、家禽)、两栖动物(例 如，非洲爪蟾)和鱼类(鱼)。
“诺里蛋白”打算包括诺里蛋白的所有脊椎动物形式和所有其多肽和核酸形式。“诺 里蛋白”也称为ND、诺里氏疾病蛋白、诺里蛋白前驱体、NDP、Ndp和诺里氏疾病蛋 白同源物(Ndph)。也涵盖诺里蛋白变异体。
“诺里蛋白活性”为其涉及Wnt信号转导通路和其与卷曲蛋白4和LRP5/6的相互作 用时的诺里蛋白活性。其将包括诺里蛋白与卷曲蛋白4(Fz4)的相互作用和其对LRP5 活性的增强。与诺里蛋白相互作用的唯一卷曲蛋白为卷曲蛋白4。然而，本文中所讨论 的Wnt可在检定系统中用于比较将在Wnt信号转导系统中调节诺里蛋白-卷曲蛋白4和 LRP5和LRP6的相互作用的任何分子的特异性。因此，“诺里蛋白调节剂”为调节诺里 蛋白活性的药剂，其中诺里蛋白活性为Wnt信号转导的部分。优选诺里蛋白活性为调控 骨重塑和/或脂质调节。关于脂质调节，参见美国申请案第09/578,900号。出于所有目的， 美国申请案第09/578,900号的内容整体以引用的方式并入本文中。诺里蛋白调节剂包括 骨活性和/或脂质含量的激动剂和拮抗剂。诺里蛋白激动剂(例如)当投与时将增强个体 的骨生长。
“Dkk”打算包括Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4的所有脊椎动物形式和所有核酸和多 肽形式。“Dkk1”也称为地可夫-1、地可夫相关蛋白-1前驱体、Dkk-1、DKK-1、hDkk-1 (对Dkk1的人类形式来说)、AK和UNQ492/PRO1008。“Dkk2”也打算包括地可夫-2、 地可夫相关蛋白-2前驱体、Dkk-2、DKK-2、hDkk-2(对Dkk2的人类形式来说)和 UNQ682/PR01316。“Dkk3”也打算包括地可夫-3、地可夫相关蛋白-3前驱体、Dkk-3、 hDkk-3(Dkk3的人类形式)、REIC和UNQ258/PR0295。“Dkk4”打算包括地可夫-4、 地可夫相关蛋白-4前驱体、Dkk-4、DKK-4和hDkk-4(对Dkk4的人类形式来说)。也涵 盖Dkk变异体。Dkk调节剂将包括Dkk拮抗剂和激动剂。
“克曼蛋白”打算包括克曼蛋白1和克曼蛋白2的所有脊椎动物形式和所有核酸和 多肽形式。“克曼蛋白1”也称为地可夫受体、FLJ31863、克曼蛋白、标记眼睛和鼻子的 含Kringle蛋白、含Kringle跨膜蛋白1和KRM1。“克曼蛋白2”也称为地可夫受体2、 克曼蛋白蛋白2前驱体、标记眼睛和鼻子的含Kringle蛋白、KRM2、MGC10791、 MGC16709和与哺乳动物基因收集(Mammalian Gene Collection，MGC)项目团队，2002 “超过15,000个全长人类和小鼠cDNA序列的产生和初始分析”(＂Generation and initial analysis of more than 15,000 full length human and mouse cDNA sequences＂)，美国国家科 学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)99(26)：16899-16903相关的克曼蛋白2形式。 也涵盖克曼蛋白变异体。克曼蛋白调节剂将包括克曼蛋白拮抗剂和激动剂。
“LRP5”或“低密度脂蛋白受体相关蛋白5”打算包括LRP5的所有脊椎动物核酸和 多肽形式。LRP5和相关同源物的其它名称包括BMND1、Zmax1、HGNC:8152、低密度 脂蛋白受体相关蛋白5前驱体、LR3、LRP7、OPPG、OPS和VBCH2。“LRP5”在果蝇 中也称为“arr”且具有以下其他同义词：BEST：CK00539、CK00539、1(2)k08131、LDLR 样、LRP、LRP5/6和LRP6。举例来说，LRP5的一个“HBM”或“高骨质量”变异体 在多肽形式中在人类多肽序列的位置171处具有从甘氨酸变为缬氨酸的单一氨基酸变 化。小鼠序列在位置170处存在类似突变。其它脊椎动物中的其它同源物可在给予三维 螺旋桨域的其它物种中测定。使用HBM涵盖包括G171V变异体和其来自其它脊椎动物 物种的同源物。HBM变异体为产生高骨质量表型的HBM，其由LRP5中的不为G171V 变化的突变产生。对Zmax1和HBM形式来说，参见美国专利第6,770,461号，出于所 有目的，其整体并入本文中。因此，LRP5的野生型变异体或同源物的实例为Zmax1。 当提及LRP5时，也涵盖LRP5的所有形式，包括野生型变异体或同源物。也涵盖LRP5 和HBM的变异体。LRP5调节剂将包括LRP5的激动剂和拮抗剂。也涵盖LRP5模拟物。
“LRP6”或“低密度脂蛋白受体相关蛋白6”打算包括LRP6的所有脊椎动物核酸和 多肽形式。LRP6也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白6前驱体。也涵盖LRP6的变异体。 当提及LRP6时，也涵盖LRP6的所有形式，包括野生型变异体或同源物。当讨论卷曲 蛋白4/LRP5复合物时，所述复合物也打算包括卷曲蛋白4/LRP6和卷曲蛋白 4/LRP5/LRP6。LRP6调节剂包括LRP6激动剂和拮抗剂。本文中也涵盖用于以增强骨生 长的方式调节Wnt通路的LRP6模拟物。
“Wnt”打算包括任何Wnt(无翅型MMTV整合位点家族成员)蛋白和核酸，包括 Wnt1-Wnt19的那些形式。例示性Wnt形式包括Wnt1(也称为无翅型MMTV整合位点 家族成员1、INT1和Wnt-1原癌基因蛋白前驱体)、Wnt3(也称为无翅型MMTV整合 位点家族成员3、INT4和Wnt-3原癌基因)、Wnt3a(也称为无翅型MMTV整合位点家 族成员3A和Wnt-3a蛋白前驱体)和Wnt10b(也称为无翅型MMTV整合位点家族成员 10B、Wnt-10b蛋白前驱体、WNT-12、Wnt-12和WNT-12)。也涵盖任何Wnt形式的变 异体。Wnt调节剂包括Wnt激动剂和拮抗剂。
“变异体”打算包括编码蛋白质的核酸的一种形式，其中所述蛋白质在Wnt级联中 具有生物学活性且参与骨代谢和脂质代谢的调节。其可包括LRP5的增强变异体，诸如 G171V变异体，其在表达这一蛋白质的人类中产生高骨质量。
“生物学活性片段”、“多肽片段”和“生物学活性多肽”意谓LRP5、LRP6、HBM、 克曼蛋白1、克曼蛋白2、任何Dkk、a任何Wnt和诺里蛋白的生物学活性片段，其中所 述活性调节Wnt通路且优选关于骨发育、骨调节和/或脂质代谢的Wnt通路。这些为参 与Wnt信号转导且从而牵涉于Wnt通路诱导的脂质和/或骨发育调节中的完全蛋白质的 域。举例来说，LRP5和LRP6的生物学活性多肽可为那些蛋白质的细胞外部分(例如， 人类LRP5的氨基酸1-1376(基因库(GenBank)寄存编号NP_002326)、Zmax1或HBM)。 另外，对长度为1615个氨基酸的人类LRP5来说，具有生物学活性的其它域可包括跨膜 域(氨基酸1385至1407)、细胞质域(氨基酸1408至1615)和细胞外域(氨基酸1-1384， 或如果移除信号肽的前19个氨基酸，那么为20-1384)。对长度为1613个氨基酸的人类 LRP6来说，其将具有类似域：细胞外域(氨基酸1-1370，或如果移除信号肽的前19个 氨基酸，那么为20-1370)、跨膜域(氨基酸1371-1393)和细胞质域(氨基酸1394-1613)。 已展示卷曲蛋白4的细胞外半胱氨酸富集域(cysteine rich domain，CRD)与诺里蛋白 (即，氨基酸36-165)相互作用(寄存编号：IPR000024；基因库寄存编号：NP_036325； 许(Xu)等人，2004细胞(Cell)116：883-895)；因此卷曲蛋白4的生物学活性多肽可 含有CRD。诺里蛋白的生物学活性多肽可包括诺里蛋白的CRD域，例如氨基酸15-150。 在另一实例中，已报导对与克曼蛋白1或克曼蛋白2结合的Dkk蛋白质来说，需要整个 细胞外域，例如对人类克曼蛋白2来说，需要氨基酸1-362(基因库寄存编号BAC00872)。 因此，克曼蛋白1和克曼蛋白2的生物学活性部分将至少含有细胞外域以及其更长的序 列。对Dkk1来说，例如生物学活性多肽将至少含有C-末端半胱氨酸富集域(对人类 Dkk1来说为氨基酸183-266；基因库寄存编号AAQ89364)。已知C-末端半胱氨酸富集 域参与LRP5和LRP6与克曼蛋白2的结合。因此，对Dkk蛋白的任何生物学活性多肽 来说，多肽可至少含有各Dkk的半胱氨酸富集域。然而，其它实例包括含有Dkk蛋白 的半胱氨酸富集域的多肽，以及例如在Dkk1中，含有Dkk1的半胱氨酸富集域的N-末 端和/或C-末端序列的多肽。对其它Dkk来说，将涵盖类似序列。这些生物学活性片段 也可包括减去羧基末端或氨基末端或形成蛋白质的多肽内的一或多个氨基酸但具有与 全长蛋白质相同的活性的完全蛋白质，且其中当与全长多肽诱导的活性相比时，这些生 物学活性多肽片段不充当阻断抑制剂。
“脂质参数”打算包括(但不限于)基于于试剂中的暴露分析脂质浓度变化的活体 外或活体内测量的参数。脂质参数可包括对apoE、HDL、LDL、VLDL、甘油三酯、胆 固醇、脂肪细胞的数目、脂肪细胞基因表达的变化或这些参数的组合的量度。脂质参数 也打算包括(例如)HDL:VLDL的比率。如果研究活体内变化，那么可进行脂质概况描 绘，诸如禁食脂质概况描绘(总胆固醇、甘油三酯、LDL和HDL)，来评估归因于投与 测试试剂所致的对脂质含量的调节。
可由诺里蛋白调节的“脂质病症”、“脂质疾病”和“脂质病状”打算包括(但不限 于)家族性脂蛋白脂肪酶不足、家族性脱辅基蛋白CII不足、家族性3型高脂蛋白血症、 家族性高胆固醇血症、家族性高甘油三酯血症、多个脂蛋白类型高脂质血症、归因于透 析和/或糖尿病的脂质含量升高和未知病因的脂质含量升高。
“骨发育”泛指骨随时间变化中所涉及的任何过程，包括(例如)正常发育、疾病 状态期间所出现的变化和老化期间所出现的变化或激素模式的变化。其可指结构变化和 动态速率变化，所述速率诸如生长速率、再吸收速率、骨修复速率等。“骨发育病症” 尤其是指骨发育中的任何病症，包括(例如)，疾病状态期间所出现的变化和老化期间 所出现的变化。骨发育在性质上为进行性的或周期性的。发育期间可变化的骨的方面包 括(例如)矿物质化、特定解剖特征的形成和各种细胞类型的相对或绝对数目。所涵盖 的可能与发育无关的其它骨病症包括(但不限于)老化相关骨损失、骨折(例如，髋部 骨折、柯雷氏骨折(Colle′s fracture)、脊椎粉碎性骨折)、软骨营养不良、药物诱导病症 (例如，归因于投与糖皮质激素或肝素所致的骨质疏松症和归因于投与氢氧化铝、抗痉 挛药或格鲁米特(glutethimide)所致的骨软化)、高骨周转率、高钙血症、骨肥厚症、 成骨不全症、骨软化、骨髓炎、骨质疏松症、佩吉特氏病、骨关节炎和佝偻病。
“骨调节”或“对骨形成的调节”是指影响骨重塑中所涉及的任何生理学过程的能 力，如所属领域的技术人员应了解，包括(例如)骨吸收和同位骨生长，尤其破骨细胞 和成骨细胞活性，且在本文中使用时可包含部分或所有骨形成和发育。
骨为通过破骨细胞更新老骨或不必要骨和成骨细胞重塑新骨来自身不断改造和更 新的动态组织。这些过程之间的耦联的性质使得生长期间骨得以塑造以及通过重塑和修 复以满足机械使用的日常需要使成人骨完整性得以维持。存在许多由骨吸收与骨形成之 间的平衡的解耦联所导致的疾病。随着老化，骨周转中存在逐渐的“生理”不平衡，其 在女性中格外加剧，这是因为雌激素支撑的绝经期损失导致进行性骨损失。当骨矿物质 密度低于人群正常值时，骨易碎性和对自发性骨折的易受性随之增加。每损失10％的骨， 骨折风险翻倍。将在脊柱或股骨近端具有低于正常峰值骨质量2.5个或2.5个以上的标 准偏差的骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)的个体归类为骨质疏松。然而， 具有低于正常值1个与2.5个标准偏差的BMD的骨质减少个体也处于风险中。
可通过数种不同形式的X射线吸光测定法来测量骨。所有仪器均测量骨的无机物或 骨矿物质含量。标准DXA测量给出面密度值，而不是经典密度定义(质量/单位体积) 的真实密度测量。尽管如此，其为临床上用于诊断骨质疏松症的测量类型。然而，虽然 BMD为骨强度的主要贡献因素，但骨强度的多达40％基于其它因素，包括(但不限于) (1)骨尺寸(即，即使在低密度情况下，较大直径也增加器官层面的刚性)；(2)小梁 结构的结缔性；(3)重塑程度(重塑所在地为应变的局部集中者)；和(4)骨物质自身 的内在强度，其又与载荷历史有关(即，通过疲劳损伤积累)和胶原交联程度和矿化程 度。可以很好地证明，所有这些强度/易碎性因素均在骨质疏松骨折中发挥部分作用，正 如大量骨外影响一般(诸如(但不限于)下降模式、软组织垫和中枢神经系统反射反应 性)。
还可使用其它分析仪器阐明这些骨特征。举例来说，pQCT允许针对尺寸和密度测 量独立的小梁和皮层室。μCT(微CT)提供关于诸如小梁结缔性等结构特征的定量信息。 μCT也可给出真实骨密度测量值。通过这些手段，可测量重要的非BMD参数来诊断疾 病的程度和治疗的功效。目前对骨质疏松症的治疗是基于药物防止或延迟骨再吸收的能 力。虽然较新的抗再吸收剂经证明适用于骨质疏松症疗法，但对于开发增加骨质量和/ 或以上所提及骨品质参数的治疗的更明确挑战而言仅将其视为短期解决方案。因此，可 通过测量以下参数评估骨调节，诸如通过pDXA X射线法测量的骨矿物质密度(BMD) 和骨矿物质含量(BMC)；如通过X射线所测量的骨尺寸、骨厚度或骨体积；如通过(例 如)钙黄绿素标记所测量的骨形成速率；总密度、小梁密度和中段密度(如通过pQCT 和/或μCT法所测量)；结缔性和其它组织参数(如通过μCT法所测量)；机械弯曲和抗 压强度(如优选分别在股骨和椎骨中所测量)。因此，可测量的参数包括(但不限于) 骨密度、骨强度、小梁数目、骨尺寸和骨组织结缔性。归因于这些测量的性质，如技术 从业者所了解，其各自可或多或少适于给定情况。此外，所属领域中已知和使用以下参 数和方法学，诸如无骨折的临床病史、骨形状、骨形态、结缔性、正常组织学、骨折修 复速率和其它骨品质参数。当适于进行椎骨抗压强度测量时，最优选通过所述椎骨抗压 强度评估骨品质。骨调节也可通过各种参数的变化速率来评估。最优选在一个以上的年 龄评估骨调节。可评估化合物对任一或多个本文中所列的参数的作用以确定其对骨密度 的调节。
