可用作抗病原剂的经修饰植物防卫素 |
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| 申请号 | CN201280008067.9 | 申请日 | 2012-02-07 | 公开(公告)号 | CN103392002B | 公开(公告)日 | 2017-07-18 |
| 申请人 | 赫希玛有限公司; | 发明人 | N·范德威尔登; M·A·安德森; | ||||
| 摘要 | 本公开内容总体上涉及抗病原剂，包括具有抗病原体活性的、在环IB区有修饰的被修饰防卫素分子的领域。还提供了表达或包含用于 园艺 和农业以及用作动物和人药剂的被修饰防卫素和抗病原体组合物的遗传修饰 植物 及其后代或部分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离的经人工修饰的NaD1防卫素多肽，其在N端末端部分具有位于第一β-链与α-螺旋之间的环区域环1B，并且具有抗真菌活性，其中所述环1B被外源性的环1B氨基酸序列所替换，所述外源性的环1B选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。 |
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| 说明书全文 | 可用作抗病原剂的经修饰植物防卫素[0001] 申请数据 [0003] 领域 [0005] 背景 [0008] 园艺和农业工业面临的主要困难之一是对病原体(例如真菌病原体)的感染和由其导致的损害的控制。植物病原体每年造成数百万吨的产量损失。虽然已成功应用杀真菌 剂和其它抗病原化学剂，但对持续使用化学剂控制植物害虫也存在许多环境和调控顾虑。 此外，日益增加的化学杀虫剂的使用不断为害虫群体中抗性的出现提供选择压。很明显需 要开发在植物中诱导对病原体例如真菌、昆虫、微生物、线虫、蜘蛛、原生动物和病毒的抗性 的替代机制。 [0009] 植物先天免疫系统包括组成型或预成型以及诱导型组分。预成型免疫力包括各种物理屏障例如叶片上的蜡质层和坚硬细胞壁以及各种抗微生物蛋白质的表达(Nurnberger 等人(2004)Immunol Rev198：249-266)。诱导型反应可包括响应各种生物和非生物刺激而 发生的细胞壁的强化(Showalter(1993)Plant Cell5(1)：9-23)以及次级代谢产物(Metlen 等人(2009)Plant Cell Environ32(6)：641-653)和抗微生物蛋白质(Berrocal-Lobo等人 (2002)Plant Physiol128(3)：951-961：Li and Asiegbu(2004)J Plant Res177(2)：155- 162)的上调。此类反应可在感染部位局部发生或在植物的远处未感染部分发生以产生系统 性反应。诱导型免疫还可通过基因对基因反应发生，借此病原体相关分子模式(PAMPS)被特 定模式识别受体(PRR)识别，从而导致阻止病原体进一步传播的超敏反应(参见Jones和 Dangl(2006)Nature444(7117)：323-329)。 [0010] 小的富含二硫键的蛋白质在植物免疫力的组成型和诱导型方面起着重大作用。它们可基于它们的半胱氨酸排列而归类至多个家族中，包括硫素、蜕皮素、索马甜样蛋白 (thaumatin-like protein)、橡胶蛋白型(havein-type)和knottin型蛋白、脂质转移蛋白 和环肽类以及防卫素。 [0011] 植物防卫素是具有4至5个二硫键的小的(45-54个氨基酸)碱性蛋白质(Janssen等人(2003)Biochemistry42(27)：8214-8222)。它们共有共同的二硫键键合模式和共同的结 构折叠，其中三链反向平行β-折叠片通过3个二硫键连系于α-螺旋，形成半胱氨酸稳定化的 αβ基元(CSαβ[参见图1])。第4个二硫键还连接N-和C-末端，从而导致极其稳定的结构。已将许多功能归功于防卫素，包括抗菌活性、蛋白质合成抑制以及α-淀粉酶和蛋白酶抑制 (Colilla等人(1990)FEBS Lett270(1-2)：191-194；Bloch和Richardson(1991)FEBS Lett279(1)：101-104)。已在转基因植物中表达了植物防卫素，这导致增强的对靶病原体的 抗性。例如，表达苜蓿防卫素(MsDef1，先前称为alfAFP)的马铃薯相较于非转化对照显示显 著的抗真菌病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抗性(Gao等人(2000)Nat Biotechnol18(12)：1307-1310)。大丽花属防卫素(DmAMPl)在稻中的表达足以提供抗两种 主要稻病原体稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的保护 作用(Jha等人(2009)Transgenic Res18(1)：59-69)。 [0012] 尽管它们存在保守结构，但植物防卫素的序列同一性非常低，仅有这8个半胱氨酸残基是完全保守的。这些半胱氨酸残基通常称为“不变的半胱氨酸残基”，因为它们的存在 和位置在防卫素间是保守的。基于序列相似性，植物防卫素可分类成不同的组(参见图2)。 在每一个组内，序列同源性相对较高，然而组间氨基酸相似性较低。来自不同组的抗真菌防 卫素似乎通过不同的机制起作用。 [0013] 植物防卫素可分成两大类。I类防卫素由内质网(ER)信号序列后跟成熟防卫素结构域组成。II类防卫素以更大的前体产生，具有约33个氨基酸的C末端前结构域(pro- domain)或前肽(pro-peptide)(CTPP)。迄今为止鉴定的大多数II类防卫素是在茄科植物种 类中发现的。II类茄科防卫素的比对提供于图3中。图3中提及的NsD1和NsD2代表了按照本 公开内容鉴定的新型防卫素。它们被包括在图3中并不意味着它们构成现有技术的一部分。 [0014] II类茄科防卫素展示抗真菌活性并且在花组织中表达。它们包括NaD1，其以高浓度在观赏性烟草花烟草(Nicotiana alata)的花中表达(Lay等人(2003)Plant Physiol131 (3)：1283-1293)。NaD1是对其抗真菌活性的机制已进行过研究的唯一II类茄科防卫素。该 肽的活性包括对细胞壁的结合、质膜的透化以及肽进入菌丝的细胞质(van der Weerden等 人(2008)J Bio1 Chem283(21)：14445-14452)。与许多其它防卫素不同，NaD1似乎特异于丝 状真菌，而对酵母、细菌或哺乳动物细胞的生长没有影响。 [0015] NaD1在棉花中的表达增强了对真菌病原体棉花枯萎病菌(Fusar ium oxysporum f.sp.vasinfectum)和大棉花丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抗性。在田间条件下，表 达NaD1的植物的存活可能性是未转化对照植物的2倍，并且每公倾棉绒产量加倍。尽管如 此，在表达NaD1的植物中仍然存在显著水平的疾病。 [0016] 防卫素的结构由7个定义为半胱氨酸残基之间的区域的′环′组成。环1包括第一个β-链(1A)以及将该β-链与位于前两个不变半胱氨酸残基之间的α-螺旋(1B)相连接的柔性 区域的大部分。图5显示包括这些保守半胱氨酸残基的NaD1的环结构。环2、3和4的开始部分 (4A)组成此α-螺旋，而剩下的环(4B-7)组成β-链2和3以及连接它们的柔性区域(β-发夹区 域)。植物防卫素的该发夹区域形成在不同种类的许多抗微生物肽中发现的γ-核心基元 (Yount and Yeaman(2005)Protein Pept Lett12(1)：49-67)。 [0017] 该β-发夹区域似乎是植物防卫素的生物活性所必需的。萝卜防卫素RsAFP2的该区域内的突变(参见图2)通常对其抗真菌活性具有负面影响。事实上，鉴定为抗真菌活性所必 需的12个残基中的8个位于该区域(De Samblanx等人(1997)J Biol Chem272(2)：1171- 1179)。此外，对应于此分子的该区域的化学合成肽本身也具有抗真菌活性(Schaaper等人 (2001)J.Pept.Res.57(5)：409-418)。在一项单独的研究中，已显示位于VrD2(来自绿豆的 防卫素)的环5内的6个残基是其α-淀粉酶抑制活性所必需的(Lin等人(2007)Proteins68 (2)：530-540)。另有一项研究调查了包含来自具有抗真菌活性的防卫素(MsDefl)和不具有 抗真菌活性的防卫素(MtDef2)的区域的嵌合蛋白质的活性。包含MsDefl的β2-β3发夹区域 的嵌合防卫素具有与完全MsDefl蛋白几乎相同的活性，而包含来自MtDef2的该区域的嵌合 防卫素不具有活性(Spelbrink等人(2004)Plant Physiol135(4)：2055-2067)。 [0018] 已报导，连接第一β-链与邻近的、位于第二不变半胱氨酸残基N末端的α-螺旋的柔性环(环1B)当与来自环5的残基结合为斑块(patch)时，在一些防卫素的抗真菌活性中起着 很小的作用。RsAFP2的诱变研究鉴定了位于该区域内的对于活性非常重要的两个氨基酸 (De Samblanx等人，1997，同上)。然而，当用来自非抗真菌防卫素的对应区域替换抗真菌防 卫素MsDef1的该区域时，抗真菌活性仅存在适度的改变(Spelbrink等人，2004，同上)。 [0019] II类茄科防卫素具有可变程度的抗真菌活性。一些I类防卫素显示极低的抗真菌活性。修饰防卫素以提高和拓宽其抗病原体活性的努力迄今在很大程度上是不成功的。对 一些防卫素的抗性的发生也是潜在的问题。需要对开发能够操控防卫素的抗病原体活性的 水平和抗性谱的方案。一系列具有抗病原体活性的新型防卫素的产生也有利于抗击抗性的 发生。 [0020] 概述 [0021] 除非上下文另外要求，否则在整个本说明书中，单词“包含”或其变化形式例如“包括”或“含有”将被理解为意指包括所述组件或整体或方法步骤，或者组件或整体或方法步 骤的组，但不排除任何其它组件或整体或方法步骤，或者组件或整体或方法步骤的组。 [0022] 如本说明书中所用，除非上下文中明确地另有所指，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。因此，例如，提及″一种(a)防卫素″包括单种防卫素以及两种或更多种防卫素；提及″一个(an)氨基酸的置换、添加和/或缺 失″包括单个氨基酸的置换、添加和/或缺失，以及两个或更多个氨基酸的置换、添加和/或 缺失；提及″所指方面(the aspect)″包括单个方面以及两个或更多个方面，如本说明书中 教导的；等等。 [0023] 核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO)来表示。SEQ ID NO在数字上对应于序列标识符〈400〉1(SEQ ID NO：1)、〈400〉2(SEQ ID NO：2)等。序列标识符的概述提供于表1中。在权利要求书后提供了序列表。 [0024] 本公开内容教导了构成具有抗病原体活性的防卫素新家族的人工修饰II类茄科防卫素。在一个实施方案中，所述被修饰的II类茄科防卫素的抗病原体活性在活性的水平 和/或范围、稳定性和/或膜透化能力的一个或多个方面相较于修饰前的II类茄科防卫素得 到增强。修饰的防卫素在本文中被教导在园艺和农业中用于控制病原体感染和生长以及在 用于动物和人药剂的制造。它们可单独使用或与化学杀病原体剂、抗病原体蛋白和/或蛋白 酶抑制剂或其前体形式组合使用。有新的防卫素家族可供利用还帮助抗击病原体对特定防 卫素的抗性。 [0025] II类茄科防卫素用作主链，在所述主链中位于防卫素N末端部分上的第一β-链(β-链1)与α-螺旋之间的环区域(也描述为第一柔性环)被氨基酸置换、添加和/或缺失和/或来 自另一种防卫素的环区域修饰，或将其修饰形式移植至II类茄科防卫素上以取代该环区域 的全部或部分。主链防卫素还可任选地在该环区域的外面包含另外的突变。当存在时，可对 环1B区域外的一个或多个区域产生1至约50个氨基酸置换、添加和/或缺失形式的另外的突 变。 [0026] 提供了人工产生的防卫素，其包含： [0027] (i)来源于或对应于II类茄科防卫素、在其N末端区域内具有环结构域的氨基酸主链； [0028] (ii)主链上的环结构域，其经历如下一项或多项：(a)氨基酸置换、添加和/或缺失；和/或(b)被来自另一种防卫素的环或其修饰形式置换第一环结构域的全部或部分； [0029] 其中所述人工产生的防卫素显示抗病原体活性。本公开内容教导单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失，包括将II类茄科防卫素的第一环结构域、特别地环1B转换成对应 于I类防卫素的环结构域的氨基酸序列。或者，将另一种II类防卫素环1B区域用于替换II类 防卫素上的环1B。被修饰的II类茄科防卫素还可在该区域外面包含一个或多个另外的氨基 酸置换、添加和/或缺失。如果存在，1至约50个额外的突变可位于环区域的外面。 [0030] 在一个实施方案中，相较于修饰前的II类防卫素，其抗病原体活性得以增强。″增强的″意指相较于非修饰的II类防卫素而言活性的水平和/或谱、稳定性和/或膜透化能力 中的一项或多项的改善。 [0031] 用作主链的II类茄科防卫素包括在NaD1成熟结构域的C末端处约20个连续氨基酸残基(包括C端最末端的不变半胱氨酸(C)残基)的序列(SEQ I D NO：52)上具有至少70％的 氨基酸序列相似性的防卫素。