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一种eNOS表达与活化的调控装置及周围动脉疾病的治疗装置
申请号	CN201610316898.2	申请日	2016-05-12	公开(公告)号	CN105944243A	公开(公告)日	2016-09-21
申请人	段俊丽; 周红生; 郝长宁; 石一沁; 李月;			发明人	段俊丽; 周红生; 郝长宁; 石一沁; 李月;
摘要	本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种eNOS表达与活化的调控装置。本发明公开了一种eNOS(Endothelial nitric oxide synthase)表达与活化的调控装置，其包含受试者照射超声波的超声波照射部件。本发明所述调控装置、治疗装置以及治疗方法，不仅治疗经费低廉，而且确立了安全性，且稳定性高，能有效地促进生物体中eNOS表达与活化的上调，从而高效地治疗周围动脉疾病。
权利要求	1.一种eNOS表达与活化的调控装置，其包含受试者照射超声波的超声波照射部件。 2.如权利要求1所述的调控装置，其特征在于所述调控装置还包含调控超声波照射部件的调控部件，以向受试者照射0.5～3MHz±10％，0.3W/cm2的范围内的超声波。 3.如权利要求1所述的调控装置，其特征在于所述调控装置还包含调控超声波照射部件的调控部件，以向受试者照射1MHz±10％，0.3W/cm2的范围内的超声波。 4.如权利要求2所述的调控装置，其特征在于所述调控部件以在平均每天9～40分钟± 10％的范围内向受试者照射超声波的方式，调控超声波照射部件。 5.如权利要求1所述的调控装置，其特征在于所述超声波照射部件为至少一个的超声波发射端子。 6.如权利要求2所述的调控装置，其特征在于所述调控部件，其以分时依次驱动多个超声波发射端子的每个端子，使其发射超声波的方式调控超声波照射部件。 7.一种周围动脉疾病的治疗装置，其特征在于其包含权利要求1所述调控装置。 8.如权利要求7所述的治疗装置，其特征在于其可向受试者照射0.5～3MHz±10％， 0.3W/cm2的范围内的超声波。 9.如权利要求7所述的治疗装置，其特征在于其可向受试者照射1MHz±10％，0.3W/cm2的范围内的超声波。
说明书全文	一种eNOS表达与活化的调控装置及周围动脉疾病的治疗装置技术领域 [0001] 本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种eNOS表达与活化的调控装置及包含该eNOS表达与活化的调控装置周围动脉疾病的治疗装置。背景技术 [0002] 周围动脉疾病(peripheral artery disease，PAD)主要是由于动脉粥样硬化累及周围动脉血管床，导致血流阻塞，组织缺血的一类疾病，总体发病率约为3％-10％。下肢是PAD的好发部位，在50岁以上PAD患者中1％-2％会发展成为严重肢体缺血(critical limb ischemia，CLI)，出现静息痛、缺血性溃疡和/或坏疽等临床表现，CLI己成为严重危害人类健康的疾病之一[TONGERS J,RONCALLI J G,LOSORDO D W.[J].Circulation,2008,118(1):9-16]。 [0003] 目前虽然药物治疗、外科搭桥手术和导管介入治疗已经发生了巨大的变革，但是各种治疗手段都有着其严格的适应症，对于存在严重合并症的患者(糖尿病、严重肾脏功能衰竭和/或心脏衰竭)往往不适合外科手术或导管介入治疗，药物治疗效果也不甚理想，多数患者难以获得令人满意的疗效，生活质量很低[HIRSCH A T,HASKAL Z J,HERTZER N R,et al.[J].Circulation,2006,113(11):e463-654]。因此，迫切需要治疗性血管新生疗法来改善患者的生活质量与远期预后。发明内容 [0004] 本发明的目的之一在于针对现有技术的不足而提供一种eNOS表达与活化的调控装置。该eNOS表达与活化的调控装置能有效地促进生物体中eNOS表达与活化的上调，从而高效地治疗周围动脉疾病。 [0005] 本发明目的之二在于提供一种包含该eNOS表达与活化的调控装置周围动脉疾病的治疗装置。 [0006] 为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案如下： [0007] 一种eNOS(Endothelial nitric oxide synthase)表达与活化的调控装置，其包含受试者照射超声波的超声波照射部件。 [0008] 另外，本发明还公开了一种周围动脉疾病的治疗装置，其特征在于其包含eNOS表达与活化的调控装置。进而，本发明的周围动脉疾病的治疗方法的特征在于：包含向生物体照射超声波，促进eNOS表达与活化的上调步骤。 [0009] 根据本发明的eNOS表达与活化的调控装置，由于具备向作为受试者的生物体照射超声波的超声波照射部件，可以调控生物体内的eNOS表达与活化。 [0010] 另外，优选本发明的eNOS表达与活化的调控装置还具备调控上述超声波照射部件的调控部件，以向上述生物体照射0.5～3MHz±10％，0.3W/cm2的范围内的超声波，更优选2 为1MHz±10％，0.3W/cm的范围内的超声波。 [0011] 进而，优选在本发明的eNOS表达与活化的调控装置中，上述调控部件以在平均每天9～40分钟±10％的范围内向上述生物体照射超声波的方式，调控上述超声波照射部件。根据上述的构成，能够更有效地促进eNOS表达与活化上调。 [0012] 进而，优选在本发明的eNOS表达与活化的调控装置中，上述超声波照射部件还具备与上述生物体经由介质非侵入性地接触，放出照射到上述生物体的超声波的至少一个的超声波发射端子。由此，可以非侵入性地调控eNOS表达与活化上调，促进血管新生。 [0013] 另外，优选本发明的eNOS表达与活化的调控装置具备调控部件，其以分时依次驱动多个上述超声波发射端子的每个端子，使其发射超声波的方式调控上述超声波照射部件。由此，超声波的能量不会集中照射在特定部位，能够高效地向生物体照射超声波。 [0014] 进而，优选本发明的周围动脉疾病的治疗方法还包含向生物体照射频率在0.5～3MHz±10％的范围内的超声波的照射步骤。再者，优选本发明的周围动脉疾病的治疗方法，在上述超声波照射步骤中，在平均每天9～40分钟±10％的范围内向上述生物体照射超声波。由此，能有效地促进生物体中eNOS表达与活化的上调，从而高效地治疗周围动脉疾病。 [0015] 另外，优选本发明的周围动脉疾病的治疗方法，在上述超声波照射步骤中，向上述生物体照射从多个超声波发射端子的各个端子以分时依次发射的超声波。由此，照射的超声波的能量不会集中在生物体的特定部位，能够高效地向生物体照射超声波。 [0016] 进而，优选本发明的周围动脉疾病的治疗方法，在上述超声波照射阶段中，向上述生物体的患处照射超声波。这样，通过向作为治疗的受试者的生物体的患处照射超声波，能够高效地治疗周围动脉疾病。 [0017] 本发明所述调控装置、治疗装置以及治疗方法，不仅治疗经费低廉，而且确立了安全性，且稳定性高，能有效地促进生物体中eNOS表达与活化的上调，从而高效地治疗周围动脉疾病。附图说明 [0018] 图1：不同剂量TUS对HUVECs细胞生长和增殖的影响。 [0019] 图2：不同剂量TUS对HUVECs细胞跨膜迁移能力的影响。 [0020] 图3：不同剂量TUS对HUVECs细胞迁移能力的影响。 [0021] 图4：不同剂量TUS对HUVECs细胞eNOS、VEGF、p-Akt以及total Akt蛋白表达的影响。 [0022] 图5：小鼠缺血后肢皮肤无缺血侧与非缺血侧肢体局部皮肤温度比值情况。 [0023] 图6：股动脉结扎手术后14天进行的小鼠缺血后肢缺血评分。 [0024] 图7：不同剂量TUS对缺血后肢肌肉毛细血管密度的影响。 [0025] 图8：不同剂量TUS对缺血后肢肌肉eNOS、VEGF、HIF-1α、p-Akt以及total Akt蛋白表达的影响。 [0026] 图9：不同剂量TUS对缺血后肢肌肉NO含量的影响。具体实施方式 [0027] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数均按重量计。 [0028] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 [0029] 实施例1、体外治疗性超声波(TUS)干预人脐静脉内皮细胞实验 [0030] 实验用细胞：本实验所用人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)购自美国ATCC，镜下观察细胞形态呈现典型铺路石样形态，折光行好，边界清晰。该研究中选用的主要是3-5代细胞。 [0031] 1、不同剂量治疗性超声波(TUS)干预HUVECs [0032] 1)于实验前一天进行HUVECs铺板，保证每个培养皿(直径35mm)中细胞密度相近，然后置于饱和湿度37℃、5％CO2培养箱过夜培养，次日TUS干预前更换新鲜培养基。 [0033] 2)本实验所用超声波发生器由同济大学声学所提供，技术参数为：连续型超声波，频率1MHz,能量0.3W/cm2，分别干预3，6，9min/天，每次间隔24小时，连续3天。 [0034] 3)将直径为2cm的圆形传感器(涂有医用超声耦合剂，尽可能消除传感器与培养皿底部之间的空气，保证尽可能多的超声传导到细胞)与铺满HUVECs的培养皿底部中心接触，采用不同剂量TUS刺激HUVECs，于第4天收集HUVECs用于后续实验。 [0035] 4)对照组(Control)HUVECs除不给予TUS刺激外，其余条件与TUS组相同。 [0036] 将经TUS处理过的HUVECs进行CCK-8细胞活性检测，连续比较TUS刺激后第0,6,12,24,48h细胞增殖能力的改变。结果显示：经1MHz 0.3W/cm2TUS分别干预3，6，9min/天×3天后，在第6,12,24,48h 4个时间点HUVECs的细胞活性与对照组(Control)相比均有不同程度的增加，其中TUS 9min组细胞增殖能力增强最为显著(P＜0.01＝(图1)。提示：TUS具有潜在的促进HUVECs细胞增殖的能力。 [0037] 2.不同剂量TUS对HUVECs细胞迁移能力的影响 [0038] 血管新生的过程既与内皮细胞向基底膜的附着、管腔样结构的形成有关，也涉及内皮细胞的迁移，在本研究中，我们采用经典Transwell实验和“划痕”创伤愈合实验来观察 TUS对HUVECs迁移能力的影响。 [0039] Transwell Permeable Supports的上室底部布满直径0.1-12.0μm的网孔，种植于小室内的细胞由于自身直径大于网孔而无法直接通过网孔进入下室，下层小室内的干预因素(如一些小分子物质)则可通过网孔作用于上室，引起上室细胞发生形变、迁移从而穿过网孔，然后根据到达下层的细胞数量来评估细胞迁移能力。本实验选择网孔直径为8μm的Transwell上层小室进行实验，在Transwell体系上室内加入不含FBS的细胞悬液，下室中加入含有10％FBS的DMEM培养基，然后给予不同时间TUS干预后，培养箱中孵育8小时后擦去上室内未跨膜的细胞，仅对穿过膜的细胞进行结晶紫染色和计数。 [0040] 结果显示：TUS以时间依赖的方式促进了细胞的跨膜迁移，以TUS 9min组跨膜细胞最多达到了330.2±25.0，与Control组(165.1±13.1)相比有统计学差异(P＜0.05)，TUS 3min和TUS 6min组与Control组相比差异无显著性(图2)。 [0041] “划痕”创伤愈合实验结果显示：在TUS干预前(0h)，不同组别HUVECs 单层融合细胞的划痕宽度基本一致；TUS干预后经过24h细胞培养，各组细胞的划痕宽度均发生了一定程度的缩减，这与HUVECs自身向无细胞区主动运动能力有关，经过显微镜下观察比较，3个TUS组的划痕修复率和Control组比较均有不同程度的增加，呈现一定的剂量依赖性，以TUS 9min组增加最为明显(图3,TUS 9min 24h vs.Control 24h,P＜0.01)。在HUVECs培养48h后再次对4组细胞进行划痕修复率比较，结果与24h所见类似，仍以TUS 9min组划痕修复率增加为明显(图3,TUS 9min 48h vs.Control 48h,P＜0.05)。 [0042] 3.不同剂量TUS对HUVECs细胞相关促血管新生因子mRNA表达的影响[0043] 本实验采用Real time-PCR方法，分别检测了4组HUVECs eNOS mRNA和VEGF mRNA的表达变化情况。常规提取细胞总RNA后行RT-PCR扩增，GAPDH为内参，基因表达水平用倍数变化来表示(2-(△△Ct)法)。 [0044] 结果显示：经不同剂量TUS干预后，TUS 9min组eNOS mRNA和VEGF mRNA水平均较Control组有显著升高(eNOS mRNA:TUS 9min vs.Control P<0.01；VEGF mRNA:TUS 9min vs.Control P<0.05)；TUS 3min和TUS 6min组的eNOS mRNA和VEGF mRNA水平均与Control组两相比较，表达虽有所增加，但无明显差异。说明TUS 9min可以使HUVECs eNOS mRNA和VEGF mRNA的表达显著升高，其高表达的程度可能与TUS干预时间有关。 [0045] 4.不同剂量TUS对HUVECs细胞相关促血管新生因子蛋白表达的影响[0046] Western blot对不同剂量TUS干预的人脐静脉内皮细胞eNOS、VEGF、p-Akt以及t-Akt蛋白表达水平进行检测显示：不同剂量TUS干预组t-Akt表达水平与对照组相比未见显著性变化(图4C,P>0.05)；TUS 9min组eNOS、VEGF和p-Akt蛋白表达水平与Control组相比显著增高(图4A B C,P<0.01)。