在HBM关联研究的情况下，“正常骨密度”是指为0的Z评分的两个标准偏差内的 骨密度。在一般情况下，正常骨密度参数的范围通过常规统计方法确定。正常参数在经 年龄和性别正规化参数的约1或2个标准偏差内，优选约2个标准偏差内。有意义的统 计量度为P值，其可表示相关量度显著不同于平均值的可能性。显著P值为P<0.05、0.01、 0.005和0.001，优选至少P<0.01。
术语“力”、“载荷”、“应力”和“应变”在本文中可互换使用且与力的原理相关， 其在机械学上为倾向于维持或改变身体位置或将其扭曲的任何作用且这一术语在本文 件中可与载荷互换使用。作为每单位面积的量度的力定义为“应力”且在本文中也称为 “机械应力”且，根据力(载荷)如何施加而可归类为压缩应力、拉伸应力或剪切应力。 具体来说，如果施加载荷，那么产生压缩应力，如此物质变短，而当使物质伸展时，产 生拉伸应力。当物质的一个区相对于相邻区滑动时，产生剪切应力。应力的结果定义为 变形，且相对变形百分率或长度的变化称为“应变”。如果(例如)使物质伸展到其原 始长度的101％，那么其具有0.01或1％的应变。因为应变不具有单位，所以其以相对 变形形式报导，其中0.01应变等于1％变形，或对微应变来说，其中10,000微应变等于 0.01应变或1％变形(特纳(Turner)等人，1993骨(Bone)，14：595-608)。
“测试药剂”和“测试试剂”打算包括小化合物、组合物、肽、模拟物、多肽、siRNA 和免疫球蛋白。组合物包括两种或两种以上活性化合物的组合，其中一或多种活性化合 物为Wnt通路(级联)调节剂。
“免疫球蛋白”打算包括抗体和抗体片段。如本文中所使用，术语“抗体”打算指 完全、完整抗体、双功能抗体和抗体片段，诸如Fab片段、Fab′片段和F(ab)2片段。完 全抗体包括单克隆抗体(mAb)，诸如鼠类单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、灵长化 抗体和人类抗体。抗体和抗体的遗传工程化或酶促产生部分的制备和编码这些分子的遗 传序列的组建为熟知的且描述于(例如)哈洛(Harlow)等人，抗体：实验手册 (ANTIBODIES：A )，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，N.Y.(1988)；哈洛(Harlow)等人，使用抗 体：实验手册(：A )，(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约(New York)，1998)和百年灵(Breitling)等人，重组抗体 (RECOMBINANT ANTIBODIES)((Wiley-Spektrum)，1999)中，出于所有目的，所述 文献以引用的方式并入本文中。免疫球蛋白也包括诸如scFv的片段。
“免疫活性”意谓识别抗原且与抗原结合的任何免疫球蛋白或其片段。免疫活性蛋 白质或其片段优选调节其所结合的抗原。举例来说，如果免疫活性蛋白质或其片段与诺 里蛋白或与诺里蛋白配体结合，那么所述免疫活性蛋白质或其片段将调节诺里蛋白活性 或诺里蛋白配体的活性。
“单链Fv”(“scFv”)为仅由彼此通过多肽连接子共价连接的可变轻链(VL)和可 变重链(VH)组成的重组抗体片段。VL或VH可为NH2-末端域。多肽连接子可具有可 变长度和组成，只要两个可变域经桥联而无严重位阻影响。连接子通常主要包含中间散 布有谷氨酸或赖氨酸以供溶解的甘氨酸和丝氨酸残基的伸展。
“双功能抗体”为二聚scFv。双功能抗体的组分通常具有比大多数scFv短的肽连接 子，且其展示优选缔合为二聚体。
“Fv”片段为由通过非共价相互作用结合在一起的一个VH和一个VL域组成的抗体 片段。术语“dsFv”在本文中用于指具有工程化分子间双硫键以便稳定VH-VL对的Fv。
“F(ab′)2”片段为基本上与由免疫球蛋白(通常IgG)通过在pH4.0-4.5下经酶胃蛋 白酶消化获得的抗体片段等效的抗体片段。所述片段也可重组产生。
“Fab”片段为基本上与通过将F(ab′)2片段中的两个重链碎片联接的双硫桥键还原所 获得的抗体片段等效的抗体片段。Fab′片段也可重组产生。
术语“蛋白质捕获剂”意谓可使蛋白质与自身结合的分子或多分子复合物。蛋白质 捕获剂优选以大体上特定的方式结合其结合搭配物。优选解离常数(KD)小于约10-6(例 如，10-7、10-8、10-9、10-10)的蛋白质捕获剂。抗体或抗体片段高度合适作为蛋白质捕 获剂。抗原也可充当蛋白质捕获剂，因为其能够结合抗体。结合蛋白质配体的受体为可 能的蛋白质捕获剂的另一实例。应了解，蛋白质捕获剂不局限于仅通过非共价相互作用 与其结合搭配物相互作用的药剂。蛋白质捕获剂也可视情况变成与其所结合的蛋白质共 价连接。举例来说，蛋白质捕获剂可在结合后与其结合搭配物光交联。
术语“结合搭配物”意谓通过特定蛋白质捕获剂结合的蛋白质，优选以大体上特定 的方式结合。在一些情况下，结合搭配物可为通常通过为蛋白质捕获剂的蛋白质活体内 结合的蛋白质。然而，在其它实施例中，结合搭配物可为选择(通过活体外或活体内选 择)或培养(如在抗体的情况下)蛋白质捕获剂所基于的蛋白质或肽。结合搭配物可为 超过一种蛋白质捕获剂所共用。举例来说，由多种多克隆抗体结合的结合搭配物可具有 多种不同抗原決定基。一种蛋白质捕获剂也可与许多结合搭配物结合(例如，如果结合 搭配物共用同一抗原決定基)。
“适于蛋白质结合的条件”意谓允许蛋白质与其结合搭配物之间在溶液中发生结合 的那些条件(关于盐浓度、pH值、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等)。所述条件优选不是 很宽以致发生大量非特异性蛋白质结合。
“阵列”为衬底上的某种模式的实体排列。虽然模式通常为二维模式，但对物质在 阵列衬底上的较大应用来说，模式也可为三维模式。
术语“衬底”是指本发明的阵列的本体、基础和核心物质。衬底为核酸、抗体、免 疫球蛋白和其它化合物所附着的物质。
“转基因动物”意谓在生殖系中含有已通过cDNA技术引入的基因或核酸的动物。 其可为(例如)将人类基因引入啮齿类动物中或小鼠体内的小鼠基因中。这一术语可包 括基因剔除动物和基因敲入动物和组合，例如其中动物已使其野生型基因剔除且然后替 换。替换的基因可为原生野生型基因、来自另一动物的同源基因(诸如人类基因)或变 异体(诸如LRP5)。所引入的基因也可在可诱导启动子的控制下。HBM变异体cDNA 可为原生变异体或非原生变异体。举例来说，可将G171V的人类HBM变异体引入小鼠 中。或者，也可将G171V的小鼠对应物引入小鼠中以产生表达原生HBM变异体的转基 因HBM小鼠。转基因动物并不打算包括转基因人类，但可包括非人类灵长类动物和其 它动物。转基因动物可能已剔除或引入Dkk、诺里蛋白、LRP5、LRP6、克曼蛋白、Wnt 或卷曲蛋白4中的任一或多个。预期转基因动物为非人类动物，但可包括非人类灵长类 动物。
“LRP5转基因动物”打算包括表达LRP5的原生与cDNA形式，或如果动物已移除 LRP5的原生形式或不能起作用(已基因剔除)，那么仅表达LRP5的cDNA形式的动物。 LRP5的cDNA形式可在可诱导元件的控制下。动物可为剔除原生基因且已引入或敲入 原生或非原生LRP5的动物。这些基因敲入动物又可具有优选在可诱导控制下的基因。
“HBM转基因动物”意谓存在或剔除原生LRP5且存在编码HBM变异体的cDNA 的动物。
“有效量”或“剂量有效量”或“治疗有效量”意谓调节诺里蛋白的生物学活性的 药剂的足以调节骨参数和/或脂质参数的量。
术语“识别和结合”当用于定义反义核苷酸、siRNA(小抑制RNA)或shRNA(短 发夹RNA)与靶序列的相互作用时，意谓特定的反义、siRNA或shRNA序列与靶序列 大体上互补，且因此将与编码多肽的mRNA的一部分特异性结合。同样地，所述序列通 常将与mRNA靶序列高度互补，且整个序列将具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个碱基错配。在许多情况下，对序列来说，可能希望精确匹配，即，与寡核苷酸 特异性结合的序列完全互补且因此沿互补伸展具有0个错配。高度互补序列将通常与 mRNA的靶序列区非常特异性地结合且因此将高度有效降低和/或甚至抑制靶mRNA序 列翻译为多肽产物。
大体上互补的寡核苷酸序列将与寡核苷酸所特异性结合的相应mRNA靶序列互补 (或“一致性％”)超过约80％且更优选将与寡核苷酸所特异性结合的相应mRNA靶序列 互补超过约85％。在某些方面，如上所述，将希望具有甚至更大体上互补的寡核苷酸序 列以用于本发明的实施中，且在这些情况下，寡核苷酸序列将与寡核苷酸所特异性结合 的相应mRNA靶序列互补超过约90％且在某些实施例中，可能与寡核苷酸所特异性结 合的相应mRNA靶序列互补超过约95％，且甚至与所设计的寡核苷酸所特异性结合的 靶mRNA互补高达且包括96％、97％、98％、99％且甚至100％精确匹配。
可(例如)通过使用从威斯康星大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics Computer Group，UWGCG)获得的GAP计算机程序6.0版本比较序列信息来 确定任何所揭示的序列的相似性％或互补％。GAP程序利用尼德曼(Needleman)和沃 尔什(Wunsch)，1970分子生物杂志(J.Mol.Biol.)48(3)：443-53的比对法。简单来 说，GAP程序定义相似性为所比对的相似的符号的数目(即，核苷酸或氨基酸)除以两 个序列中较短者的符号的总数目。GAP程序的优选默认参数包括：(1)核苷酸的一元比 较矩阵(含有一致性为1值且非一致性为0值)和格伯斯克(Gribskov)和布格斯(Burgess) (1986核酸研究(Nucleic Acids Res.)14(1)：327-34)的加权比较矩阵；(2)各间隙处 罚为3.0且各间隙中各符号再0.10处罚；和(3)末端间隙无处罚。
“模拟物”意谓执行与所模拟的药剂相同的功能或类似于所模拟的药剂表现或具有 增强所模拟的药剂的活性的活性的分子。举例来说，诺里蛋白模拟物如同诺里蛋白多肽 与LRP5和/或LRP6和卷曲蛋白4相互作用且如同诺里蛋白或在比对于诺里蛋白所观察 到的程度增强的程度下调节骨质量和/或脂质含量。举例来说，模拟物可诱导高骨质量样 表型，诸如对于HBM表型所观察到的表型(其例如由人类LRP5多肽或另一脊椎动物 中的同源位置LRP5的G171V突变所产生)。模拟物分子可为多肽、肽、免疫球蛋白或 小化合物。
“报导体元件”意谓编码能够在筛检检定中检测到的多肽的聚核苷酸。由报导体元 件编码的多肽的实例包括(但不限于)lacZ、GFP、YFP(或其它荧光报导体)、荧光素 酶和氯霉素乙酰转移酶。
“细胞”或“宿主细胞”打算包括脊椎动物细胞以及酵母细胞或筛检检定中使用的 某些原核细胞。举例来说，在酵母双杂交检定中，合适细胞可为酵母细胞。
“骨细胞”打算包括来自组织培养物(“培养细胞”)的细胞或从骨组织获得的细胞。 这些细胞包括(但不限于)成骨细胞、前成骨细胞、骨祖细胞、破骨细胞、骨细胞、间 叶干细胞、任何本文中所讨论的细胞或其任何组合。骨组织将打算包括这些细胞的组合， 如可从骨活检获得。
“Dkk拮抗剂”打算包括(但不限于)单克隆或多克隆抗体或其免疫活性片段、肽 适体、GSK结合蛋白、GSK核酸的反义分子、RNA干扰分子、吗啉基寡核苷酸、肽核 酸(PNA)、核糖酶和可抑制Wnt通路中Dkk活性的肽。
同样地，“克曼蛋白拮抗剂”打算包括(但不限于)单克隆或多克隆抗体或其免疫 活性片段、肽适体、RNA干扰分子、吗啉基寡核苷酸、肽核酸(PNA)、核糖酶和可抑 制Wnt通路中克曼蛋白活性的肽。
“Wnt3A激动剂”打算包括可上调Wnt3A合成和/或活性的试剂。“Wnt3A模拟物” 意谓模拟Wnt3A活性的分子。“Wnt3A变异体”将包括当在载荷下投与时可增强Wnt/β- 联蛋白反应的活化的任何功能变异体。
术语“融合蛋白”是指包含两种或两种以上多肽的蛋白质，所述多肽虽然通常不以 其原生状态联接在一起，但其通过肽键由其相应氨基和羧基末端联接以形成单一连续多 肽。应了解，两种或两种以上多肽组分可直接联接或通过肽连接子/间隔子间接联接。
2.用于筛检调节诺里蛋白的测试药剂的检定
本文中所揭示的物质和方法部分针对筛检调节NDP基因或由那些基因编码的诺里 蛋白的药剂或鉴别诺里蛋白模拟物和诺里蛋白激动剂的方法。所述检定也针对筛检调节 与诺里蛋白相互作用的试剂的药剂、鉴别诺里蛋白激动剂和鉴别诺里蛋白模拟物的物质 和方法。这些试剂可为通过与卷曲蛋白4结合来调节诺里蛋白活性的试剂。这些试剂也 可为通过调节Dkk1活性(基因或蛋白质)来调节诺里蛋白活性的试剂。另一实例将为 克曼蛋白2，其中调节克曼蛋白2(基因或蛋白质)将调节诺里蛋白活性。在Dkk1和克 曼蛋白2的情况下，调节这些化合物活性的试剂优选将为Dkk1或克曼蛋白2的拮抗剂。 所述检定优选将产生通过卷曲蛋白4与诺里蛋白相互作用也调节LRP5活性的试剂。优 选LRP5调节将呈增强活性的形式，诸如由激动剂或模拟物(例如，诺里蛋白模拟物或 卷曲蛋白4模拟物)所产生的增强的活性。