II类茄科防卫素的实例包括NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、 TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth和Cc-gth。其它主链防卫素包括来自辣椒属 的C20和来自烟草属的SL549。NsD1和NsD2来自香甜烟草(Nicotiana suaveolens)，其氨基 酸序列分别示于SEQ ID NO：49和51。 [0032] 提及II类茄科防卫素的N末端区域处的″环结构域″时，其包括由前两个(不变)半胱氨酸(C)残基侧翼连接所界定的整个环区域。这是防卫素在其N末端区域的第一个柔性 环。然而，在一个实施方案中，″环结构域″可以是指于第一β-链的末端开始、于第二个不变半胱基酸残基的N末端侧结束的环区域。该区域在图5中称为″L1B″[环1B]。在NaD1(II类茄 科防卫素的一个实例)中，该区域或结构域包含以单字母代码表示的氨基酸序列NTFPGI(参 见图5)。其它II类茄科防卫素的第一环区域示于图3。图4代表不同种类的防卫素的氨基酸 序列比对，显示了8个保守半胱氨酸残基。 [0033] 因此，II类茄科防卫素主链的环1B区域可被突变或可以将来自另一种防卫素(例如来自I类防卫素或另一种II类防卫素)的环1B区域原位移植以产生具有X1X2X3X4X5X6的环 1B氨基酸序列，其中： [0034] X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0035] X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0036] X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0037] X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0038] X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或 [0039] X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0040] 使用单字母氨基酸命名法，其中突变的II类茄科防卫素中的氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于在修饰之前形成主链的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0041] 在一个实施方案中，突变II类茄科防卫素主链的环1B区域，或将来自另一种防卫素(例如来自I类防卫素)的环1B区域在其原位移植以产生X1 X2 X3 X4 X5 X6的氨基酸序 列，其中： [0042] X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R； [0043] X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y； [0044] X3是W、Y、H、L、G、F或P； [0045] X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G； [0046] X5是S、K、Y、F、G或H；和/或 [0047] X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y； [0048] 使用单字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1 X2 X3 X4 X5 X6不对应于在修饰之前形成主链的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0049] 在另一个实施方案中，突变II类茄科防卫素主链的环1B区域，或将来自另一种防卫素(例如来自I类防卫素)的环1B区域在其原位移植以产生X1 X2 X3 X4 X5 X6的氨基酸 序列，其中： [0050] X1是N、H、Q、D、K或E； [0051] X2是R、H、T、K或G； [0052] X3是F、H、Y或W； [0053] X4是P、K、S或R； [0054] X5是G或F；和/或 [0055] X6是P、V、I、N； [0056] 使用单字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1 X2 X3 X4 X5 X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0057] 在一个实施方案中，人工产生的或经修饰的防卫素包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列。在该序列中，环1B区域被定义为X1X2X3X4X5X6，其中： [0058] X1是选自下述的氨基酸：L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G； [0059] X2是选自下述的氨基酸：S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G； [0060] X3是选自下述的氨基酸：A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H； [0061] X4是选自下述的氨基酸：K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S； [0062] X5是选自下述的氨基酸：M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F；和 [0063] X6是选自下述的氨基酸：V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N。 [0064] 在一个实施方案中，人工产生的或经修饰的防卫素包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列。在该序列中，环1B区域被定义为X1X2X3X4X5X6，其中： [0065] X1是选自下述的氨基酸：N、H、Q、D、K、E； [0066] X2是选自下述的氨基酸：R、H、T、K、G； [0067] X3是选自下述的氨基酸：F、H、Y W； [0068] X4是选自下述的氨基酸：P、K、S、R； [0069] X5是选自下述的氨基酸：G、F；和 [0070] X6是选自下述的氨基酸：P、V、I、N。 [0071] 在一个实施方案中，本文中教导的是具有抗病原体活性的II类茄科防卫素，所述防卫素包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39具有至少70％的相似性 的氨基酸序列，其修饰是对II类茄科防卫素的环1B氨基酸序列的氨基酸置换、添加或缺失。 SEQ ID NO：39是NaD1主链中的NaD2环1B序列(HRFKGP)的氨基酸序列，产生HXP4。本公开内 容不扩展至NaD1，但扩展至其中其环1B序列已被改变的经修饰NaD1。本公开内容也不扩展 至FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth或Cc-gth，但扩展至其中其环1B序列已被改变的FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth或Cc-gth的修饰形式。 [0072] 如上文中所指出的，这些方面适用于任何II类茄科防卫素，包括具有与NaD1成熟结构域的C末端区域的约20个连续氨基酸残基序列具有70％或更高的氨基酸序列相似性的 防卫素。该20个连续氨基酸的序列定义为SEQ ID NO：52。 [0073] 在一个实施方案中，将主链氨基酸序列上的环1B区域修饰成HRFKGP(SEQ ID NO：29)、QHHSFP(SEQ ID NO：30)、DTYRGV(SEQ ID NO：31)，或修饰成SEQ ID NO：67至79之任一、PTWEGI(SEQ ID NO：32)、DKYRGP(SEQ ID NO：33)、KTFKGI(SEQ ID NO：34)、KTWSGN(SEQ ID NO：35)、EGWGK(SEQ ID NO：36)、GTWSGV(SEQ ID NO：37)或AGFKGP(SEQ ID NO：38)[使用单 字母氨基酸命名法]。方便地，这可通过将来自NaD2(HRFKGP)、γ-zeathionin2(QHHSFP)、 PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)或DmAMP1(KTWSGN)的环1B区域或由SEQ ID NO：67至79定义的环1B移植至II类茄科防卫素主链上其环1B氨基酸序列的位置处，或修饰 现有的环1B区域以产生选自HRFKGP、QHHSFP、DTYRGV、DKYRGP、KTFKGI和KTWSGN的环1B氨基 酸序列来实现。II类茄科防卫素可仅包含该经修饰的环区域，或者还组合包含对该环区域 外面的防卫素主链的氨基酸置换、添加和/或缺失。如上文中所指出的，还可使用SEQ ID NO：67至79中定义的环1B，或可将一种II类茄科环1B置换至另一种II类茄科防卫素主链上。 [0074] 因此提供了人工产生的防卫素，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的、具有位于所述防卫素N末端部分上具有第一β-链与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序列，其中 所述环区域通过氨基酸置换、缺失和/或添加而被修饰，以产生具有抗病原体活性的防卫 素。 [0075] 在一个实施方案中，提供了人工产生的防卫素，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的在第二不变半胱氨酸残基的N末端具有环1B区域的主链氨基酸序列，其中1B区域已 被氨基酸的置换、添加和/或缺失修饰，从而产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0076] 另一个实施方案提供了人工产生的防卫素，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的、在第二个不变半胱氨酸残基的N末端具有环1B区域的主链氨基酸序列，其中所述环1B区 域已被氨基酸置换、添加和/或缺失所修饰，从而产生相较于修饰前的II类茄科防卫素而言 具有增强的抗病原体活性的防卫素，其中所述II类茄科防卫素包含在最佳比对后与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少约70％相似性的成熟结构域的C末端部分。″氨基酸置换、 添加和/或缺失″意指一个或多个置换、添加和/或缺失。 [0077] 在一个实施方案中，人工修饰的II类茄科防卫素具有抗病原体活性，其包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列或在最佳比对后与SEQ ID NO：57具有至少70％相似性的氨 基酸序列，所述修饰是针对II类茄科防卫素环1B区域的修饰。 [0078] 在一个实施方案中，人工修饰的II类茄科防卫素具有抗病原体活性，其包含SRQ ID NO：84所示的氨基酸序列或在最佳比对后与SEQ ID NO：84具有至少70％相似性的氨基 酸序列，所述修饰是针对II类茄科防卫素环1B区域的修饰。 [0079] 在一个实施方案中，相较于修饰前的II类茄科防卫素，抗病原体活性在活性的水平和/或范围、稳定性和/或膜透化中的一个或多个方面得到增强。在一个实施方案中，抗病 原体活性是抗真菌活性。在一个实施方案中，抗病原体活性是抗-杀昆虫活性。 [0080] 在一个其它实施方案中，提供了人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、位于该II类茄科防卫素N末端部分的第一β-链与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序 列，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，并且其中通过氨基酸置换、添加和/或缺失对所述环区域进行 了修饰产生包含氨基酸序列X1 X2 X3 X4 X5 X6的环区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残 基，并且其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于来自II类茄科防卫素的环1B区域的氨基酸序列；从而产生具有抗病原体活性的防卫素。在一个实施方 案中，所述环区域是位于第二个不变半胱氨酸残基的N末端侧的环1B。 [0081] 在一个实施方案中，提供了人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、具有位于该II类茄科防卫素N末端部分处的第一β-链与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序 列，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，并且其中通过氨基酸置换、添加和/或缺失而修饰所述环区 域，以产生包含氨基酸序列X1 X2 X3 X4 X5 X6的环区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，其中X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；以及X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、T或Y，其中氨基酸序列X1 X2 X3 X4 X5 X6不对应于来自II类茄科防卫素的环1B区域的氨基酸序列；从而产生抗病原体活性的防卫素。在一个实施方案中，所述环区域是位于 第二个不变半胱氨酸残基N末端的环1B。 [0082] 在一个实施方案中，提供了人工产生的防卫素，其含来自II类茄科防卫素的、具有位于该II类茄科防卫素N末端部分处的第一β-链与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序 列，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述防卫素主链上的环区域被来自选自NaD2(HRFKGP)、 Zea2(QHHSFP)、PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1(KTWSGN)的防卫素 的环区域或其修饰形式或选自SEQ ID NO：67至79的环1B序列所替换，以产生具有抗病原体 活性的防卫素。 [0083] 在一个实施方案中，所述环区域被1或2或3或4或5或6个氨基酸置换、添加和/或缺失所修饰。在一个实施方案中，所述II类茄科防卫素包含经修饰的环区域和位于环区域外 面的主链区域中的氨基酸置换、添加和/或缺失。当存在时，可在环区域外面产生1至约50个 氨基酸置换、添加和/或缺失。 [0084] 病原体可以是真菌(丝状或非丝状的)、微生物、昆虫、蜘蛛、线虫、原生动物或病毒。在一个实施方案中，病原体是真菌。在另一个实施方案中，病原体是昆虫。术语″增强的 抗病原体活性″包括更广谱的作用、更高水平的活性、更大的稳定性和/或增强的膜透化活 性。 [0085] 在一个实施方案中，病原体是真菌，包括植物真菌和动物真菌。″动物真菌″包括感染哺乳动物(包括人)的真菌，例如担子菌类和子囊菌。 [0086] 本文中还提供了包含人工产生的防卫素分子以及编码所述防卫素分子的核酸分子的组合物。所述组合物可用于植物中或植物上或者动物中或动物上，例如哺乳动物，包括 人。所述组合物可包含另外的试剂例如化学杀病原体剂、蛋白质性质的杀病原体剂和/或丝 氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其前体。 [0087] 还提供了用于产生具有病原体抗性的植物以及处理植物和动物(包括哺乳动物，例如人)以治疗或预防病原体感染、生长和/或维持的方案。本公开内容还教导了人工产生 的防卫素用于制造抗病原体药剂的用途，所述人工产生的防卫素包含来自II类茄科防卫素 的、具有位于II类茄科防卫素的N末端部分处的第一β-链与α-螺旋之间的环区域的主链氨 基酸序列，其中所述环区域已通过氨基酸置换、添加和/或缺失而被修饰。在一个方面，将化 学或蛋白质性质的杀病原体剂和/或蛋白酶抑制剂或其前体与该经修饰的防卫素组合使 用。在一个方面，单个基因构建体编码包含改变的环1B区域的被修饰防卫素和蛋白酶抑制 剂或其前体形式例如NaPinlA(来自花烟草)、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、番茄半胱氨酸蛋白 酶抑制剂、S1Cys9或大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂、HvCPI6。在另一个实施方案中，使用多个 构建体，每一个构建体单独地编码被修饰防卫素和蛋白酶抑制剂或其前体形式中的一个或 多个。 [0088] 在一个实施方案中，所述环区域是环1B。 [0089] 在一个实施方案中，提供了来自澳大利亚本地香甜烟草的分离的防卫素以及其作为主链防卫素分子的用途。香甜烟草防卫素包括NsD1和NsD2。NsD1的核苷酸序列和对应的 氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：48和49。NsD2的核苷酸序列和对应的氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO：49和51。本文中还涉及单独具有经修饰的环1B或者还组合有对主链的1至约50 个氨基酸置换、添加和/或缺失的香甜烟草防卫素。还提供了例如有效地连接了异源启动子 和/或载体核酸分子的编码香甜烟草防卫素的分离的核酸分子。 [0090] 因此，本文中教导的另一个方面是来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。 本文中教导的另一个方面涉及来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：51[NsD2] 所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。 [0091] 根据这些方面，香甜烟草防卫素可以是分离的纯化形式，或作为包含防卫素和稀释剂、载体、赋形剂、防腐剂、稳定剂和/或固体或液体添加剂的制剂或组合物的部分存在。 [0092] 在本文中提供了编码NsD1(SEQ ID NO：48)和NsD2(SEQ ID NO：50)的分离的核酸分子，以及具有在最佳比对后与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50具有至少70％同一性或的核 苷酸序列的核酸分子，或在中等严格条件下与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50或其互补形式 杂交的核酸分子，其例如同操作地连接至异源启动子和/或载体核酸分子。 [0093] 当将经修饰的防卫素与另一种试剂例如蛋白酶抑制剂或半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合使用时，可将编码所有蛋白质的单个基因构建体或各自编码蛋白质的多个构建体用于 转化植物细胞。或者，可将经修饰而表达防卫素的植物经历蛋白酶抑制剂或化学杀病原体 剂的局部施用。 [0094] 在本说明书中通篇使用的序列标识符概述于表1中。 [0095] 表1 [0096] 序列标识符的概述 [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] 表2提供了用于说明举例说明的被修饰防卫素的命名概述。 [0102] 表2 [0103] 磁修饰防卫素的命名所概述 [0104]命名 说明 HXP4 NaD1主链中的NaD2环1B HXP34 NaD1主链中的Zea2环1B HXP35 NaD1主链中的PSD1环1B [0105]命名 说明 HXP37 NaD1主链中的VrD1环1B HXP91 NaD1主链中的MsDeF1环1B HXP92 NaD1主链中的SoD2环1B HXP58 NaD1主链中的DmAMP1环1B HXP72 PhD2主链中的NaD2环1B HXP95 NsD1主链中的NaD2环1B HXP107 TPP3主链中的NaD2环1B [0106] 表3是本文中使用的氨基酸残基的单字母和三字母代码表。 [0107] 表3 [0108] 氨基酸残基的单字母和三字母缩写列表 [0109] [0110] [0112] 图1是显示共同的二硫键合模式和共同的结构折叠的防卫素NaD1、RsAFP1、VrD2和甜味蛋白(Brazzein)的图示，其中三链的反向平行β-折叠片通过3个二硫键系连至α-螺旋， 从而形成半胱氨酸稳定的αβ基元(CSαβ)。第四个二硫键还连接N与C末端，从而导致稳定的 结构。 [0113] 图2是显示基于序列相似性而将防卫素分入16个组的图示。 [0114] [0115] 图3A和B表示II类茄科防卫素NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、Na-gth、NpThiol和Cc-gth的序列比对。图3A中的阴影描述了序列之间的高水平保 守。 [0116] 图4表示不同种类的防卫素的序列比对，所述比对显示，除保守的8个半胱氨酸残基外，只有位置7和10上的氨基酸是高度保守的。编号基于NaD1。 [0117] 图5是显示连接β-链1与α-螺旋的环1B位置的NaD1环结构的图示。 [0118] 图6A表示描述重组NaD1(rNaD1)的表达和纯化的免疫印迹。在48小时收集的巴斯德毕赤酵母表达培养基(30μL)，以及来自SP琼脂糖纯化的不同阶段的样品，包括未结合级 分(30μL)、洗涤级分(30μL)和前5个1.5mL洗脱级分(每份30μL)均通过SDS-PAGE分离，并利 用α-NaD1抗体通过免疫印迹检查。将来自花的NaD1(200ng)用作阳性对照。可在48小时的表 达培养基以及SP琼脂糖洗脱级分中检测到rNaD1。 [0119] 图6B表示举例说明使用SP琼脂糖从巴斯德毕赤酵母纯化的rNaD1的纯度的反相HPLC描迹。将包含rNaD1的SP琼脂糖洗脱级分加载至分析C8RP-HPLC柱上，使用40分钟的线 性梯度(0-100％缓冲液B)进行洗脱。通过在215nm的吸光度来检测蛋白质。检测到单个主要 蛋白质，表明该蛋白质纯度很高。 [0120] 图6C表示rNaD1与从花纯化的天然NaD1的结构。比较rNaD1(空心方块)与天然NaD1(闭合菱形)的远紫外圆二色光谱，显示没有显著差异，表明rNaD1是正确折叠的。 [0121] 图6D表示rNaD1相对于从花纯化的天然NaD1的抗真菌活性。将在rNaD1(空心方块)或天然NaD1(闭合菱形)存在的情况下棉花枯萎病菌的菌丝生长相对于进行相同时期的无 蛋白质对照的生长作图。曲线图代表来自以一式四份进行的3个单独实验的数据。误差棒代 表平均值的标准误差。 [0122] 图7是用于环交换的I类防卫素相较于NaD1和NsD1的抗禾谷镰孢的抗真菌活性的图示。 [0123] 图8是环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗禾谷镰孢(Fgr)的相对抗真菌活性的图示。 [0124] 图9是环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗环珠镰孢(F.verticilloides)(Fve)的相对抗真菌活性的图示。 [0125] 图10是环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗禾生刺盘孢(C.graminicola)(Cgr)的相对抗真菌活性的图示。 [0126] 图11是pHEX138构建体的图示。DNA被插入在二元载体pBIN19的左右边界之间(Bevan(1984)Nucleic Acids Research12：8711-8721)。通过修饰NaD1基因产生所述DNA。 缩写按顺时针顺序排列为： [0127] oriV：无性复制起始点 [0128] ColE1 orl：来源于大肠杆菌素E1的复制起始点； [0129] TDNA RB：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)TDNA的右边界； [0130] Nos启动子：胭脂碱合酶Nos基因的启动子； [0131] NPTII：编码新霉素磷酸转移酶II的基因序列； [0132] Nos终止子：Nos基因的终止子序列； [0133] 被破坏的lacZ：编码B-半乳糖苷酶的部分序列的DNA区段； [0134] CaMV35S启动子：花椰菜花叶病毒(CaMY)35S蛋白的启动子； [0135] HXP4：编码NaD1中的NaD2环1B[NaD2L1B]+CTPP的DNA； [0136] CaMV35S终止子：编码CaMV35S蛋白的基因的终止子序列； [0137] M13ori：M13病毒复制起点； [0138] TDNA LB：TDNA左边界； [0139] 所有箭头表示转录方向。 [0140] 图12是环变体HXP4相较于NaD1的抗黑曲霉的相对抗真菌活性的图示。 [0141] 图13A至C是HXP4相较于NaD1的抗隐球酵母属的种的相对抗真菌活性的图示。 [0142] 图14A至C是相较于NaD1，HXP4对亚洲大豆锈菌(大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi))的萌发(24小时，A)、附着胞(24小时，B)和附着胞后结构(48小时，C)的作用的 图示。 [0143] 图15是用于玉米的包含编码HvCPI6(大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂)的核苷酸序列的构建体的核苷酸序列图示。还提供了HvCPI6的氨基酸序列。 [0144] 图16是用于玉米的包含编码HvCPI6(大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和被修饰的防卫素HXP4的核苷酸序列的构建体的核苷酸序列图示。还提供了HvCPI6和HXP4的氨基酸序 列。 [0145] 发明详述 [0146] 提供具有抗病原体活性的被修饰防卫素分子。术语″被修饰防卫素″、″变体防卫素″、″突变的防卫素″和″嵌合防卫素″全部可用于描述本文中描述的被修饰II类茄科防卫 素。