结果提示：TUS 9min可以使eNOS、VEGF和p-Akt的蛋白表达量明显增加，Akt酶的活性增强。 [0047] 实施例2体内实验 [0048] 实验动物：健康雄性成年C57BL/6小鼠24只，体重18-22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海交通大学医学院附属新华医院SPF级动物房。 [0049] 2.实验方法 [0050] 2.1后肢缺血小鼠动物模型制作 [0051] 1)C57BL/6小鼠称重后腹腔注射4％水合氯醛溶液(0.1ml/10g)进行全麻，左后肢常规备皮消毒，仰卧位固定于手术板上。 [0052] 2)在左侧腹股沟带至膝关节作一纵行切口，逐层分离皮下筋膜组织，于腹股沟下方清晰暴露股动静脉及股神经，仔细分离出股神经(避免神经损伤)，然后从股动脉起始部至胫后动脉分支处，分离出股深动脉和腹壁下动脉及其分支(Figure 16)。 [0053] 3)用7-0丝线弯头镊穿过股动脉近端和远端，分别用线结扎(先结扎近心端，再结扎远心端)，然后将股动脉近心端和远心端结扎之间的血管结扎后剪除。术毕，缝合切口。 [0054] 4)术后每天腹腔注射青霉素钠，连续3天，防治感染。 [0055] 2.2后肢缺血小鼠分组及实验方案 [0056] 本部分实验共有24只后肢缺血C57BL/6小鼠动物模型制作成功，随机平均分为4组，每组6只： [0057] 1)缺血(Ischemia)组：仅单纯进行后肢股动脉结扎手术，不给予TUS干预； [0058] 2)TUS 3min组；给予TUS(1MHz,0.3W/cm2)干预3min/次，每天1次； [0059] 3)TUS 6min组：给予TUS(1MHz,0.3W/cm2)干预6min/次，每天1次； [0060] 4)TUS 9min组：给予TUS(1MHz,0.3W/cm2)干预9min/次，每天1次。 [0061] 从术后第1天开始给予不同剂量TUS干预，每天1次，连续14天。分别于术前、术后0天和14天行红外热像仪评估双下肢血流情况；于术前和术后第14天测定清醒状态下小鼠动脉收缩压、舒张压、平均动脉压和心率，并留取小鼠血清进行一氧化氮、生化指标测定；术后14天进行后肢缺血评分后处死动物，留取缺血后肢肌肉组织，置于-80℃冰箱保存进行后续Western Blot蛋白定量分析，4％多聚甲醛固定肌肉组织制备石蜡切片进行CD31免疫组织荧光染色，进一步评估TUS体内促进血管新生的有效性和安全性。 [0062] 小鼠后肢缺血评分参考文献[THEURL M,SCHGOER W,ALBRECHT K,et al.Circulation research,2010,107(11):1326-1335]，于手术后第14天进行后肢缺血评分； [0063] 红外热像仪成像评估双下肢血流情况参考文献[COWBURN A S,TAKEDA N,BOUTIN A T,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(43):17570-17575] [0064] 分别于术前、术后第0、14天，各组小鼠常规麻醉后，为避免超声波“热效应”导致的组织温度升高影响血流情况评估的准确性，于超声波干预缺血后肢2小时后，在相对恒定的26℃室温下进行红外热像仪测定双下肢皮肤温度，比较缺血侧(手术侧)与非缺血侧(非手术侧)肢体局部皮肤温度的比值，间接反应血流情况。 [0065] 结果： [0066] TUS能改善缺血后肢血供 [0067] 我们分别于术前1天和术后当天对小鼠后肢进行红外热像仪检测，无缺血侧与非缺血侧肢体局部皮肤温度的比值分别为：术前1天(Before operation)0.95±0.01，术后当日(Operation day 0)0.27±0.02(Before vs.Operation day 0，P＜0.05)，提示进行股动脉结扎术后缺血侧血流较非缺血侧明显减少，说明手术造模成功，为后续实验打下良好的动物模型基础。 [0068] 所有造模动物均存活，术后14天红外热像仪检测Ischemia、TUS 3min和6min组无缺血侧与非缺血侧肢体局部皮肤温度的比值分别为：0.37±0.02，0.42±0.02，0.45±0.03，而TUS 9min组为0.79±0.03(图5,Ischemia vs.TUS 9min，P＜0.01)。术后14天观察小鼠缺血后肢进行缺血评分，结果显示：Ischemia、TUS 3min和TUS 6min组的下肢缺血评分分别为：2.33±0.21，2.17±0.31，1.83±0.17；而TUS 9min组缺血评分为0.67±0.21(图 6Ischemia vs.TUS 9min，P＜0.01)。