检定系统可包括就测试药剂与卷曲蛋白4、诺里蛋白、Dkk1、克曼蛋白2、LRP5 结合或充当诺里蛋白模拟物的能力加以筛检的步骤。其可为包括衬底或在溶液中呈游离 形式的任何系统，其中允许发生测试药剂与任何上述衬底的结合且然后检定以确定结 合。可将测试药剂与卷曲蛋白4、诺里蛋白、Dkk1、克曼蛋白2或LRP5在生理条件(例 如，pH值为约7.0至约7.4；24℃至约40℃)下混合足以准许结合的时间，例如，约1 分钟至6小时。
测试药剂可就如以上所讨论的结合加以筛检或可为来自任何化学文库的候选物。然 后可在细胞基检定系统中检定所述测试药剂。所述细胞基检定系统可为将细胞用编码以 下各物中的至少一者的核酸瞬时或稳定转染的检定系统：卷曲蛋白4、诺里蛋白、Dkk1、 克曼蛋白2或LRP5或其任何组合。因此，细胞将至少个别地表达卷曲蛋白4和诺里蛋 白以及其余三个基因。也将存在一系列用核酸的下列组合稳定或瞬时共转染的细胞：
(a)诺里蛋白和LRP5和/或LRP6；
(b)诺里蛋白、Dkk(例如Dkk1至Dkk4)和LRP5和/或LRP6；
(c)诺里蛋白、克曼蛋白(例如克曼蛋白1或克曼蛋白2)和LRP5和/或LRP6；
(d)诺里蛋白、克曼蛋白、Dkk和LRP5和/或LRP6；
(e)卷曲蛋白4和诺里蛋白；
(f)卷曲蛋白4、诺里蛋白和LRP5；
(g)卷曲蛋白4、诺里蛋白和Dkk(例如Dkk1至Dkk4)；
(h)卷曲蛋白4、诺里蛋白和克曼蛋白(例如克曼蛋白1和/或克曼蛋白2)；
(i)卷曲蛋白4、诺里蛋白、Dkk和克曼蛋白2；
(j)卷曲蛋白4、诺里蛋白、LRP5和Dkk1；
(k)卷曲蛋白4、诺里蛋白、LRP5和克曼蛋白2；和/或
(1)卷曲蛋白4、诺里蛋白、LRP5、Dkk1和克曼蛋白2；和/或
(m)或任何组合。
任何上述组合也涵盖LRP6、HBM、其它Dkk(例如，Dkk2、Dkk3和/或Dkk4)、 Wnt和/或克曼蛋白1。
所属领域的一般技术人员应了解所述检定系统也可能需要载体对照，其中所述载体 为编码任何上述蛋白质的核酸经可操作性连接以供在细胞中表达的载体。载体对照可由 仅用载体和/或不用载体瞬时或稳定转染细胞组成。细胞的瞬时转染和稳定转染可使用所 属领域中已知的技术进行。例如参见萨布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手册 (：A )，第1-3卷(第3版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，NY 2001)或萨布鲁克(Sambrook)的任何的先前版本。共转染可 如所属领域中所知瞬时或稳定制备。萨布鲁克(Sambrook)等人，2001。
编码卷曲蛋白4、诺里蛋白、LRP5、Dkk1和克曼蛋白的核酸与其相关蛋白质序列 一起部分列于下文中。本申请案的实施例不限于本文中所揭示的序列。
  基因 生物体 蛋白质基因库寄存 编号             核酸基因库寄存编号 诺里蛋白 智人 AAH29901 BC029901.1 智人 CAA46639 X65724.1
  小家鼠 AAH90623 BC090623 小家鼠 CAA58725 X83794.1 Dkk1 智人 AAF02674 AF177394.1 小家鼠 AAH50189 BC050189.1 小家鼠 AAC02426.1 AF030433.1 斑马鱼 BAA82135 AB023488.1 斑马鱼 AAD2246.1 AF116852.1 Dkk2 智人 AAF02675 AF177395 智人 AAH75078 BC075078.2 小家鼠 CAP6010.1 AJ243963.2 Dkk3 智人 AAF02676 AF177396.1 智人 AAH07660 BC007660.2 智人 AAQ88744 AY358378.1 小家鼠 AAF02680 AF177400.1 小家鼠 AAH46304 BC046304.1 小家鼠 AAH50934 BC050934.1 Dkk4 智人 AAF02677 AF177397.1 智人 BAA33438.1 AB01778 小家鼠 AAH18400 BC018400 卷曲蛋白4 智人 BAA86286.1 AB032417.1 智人 BAB4081L1       FZD4S剪接变异体 AB054881 智人 AAR23924.1 AY462097.1 小家鼠 AAH15256 BC015256.1 小家鼠 AAC52430 U43317.1 黑腹果蝇 AAF81195 AF241270.1 LRP5 智人 AAC36467.1 AF064548.1 智人 AAC72791 AF077820.1 智人 AAK52433 AF283320.1 小家鼠 AAC36468 AF064984.1 小家鼠 AAC70183 AF077847.1 小家鼠 AAH11374 BC011374.1 黑腹果蝇 AAF58373 AE003818.3 基因 生物体 蛋白质基因库寄存 编号             核酸基因库寄存编号 LRP6 智人 AAC33006 AF074264.1 小家鼠 AAC33007 AF074265.1 小家鼠 AAH60704 BC060704.1 黑腹果蝇(arr) AAF58373 AE003818.3 克曼蛋白1 智人 AAH63787 BC063787.1 智人 BAB40969.1 AB059618 小家鼠 BAB40968.1 AB059617 小家鼠 BC049771 克曼蛋白2 智人 AAH03533 BC003533.1
  智人 AAH09383 BC009383.2 智人 BAC00823.1 AB086355 小家鼠 CAD29805 AJ457192
其它HBM和LRP5序列(例如，Zmax1)揭示于美国申请案第09/544,398号(现 为美国专利第6,770,461号)和第10/240,851号中，出于所有目的，所述揭示案整体以 引用的方式并入本文中。
可转染的细胞可为任何哺乳动物细胞系。优选细胞系为人类细胞系，尤其当使用编 码任何上述人类蛋白质的核酸时。因此，对小鼠核酸来说转染可发生于小鼠细胞系中或 对人类核酸来说，转染可发生于人类细胞系中。细胞系可为来自人类或其它脊椎动物的 骨细胞系、肾细胞系、干细胞系。例示性肾细胞系包括(但不限于)HEK-293细胞(ATCC 第CRL-1573号)和HepG2细胞。例示性骨细胞系包括(但不限于)KHOS/NP(R-970-5) (ATCC第CRL-1544号)、KHOS-240S(ATCC第CRL-1545号)、KHOS-321H(ATCC 第CRL-1546号)、DSDh(ATCC第CRL-2131号)、VA-ES-BJ(ATCC第CRL-2138 号)、7F2(ATCC第CRL-12557号)、U-2OS(也称为U2OS；ATCC第HTB-96号)、 HOSTE85、ROS、MC3T3-E6、UMR-106、Saos2、MG63和HOBs。例示性干细胞系包 括(但不限于)成人间叶细胞干细胞(卡姆布莱克斯生物科学(Cambrex Bioscience)) 和小鼠干细胞系C3H10T1/2(ATCC)。
编码任何所述蛋白质的核酸将包括开放阅读框架(ORF)以及转录和翻译所需的任 何转录信息。编码蛋白质的核酸又将可操作性连接于适于在细胞中稳定和/或瞬时转染的 载体。合适载体包括(但不限于)TK-海肾、pcDNA3.1(英杰(Invitrogen))和pUSE (上州生物技术(Upstate Biotech))。可使用其它能够在脊椎动物细胞中表达的可操作载 体。
可利用提供关于对基因和其相关蛋白质的调控的信息的任何报导体系统，其包括 (但不限于)TK-海肾、β-半乳糖苷酶(β-gal)、碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)或 其它荧光蛋白标记物。如本文中所述，优选系统为如实例中所述的TCF-luci和TK-海肾 的组合。也可利用可在脊椎动物细胞中操作的其它报导体和载体组合。
一方面，将已暴露于待测试的药剂的细胞群体的诺里蛋白或诺里蛋白相互作用蛋白 质的相对量与未暴露的对照细胞群体相比较。可使用抗体监测不同细胞群体中蛋白质的 差异表达。在适当条件下将细胞系或群体暴露于待测试的药剂下且持续适当的时间。细 胞溶解产物可由所暴露细胞系或群体和对照未暴露细胞系或群体制备。然后如所属领域 中所知，用探针分析细胞溶解产物。例如参见爱登·哈洛(Ed Harlow)和大卫·莱因(David Lane)，抗体：实验手册(ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL)，(冷泉港(Cold Spring Harbor)，N.Y.1988)和哈爱登·洛(Ed Harlow)和大卫·莱因(David Lane)，使用抗体： 实验手册(USING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL)，(冷泉港，NY，1998)。
举例来说，诺里蛋白的N-末端和C-末端片段可在细菌中表达且用于寻找与这些片 段结合的蛋白质。可制备融合蛋白，诸如与诺里蛋白的N-末端或C-末端区(或诺里蛋 白的生物学活性域)或完整诺里蛋白融合的His-标签或GST融合体。这些融合蛋白可与 (例如)泰伦(Talon)或谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(Glutathione Sepharose bead)偶合，且 然后用细胞溶解产物探测以鉴别与诺里蛋白结合的分子。溶解之前，可将细胞用经纯化 Wnt蛋白、RNA或可调节Wnt信号转导的药物或与Wnt通路的下游元件相互作用的蛋 白质处理。如所属领域中所知，与融合蛋白结合的溶解产物蛋白质可通过SDS-PAGE拆 分，分离且通过(例如)蛋白质测序或质谱来鉴别。例如参见蛋白质纯化应用：实践方 法(PROTEIN PURIFICATION ：A )(西蒙·罗伊 (Simon Roe)编，第2版，牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)，2001)和“蛋白质纯 化指南”(＂Guide to Protein Purification＂)，酶学方法(Meth.Enzymology)第182卷(学 术出版社(Academic Press)，1997)。
诺里蛋白、诺里蛋白模拟物、诺里蛋白相互作用蛋白质(例如，诺里蛋白激动剂或 诺里蛋白拮抗剂)或诺里蛋白与LRP5/LRP6/HBM和/或克曼蛋白或Dkk蛋白的复合物 的活性可能受调节诺里蛋白与诺里蛋白相互作用蛋白质和/或诺里蛋白和 LRP5/LRP6/HBM、诺里蛋白和/或卷曲蛋白4、Dkk蛋白或克曼蛋白之间的相互作用的 化合物影响。本文中提供发现和表征这些化合物的方法和研究手段。可活体内和活体外 监测诺里蛋白或诺里蛋白模拟物与诺里蛋白/卷曲蛋白4相互作用蛋白质和/或诺里蛋白 和LRP5/6/HBM和诺里蛋白/Dkk和诺里蛋白/克曼蛋白之间的相互作用。类似检定也可 用于评估诺里蛋白激动剂和拮抗剂。调节诺里蛋白/Fz4复合物的稳定性的化合物为潜在 治疗化合物。
实例活体外方法包括：使LRP5/6/HBM、诺里蛋白/Fz4或诺里蛋白/Fz4相互作用蛋 白质与为由百克(Biacore)(上州(Uppsala)，瑞典(Sweden))制造的仪器设计的传感 器芯片结合以进行等离子体共振光谱学观察。举例来说，使用这一方法，可首先在准许 形成复合物的条件下将具有诺里蛋白/Fz4、诺里蛋白/Fz4相互作用蛋白质或LRP5/LRP6 中的一个的芯片暴露于另一个中。然后引入测试化合物且仪器的输出信号提供测试化合 物产生的任何效应的指示。通过这一方法，可快速筛检化合物。这一方法可用于诺里蛋 白/Fz与LRP5、LRP6、HBM、任何Dkk、任何克曼蛋白、任何Wnt和任何其组合的任 何组合。
另一活体外方法由SAR-by-NMR方法例示(舒克(Shuker)等人，1996科学(Science) 274：1531-4)。举例来说，诺里蛋白/Fz4结合域和/或LRP5/LRP6/HBM LBD可通过在经 标记培养基中表达以经15N标记的蛋白质形式表达和纯化。允许经标记蛋白质在核磁共 振(nuc1ear magnetic resonance，NMR)样品管中在溶液中形成复合物。在存在和不存 在测试化合物的情况下的杂核相关光谱提供在个别残基层面上关于与测试化合物相互 作用和复合物的蛋白质-蛋白质界面处的变化的数据。这一方法可供诺里蛋白/卷曲蛋白4 与LRP5、LRP6、HBM、任何Dkk、任何克曼蛋白、任何Wnt和任何其组合的任何组合 使用。
所属领域的技术人员知道许多其它方案，例如，亲和力毛细管电泳(奥肯(Okun) 等人，2001生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276：1057-1062)、荧光光谱法、电子顺磁共 振等，其也可用于在存在和不存在测试药剂的情况下就任何以上所列的蛋白质或其生物 学活性片段的组合监测对复合物的调节和/或测量复合物形成的结合亲和力。