在一个实施方案中，在防卫素的N末端部分的第一β-链(β-链1)与α-螺旋之间的环区域 处修饰II类茄科防卫素。在一个实施方案中，该环区域包括第二个不变半胱氨酸残基或其 等同物的N末端的6个氨基酸。该区域定义为″环1B″(参见图5)。II类茄科防卫素与其它防卫 素的区别在于成熟结构域的相对保守的C末端部分。″II类茄科防卫素″包括与NaD1成熟结 构域的C末端部分具有至少70％氨基酸序列相似性的任何防卫素，其中NaD1的C末端部分包 含包括NaD1成熟结构域的C端最末端的不变半胱氨酸并在此终止的约20个连续氨基酸残基 (例如，SEQ ID NO：52)。″至少70％″意指至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。表4提供了NaD1的C末端氨基酸序列与一些II类茄科防卫素成熟结构域之间的百分比同一性。 [0147] II类茄科防卫素中的环1B氨基酸序列被修饰成序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0148] X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0149] X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0150] X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0151] X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0152] X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或 [0153] X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V； [0154] 使用单字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0155] 在一个实施方案中，II类茄科防卫素中的环1B序列被修饰成序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0156] X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、或R； [0157] X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y； [0158] X3是W、Y、H、L、G、F或P； [0159] X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G； [0160] X5是S、K、Y、F、G或H；和/或 [0161] X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y； [0162] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0163] 在一个实施方案中，将II类茄科防卫素中的环1B序列修饰成序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0164] X1是N、H、Q、D、K或E； [0165] X2是R、H、T、K或G； [0166] X3是F、H、Y或W； [0167] X4是P、K、S或R； [0168] X5是G或F；和 [0169] X6是P、V、I或N； [0170] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0171] ″X1X2X3X4X5X6″意指对应于环1B区域的6个连续氨基酸残基。 [0172] 在一个实施方案中，所述人工产生的或被修饰的防卫素包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。在该序列中，环1B区域被定义为X1X2X3X4X5X6，其中： [0173] X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸； [0174] X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸； [0175] X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸； [0176] X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸； [0177] X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和 [0178] X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。 [0179] 在一个实施方案中，所述人工产生的或经修饰的防卫素包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列。在该序列中，环1B区域被定义为X1X2X3X4X5X6，其中： [0180] X1是选自N、H、Q、d、K、E的氨基酸； [0181] X2是选自R、H、T、K、G的氨基酸； [0182] X3是选自F、H、Y W的氨基酸； [0183] X4是选自P、K、S、R的氨基酸； [0184] X5是选自G、F的氨基酸；和 [0185] X6是选自P、V、I、N的氨基酸。 [0186] 在NaD1(II类茄科防卫素)的情况下，环1B氨基酸序列是NTFPGI(SEQ ID NO：12)。因此，修饰NTFPGI以便N被选自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式之一的X1替代；T被选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y或V或其天然存在的修饰形式之一的X2替代；F被选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式之一的X3替代；P被选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式之一的X4替代：G被选自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式之一的X5替代；和/或I被选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V之一的X6替代；前提是所述环1B氨基酸序列不对应于来自NaD1的环1B。在一 个实施方案中，环1B区域被定义为X1X2X3X4X5X6，其中X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸； 以及X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。所述环1B序列可具有单个氨基酸改变或者可改变2或3或4或5或全部6个氨基酸。这均包括在表述″单个或多个氨基酸置换、 添加和/或缺失″。 [0187] 可单独改变环1B区域的任何数目氨基酸或结合其它突变来修饰II类茄科防卫素。其它修饰包括氨基酸置换、添加和/或缺失。环1B区域外的突变可以为1至约50个氨基酸。″ 改变″包括将一种防卫素的环1B区域移植至II类茄科防卫素环1B区域。其来源可以是I类防 卫素环1B或来自另一种II类防卫素的环1B。这些方面基于这样的前提，即被修饰防卫素抗 至少一种植物或动物病原体的抗病原体活性得到维持。在一个实施方案中，相对于修饰前 的II类防卫素而言，抗病原体活性在活性的水平或范围、稳定性和/或透化作用方面得到增 强。 [0188] 本文中提供了人工产生的防卫素，其中包含经修饰的II类茄科防卫素主链，其中N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间的环区域通过单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失进 行修饰，从而产生了具有抗病原体活性的变体防卫素。在一个实施方案中，所述环区域是由 第二个不变半胱氨酸残基的N末端的6个氨基酸残基界定的环1B。参考图3至5。本文中涉及 其在任何防卫素中的等同区域。可对环1B区域进行1至约6个氨基酸的改变。在一个实施方 案中，抗病原体活性是抗真菌或抗昆虫活性。在一个实施方案中，相较于修饰前的II类茄科 防卫素，被修饰的II类茄科防卫素的抗病原体活性在活性的水平和/或范围、稳定性和/或 膜透化能力等的一个或多个方面得到增强。 [0189] 本文中教导的另一个方面提供了人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、具有在第二个不变半胱氨酸残基的N末端的环1B区域的主链氨基酸序列，其中通过氨基 酸置换、添加和/或缺失而修饰了所述环1B区域，产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0190] ″单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失″包括在表述″氨基酸置换、添加和/或缺失″中。所述人工产生的防卫素代表了防卫素的新家族。本文中教导所述被修饰的防卫素可 以在园艺学和/或农业中用于控制病原体感染和生长以及用作用于动物或人的药剂。所述 被修饰防卫素可单独使用，或与化学杀病原体剂、蛋白质性质的抗病原体剂和/或丝氨酸或 半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其前体形式组合地使用。有一小组防卫素可供选用能够有助于对 抗针对防卫素的病原体抗性发展。 [0191] 当与蛋白酶抑制剂或抗病原体剂组合使用时，它们可以分开地局部施用，或将一种在遗传修饰的植物中表达并且另一种进行局部施用，或将经修饰的防卫素和蛋白酶抑制 剂和/或抗病原体剂全部在单个或多个基因构建体上表达。 [0192] ″环1B″是指第二个不变半胱氨酸残基的N末端的6个氨基酸残基或其等同物，如图5中描述的。一些防卫素例如VrD1和NeThio1仅具有5个氨基酸残基。然而，在该情况下，环1B 区域包含5个残基。其还被描述为β-链1与α-螺旋之间的第一个环区域。环1A(参见图5)是β- 链。 [0193] 如上文中所指出的，″氨基酸置换、添加和/或缺失″包括单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失，其包括用来自另一种防卫素的环1B替换环1B。这样的替换在本文中称为结 构域交换、环交换、移植或其它类似的表达。″另一种防卫素″包括任何防卫素，无论I类还是II类防卫素(也参见图2)。II类防卫素主链任选地还通过除去C末端尾(即CTPP)或通过用另 一种尾交换现有CTPP来进行修饰，和/或主链可在上文中提及的环区域外面的主链上位置 处具有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。″II类茄科防卫素″包括在最佳比对后与 SEQ ID NO：52具有至少70％相似性的任何防卫素。SEQ ID NO：52代表包括NaD1成熟结构域 中的C端最末端半胱氨酸残基并且终止于此的20个连续氨基酸残基。与SEQ ID NO：52具有 至少70％相似性的此类II类茄科防卫素的实例列于表4中。 [0194] 因此，本文中教导了被修饰防卫素，其包含已对其环1B区域进行了氨基酸置换、添加和/或缺失(以产生具有抗病原体活性的被修饰防卫素)的II类茄科防卫素主链。在一个 实施方案中，相对于修饰前的II类防卫素，抗病原体活性得到增强。 [0195] 在一个实施方案中，提供了被修饰的防卫素，其包含已对其环1B区域进行了氨基酸置换、添加和/或缺失(以产生具有抗病原体活性的被修饰防卫素)的II类茄科防卫素主 链，所述II类茄科防卫素包含在最佳比对后与SEQ ID NO：52具有至少70％相似性的其成熟 结构域的C末端区域上的氨基酸序列。 [0196] 在一个实施方案中，本文中教导了具有抗病原体活性的分离的II类茄科防卫素，其包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39具有至少70％相似性的氨基酸 序列，所述修饰是对II类茄科防卫素的环1B氨基酸序列的氨基酸置换、添加或缺失。在一个 实施方案中，所述抗病原体活性是抗真菌活性。 [0197] 本文中还教导了具有抗病原体活性的人工修饰的II类茄科防卫素，其包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或在在最佳比对后与SEQID NO：57具有至少70％相似性的氨基酸 序列，其中所述修饰是针对II类茄科防卫素环1B区域。 [0198] 在一个实施方案中，本文中教导了具有抗病原体活性的人工修饰的II类茄科防卫素，其包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列或在最佳比对后与SEQ ID NO：84具有至少70％ 相似性的氨基酸序列，其中所述修饰是针对II类茄科防卫素环1B区域。 [0199] ″至少70％相似性″包括70、71、72、73、74，75，76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的相似性。