两种缺血评估方法均说明在后肢缺血动物模型中，TUS能改善缺血区域血液供应，以TUS 9min的效果最为显著，与缺血组相比有统计学差异(P＜ 0.01)。 [0069] TUS能增加缺血后肢肌肉毛细血管密度 [0070] 腓肠肌横截面CD31免疫组织荧光染色显示，Ischemia、TUS 3min和6min组毛细血管密度(capillaries/field)分别为：38.0±0.82，41.50±1.19，42.75±1.79，而TUS 9min 组达到了75.75±1.44(图7,Ischemia vs.TUS 9min，P＜0.01)。说明在小鼠后肢缺血模型中给予治疗性超声波能增加缺血下肢肌肉毛细血管密度，且以TUS 9min的效果最为显著，与缺血组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。 [0071] TUS能促进缺血后肢肌肉中相关促血管生成因子表达 [0072] 对不同剂量TUS干预的缺血后肢肌肉中相关促血管生成因子eNOS、VEGF、HIF-1α、p-Akt以及t-Akt蛋白表达水平进行Western blot分析显示：除t-Akt表达水平在各组间表达无明显差异外(图8C,P>0.05)；TUS 9min组eNOS、VEGF、p-Akt和HIF-1α蛋白表达水平与Ischemia组相比明显升高(图8A B C,P<0.01)。结果提示：在小鼠后肢缺血模型中给予治疗性超声波能增加缺血下肢肌肉组织中相关促血管生成因子eNOS、VEGF和HIF-1α蛋白表达，Akt酶的磷酸化水平升高，以TUS 9min的剂量效果最为显著，与缺血组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。 [0073] TUS能提高缺血后肢肌肉中一氧化氮(NO)含量 [0074] 对TUS干预的缺血后肢肌肉匀浆中一氧化氮(NO)含量进行Griess Reagent分析，Ischemia、TUS 3min和6min组NO含量分别为：0.59±0.17μM，0.63±0.11μM，0.70±0.38μM，而TUS 9min组达到了1.25±0.38μM(图9,Ischemia vs.TUS 9min，P＜0.01)。说明在小鼠后肢缺血模型中给予治疗性超声波能增加缺血后肢NO含量，且以TUS 9min的剂量效果最为显著，与缺血组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。 [0075] TUS对小鼠清醒状态下血压和心率的影响 [0076] 虽然有创血流动力学测定准确性较高，但由于本实验需对同一只小鼠进行多次血流动力学测定，需要尽量避免动脉插管等有创操作带来的影响，所以我们采用无创的鼠尾传感器测压法进行测定手术前及术后第14天测定了清醒状态下小鼠的SBP、DBP、MAP和HR。结果显示手术前及术后14天TUS干预组血压与Ischemia组比较没有统计学差异(表1，P＞ 0.05)，各组间心率差异无统计学意义(表1，P＞0.05)。说明TUS对小鼠血压及心率无明显影响。 [0077] 表1.不同剂量TUS对小鼠血压和心率的影响(mean±SEM,n＝6) [0078] [0079] SBP:systolic blood pressure；DBP:diastolic blood pressure；MAP:mean arterial pressure；HR:heart rate；Before:before operation；Day 14:day 14after ischemic operation. [0080] TUS对小鼠血生化指标的影响 [0081] TUS干预14天后，留取外周血标本进行血生化指标检测。结果显示各组间葡萄糖 (GLU)、肌酐(CREA)以及丙氨酸氨基转移酶(ALT)浓度均无显著性差异，表明TUS干预14天没有引起肝脏、肾脏损害等不良反应(表2)。 [0082] 表2不同剂量TUS对小鼠血生化指标的影响(mean±SEM,n＝6) [0083] [0084] GLU:glucose；CREA:creatinine；ALT:alanine aminotransferase.[0085] 本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

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