用于监测对诺里蛋白/卷曲蛋白4相互作用、诺里蛋白/LRP5/卷曲蛋白4相互作用或 诺里蛋白模拟物与LRP5、LRP6、HBM、克曼蛋白1、克曼蛋白2、任何Dkk和任何 Wnt中的任一或多个的相互作用的调节的方案可使用酵母杂交方案进行。可使用酵母双 杂交或更多杂交法通过监测由诺里蛋白/卷曲蛋白4和/或任何以上所列的其它蛋白质的 融合蛋白的复合物的形成活化的基因表达来监测对复合物的调节。如果使用LRP5、LRP6 或HBM，那么可使用完整蛋白质或含有YWTD重复的β螺旋桨的配体结合域(LBD) 或部分。将本发明的编码相互作用诺里蛋白和卷曲蛋白4或诺里蛋白和LRP5/LRP6/HBM LBD域的核酸并入诱饵质粒和捕获质粒中。在存在一或多种测试化合物的情况下进行酵 母双杂交(Y2H)法或三种或三种以上蛋白质的酵母杂交法。通过复合物活化基因的表 达的变化观察对复合物的调节。所属领域的技术人员应了解，测试化合物可直接添加到 检定中，或在蛋白质的情况下，可与诱饵和捕获化合物共表达于酵母中。类似地，诺里 蛋白和诺里蛋白相互作用蛋白质的融合蛋白也可用于Y2H筛检中以鉴别调节诺里蛋白/ 卷曲蛋白4复合物的其它蛋白质(诸如Dkk、克曼蛋白、其它负调控剂和正调控剂)。 酵母杂交技术在所属领域中为已知的。例如参见李珠(Li ZHU)和乔治·杰·汉农( J.)，酵母杂交技术()(2000)。
诸如这些的检定方案可用于筛检调节诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的化合物、药物、 治疗的方法中，不管这些调节是通过竞争性结合、充当诺里蛋白模拟物发生还是通过改 变诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的结构或使蛋白质-蛋白质界面稳定或不稳定发生。可预 期肽适体可竞争性结合，但也有可能为由空间效应诱导结合位点结构改变。如本文中所 使用，由诺里蛋白/卷曲蛋白4和诺里蛋白/Fz4/LRP5复合物调节的生物或病理过程可包 括使诺里蛋白与卷曲蛋白4结合或与诺里蛋白/卷曲蛋白4/LRP5复合物相互作用或防止 Dkk和/或克曼蛋白下调诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的蛋白质结合。其可包括与诺里蛋 白相互作用或调节参与复合物以及诺里蛋白模拟物的蛋白质的合成的化合物。
除如本文中所讨论的可结合诺里蛋白/卷曲蛋白4/LRP5复合物的调节的生化分析评 估的其它骨相关因素外，还可观察其它骨相关指标，诸如碱性磷酸酶活性、骨钙素产生 或矿物质化。
病理过程是指一类产生有害效应的生物过程。举例来说，LRP5或LRP6和/或Dkk 和/或Dkk相互作用蛋白质的表达或表达的上调可能与某些疾病或病理学病状相关。如 本文中所使用，当药剂在个体内将过程从其基本程度改变到统计上显著的程度时，认为 所述药剂调节病理过程。举例来说，药剂在投与所述药剂的个体中可降低由蛋白质介导 的过程的程度或严重性。举例来说，可通过投与某种程度上降低或调节本发明的蛋白质 的表达或至少一种活性的药剂来预防疾病或病理病状或调节疾病进展。
因为卷曲蛋白4/诺里蛋白和LRP5/LRP6(以及克曼蛋白、Dkk和Wnt)直接和/或 间接参与骨质量调节，所以本发明的一个实施例为使用诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物和诺 里蛋白/卷曲蛋白4复合物配体作为诊断骨病状或疾病的方法。某些指标与特定Wnt信 号转导条件(例如，TCF/LEF活化)相关。骨病状的诊断测试可包括就Dkk或Dkk相 互作用蛋白质核酸(即，DNA或RNA)、寡聚物或其片段或TCF/LEF调控表达的蛋白 质产物的存在性测试样品或其提取物的步骤。举例来说，可利用标准原位杂交或其它成 像技术来观察Wnt信号转导的产物。
本文中也讨论调节骨发育或骨损失病状的方法和物质。对骨损失的抑制可通过抑制 或调节诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的变化且从而调节Wnt信号转导通路的变化来达成。 举例来说，诺里蛋白活性的缺少或Dkk1活性的增加可能与低骨质量相关。诺里蛋白和 卷曲蛋白4活性的增加可能与高骨质量相关。因此，调节诺里蛋白/卷曲蛋白4活性又将 调节骨质量。通过激动剂和拮抗剂来调节Dkk与诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的相互作 用是调控骨发育的方法的一个实施例。
本发明的药剂可单独或与调节特定病理过程的其它药剂组合提供。如本文中所使 用，当同时投与两种药剂或以使得药剂同时起作用的方式独立投与两种药剂时，认为所 述两种药剂被组合投与。
可将本发明的药剂投与非人类测试动物，例如通过非经肠、皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、 肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、经皮或经颊途径。或者或同时，可通过经口途径投与。 所投与的剂量应视以下因素而定：接受者的年龄、健康状况和体重、伴随治疗(如果有) 的类型、治疗的频率和所要效应的性质。
本发明进一步提供含有一或多种调节诺里蛋白或诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的表 达或至少一种活性或充当诺里蛋白模拟物的药剂的组合物。虽然个体需要不同，但各组 分的有效量的最佳范围的确定在所属领域的技术范围内。活性剂，包括诺里蛋白模拟物 或调节诺里蛋白的药剂、诺里蛋白相互作用蛋白质或诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物(或诺 里蛋白/卷曲蛋白4/LRP5复合物，所有讨论诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物之处也涵盖所述 复合物)的配体，其典型剂量可包含每千克体重约0.0001mg至约50mg。优选剂量可 包含每千克体重约0.001mg至约50mg。最优选剂量可包含每千克体重约0.1mg至约1 mg。在70kg的普通人类中，所述范围将为约7μg至约3.5g，其中优选范围为约0.5mg 至约5mg(且例如这一范围内的任何0.1mg值)。
除药理学活性剂外，本发明的组合物还可含有合适的医药学上可接受的载剂，包含 赋形剂、载剂和助剂，其有利于活性化合物加工为可在医药学上使用以传送到作用位点 的制剂。用于非经肠投药的合适调配物包括呈水可溶性形式(例如水溶盐)的活性化合 物的水溶液。另外，可投与活性化合物的悬浮液，适当时油性注射悬浮液。合适的亲脂 性溶剂或媒剂包括脂肪油(例如，植物油，诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如，油酸 乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘稠度的物质，且包括(但不限 于)羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液视情况也可含有稳定剂。也可使用 微脂粒和其它非病毒载体来封装药剂以传送到细胞中。
本发明的用于全身性投药的医药调配物可经调配以用于肠内、非经肠或局部(top) 投药。实际上，可同时使用所有三种类型的调配物以达成活性成分的全身性投药。
用于经口投药的合适调配物包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、 酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂和其控释形式。
结合且从而调节诺里蛋白、诺里蛋白模拟物、诺里蛋白配体或诺里蛋白/卷曲蛋白4 复合物的任何化合物可能潜在地为治疗化合物。在本发明的一实施例中，在治疗组合物 中使用本发明的肽或核酸适体。这些组合物可包含未经修饰或经修饰的适体或诺里蛋白 /卷曲蛋白4片段。在另一实施例中，治疗化合物包含诺里蛋白或诺里蛋白/卷曲蛋白4 复合物相互作用蛋白质或其生物学活性片段。
核酸适体已(例如)通过化学键接于诸如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的 载剂用于组合物中，所述载剂分子可有利于摄取或稳定适体。可使用连接于RNA的二 烷基甘油部分以将适体嵌入微脂粒中，从而使化合物稳定。合并化学取代(即，使核糖 的2′-OH基团变为RNA中的2′-NH给予核糖核酸酶抗性)和封端等可防止分解。关于 RNA适体的数种这种技术讨论于布洛迪(Brody)和古德(Gold)，2000分子生物学评 论(Rev.Mol Biol).74：3-13。
肽适体可通过(诸如)反转录病毒传送将指导适体表达的表达载体引入感染组织中 或通过将DNA封装入传送复合物中或简单通过裸DNA注射用于治疗应用中。或者，适 体本身或合成类似物可直接作为药物使用。封装入聚合物和脂质中可有助于传送。肽适 体作为治疗剂和诊断法剂的用途由霍普·赛勒(Hoppe-Syler)和布兹(Butz)，2000分 子医学杂志(J.Mol Med.)78：426-430综述。
另一方面，可(诸如)通过NMR或X射线结晶学测定本发明的受限肽适体的结构 (卡文那夫(Cavanagh)等人，蛋白质NMR光谱学：原理和实践( NMR )，学术出版社(Academic Press)，1996；德伦 斯(Drenth)，蛋白质X射线结晶学原理( )，施普林格(Springer Verlag)，1999)。优选测定具有靶蛋白质的复 合物中的所述结构。然后根据适体的三维结构的功能元件的位置设计小分子类似物。 (药物设计中的分子建模指南(GUIDEBOOK ON MOLECULAR MODELING   )，克汉(Cohen)编，学术出版社(Academic Press)，1996；分子建模和药物设 计()(分子和结构生物学主题( ))，温特(Vinter)和嘎德内(Gardner)编，CRC 出版社(CRC Press)，1994)。本文中提供鉴别和设计调节诺里蛋白活性、充当诺里蛋 白模拟物、诺里蛋白相互作用蛋白质、诺里蛋白/卷曲蛋白4相互作用蛋白质和诺里蛋白 /卷曲蛋白4复合物的有效和特异性药物的方法。本发明范畴内也包涵肽适体的小分子模 拟物。
2.1细胞基诺里蛋白功能报导体检定
可将以下实例中所述的TCF-报导体检定发展为筛检检定以鉴别诺里蛋白模拟物(图 1和2)或鉴别诺里蛋白-信号抑制剂的拮抗剂，诸如Dkk1/克曼蛋白2(图3)的拮抗剂。 在检定的两种类型中，当预先形成于骨或非骨细胞类型中时，活性分子将增强TCF-荧 光素酶信号或其它合适信号方法。
2.2诺里蛋白/LRP5/LRP6和DKK/LRP5/LRP6/克曼蛋白检定
可用于筛检调节诺里蛋白与卷曲蛋白4/LRP5/LRP6的相互作用的的另一方法为通 过酶联免疫吸附检定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。例示这一检定的两 种可能的变化形式，但也可利用其他变化形式。举例来说，可将LRP5固定于诸如组织 培养板孔的固体表面上。所属领域的技术人员应认识到可替换和利用其它支撑物，诸如 (但不限于)尼龙或硝化纤维膜、硅芯片、载玻片、珠粒等。实现此的一种方式可为具 有呈融合蛋白形式的LRP5/LRP6/Fz4形式，其中使LRP5/LRP6/Fz4的细胞外域与人类 IgG或其它IgG的Fc部分融合。可在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细 胞(或另一合适细胞系)中产生LRP5/LRP6/Fz4-Fc融合蛋白，其中融合蛋白从细胞系 或培养基提取。举例来说，可将所分离的LRP5/6/Fz4-Fc融合蛋白通过抗人类Fc抗体或 通过经蛋白质A或蛋白质G涂布的板固定于固体表面上。然后可洗涤衬底以移除任何 未结合蛋白质。可在孔或容器中培育含有分泌型诺里蛋白或分泌型诺里蛋白-抗原決定基 标签标记的蛋白质(或经纯化诺里蛋白、经纯化诺里蛋白-抗原決定基标记蛋白质、诺里 蛋白模拟物或含有骨调节中涉及的诺里蛋白生物学活性部分的片段)的条件培养基。或 者，可将测试试剂与固定融合蛋白一起培育以筛检诺里蛋白模拟物。诺里蛋白或诺里蛋 白模拟物与LRP5/LRP6/Fz4的结合可使用针对诺里蛋白或抗原決定基标签的抗体来评 估。举例来说，诺里蛋白-V5抗原決定基标签标记蛋白质或其片段可用抗V5抗体检测。 然后，这一检定系统可用于(例如)鉴别诺里蛋白模拟物、诺里蛋白激动剂和以如同诺 里蛋白的方式与LRP5/LRP6/Fz4融合蛋白结合的免疫球蛋白。检定可(例如)呈竞争检 定、经标签标记测试试剂和其类似物的形式。这些检定系统也可供HBM利用。当筛检 调节这些蛋白质和多肽之间的复合物的相互作用和形成的测试药剂时，也可修改这一检 定以具有包括Dkk、克曼蛋白和/或Wnt蛋白或其生物学活性片段的洗涤物。
或者，可将诺里蛋白或其生物学活性片段(对诺里蛋白的所有提及认为也可使用生 物学活性片段)或参与骨调节的诺里蛋白模拟物与检测标记物(诸如碱性磷酸酶)直接 融合。此处，可在无需后续抗体基实验的情况下直接研究诺里蛋白-LRP5/LRP6/Fz4相互 作用的检测。在碱性磷酸酶检定或其它检测检定中检测所结合的诺里蛋白或诺里蛋白模 拟物。如果诺里蛋白-碱性磷酸酶融合蛋白结合于固定的LRP5/LRP6/Fz4，那么在比色、 放射性或荧光读数中将检测到碱性磷酸酶活性。结果，使用这一系统可检定小分子化合 物改变诺里蛋白与LRP5/LRP6/Fz4的结合的能力或测试试剂是否为诺里蛋白模拟物或 诺里蛋白激动剂。举例来说，当化合物与诺里蛋白(或抗原決定基标签标记诺里蛋白) 一起添加到板的各孔中时，可就化合物调节诺里蛋白与LRP5/LRP6/Fz4之间的相互作用 的能力基于合适培育时间和洗涤后孔中所存在的所结合诺里蛋白的信号强度对其进行 评分。这一检定可通过进行使用未标记诺里蛋白或第二种类型的抗原決定基标签标记诺 里蛋白的竞争实验校正。能够调节(例如，增强)诺里蛋白-LRP5/LRP6/Fz4相互作用的 任何分子可为合适治疗候选物，更优选为成骨治疗候选物或能够调节脂质(例如，ApoE、 LDL、HDL、VLDL、甘油三酯、胆固醇)的候选物。这些分子包括小化合物、肽和免 疫球蛋白；(抗体、抗体片段)所有都可使用这一检定系统检查。