在一个实施方案中，这可称为同一性。 [0200] 本公开内容还提供了人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、在该II类茄科防卫素的N末端部分上的第一β-链(β-链1)与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序 列，所述防卫素选自NaD1，NsD1，NsD2，PhD1，PhD2，TPP3，FST，NeThio1，NeThio2，NpThio1，Na-gth，Cc-gth，C20和SL549，其中通过氨基酸置换、添加和/或缺失对所述环1B区域已进行 修饰，产生了包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且 其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防 卫素环1B区域的氨基酸序列，从而产生具有抗病原体活性的防卫素。在一个实施方案中，通 过氨基酸置换、添加和/或缺失而修饰所述环1B区域，以产生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的 区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且其中X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸； 以及X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N或其天然存在的修饰形式的氨基酸；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0201] 本公开内容还提供了人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、在所述II类茄科防卫素的N末端部分上的第一β-链(β-链1)与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸 序列，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述环1B区域已被氨基酸置换、添加和/或缺失进行修 饰，从而产生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且 X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G：X5是S、K、Y、F、G或H；以及X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸 序列，从而产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0202] 在一个实施方案中，X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和/或X6是P、V、I或N，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于来自II类茄科防卫素的环1B区域的氨基酸序列。来自II类茄科防卫素的环1B序列的实例包括来自NaD1(翼状猪笼草)、NsD1(香花烟草)、NsD2(香花烟草)、NeThio2(高烟草)和FST(普通烟草)的 NTFPGI；来自PhD1(矮牵牛)的PTWDSV；来自PhD2(矮牵牛)的PTWEGI；来自TPP3(番茄)的 QTFPGL；来自Na-gth(N.attenuata)的NTFEGF；来自Np-Thio1(圆锥烟草)的NTFPGL；来自 NeThio1(高烟草)的IFTGL和来自Cc-gth(黄灯笼辣椒)的KHFKGL。另一种环1B序列是KYFKGL (SEQ ID NO：60)。 [0203] 本文中教导的另一个方面还涉及人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、在II类茄科防卫素的N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间的环区域的主链氨基酸序列， 所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth和Cc-gth，其中防卫素主链上的环区域被来自选自NaD2(HRFKGP)、Zea2(QHHSFP)、PSD1 (DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1(KTWSGN)的防卫素的环区域或其修饰 形式，或选自SEQ ID NO：67至79的环1B序列替换，以产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0204] 在一个实施方案中，相较于修饰前的II类茄科防卫素，抗病原体活性得到增强。测定增强的活性的参数包括活性的水平和/或范围、稳定性的程度和/或透化活性的水平。在 一个实施方案中，所述环区域是如本文中定义的环1B。这是防卫素中的第一个柔性环。 [0205] 如上文中所指出的，II类茄科防卫素上的环1B区域包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中每一个X如上文中所定义的，其中至少一个或多个在一个方面包括所有6个(或相应地5 个)氨基酸残基通常、但非排他地被替换成对应于来自另一种防卫素例如I类防卫素或另一 种II类防卫素的环1B或其衍生物的序列。 [0206] 还提供了具有抗病原体活性的被修饰防卫素，所述被修饰防卫素包含： [0207] (i)来源于II类茄科防卫素的主链氨基酸序列，所述防卫素包含位于防卫素N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间的环1B区域； [0208] (ii)通过氨基酸置换、添加、缺失或交换而修饰的防卫素上的环1B区域，以产生与另一种防卫素环1B类似或同源或以其它方式在功能上相似的环1B区域； [0209] (iii)其中所得的环1B包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0210] X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0211] X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0212] X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0213] X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0214] X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或 [0215] X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式，[0216] 使用单字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0217] 还提供了具有抗病原体活性的被修饰防卫素，所述被修饰防卫素包含： [0218] (i)来源于II类茄科防卫素的主链氨基酸序列，所述防卫素在防卫素N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间具有环1B区域； [0219] (ii)防卫素上的环1B区域通过氨基酸置换、添加、缺失或交换而被修饰，以产生与另一种防卫素环1B类似或同源或以其它方式在功能上相似的环1B区域； [0220] (iii)其中所得的环1B包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0221] X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R； [0222] X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y； [0223] X3是W、Y、H、L、G、F或P； [0224] X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G； [0225] X5是S、K、Y、F、G或H；和/或 [0226] X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y， [0227] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0228] 主链氨基酸序列还可包含针对环1B区域之外的区域的氨基酸置换、添加和/或缺失。如果存在，可对环1B区域外的主链氨基酸序列产生约1至约50个氨基酸置换、添加和/或 缺失。″1至50″意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在一个实施方案中，所述另外的突变存在于II型茄科防卫素的C末端尾(CTPP)中。 [0229] 还提供了被修饰的防卫素，其包含来自香甜烟草(澳大利亚本地的)的主链防卫素分子其环1B区域或其等同物通过氨基酸置换、添加和/或缺失进行了修饰，以引入包含 X1X2X3X4X5X6的环1B序列，其中： [0230] X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0231] X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0232] X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0233] X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0234] X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或 [0235] X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式，[0236] 使用单字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，并且其中所述被修饰的防卫素具有抗病原体活性。在一 个实施方案中，所述香甜烟草防卫素选自NsD1和NsD2。 [0237] 另一个本文中提供的实施方案包含被修饰的防卫素，其包含来自香甜烟草(澳大利亚本地的)的主链防卫素分子其环1B区域或其等同物通过一个或多个氨基酸置换、添加 和/或缺失而引入包含X1X2X3X4X5X6的环1B序列，其中： [0238] X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R； [0239] X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y； [0240] X3是W、Y、H、L、G、F或P； [0241] X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G； [0242] X5是S、K、Y、F、G或H；和/或 [0243] X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y， [0244] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，其中所述被修饰的防卫素具有抗病原体活性。在一个实施方案中，所述香甜烟草防 卫素选自NsD1和NsD2。 [0245] 在一个实施方案中，X1X2X3X4X5X6包含氨基酸残基，所述残基选自： [0246] X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸； [0247] X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸； [0248] X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸； [0249] X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸； [0250] X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和 [0251] X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。 [0252] 在这方面，本公开内容还提供了来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。 本公开内容的另一个方面涉及来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：51[NsD2] 所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。