2.3诺里蛋白-LRP5/6/Fz4同源检定
研究蛋白质-蛋白质相互作用的调节的另一方法是通过荧光共振能量传递法 (Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)。FRET为量子机械过程，其中供体荧 光分子将能量转移到紧邻的接受体发色团分子。类似地，也可使用扩增发光邻近同源检 定(ALPHA筛检)来评估诺里蛋白-LRP5/6或Fz4相互作用域和Fz4/LRP5复合物中诺 里蛋白模拟物的作用。在文献中，这些系统已成功用于表征LRP5与Axin之间的分子间 相互作用(例如参见苗(Maio)等人，分子细胞生物学(Molec.Cell Biol.)7：801-9)。 存在许多可供这些研究利用的不同荧光标签且存在数种荧光标签标记所关注蛋白质的 方法。举例来说，可分别使用CFP(即，青色荧光蛋白)和YFP(即，黄色荧光蛋白) 作为供体和接受体。可将具有供体和接受体的融合蛋白工程化、表达和纯化或与特定供 体和接受体珠粒接合。
举例来说，在FRET型检定中，可将经纯化诺里蛋白或其生物学活性多肽或作为诺 里蛋白模拟物筛检的药剂与CFP(或另一荧光蛋白)融合，且可使用标准方法产生和纯 化与YFP融合的经纯化LRP5/6/Fz4蛋白或其生物学活性多肽(例如，LBD或含有β螺 旋桨的域)。如果诺里蛋白-CFP和LRP5/Fz4-YFP紧邻，那么从CFP到YFP的能量转移 将使得CFP发射降低和YFP发射增加。能量具有450nm的激发波长，且在480nm和 570nm发射波长下记录能量转移。YFP发射与CFP发射的比率提供诺里蛋白(或诺里 蛋白模拟物)与LRP5/Fz4之间的相互作用的的变化的计量。这一系统适用于筛检可改 变Wnt级联中的诺里蛋白-LRP5/Fz4蛋白质-蛋白质相互作用和活性的小分子化合物。增 强或破坏这一相互作用的化合物将分别通过YFP发射与CFP发射的比率的增加或减小 来鉴别。于是，以与诺里蛋白相同的方式调节LRP5/Fz4相互作用的这些化合物将视为 候选诺里蛋白模拟物分子。也筛检药剂中增强诺里蛋白样活性的那些药剂。可进一步用 不同荧光蛋白修改这些检定系统以包括呈不同组合形式的克曼蛋白、Dkk和/或Wnt。化 合物的进一步表征可使用TCF-荧光素酶或非洲爪蟾胚胎检定来进行以阐明化合物对功 能性诺里蛋白信号转导的效应。
2.4酵母杂交检定
双杂交、三杂交或其它酵母杂交系统非常适用于研究蛋白质:蛋白质相互作用。例如 参见简(Chien)等人，1991美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)88： 9578-82；菲尔兹(Fields)等人，1994遗传学进展(Trends Genetics)10：286-92；哈珀 (Harper)等人，1993细胞(Cell)75：805-16；沃特克(Vojtek)等人，1993细胞(Cell) 74：205-14；鲁班(Luban)等人，1993细胞(Cell)73：1067-78；李(Li)等人，1993美 国实验生物学联合会会志(FASEB J.)7：957-63；臧(Zang)等人，1993自然(Nature) 364：308-13；戈莱米斯(Golemis)等人，1992分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)12： 3006-14；佐藤(Sato)等人，1994美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA) 91：9238-42；考夫兰(Coghlan)等人，1995科学(Science)267：108-111；卡尔帕娜 (Kalpana)等人，1994科学(Science)266：2002-6；海尔普斯(Helps)等人，1994欧 洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)340：93-8；杨(Yeung)等人，1994基因与发育 (Genes & Devel.)8：2087-9；德费(Durfee)等人，1993基因与发育(Genes & Devel.) 7：555-569；皮特卡(Paetkau)等人，1994基因与发育(Genes & Devel.)8：2035-45； 斯帕格伦(Spaargaren)等人，1994美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA) 91：12609-13；叶(Ye)等人，1994美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA) 91：12629-33和美国专利第5,989,808号、第6，251,602号和第6,284,519号。
所述系统的变化形式可用于筛检酵母噬粒(例如参见哈珀(Harper)，分子相互作 用和发育：实践方法(CELLULAR INTERACTIONS AND DEVELOPMENT：A PRACTICAL APPROACH)，153-179(1993)和艾勒乔(Elledge)等人，1991美国国家科 学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)88：1731-5)或质粒(巴特儿(Bartel)，1993 细胞(Cell)14：920-4；芬利(Finley)等人，1994美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)91：12980-4)cDNA文库以克隆相互作用蛋白质，以及用于研究已知 蛋白质对。
双杂交系统的成功依赖于可将许多转录因子(诸如GAL4)的DNA结合和聚合酶 活化域分离且然后再联接以恢复功能性的事实(莫里(Morin)等人，1993核酸研究(Nuc. Acids Res.)21：2157-63)。虽然这些实例描述酵母系统中的双杂交筛检，但应了解可在 诸如哺乳动物细胞系的其它系统中进行双杂交筛检。因此，本发明不局限于使用酵母双 杂交系统，而是包涵这些可选择系统。
使具有多种报导体基因序列盒的整合复本的酵母菌株(诸如GAL→LacZ、GAL→ HIS3或GAL→URA3)(巴特儿(Bartel)，分子相互作用和发育：实践方法(CELLULAR ：A )，153-179(1993)；哈珀(Harper) 等人，1993细胞(Cell)75：805-16；菲尔兹(Fields)等人，1994遗传学进展(Trends Genetics)10：286-92)用两种各表达不同融合蛋白的质粒共转化。一质粒编码蛋白质 “X”与(例如)GAL4酵母转录活化因子的DNA结合域之间的融合体(布伦特(Brent) 等人，1985细胞(Cell)43：729-36；马(Ma)等人，1987细胞(Cell)48：847-53； 凯加(Keegan)等人，1986科学(Science)231：699-704)，而另一质粒编码蛋白质“Y” 与GAL4的RNA聚合酶活化域之间的融合体(凯加(Keegan)等人，1986)。将质粒转 化进含有调控区含有GAL4结合位点的报导体基因(诸如lacZ)的酵母菌株。如果蛋白 质X与Y相互作用，那么其通过使两个GAL4组分足够邻近以活化转录来重构功能性 GAL4转录活化因子蛋白质。应充分了解诱饵和捕获蛋白质的作用可交替转换且因此本 发明的实施例涵盖且包涵这两种可选择配置。
仅任一杂交蛋白质必定不能活化报导体基因的转录。DNA结合域杂交必定不能活化 转录，因为其不提供活化功能；且活化域杂交必定不能活化转录，因为其不能定位于 GAL4结合位点。两种测试蛋白质的相互作用重构GAL4的功能且使得报导体基因表达。 报导体基因序列盒由含有5′克隆于其TATA盒的GAL4 DNA识别位点的最小启动子组成 (约翰逊(Johnson)等人，1984分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)4：1440-8；洛奇(Lorch) 等人，1984分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)186：821-824)。通过测量β-半乳糖苷酶 (或其它报导体)的表达或使转化体在缺乏准许关于转录产物的营养缺陷选择的特殊营 养物(例如，URA3(尿嘧啶选择)或HIS3(组氨酸选择))的最低培养基上生长来评 分转录活化。例如参见巴特儿(Bartel)，1993；德费(Durfee)等人，1993基因与发育 (Genes & Devel.)7：555-569；菲尔兹(Fields)等人，1994遗传学进展(Trends Genetics) 10：286-292；和美国专利第5,283,173号。
这些方法通常包括待就相互作用加以测试的两种蛋白质，其在酵母细胞的细胞核中 表达为杂交体形式。将一种蛋白质与转录因子的DNA结合域(DNA-binding domain， DBD)融合，且将另一种与转录活化域(activation domain，AD)融合。如果这些蛋白 质相互作用，那么其重构活化一或多个含有DBD的结合位点的报导体基因的功能转录 因子。例示性双杂交检定为诺里蛋白、诺里蛋白/卷曲蛋白4或卷曲蛋白4/LRP5融合体。
3.检定药剂的活体内方法
除本文中所鉴别的活体外方法外，方法和物质可进一步包括使用动物来研究通过活 体外分析所筛检和鉴别的测试药剂的效应。举例来说，以cDNA形式引入诺里蛋白、克 曼蛋白(克曼蛋白1和/或克曼蛋白2)、Dkk(Dkk1、Dkk2、Dkk3和/或Dkk4)、LRP5、 LRP6、HBM、Wnt(Wnt1至Wnt19)和卷曲蛋白4基因中的一个(或多个)的转基因 动物。LRP5和HBM转基因动物的实例可见于国际PCT申请案第PCT/US02/14876号和 美国申请案第10/680,287号中。出于所有目的，这些申请案的标的物整体以引用的方式 并入本文中。
因此，一方面，在筛检抵抗以上所讨论的的任何经转染细胞系的测试药剂的步骤后 和/或在测试药剂以探索其是否与Dkk、诺里蛋白、卷曲蛋白4、LRP5、LRP6、HBM、 Wnt和/或克曼蛋白中的任一个结合后，也可活体内评估这些测试药剂。添加活体内测试 试剂的步骤添加针对由前述第2部分中所讨论的任何方式所获得的测试物的验证步骤。 可通过任何适于化合物的投药方式向动物投与试剂，例如经口、静脉内、肌肉内、腹膜 内、经皮和其类似方式。投药可视测试化合物的调配物而定。举例来说，小抑制RNA (siRNA)和免疫球蛋白可静脉内而不是经口投与。小化合物可经口或静脉内投与。测试 化合物的量将基于动物的重量基位来投与。
也可利用动物来测试化合物的生物可用性和降解产物。
将经数天、数周或数月的时间向动物投与测试化合物。投药可为每日、每周、两月 一次、每月一次和其类似频率。可单独或与使得于动物骨上产生应变的锻炼结合向动物 投与药剂。关于如何可使应变位于动物骨上的讨论描述于国际PCT申请案第 PCT/US2004/17951号中。出于所有目的，这一申请案的内容整体以引用的方式并入本 文中。
举例来说，可在投与多种药剂剂量的野生型和转基因动物中测量pDXA。举例来说， 使野生型和转基因小鼠麻醉，称重且使用LUNAR小动物PIXImus装置产生骨架的全身 X射线扫描。扫描可在小鼠断乳(即，3周大)时进行且间隔2周重复。野生型动物可 在3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29周时扫描。转基因动物的扫描 可进行历时长达17周的时间。可就多处体区的BMD(骨矿物质密度)、BMC(骨矿物 质含量)、TTM(总组织质量)和脂肪百分率(％)分析扫描。
另外或其它，可获得以上动物的faxitron射线照片。举例来说，pDXA扫描麻醉动 物后，可使用允许测量骨尺寸的Faxitron装置采集另一X射线。
另外或其它，可对以上动物进行钙黄绿素标记。举例来说，可连续两次给动物服用 每千克动物体重15mg钙黄绿素。第一剂量可在使动物安乐死之前9天给予，且第二剂 量在动物安乐死之前两天给予。然后可测定骨形成的量度。
视情况也可进行以上动物的某些类型的离体分析。举例来说，可从组织进行RNA 分离，可进行pQCT和微CT(μCT)组织学、弯曲强度分析、椎骨的抗压强度分析和血 清分析。举例来说，可使用TRIzo17从胫骨和其它组织分离RNA以测定mRNA表达。 可通过获得股骨且清除其软组织进行任何以上动物的pQCT分析。然后可将股骨存储于 70％乙醇中以供测定总密度且然后测定干骺远端的小梁密度和中段的皮层密度。
也可使用动物股骨的分析确定干骺远端的小梁指数。
视情况可对任何以上动物进行组织学分析。举例来说，可使用小鼠的股骨测定骨面 积和干骺远端的静态和动力学参数。其它或另外，可进行免疫组织化学(例如，成骨标 记物的原位杂交和经历凋亡的细胞的TUNEL染色)。
也可使任何以上动物的骨就椎骨的弯曲强度或抗压强度加以检查。就弯曲强度来 说，可清除动物的股骨(或其它合适骨)的软组织且存储在约-20℃下，随后分析中段的 三点弯曲强度。抗压强度可通过使(例如)小鼠的脊柱从T10移动到L6或L7来测量。 将软组织留在脊柱上，然后将其在约-20℃下冷冻直到分析。通常在L5椎骨处测量抗压 强度。
出于脂质分析的目的，可评估动物的血清。举例来说，可使动物安乐死且由血液制 备血清以测量总胆固醇、甘油三酯、骨钙素和其它生物化学替代指标。
也可对动物评估基因转录和表达调节。举例来说，已知骨载荷如下影响基因：
表1
比较HBM TG与Non-TG动物的活体内载荷对基因表达的效应


可就归因于投与测试药剂、对照药剂所致的表达的变化、骨或骨细胞应力的变化等 评估呈任何组合形式的任一或多个以上所提及的基因。然后可结合药剂对诺里蛋白-卷曲 蛋白4或卷曲蛋白4-LRP5复合物所产生的影响和其在Wnt通路中的活性评估所产生的 基因概况。举例来说，由调节诺里蛋白-卷曲蛋白4-LRP5复合物或诺里蛋白模拟物的药 剂所获得的基因/蛋白质概况产生如同由投与Dkk拮抗剂或克曼蛋白拮抗剂或通过对骨 或骨细胞的应力所观察到的概况。
也可活体外进行骨载荷和比较骨载荷与药剂的调节。举例来说，可使用重力载荷诱 导对本文中所讨论的任何骨细胞的应力，且可以骨应力概况的一部分的形式评估任一或 多个基因或以下基因的任何组合的基因表达概况。可评估骨应力概况以探索(例如)诺 里蛋白模拟物是否诱导增强骨应力概况或降低Dkk和/或克曼蛋白对骨应力概况的基因 的抑制。
表2
活体外载荷对基因表达的效应


所投与的测试药剂是否可诱导骨调节效应的确定可通过骨密度变化的X射线或通 过如美国申请案第10/680,287号和国际PCT申请案第PCT/US2004/17951号中所述的动 物处死和皮层骨的检查或本文中所述或所属领域中已知的任何方法来评估。出于所有目 的，这些申请案的内容整体以引用的方式并入本文中。
4.活体外研究骨载荷的方法
本发明的一个方面为骨载荷效应活体外研究和可增强骨载荷效益(即，增加骨矿物 质化)的方式。可在活体内(如以上所讨论)与活体外进行骨载荷增强研究。可首先在 活体外进行骨载荷增强，然后接着为活体内实验，诸如以上所讨论的那些实验。
因此，本发明的一个方面涉及将细胞放置在模拟载荷刺激的条件下。存在数种可用 于将应变置于细胞培养物上以模拟活体内所观察到的骨载荷反应的方法。这些方法包括 (但不限于)流体剪切、静水压缩、单轴伸展、双轴伸展、重力载荷和使用Flexercell 或等效系统诱导的载荷。
4.1骨载荷刺激物
通过骨载荷刺激物(诸如通过任何以上方法提供的刺激物)调节的优选基因包括(但 不限于)SFRP1、联接蛋白、WISP2 43、CCND1、Wnt10b、Jun、Fos、PTGS2(COX-2) 和eNOS。
可就活性的增加(例如，mRNA转录物和蛋白质的增加)加以监测的其它基因反映 在本文中的许多表中。已展示应答骨载荷不断上调的至少六个基因(即，Jun、Fos、eNOS、 SFRP1、COX-2和联接蛋白43)通过添加活化Wnt通路的药剂也得到增强。诸如Wnt2 的其它基因通过添加活化Wnt通路的试剂(例如，GSK-3抑制剂和Wnt3A和其激动剂、 模拟物和变异体)并未得到增强且其仅应答骨载荷。因此，一个方面将包括使用所述活 体外系统来研究应答(例如)诺里蛋白模拟物、诺里蛋白激动剂、卷曲蛋白4模拟物或 卷曲蛋白4模拟物的应力概况基因的增强。
4.1.1  流体剪切刺激
诱导骨载荷的一种方法是通过流体剪切。流体剪切可利用通过搅拌机制产生连续层 流剪切的锥板式粘度计。或者，流动回路设备可在平行流培养腔室中产生所述剪切。后 者方法和设备例如为福莱克赛尔国际公司(Flexcell International Corporation)制造的流 体系统(Streamer system)。也已知流动回路设备产生可重现和一致的刺激。唯一缺点在 于端点通常短暂且任一这些变化都影响已分化骨细胞的功能(巴索(Basso)等人，2002 骨(Bone)30(2)：347-51)。
4.1.2  静水压缩刺激
诱导骨载荷的第二种方法是使用静水压缩。静水压缩可利用压缩空气产生连续或间 断的力，认为其将力特异性定位于细胞与细胞外基质蛋白/粘附蛋白相互作用的区。
4.1.3  单轴伸展刺激
活体外诱导骨载荷的第三种方式是使用单轴伸展刺激。单轴伸展方法利用一个方向 上的伸展力。这一方法涉及使细胞在固定于硅酮柔性层的聚苯乙烯膜或其它膜的经处理 条带上的组织培养物中生长。硅酮层进一步连接于两个金属棒。可使用电磁铁或一些其 它移动方式使金属棒相对彼此操作。这一方法不产生任何流体剪切。流体剪切的缺乏使 得这一方法不太优选，因为间质流体流动在骨重塑中可较机械伸展发挥更大作用。因此， 这一方法可能不能完全模拟活体内所发生的情形，即使产生可重现和一致的刺激(巴索 (Basso)等人，2002骨(Bone)30(2)：347-51)。
4.1.4  双轴伸展刺激
双轴伸展基本上为本文中所讨论的Flexercell系统。这一方法使用经胶原涂布的硅 胶膜，细胞生长于其上。然后将板放置在连接于真空泵的特殊塔盘中。真空泵通过伸展 或扭曲细胞膜使膜伸展和松弛。另外，任何培养基或流体运动将进一步增加流体剪切。
4.1.5  重力载荷刺激
重力载荷为可活体外诱导骨载荷的另一种方法。将力基本上置于细胞上以使细胞变 平。关于其它详情，例如参见哈顿(Hatton)等人，2003骨与矿物质研究杂志(J.Bone& Min.Res.)18(1)：58-66和费兹杰拉(Fitzgerald)等人，1996实验细胞研究(Exp.Cell. Res.)228：168-71。具体来说，使细胞在板或盖玻片上生长，且然后暴露于递增的重力 下。
4.1.6   刺激
一种用于评估Wnt通路的试剂基增强和骨矿物质化的优选方法是使用双轴伸展刺 激系统。简单来说，将骨细胞(例如MC3T3细胞)暴露于约3,400με。对 机械载荷刺激来说，也可使用约50με至约5,000με(和中间的任何值)的载荷。这一 范围内的任何刺激模拟生理学骨载荷刺激。超过5,000με的刺激产生生理病理性载荷， 且因此不优选。在暴露于双轴伸展之前，也可将细胞暴露于Wnt通路调节剂(例如， GSK抑制剂)中。
通过单独或与GSK-3抑制剂一起投与而上调的基因包括(但不限于)COX-2、eNOS、 联接蛋白43、Fos、Jun、WISP2、Wnt10b、细胞周期素D1和SFRP1。从Flexercell研 究活体外获得的表达概况模拟活体内载荷基因表达概况(即，对来自HBM TG小鼠胫骨 的细胞进行RNA分析，其中使用四点系统使小鼠经受骨载荷)。因此，可使用这一机械 载荷检定或供本文中所揭示的多种细胞系使用的其它机械载荷手段来鉴别调节且优选 活化典型Wnt通路和模拟HBM表型的小分子、肽、免疫球蛋白和其类似物。诺里蛋白 模拟物可产生与诺里蛋白相同的反应或增强的反应，如同增加的骨质量的LRP5的HBM 变异体的反应增强。因此，使用这一系统将有助于筛检以类似HBM的方式增强应力概 况以及以等同于野生型诺里蛋白的方式作用的上调基因的试剂。
也可使用诱导对细胞的机械应力刺激的活体外方法来研究细胞增生和细胞凋亡，其 与骨重塑和对成骨细胞和破骨细胞增生和破骨细胞再吸收的需要相关。举例来说，可将 HBM和未感染成骨细胞接种于毕欧福莱克斯(bioflex)6孔板中且在含有10％FBS的 生长培养基中培养2-3天直到细胞约60％长满。机械载荷前24小时，用1mL含有约2％ 至约4％FBS的基础培养基替换所述培养基。然后使细胞经受约50με至约5,000με载 荷约1小时至约5小时。可进一步就诺里蛋白模拟物或为LRP5/诺里蛋白/卷曲蛋白4复 合物的激动剂(例如，诺里蛋白激动剂、卷曲蛋白4激动剂或LRP5激动剂)以及其拮 抗剂的试剂研究所述细胞。
载荷后，将细胞再培养一段时间。接着，可使用大量商业检定或所属领域中已知的 检定评估细胞数目和增生，所述检定包括(但不限于)[3H]-胸苷并入、5-溴-2′-脱氧尿苷 (BrdU)并入、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐 (MTS)检定、TUNEL检定(即，未端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)或膜联 蛋白V(Annexin V)检定。
关于所述概况可分析以下基因。在另一实施例中，可筛检Wnt拮抗剂或将其用于治 疗需要骨脱矿物质化(例如骨硬化病)的个体。Wnt拮抗剂包括(但不限于)Dkk1拮 抗剂和克曼蛋白拮抗剂。在这一系统下也可评估诺里蛋白激动剂和诺里蛋白模拟物以及 卷曲蛋白4激动剂和模拟物、Wnt激动剂和模拟物和LRP5和LRP6激动剂和模拟物。
表3
用于开发高骨质量微阵列或蛋白质/抗体阵列的基因



涉及骨载荷的蛋白质和核酸阵列的物质和方法更详细讨论于国际PCT申请案第 PCT/US2004/17951号中，出于所有目的，其整体并入本文中。
4.2非洲爪蟾中的诺里蛋白的功能性评估
非洲爪蟾胚胎是评估Wnt信号转导调节的信息丰富且完善建立的活体内检定系统， 例如参见麦克马洪(McMahon)等人，1989细胞(Cell)58：1075-84；史密斯(Smith) 和哈兰德(Harland)1991细胞(Cell)67：753-65，综述于沃达兹(Wodarz)和努斯 (Nusse)，1998细胞与发育生物学年鉴(Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.)14：59-88中。
通过影响诺里蛋白-卷曲蛋白4-LRP5复合物对Wnt信号转导通路加以修改可通过在 4或8细胞期时将RNA注射到腹部卵裂球后检查胚胎的背部化表型(加倍体轴)来观察。 在分子层面上，可通过在10.5天胚胎期时寻找多种标记物基因的表达来分析表型。所述 标记物将包括一般内胚层、中胚层和外胚层标记物以及多种组织特异性转录物。
胚胎的分析可使用RT-PCR/TaqMan进行且可对整个胚胎组织或以再受限制的方式 (显微解剖)进行。因为这一系统极灵活且快速，所以通过注射诸如诺里蛋白、LRP5/LRP6 和Fz4的转录物的组合，可仔细研究诺里蛋白信号转导通路的机制。先前研究已证明 LRP6单独或与LRP5+Wnt5a组合能够在这一系统中诱导轴复制(背部化)(泰麦(Tamai) 等人，2000自然(Nature)407：530-35)。一旦建立诺里蛋白信号转导，则其即可通过 Dkk和克曼蛋白拮抗剂和诺里蛋白激动剂和诺里蛋白模拟物用于评估。
4.2.1用于非洲爪蟾表达的构筑体(载体pCS2)
可将诺里蛋白、LRP5/6、Fz4、Dkk(例如，Dkk1)、Wnt和克曼蛋白1/2cDNA相 对于载体SP6启动子正向亚克隆于诸如pCS2+的载体中。pCS2+载体在插入物下游含有 SV40病毒聚腺嘌呤化信号和T3启动子序列(以供产生反义mRNA)。对蛋白质的表达 来说，也可利用呈任何组合形式的其它载体。
4.2.2  mRNA合成和微量注射方案
可在(例如)如上所述的pCS2+载体中使用cDNA构筑体作为模板通过活体外转录 产生用于微量注射到非洲爪蟾胚胎中的mRNA。使用阿姆毕欧(Ambion)mMessage mMachine高产率封盖RNA转录试剂盒(阿姆毕欧(Ambion)，目录号1340)根据制造 商的Sp6聚合酶反应说明书合成RNA。可使RNA产物达到于无菌玻璃蒸馏水中的50μL 的最终体积，且经用于放射性标记RNA纯化(Radiolabeled RNA Purification)的快速离 心柱(Quick Spin Column)使用G50-葡聚糖管柱(G50-Sephadex column)(罗氏(Roche)， 目录号1274015)根据制造商的说明书纯化。最后用苯酚:氯仿:异戊醇萃取所得洗脱液且 使用标准方案(萨布鲁克(Sambrook)等人，1989)进行异丙醇沉淀。最终RNA体积通 常为约50μL。RNA浓度可通过260nm和280nm下的吸光度值测定。RNA整体性可通 过变性(甲醛)琼脂糖凝胶电泳的溴化乙锭染色来观测(萨布鲁克(Sambrook)等人， 1989)。将各种量的RNA(约2pg至约1ng)注射到4或8细胞非洲爪蟾胚胎的腹部卵 裂球中。所述方案描述于慕恩(Moon)等人，1989技术：细胞与分子生物学方法杂志 (Technique-J.Meth.Cell & Mol.Biol)1：76-89和彭(Peng)，1991细胞生物学方法(Meth. Cell.Biol.)36：657-62中。
在任何本文中所述的检定中鉴别为调节诺里蛋白功能或充当诺里蛋白模拟物的分 子可使用动物模型或其它活体外筛检检定进一步加以验证。
4.3诺里蛋白的间叶干细胞中成骨效应的评估
人类间叶干细胞(hMSC)(卡姆布莱克斯生物科学(Cambrex Bio Science)，沃克斯 威尔(Walkersville)，MD)和小鼠干细胞(例如，C3H10T1/2，ATCC)可经诱导以分 别通过成骨或生脂培养基活体外分化为矿物质化骨结节(杰斯瓦尔(Jaiswal)等人，1997 细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)64：295-312)或脂肪组织(皮丁格(Pettinger)等人，1999 科学(Science)284：143-147)。Wnt信号活化在hMSC中增强骨生成且抑制脂肪生成。 预期诺里蛋白-Fz4-LRP5介导的信号转导在hMSC中提供类似类型的分化模式。因此， 使用hMSC(或来自另一脊椎动物的其它MSC细胞)鉴别诺里蛋白模拟物和诺里蛋白 激动剂为所涵盖的筛检检定。
除人类间叶干细胞外，也可使用来自其它脊椎动物的干细胞。间叶干细胞是各种骨 细胞(例如，成骨细胞)以及脂肪细胞的祖细胞(例如参见贝内特(Bennett)等人，2005 美国国家科学研究院学报(Proc.Nat′I Acad.Sci.USA)102(9)：3324-3329)。或者，可 用更多已分化细胞替换，诸如前成骨细胞、骨细胞和成熟成骨细胞。应注意，指示细胞 系为人类来源细胞系的情况可用来自另一脊椎动物的类似细胞替换。
4.3.1通过诺里蛋白对表达的作用评估成骨活性