本文中还涉及 分别编码NsD1和NsD2的核苷酸序列例如SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50，或在最佳比对后与 SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50具有至少70％同一性的核苷酸序列，或能够在中等严格条件 下与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50或者SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50的互补形式杂交的 核苷酸序列。″至少70％的同一性″意指至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、988、99或100％。在一个方面，相较于修饰前的NsD1或NsD2，抗病原体活性在活性的范围或水平、稳定性水平和/或诱导透化的能 力方面得到增强。 [0253] 在一个实施方案中，II类防卫素上的环区域被X1X2X3X4X5X6置换，其中： [0254] X1是N、H、Q、D、K或E； [0255] X2是R、H、T、K或G； [0256] X3是F、H、Y或W； [0257] X4是P、K、S或R； [0258] X5是G或F；和/或 [0259] X6是P、V、I或N， [0260] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0261] 只要主链防卫素是NaD1，则可修饰环1B，其中修饰包括： [0262] 用选自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换N； [0263] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换T； [0264] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换F； [0265] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换P； [0266] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换G；和/或 [0267] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换I， [0268] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于来自NaD1的环1B区域的氨基酸序列。 [0269] 只要主链防卫素是NaD1，则可修饰环1B，其中修饰包括如下修饰的一个或多个： [0270] 用选自G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、T和R的氨基酸残基置换N； [0271] 用选自K、R、G、H、L、N、F、I、S和Y的氨基酸残基置换T； [0272] 用选自W、Y、H、L、G和P的氨基酸残基置换F； [0273] 用选自K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G的氨基酸残基置换P； [0274] 用选自S、K、Y、F和H的氨基酸残基置换G；和/或 [0275] 用选自P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H和Y的氨基酸残基置换I。 [0276] 在一个实施方案中，X1X2X3X4X5X6包含氨基酸残基，所述残基选自： [0277] X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸； [0278] X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸； [0279] X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸； [0280] X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸； [0281] X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和 [0282] X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。 [0283] X1至X6的“一个或多个”意指修饰1或2或3或4或5或所有6个氨基酸残基。如果存在的话，环1B区域外的突变包括1至约50个氨基酸置换、添加和/或缺失。 [0284] ″病原体″包括真菌、微生物(包括细菌)、昆虫、蜘蛛、病毒和线虫以及原生动物。在一个实施方案中，所述病原体是真菌或昆虫。 [0285] ″真菌″包括感染植物或动物以及另外地为植物或动物的病原体的真菌。动物的真菌病原体包括哺乳动物(包括人)的真菌病原体。具体的真菌病原体包括禾生刺盘孢 (Colletotrichum graminicola)、玉蜀黍壳色单隔孢(Diplodia maydis)、禾谷镰孢 (Fusarium graminearum)和轮枝样镰孢(Fusarium verticilloides)。主要农作物的具体 病原体包括：玉米：玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾谷镰孢)、禾生刺盘孢、玉米狭壳柱孢 (Stenocarpella maydi)(玉蜀黍壳色单隔孢(Diplodia maydis))、亚粘团串珠镰孢 (Fusarium moniliforme var.subglut inans)、轮枝样镰孢、玉蜀黍平脐蠕孢菌O、T (Bipolaris maydis O、T)(异旋孢腔菌(Cochliobolis heterostrophus))、玉米大斑菌I、 II和III、玉米尾孢(Cercospora zeae-maydis)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利 腐霉(Pythium debaryanum)、禾生腐霉(Pythium graminicola)、华丽腐霉(Pythium splendens)、终极腐霉(Pythium ultimum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、曲霉属 的种(Aspergillus spp)、黄曲霉(Aspergi llus flavus)、炭色长蠕孢(Helminthospor ium carbonum)I、II和III(炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum))、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)、玉米叶点霉(Phyllosticta maydis)、 玉米球梗孢(Kabat iella maydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉米黑粉菌 (Ustilago maydis)、玉米黑粉菌(Ustilago zeae)、玉米柄锈菌(Puccinia sorghi)、多堆 柄锈菌(Puccinia polysora)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、草酸青霉 (Penicillium oxalicum)、稻黑孢(Nigrospora oryzae)、草本枝孢(Cladosporium herbarium)、新月弯孢(Curvularia lunata)、不等弯孢(Curvularia inaequalis)、苍白弯 孢(Curvularia pallescens)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉米麦角(Claviceps sorghi)、大孢色二孢(Diplodia macrospora)、水稻霜霉病(Sclerophthora macrospora)、 高粱霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉 (Peronosclerospora sacchari)、丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana)、玉米壳锈菌 (Physopella zeae)、玉蜀黍头孢(Cephalosporum maydis)、顶头孢(Cephalosporum acremonium)；大豆：枝状镰孢…、茄腐镰孢…、核盘菌、尖镰孢、Fusarium tucumaniae、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、大豆疫霉(Phytophthora megaspermaf.sp.glycinea)、 大豆疫霉(Phytophthora sojae)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)、菜豆间座壳大豆种(Diaporthe phaseolorum var.sojae)(大豆拟 茎点霉(Phomopsis sojae))、菜豆间座壳种花椰菜(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、 大豆尾孢(Cercospora sojina)、大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica)、束状刺盘孢 (Colletotrichum dematium)(平头刺盘孢(Colletotrichum truncatum))、山扁豆生棒孢 (Corynespora cassiicola)、大豆壳针孢(Septoria glycines)、大豆生叶点霉 (Phyllosticta sojicola)、链格孢(Alternaria alternata)、弥漫叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、大豆瓶霉(Phialophora gregata)、大豆小丝 壳(Glomerella glycines)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)；芸苔：白锈菌(Albugo candida)、芸苔链格 孢(Alternaria brassicae)、油菜小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)、核盘菌、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、终极腐 霉(Pythium ultimum)、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、链格孢 (Alternaria alternata)；棉花：棉花尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、 大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大孢链格 孢(Alternaria macrospora)、棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phoma exigua)(棉壳二胞菌(Ascochyta gossypii))、腐霉属的种、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Puccinia scheddardii、Puccinia cacabata、Phymatotrichopsis omnivore；芸 苔：油菜小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、核盘菌、芸苔链格孢(Alternaria brass icae)、黑斑病菌(Alternaria brasicicola)、芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、 立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、镰孢属(Fusarium)的种、腐霉属的种、疫霉属 (Phytophthora)的种、链格孢属(Alternaria)的种、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、 Mycosphaerella capsellae (芸苔假小尾孢(Pseudocercosporella capsellae))、白锈菌 (Albugo candida)、大雄疫霉(Phytophtohora megasperma var.megasperma)、灰葡萄孢 (Botryt i s cinerea)、十字花科白粉菌(Erysiphe cruciferarum)；小麦：麦根腐平脐蠕 孢(Cochliobolus sativus)、Drechslera wirreganensis、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、Phaeosphaeria avenaria