简单来说，可将诺里蛋白以经纯化蛋白质或条件培养基的部分的形式添加到hMSC (第3-6代)中或通过使用病毒载体感染hMSC来表达。或者，可将诺里蛋白、诺里蛋 白激动剂和诺里蛋白模拟物连同成骨培养基(补充有10nM地塞米松(dexamethasone)、 50μg/ml L-抗坏血酸和5mMβ-甘油磷酸酯的生长培养基)一起添加到hMSC中。在约 37℃下与适当的对照培养基一起培育约1至约3周且每周补充含或不含诺里蛋白的新鲜 培养基后，可由标准技术测量成骨活性。举例来说，可通过针对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AlkPhos)蛋白表达将细胞染色、测定AlkPhos的酶活性、诱导AlkPhos 或骨钙素mRNA和通过茜素红(Alizerin Red)或冯库萨(von-Kossa)染色以及适当对 照来检测矿物质化来测量成骨活性。
4.3.2通过诺里蛋白对表达的影响评估对脂肪生成的调节
可通过使用病毒或其它类型的载体以及生脂分化培养基(即，含有10nM地塞米松、 50μg/ml L-抗坏血酸磷酸酯、500μM异丁基甲基黄嘌呤和60μM吲哚美辛 (indomethacin)的生长培养基)表达1-3周将诺里蛋白、诺里蛋白激动剂或诺里蛋白模 拟物添加到hMSC中。可通过生脂标记物基因(例如，降脂蛋白(Adipsin))的表达的 变化或通过用油性红O试剂将细胞染色来测定诺里蛋白、诺里蛋白激动剂或诺里蛋白模 拟物对脂肪细胞调节的效应。
可使用DNA阵列技术检测因投与测试药剂所致的表达变化。所述技术早已用于肥 胖症和糖尿病的测试。因此，一个方面为使用针对肥胖症开发的DNA阵列技术筛检测 试药剂，例如参见纳德尔(Nadler)等人，2000国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci) 97(21)：11371-11376，和指示用于脂质代谢的基因、分泌型蛋白质以及具有与肥胖症相 关的表达降低或增加的其它基因。与DNA阵列技术结合使用的细胞可为间叶细胞、脂 肪细胞或前脂肪细胞或本文中所讨论的其它细胞。
可通过多种不同测试测量活体内脂质含量的变化和脂肪生成。可收集血液和血清且 进行血液化学分析。因此，可就所述活体内效应筛检诺里蛋白模拟物或诺里蛋白激动剂。 同样地，可用LRP5/LRP6/卷曲蛋白4复合物就Dkk抑制剂和/或克曼蛋白抑制剂对诺里 蛋白(存在或不存在诺里蛋白激动剂)或诺里蛋白模拟物活性的影响对其进行筛检。
4.3.3通过诺里蛋白基因抑制评估骨生成和脂肪生成调节
通过使用成骨或生脂培养基，hMSC将分化为成骨或生脂系。可使用诺里蛋白、卷 曲蛋白4或LRP5的小发夹RNA作为对照来证明诺里蛋白和卷曲蛋白4对通路的增强 效应且展示这些蛋白质的抑制对脂肪生成和骨生成的影响。举例来说，在存在成骨培养 基和含有诺里蛋白shRNA的病毒载体的感染的情况下，可阻断诺里蛋白基因转录且通 过如上所说明的各种方法检测hMSC至成骨细胞的分化或矿物质化骨结节的产生。
可由可阻断所选单链遗传序列的活性的序列特异性DNA或RNA类似物获得组织培 养物和活体内的基因抑制。所述方法的实例包括反义寡核苷酸技术和引入同源双链RNA (dsRNA)或短干扰RNA(siRNA)，其也称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)或RNA干扰(RNAi)。这可通过使用多种病毒基因传送载体经由shRNA (短发夹RNA)引入到对给定靶基因mRNA具有特异性的细胞siRNA中来达成或通过 转染质粒载体来达成。已知进行RNA干扰和基因沉默的方法讨论于(例如)米斯特 (Meister)和图仕(Tuschl)，2004“通过双链RNA进行基因沉默的机制”(＂Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA＂)，自然(Nature)431：343-349；多赛特 (Dorsett)和图仕(Tuschl)，2005“siRNA在功能基因组学中的应用和作为治疗剂的可 能性”(＂siRNAs：applications in functional genomics and potential as therapeutics＂)，自然 综述RNA干扰集(Nat.Rev.RNA Interference Collection)40-51和本文中所引用的参考 文献中。一旦引入siRNA，即通过标准技术测量靶基因抑制的程度，所述技术包括 qRT-PCR、RNA的北方印迹法(Northern Blot)或蛋白质表达的西方印迹法(Western blot)。
5.用于测试调节诺里蛋白的药剂的试剂盒
另一方面涵盖用于测试调节诺里蛋白活性的药剂且优选通过调节诺里蛋白活性来 调节Wnt通路的药剂的试剂盒。这些试剂盒可用于筛检诺里蛋白模拟物和诺里蛋白激动 剂以及LRP5/诺里蛋白/卷曲蛋白4复合物的其它模拟物和激动剂。
所涵盖的试剂盒将包括细胞和至少编码诺里蛋白和卷曲蛋白4的核酸。优选将存在 编码LRP5、Dkk(任何Dkk)、HBM和/或克曼蛋白(克曼蛋白1和克曼蛋白2)以及诺 里蛋白和卷曲蛋白4和/或任何其组合的核酸。也可包括LRP6和Wnt。编码以上多肽的 核酸将与载体可操作性连接。出于对照的目的，也优选将仅包括载体。试剂盒可经设计 以供瞬时转染使用或用于稳定转染细胞。
或者，试剂盒可含有供活体外检定系统使用的任何以上蛋白质的经纯化蛋白质，诸 如此处所述的那些蛋白质。其可包括衬底，诸如硝化纤维、ELSA板或其它合适衬底。
试剂盒优选应包括适于检定的报导体系统，可为碱性磷酸酶、一或多种荧光蛋白质 和其类似物中的任一者。
一方面，试剂盒可具有供筛检使用的冷冻细胞系。另一方面，试剂盒可具有列出适 于本文中所述的活体外检定的适当的先前已测试的细胞的说明书。
另一方面，试剂盒可具有各种报导体、酶和为检测用于检测调节的报导体所需的试 剂。举例来说，如果使用TCF-luci和TK-海肾检定系统，那么试剂盒可具有TCF-luci 和TK-海肾荧光素酶和检测试剂。试剂盒也可具有转基因动物，其中已将Dkk、诺里蛋 白、LRP5、LRP6、HBM、克曼蛋白、Wnt和/或卷曲蛋白4的cDNA引入动物中。试剂 盒可包括一系列用于阐明特定测试试剂的活性的所述动物。
6.细胞系
另一方面，制备不表达诺里蛋白和/或卷曲蛋白4的细胞系。这些细胞系因此可具有 呈本文中所讨论的任何组合形式的LRP5、LRP6、卷曲蛋白、诺里蛋白、Dkk、克曼蛋 白、Wnt和诺里蛋白的瞬间或稳定表达的非原生形式。因此，可使用细胞系来筛检为诺 里蛋白模拟物或诺里蛋白激动剂的试剂。举例来说，具有所表达的LRP5和卷曲蛋白4 的非原生(非内源性)形式和缺乏诺里蛋白的细胞系，将不存在通过LRP5-卷曲蛋白4- 诺里蛋白机制活化Wnt通路的方式。然而，通过引入诺里蛋白模拟物，通路将被活化。 这些细胞系可为用于鉴别诺里蛋白模拟物的有效对照。这些细胞因此可具有通过检查调 节Dkk和/或克曼蛋白与卷曲蛋白4-LRP5/6-诺里蛋白复合物的相互作用的测试药剂的筛 检引入的Dkk和/或克曼蛋白的其它非内源性转录物。使用这一方法，可鉴别Dkk拮抗 剂和/或克曼蛋白拮抗剂。将非内源性诺里蛋白引入这些无诺里蛋白的细胞系中的一个中 可用于评估诺里蛋白-LRP5-卷曲蛋白4相互作用的诺里蛋白激动剂。
编码任何蛋白质或其生物学活性多肽片段的核酸的稳定和瞬时表达可通过所属领 域中已知的方式实现。例如参见瑞·伊恩·弗雷什尼(R.IAN FRESHNEY)，动物细胞的 培养：基本技术手册(A )(2000) 和约瑟夫·萨布鲁克()和大卫·沃·拉塞尔( W. )，分 子克隆：实验手册(：A )(第3版2001)。
不具有内源性诺里蛋白的细胞包括(但不限于)肾细胞。因此，肾细胞提供适用于 筛检诺里蛋白模拟物的手段。或者，可制备受抑制细胞系，其中剔除一或多个编码LRP5、 LRP6、诺里蛋白、Wnt、Dkk、克曼蛋白和/或卷曲蛋白4的基因以使得不能再合成内源 性多肽。这一过程可以任何细胞进行，诸如(但不限于)脂肪细胞、前脂肪细胞、间叶 细胞、各种骨细胞和肾细胞。
对所属领域的技术人员来说将显而易见，在不悖离本发明的精神或范畴的情况下， 可对本文中所述的物质和方法进行各种修改和变化。因此，希望本发明涵盖本发明的修 改和变化形式，只要其属于随附权利要求书和其等效物的范畴内。
实例
实例1：诺里蛋白/Wnt-TCF信号检定
诺里蛋白克隆分离：由IMAGE克隆通过标准PCR方法克隆cDNA。具体来说，使 用来自NCBI的诺里蛋白开放阅读框架(open reading frame，ORF)序列(NM_000266) 寻找可用的IMAGE克隆。克隆#5179578经鉴别为所预测的全长cDNA。IMAGE克隆购 自开放生物系统(Open Biosystems)(亨兹威尔(Huntsville)，AL)。通过标准PCR技 术使用以下引物扩增ORF：
5′-CATATGAATTCACCATGAGAAAACATGTACTAGCTGCATC-3′(SEQ ID NO：1) (其带来用于克隆的EcoRI位点以及紧接起始ATG的5′端的一致Kozak)和
5′-GATATGCGGCCGCTCTAGATCAGGAATTGCATTCCTCGCAGTG-3′(SEQ ID NO：2)(其带来位于终止密码子后方的XbaI和NotI位点)。将所得PCR产物用EcoRI 和NotI消化且克隆于pcDNAS.1(英杰(Invitrogen))的EcoRI和NotI位点中。阳性分 离物通过限制消化鉴别且通过DNA序列分析经确认匹配公开序列(寄存编号： NM_000266)。
Kretnen克隆分离：将PCR扩增全长片段亚克隆至pcDNA3.1载体的EcoRI/BamHI 限制酶位点中。然后分离序列经验证匹配公开人类克曼蛋白2序列(寄存编号 NM_172229/AB086405.1和NP_757384.1)。从人类成骨细胞样U2OS细胞系总RNA中 分离出cDNA。使用RNeasy试剂盒(恰根(Qiagen)，巴伦西亚(Valencia)，CA)根据 制造商的方案纯化来自约2.5×106个U2OS细胞的总RNA。根据标准PCR方法扩增克曼 蛋白2cDNA分离物。所使用的PCR引物为：
5′引物：5′-GGACGAATTCACCATGGGGACACAAGCCCTGCAG-3′(SEQ ID NO：3)， 3′引物：5′-CTCGCTCATCTCCGCTCTCTGAGGATCCCAGG-3′(SEQ ID NO：4)。将PCR 扩增全长片段亚克隆至pcDNA3.1载体的EcoRI/BamHI限制酶位点中且整个序列经验证 匹配公开人类克曼蛋白2序列(寄存编号NM_172229/AB086405.1和NP_757384)。
Dkk克隆分离：基因库寄存编号为AF127563的人类cDNA可在公开数据库中获得。 使用这一序列，设计PCR引物以扩增具有紧接起始ATG上游的一致Kozak序列的开放 阅读框架。使用寡核苷酸117162 (5′-CAATAGTCGACGAATTCACCATGGCTCTGGGCGCAGCGG-3′；SEQ ID NO：5)和 117163(5′-GTATTGCGGCCGCTCTAGATTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAA-3′；SEQ ID NO：6)通过PCR筛检来人类子宫cDNA文库。将所得PCR产物纯化，亚克隆至 pCRII-TOPO(英杰公司(Invitrogen Corp.))中，验证序列且用EcoRI/XhoI消化。将这 一插入物亚克隆至pCS2+载体的EcoRI-XhoI位点中。
分离编码人类Dkk2的全长cDNA以研究Zmax/LRP5/HBM与分子Dkk家族相互作 用的的特异性。Dkk1在酵母中经鉴别为Zmax/LRP5/HBM的潜在结合搭配物。在文献 中已展示Dkk1为Wnt信号转导通路的拮抗剂，而Dkk2不然(克鲁尼克(Krupnik)等 人，1999)。Dkk2全长cDNA充当区分Zmax/LRP5/HBM与Dkk家族(例如，Dkk1、Dkk2、 Dkk3、Dkk4、Soggy、其同源物和变异体等)相互作用的的特异性和生物显著性的手段。 Dkk2的人类cDNA序列(基因库寄存编号NM_014421)可在公开数据库中获得。使用 这一序列，设计PCR引物以扩增具有紧接起始ATG上游的一致Kozak序列的开放阅读 框架。使用寡核苷酸51409(5′-CTAACGGATCCACCATGGCCGCGTTGATGCGG-3′；SEQ ID NO：7)和(5′-GATTCGAATTCTCAAATTTTCTGACACACATGG-3′；SEQ ID NO:8) 通过PCR筛检人类胚胎和脑cDNA文库。将所得PCR产物纯化，亚克隆至pCRII-TOPO 中，验证序列且用BamHI/EcoRI消化。将这一插入物亚克隆至pCS2+载体的BamHI-EcoRI 位点中。关于Dkk1和Dkk2克隆的其它讨论，参见国际PCT申请案PCT/US02/15982。 使用本文中所提及的序列可制备Dkk3和Dkk4的类似构造。
LRP6克隆：通过XhoI-XbaI消化将全长LRP6从pED6dpc4载体中分离出来。将全 长cDNA重新装配于pCS2+的XhoI-XbaI位点中。通过DNA测序确认插入方向。
LRP5(Zmax1)和HBM：通过BglII-EcoRI消化将插入cDNA从全长cDNA反转 录病毒构筑体(具有经优化Kozak序列)分离出来且亚克隆至pCS2+载体的BamHI-EcoRI 位点中。关于LRP5和HBM构筑体的更多详情，参见美国专利第6,770,461号和标题为 “通过Zmax1或HBM基因调控脂质含量”(＂Regulating lipid levels via the Zmax1or HBM gene＂)的国际PCT申请案PCT/USO1/16946。
Wnt克隆：如下获得本文中所示的实验中所利用的Wnt基因。10种不同全长Wnt cDNA于载体pUSEamp(+)中购自上州生物技术(Upstate Biotechnology)(宁静湖(Lake Placid)，NY)。所述基因为：Wnt1(目录号21-121)、Wnt2(目录号21-122)、Wnt3(目 录号21-123)、Wnt3a(目录号21-124)、Wnt4(目录号21-125)、Wnt5a(目录号21-133)、 Wnt5b(目录号12-126)、Wnt6(目录号21-127)、Wnt7a(目录号21-128)和Wnt7b(目 录号21-129)。通过XbaI消化释放插入物且将其亚克隆于用于非洲爪蟾表达的pCS105 载体的XbaI位点中。通过序列分析确认定向。
通过RT-PCR使用GCRich试剂盒(克隆技术(Clontech)，芒廷维尤(Mountain View)， CA)和以下特异性引物将全长Wnt1 1 cDNA从1×106个人类成骨细胞(human osteoblast cell，HOB，第13代)中分离出来：(正向)： 5′-GGGAATTCGCGACGATGAGGGCGCGGCCGCA-3′(SEQ ID NO：9)(包括EcoRI位 点)和(反向)：5′-GGGCGGCCGCAGGGCCTCACTTGCAGACATAGC-3′(SEQ ID NO： 10)(包括NotI位点)。将RT-PCR产生的DNA片段用EcoRI和NotI消化且插入pcDNA3.1 vector的EcoRI和NotI产生的位点中。全长序列经验证匹配公开Wnt11序列(寄存编 号：Y12692)。
其它Wnt基因的全长cDNA可通过标准PCR技术由各种人类cDNA文库来源使用 公开序列设计用于扩增基因的开放阅读框架且有利于克隆至pCS105载体或pcDNA3.1 型哺乳动物载体或其它合适哺乳动物载体中的引物来获得。其它Wnt基因的合适引物存 在于下表1中。“F”代表“正向”引物而“R”代表“反向”引物。
表1

报导体检定：TCF检定包括16x-TCF报导体(含有16个拷贝的具有基本TK-启动 子的Wnt-β联蛋白信号反应性TCF元件)和荧光素酶基因。所述构筑体于pGL3载体(普 洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，WI)中含有16个拷贝的位于最小TK(胸苷激 酶)启动子上游的TCF结合位点和荧光素酶基因。四个TCF结合位点的序列(参见下 文的成对序列)通过寡核苷酸合成法产生且含有分别在5′和3′端处具有Nhe1和Xho1限 制酶位点的以下序列。下划线区域指示TCF结合位点。提供两条链。当使两条链退火时， 引入NheI(5′)和XhoI(3′)相容性限制位点以供进一步克隆且其含有TCF结合位点(分 别为SEQ ID NO：27和28)：
5′-CTAGCGAGAACAAAGGAGATTCAAAGGAGATCAAAGGAGATCAAAGGACT AGTTC-3′
3′-TCGAGAACTAGTCCTTTGATCTCCTTTGATCTCCTTTGAATCTCCTTTGTTCTC G-5′
使用TK-海肾(普洛麦格公司(Promega Corp.)，WI)作为内部检定正规化对照； 且如以上所讨论的诺里蛋白、Wnt1、Wnt3a、Dkk1和克曼蛋白2cDNAs的pcDNA载体 基构筑体和卷曲蛋白4构筑体(傲锐东源技术公司(Origene Tech.Inc.)；洛克威尔 (Rockville)，MD)也是检定的一部分。可用能够表达脊椎动物诺里蛋白、Wnt1、Wnt3a、 Dkk1和克曼蛋白2的不同形式的其它载体替换。
将个别含有这些基因的克隆共转染于人胚肾(Human Embryonic Kidney，HEK) -293A细胞(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，VA)中或人类骨肉瘤来源骨/成骨细胞样细 胞系U2OS(ATCC)中。将细胞在补充有10％热失活胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、 1％glutamax(英杰(Invitrogen))和1％青霉素/链霉素(英杰(Invitrogen))的杜氏最 低必要培养基(Dulbecco′s Minimum Essential Media，DMEM)(英杰(Invitrogen))或 RPMI培养基(英杰(Invitrogen))中培养。
将HEK-293A细胞(每孔50,000个细胞)或U2OS细胞(每孔25,000个细胞)涂 铺于96孔板中。涂铺后培育24小时后(约80-90％长满)，用100μL新鲜无血清OPTBM 培养基(吉布可(Gibco)/BRL)替换所述培养基。使用Lipofectamine2000转染试剂(普 洛麦格(Promega)；麦迪逊(Madison)，WY)根据制造商的说明书将两种细胞类型用 16x-TCF(TK)-萤火虫荧光素酶(0.3微克/孔)和TK-海肾-荧光素酶(0.06微克/孔) 转染。一式两份地进行实验。
按需要，以不同浓度转染测试cDNA构筑体。各构筑体使用约0.0005微克/孔至0.05 微克/孔cDNA。使用LipofectamineTM 2000(英杰(Invitrogen))根据制造商的说明书进 行转染。将DNA混合物和试剂培育30分钟。将50微孔/孔DNA-试剂混合物添加到100 微升OPTIM培养基中。然后将细胞在37℃下培育4小时。分别对HEK 293A和U2OS 细胞用新鲜的150μL DMEM或RPMI培养基替换转染培养基。在37℃下在CO2培育箱 中培育20-24小时后，移除培养基。通过添加150μL双重Luci试剂(普洛麦格公司 (Promega Corp.))的1倍溶解缓冲液溶解经转染的细胞单层。
10分钟后，将20μL溶解产物转移到新的96孔白板(帕卡德(Packard)/科思达 (Costar))中。将细胞溶解产物与100微升/孔LARII缓冲液(双重Luci试剂)混合且 使用帕卡德(Packard)Topcount NXTTM发光计数器(美瑞康(Meriden)，CT)测量相 对荧光素酶单位(Relative Luciferase Unit，RLU)。其后为添加100微升/孔“停止和淬 灭(stop & glo)”试剂(双重Luci试剂)，且使用帕卡德(Packard)Topcount NXTTM发 光计数器测量内部检定对照海肾荧光素酶。
计算TCF-萤火虫-luci与海肾的比率且在图1-4中以条形图表示。一式四份地进行实 验，其中展示就误差度所计算的标准偏差。
图1指示当将诺里蛋白cDNA转染至人类U2OS细胞中时，在不存在Wnt cDNA 转染的情况下，其产生TCF信号的约2至3倍的诱导(粉红色斜线条)。然而，HEK-293A 转染细胞不产生任何显著的TCF信号活化。图1也展示将诺里蛋白和一个其辅助受体 LRP5共转染至HEK-293A细胞中并不活化TCF-信号(紫色方格条)。
引人关注地，当将含有诺里蛋白(Nr)或LRP5(L5)的基因的载体共转染至U2OS 细胞中时，TCF-信号增强。所利用的物质和方法如上所述。参见图1的右侧。当将诺里 蛋白与LRP5两者共转染至U2OS细胞中时，TCF信号协同增强(最右侧的条，图1)， 超出仅载体(对照)的约6倍。因为除LRP5/6辅助受体外，诺里蛋白还需要卷曲蛋白4 (Fz4)受体，所以数据暗示U2OS细胞含有Fz4，而HEK-293A细胞缺乏Fz4。诺里蛋 白在无Fz4的情况下不能诱导TCF-信号，且因此在HEK-293A细胞中缺乏反应(图1 左侧)。
实例2：Fz4为诺里蛋白信号转导所需
为评估Fz4-诺里蛋白相互作用，将Fz4和LRP5 cDNA转染至也用诺里蛋白转染的 两种细胞类型中。
如以上实例1中所讨论进行转染。进行TCF的检测且所使用的构筑体如实例1中所 讨论。以一式四份获得数据，其中所见统计学分析为计算标准偏差。
HEK-293A细胞展示对仅载体(V)、仅LRP5(L5)、仅Fz4(F4)或LRP5和诺里 蛋白(L5+Nr)来说，不存在TCF反应。添加诺里蛋白和Fz4(F4+Nr)，TCF产生超出 仅载体或Fz4的约6倍增加。图2中的数据证明在HEK7293 A细胞中，功能性Fz4是 诺里蛋白-TCF-信号活化的限制因子。也指示在HEK-293A细胞中，诺里蛋白-Fz4相互 作用可能利用细胞的内源性LRP5/6受体。另外，将LRP5以及fz4和诺里蛋白(L5+F4+Nr) 共转染至HEK-293细胞中使得TCF-信号进一步增强，超出仅LRP5(L5)和仅诺里蛋 白(Nr)转染HEK293A细胞的至多16倍。参见图2的左侧。
与此相对，用U2OS细胞进行相同测试。U2OS细胞因Fz4和诺里蛋白(F4+Nr)的 共转染而产生显著比仅载体(V)、仅LRP5(L5)、仅卷曲蛋白4(F4)和经LRP5和诺 里蛋白(L5+Nr)共转染的U2OS细胞高的TCF活性。参见图2。当Fz4、LRP5和诺里 蛋白(F4+L5+Nr)所有都共转染于细胞中时，U2OS细胞中的反应进一步增强(约2倍 至约6倍)。U2OS细胞中的所述数据可能指示存在内源性Wnt信号组分，包括Fz4和 LRP5/6受体。
实例3：在U2OS细胞中诺里蛋白诱导的LRP5-Fz4-TCF信号会受到Dkk1和克曼 蛋白2显著抑制
如图3中所指示，根据实例1中所陈述的检定程序，将U2OS细胞用空白载体(V)、 LRP5(L5)、卷曲蛋白4(Fz4)、诺里蛋白(Nr)、克曼蛋白2(Krm2)或Dkk1转染或 共转染。以一式四份获得结果且由其计算标准偏差。
图3展示当用各种cDNA构筑体转染时，U2OS-TCF检定中TCF-luci与海肾信号调 节的比率。在图3的右侧，各条指示LRP5(L5)、Fz4(Fz4)或诺里蛋白(Nr)的转染 产生超出载体对照的至多约2至5倍的诱导。然而，Fz4与诺里蛋白(Fz4+Nr)的共转 染产生TCF信号的约15倍的诱导。
通过表达LRP5(L5)cDNA，Fz4和诺里蛋白的效应进一步增强(即，最高且最深 色的条)。Fz4+Nr+L5的最大活性部分受到用Dkk1共转染的细胞抑制。当将Dkk1与 Krm2添加到用LRP5、Fz4和诺里蛋白(L5+Fz4+Nr)共转染的细胞中时，TCF-信号几 乎完全受到抑制(右侧，最右边的条)。
图3中所展示的结果指示，诺里蛋白-LRP5-Fz4介导的TCF-信号可受Dkk1抑制。 认为Dkk1是Wnt-LRP5-Fz诱导的Wnt典型通路的有效抑制剂。令人关注地，克曼蛋白 2(Krm2)添加与Dkk1协同作用且转而又使得阻断诺里蛋白增强Wnt通路的作用。
实例4：在HBM和LRP5下诺里蛋白介导的TCF信号不同地受到Dkk1和克曼蛋 白2抑制
在cDNA转染的U2OS细胞中研究由LRP5或其功能突变体HBM的增益所致的诺 里蛋白-TCF-信号调节的比较。结果展示于图4中。用HBM cDNA转染U2OS细胞产生 比用LRP5 cDNA转染稍高的TCF-信号。参见图4的左侧，其展示仅载体(V)、仅LRP5 (L5)、仅HBM(H)、仅卷曲蛋白4(Fz4)和诺里蛋白(Nr)。构造和条件如关于实例1 所述。以一式四份进行实验，由其计算标准偏差。
用诺里蛋白和Fz4以及LRP5(Nr+Fz4+L5)或HBM(Nr+Fz4+H)共转染U2OS细 胞在LRP5与HBM cDNA下都产生最大TCF-信号，即，超出基本活性的约25倍。具有 诺里蛋白、卷曲蛋白4、LRP5或诺里蛋白、卷曲蛋白4和HBM组合的Dkk1共转染对 TCF信号产生约38-40％的抑制。通过添加克曼蛋白2(Krm2)，Dkk1抑制进一步增强。 参见图2的右侧，两个最右侧的条。
比较性诺里蛋白-TCF信号分析暗示，LRP5突变G171V介导的诺里蛋白-Fz4-TCF 信号赋予针对克曼蛋白2和Dkk1的抑制作用的部分抵抗性。这一引人关注的观察结果 与先前在存在Dkk1和克曼蛋白2的情况下在LRP5和HBM下由Wnt3a和Wnt1介导的 TCF-信号观察到的结果非常类似。已报导，在人类和转基因小鼠中，LRP5-Wnt-TCF信 号转导调节骨生成，同时HBM突变产生高骨质量表型。基于这些结果，作为比Wnt更 具特异性的LRP5-Fz4复合物的配体，诺里蛋白很可能在骨代谢中发挥重要作用。
在以上各实例中，可用Dkk2、Dkk3和/或Dkk4替换Dkk1。另外，在使用克曼蛋白 2的实例中，应了解，可用克曼蛋白1替换且用于同一检定中。另外，蛋白质或生物学 活性多肽可通过共转染或通过添加经纯化蛋白质和/或含有蛋白质和/或生物学活性多肽 的改良培养基来引入。
由以上所讨论的活体外数据，已展示诺里蛋白通过在U2OS骨细胞而不是在 HEK-293A细胞中在无卷曲蛋白4转染的情况下活化TCF报导体来增强LRP5-卷曲蛋白 4介导的Wnt典型通路。如由人类和转基因动物中的LRP5-G171V突变的高骨质量 (“HBM”)表型所证明，LRP5介导的Wnt信号转导在骨形成/维持中很重要。所呈示的 数据也展示，与在LRP5下相比，在存在LRP5-G171V(HBM)突变体的情况下诺里蛋 白介导的TCF-信号对Dkk1介导的抑制不太敏感。因为假设归因于LRP5中的G171V突 变所致的抑制降低是HBM表型的一个原因，所以我们将预期诺里蛋白、其表达、其诱 导和/或诺里蛋白模拟物可活体内增强骨形成或维持。因此，活体内诺里蛋白基因剔除可 展示骨质減少症。以上检定是供筛检尤其诺里蛋白模拟物、诺里蛋白激动剂和卷曲蛋白 4激动剂使用的代表性检定。
出于所有目的，含有SEQ ID NO：1-28的随附序列表以引用的方式并入本文中。
出于所有目的，本文中所引用的所有参考文献整体以引用的方式并入本文中。