f.sp.triticea、小麦小暗球壳(Phaeosphaeria nodorum)、布氏禾白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)、冰草条黑粉菌(urocystis agropyri)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、禾黑芽枝霉菌(Cladosporium herbarum)、禾谷镰孢、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、尖镰孢(Fusarium culmorum)、小 麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)、 Ascochyta tritici、谷头孢菌(Cephalosporium gramineum)、禾生刺盘孢、白粉病菌 (Erysiphe graminisf .sp.tritici)、大麦抗禾柄锈菌(Puccinia graminisf.sp.tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)、小麦条锈菌 (Pucciniastriiformi s)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、水稻霜霉病 (Sclerophthora macrospora)、冰草条黑粉菌(Urocystis agropyr i)、小麦黄斑枯叶菌 (Pyrenophora tritici-repent is)、小麦不孕病菌(Pyrenophora semeniperda)、小麦叶 枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)、小麦叶斑病病原菌 (Septoria tritici)、燕麦亮针抱菌(Septoria avenae)、小麦基腐病菌 (Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、禾谷丝 核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、 腐霉(Pythium spp)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、Pythium arrhenomannes、 Pythium gramicola、终极腐霉(Pythium ultimum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、麦角菌(Claviceps purpurea)、Tapesia yallundae、小麦光腥黑穗菌 (Tilletia tritici)、Tilletialaevis、小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麦印度 腥黑穗病菌(Tilletia indica)、小麦散黑粉病菌(Ustilagotritici)、Wojnowiciagramini s、麦根腐平脐蠕孢(Cochliobolus sativus)；高粱：玉米大斑菌(Exserohilum turcicum)、 炭疽病菌(Colletotrichum sublineolum)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、Gloeo高粱尾 孢(Cercospora sorghi)、高粱粗斑壳二孢(Ascochyta sorghina)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、粱黑葱花霉(Perconia circinata)、串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、高粱平脐蠕孢菌(Bipolaris sorghicola)、长蠕孢菌(Helminthosporium sorghicola)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、高梁类 斑点病菌(Ramulispora sorghi)、高粱紫轮病菌(Ramulispora sorghicola)、Phyllachara saccari、玉米丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)(玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))、高粱散黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、苏丹草紫斑病(Claviceps sorghi)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、枝顶 孢霉(Acremonium strictum)、小麦霜霉病菌(Sclerophthona macrospora)、高粱霜霉病菌 (Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、禾 生指梗霉(sclerospora graminicola)、禾谷镰孢、尖镰孢、雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、禾生腐霉(Pythium graminicola)；向日葵：向日葵单轴霉(Plasmopara halstedii)、核盘菌、壳针孢菌(Septoria helianthi)、向日葵茎溃疡病菌(Phomops is helianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi)、百日草链格孢菌(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢菌(Botryt is cinerea)、茎点霉黑茎病菌(Phoma macdona ldii)、菜 豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉 (Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、 Puccinia helianthe、大丽轮枝菌(Verti cillium dahliae)、顶头孢霉菌(Cephalosporum acremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白锈菌(Albugo tragopogonis)；苜蓿：终极腐霉(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium i rregulare)、华 丽腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、大豆疫病菌(Phytophthoramegasperma)、三叶草霜霉菌(Peronospora trifol iorum)、Phoma medicagini s var.medicagini s、苜蓿尾孢菌(Cercospora medicagini s)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicagini s)、尖镰孢、黑白轮枝菌(Vert ic illium albo-atrum)、根腐丝囊霉 (Aphanomyces euteiches)、Stemphylium herbarum、Stemphylium Alfalfa、三叶草炭疽病 菌(Colletotrichum trifolii)、苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)、条纹单胞锈 菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、草木樨壳多孢菌 (Stagonospora melilot i)、葱叶枯匍柄霉(Stemphylium botryosum)和Leptotrichila medicaginis。 [0286] 在一个实施方案中，玉米中的真菌病原体包括禾谷镰孢、禾生刺盘孢、玉蜀黍壳色单隔孢、轮枝样镰孢、Cochliobolis heteros trophus、玉米大斑病菌，玉米尾孢菌。 [0287] 在一个实施方案中，大豆中的真菌病原体包括Fusarium virguliforme、腐皮镰孢、核盘菌、尖镰孢、Fusarium tucumaniae、豆薯层锈菌。 [0288] 动物(包括哺乳动物，特别地人)真菌病原体包括链格孢属的种(Alternaeria spp)、曲霉属的种(Aspergillus spp)、假丝酵母属某些种)Candida spp)、镰孢属的种 (Fusarium spp)、发癣菌属的种(Trychophyton spp)、隐球酵母属的种(Cryptococcus spp)、小孢霉属的种(Microsporum spp)、青霉属的种(Penicillium spp)、丝孢酵母的种 (Trichosporon spp)、丝孢菌属的种(Scedosporium spp)、拟青霉属的种(Paecil iomyces spp)，支顶孢属某些种(Acremonium spp)和暗色霉。具体动物、包括哺乳动物、特别地人病 原体包括烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲 霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Aspergillus paraciticus、白色假丝酵母(Candida albicans)、都柏林假丝酵 母(Candida dubliniensis)、无名假丝酵母(Candida famata)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、希木龙假丝酵母(Candida haemu l onii)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、葡萄牙假丝 酵母(Candida lusitaniae)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、近平滑假丝酵母 (Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄腐镰孢(Fusarium solani)、串株镰孢 (Fusarium monoliforme)、红色毛癣菌(Trycophyton rubrum)、须癣毛癣菌(Trycophyton mentagrophytes)、Trycophyton interdigitales、断发毛癣菌(Trycophyton tonsurans)、 新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、隐球酵母(Cryptococcus gat tii)、 Cryptococcus grubii、犬小孢霉(Microsporum canis)、石膏样小孢霉(Microsporum gyPseum)、马尔尼菲青霉(Penic illium marneffei)、白吉尔毛孢子菌(Tricosporon beigelii)、阿氏丝孢酵母(Tr ichosporon asahii)、墨汁丝孢酵母(Trichosporon inkin)、星状丝孢酵母(Trichosporon asteroides)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、Tr ichosporon domesticum、粘性丝孢酵母(Trichosporon mucoides)、卵形丝 孢酵母(Trichosporon ovoides)、茁芽丝孢酵母(Trichos poron pullulans)、 Trichosporon loubieri、日本丝孢酵母(Trichosporon japonicum)、尖端赛多孢子菌 (Scedosporium apiospermum)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、宛氏拟青霉 (Paecilomyces variotii)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、枝顶孢霉 (Acremonium stricutm)、斑替枝孢霉(Cladophialophora bantiana)、皮炎外瓶霉 (Wangiella dermatitidis)、Ramichloridium obovoideum、Chaetomium atrobrunneum、 Dactlaria ga llopavum、平脐蠕孢属(Bipolaris spp)、嘴突脐孢(Exserohilum ros tratum)以及伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、精美尖端节肿霉(Apophysomyces elegans)、印度毛霉菌(Mucor indicus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米根霉 (Rhizopus oryzae)、灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)、Cokeromyces recurvatus、Saksenaea vasiformis、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、蛙粪霉 (Basidiobolus ranarum)、冠状耳霉(Conidiobolus coronatus)/异孢耳霉(Conidiobolus incongruus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、Coccidioides posadasii、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、巴西芽 生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、波氏足肿菌(Pseudallescheria boydii)和申克 孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。 [0289] ″真菌″还包括卵菌纲(oomycetes)例如腐霉属的种和疫霉属的种。术语″真菌″还包括锈菌属。 [0290] 细菌性病原体包括黄单胞菌属(Xanthomonas)的种和假单胞菌属(Pseudomonas)的种。其它微生物包括植原体属(Phytoplasma)的种和螺原体属(Spiropla sma)的种。其它 病原体包括病毒、线虫和原生动物。昆虫病原体包括巨座玉米螟、玉米螟蛾、缢管蚜的种、夜 蛾属的种、小菜蛾和盲蝽属的种。 [0291] 本文中还提供了编码所述被修饰的II类茄科防卫素的分离的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸包含编码SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施 方案中，所述核酸包含编码SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的核苷酸序列。 [0292] 因此，提供了编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述人工产生的防卫素包含： [0293] (i)来源于或对应于II类茄科防卫素的氨基酸主链； [0294] (ii)经历一个或多个如下修饰的主链上的环1B或其等同物：(a)氨基酸置换、添加和/或缺失；和/或(b)被来自另一种防卫素的环1B或其修饰形式全部或部分地替换；和任选 地(c)在主链上环1B区域外的另外的氨基酸置换、添加和/或缺失； [0295] 其中所述人工产生的防卫素展示具有抗病原体活性的环1B。 [0296] 本文中教导的另一个方面是编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的主链氨基酸序列，具有在II类茄科防卫素的N末端部分上的 β-链1与α-螺旋之间的环区域，其中所述环区域通过氨基酸置换、添加和/或缺失而被修饰， 以产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0297] 在一个方面，所述环区域是环1B。另一个方面涉及编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的主链氨基酸序列，其具有在II类茄科 防卫素N末端部分上的p-链1与o-螺旋之间的环1B区域，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、 PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述环1B区域已被氨基酸置换、添加和/或缺失所修饰，从而产生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的 区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且其中X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S或R； X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，从而人工地产生具有抗病原体活 性的防卫素。在一个实施方案中，X1X2X3X4X5X6包含如下氨基酸序列，其中X1是选自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸残基；X2是选自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是选自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是选自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是选自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；以及X6是选自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。 [0298] 另一个方面涉及编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述防卫素包含来自II类茄科防卫素的主链氨基酸序列，其具有在II类茄科防卫素N末端部分上的β-链1与α-螺 旋之间的环1B区域，所述防卫素具有与SEQ ID NO：52具有至少70％相似性的成熟结构域的 C末端氨基酸序列，其中环1B区域已被氨基酸置换、添加和/或缺失所修饰，从而产生包含氨 基酸序列X1X2X3X4X5X6的区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，从而产生具有抗病 原体活性的防卫素。 [0299] 另一方面涉及编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述防卫素具有来源于香甜烟草防卫素的主链氨基酸序列，其环1B区域或其等同物已被单个或多个氨基酸置换、 添加和/或缺失所修饰，从而产生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的区域，其中X1至X6的每一个 是氨基酸残基，并且X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，从而人工地产生具有抗病原体活性的防卫素。 香甜烟草的防卫素的实例包括NsD1和NsD2。 [0300] 另一个方面还提供了编码人工产生的防卫素的分离的核酸分子，所述防卫素具有来源于香甜烟草防卫素的主链氨基酸序列，其环1B区域或其等同物已被单个或多个氨基酸 置换、添加和/或缺失所修饰，从而产生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的区域，其中X1至X6的每一个是氨基酸残基，并且X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列，从而人工地产生具有抗病原体活性的防卫素。香甜烟草的 防卫素的实例包括NsD1和NsD2。 [0301] 在另一个实施方案中，所述分离的核酸分子编码人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的、在茄科防卫素N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间具有环1B区域的主链 氨基酸序列，所述防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中II类茄科防卫素主链上的环1B区域被来自选自 NaD2(HRFKGP)、Zea2(QHHSFP)、PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1 (KTWSGN)的防卫素的环1B区域或者选自SEQ ID NO：67至79的环1B序列替换，以产生具有抗 病原体活性的防卫素。 [0302] 如本文中所用，术语″相似性″包括在核苷酸或氨基酸水平上比较的序列之间的确切同一性。当在核苷酸水平上存在不相同时，“相似性”包括序列之间导致不同的、然而在结 构、功能、生物化学和/或构象水平上彼此相关的氨基酸的差异性。当在氨基酸水平上存在 不相同时，“相似性，，包括在结构、功能、生物化学和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，在同一性而相似性水平上进行核苷酸和序列比较。 [0303] 用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括″参照序列″、″比较窗口″、″序列相似性″、″序列同一性″、″序列相似性百分比″、″序列同一性百分比″、″大体上相似的″和″大体上同一的″。″参照序列″在长度上为至少12个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基，但常常是15至18个，通常至少25个或以上，例如30个。因为两个多核 苷酸可能各自包含(1)在这两个多核苷酸之间相似的序列(即仅整个多核苷酸序列的一部 分)，和(2)在两个多核苷酸之间有差异的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸之间的序列 比较通常通过在“比较窗口，，中比较这两个多核苷酸的序列以鉴定和比较具有序列相似性 的局部区域来进行。″比较窗口″是指与参照序列相比较的通常具有12个连续残基的假想区 段。比较窗口相较于参照序列(其不包含添加或缺失)可包含约20％或更少的添加或缺失 (即缺口)，以进行两个序列的最佳比对。可通过算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics software Package Release7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)或通过目测以及利用任何所选择的各种方法 产生的最佳比对(即在比较窗口中导致最高百分比同源性)进行用于对齐比较窗口的序列 最佳比对。还可参考如例如由Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25：3389)公开的程序 的BLAST家族。序列分析的详细论述可见于Ausubel等人(1998)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wil ey＆Sons Inc.1994-1998的单元19.3中。 [0304] 如本文中所用，术语″序列相似性″和″序列同一性″是指序列在比较窗口中基于逐个核苷酸或逐个氨基酸的比较而相同或在功能上或结构上相似的程度。因此，″序列同一性 的百分比″例如可通过如下步骤进行计算：在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列，测定在 其上在两个序列中都存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如A1a、 Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即，窗 口大小)，然后将结果乘以100而得到序列同一性百分比。为了本公开内容的目的，″序列同 一性″应理解为表示使用标准缺省值(如随软件所附的参考手册中使用的)通过DNASIS计算 机程序(对于windows，2.5版；可从Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA获得)计算的“匹配百分比”。关于序列相似性，应用类似的注 释。″至少70％″意指70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％。 [0305] 本公开内容扩展至在低严格条件下与编码所述被修饰的防卫素的核酸分子杂交的核酸分子。 [0306] 严格度条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺浓度，或杂交温度来确定，并且在本领域是公知的。例如，严格度可通过降低盐的浓度，增加甲酰胺的浓度，或升 高杂交温度，改变杂交时间来提高，如下文中详细描述的。在一些可选择的方面，本公开内 容的核酸通过它们在各种严格度条件(例如高、中和低)下杂交的能力来定义。 [0307] 本文中提及的″低严格度″包括且包含至少约0至至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M至至少约2M的盐用于杂交，以及至少约1M至至少约2M的盐用于清洗条件。通常地，低严 格度是在约25-30℃至约42℃。温度可被改变，更高的温度用于替代甲酰胺和/或提供另外 的严格度条件。需要时可应用另外的严格度条件，例如“中等严格度”，其包括且包含至少约 16％v/v至至少约30％v/v的甲酰胺以及至少约0.5M至至少约0.9M的盐用于杂交，和至少约 0.5M至至少约0.9M的盐用于清洗条件，或″高度严格度″，其包括且包含至少约31％v/v至至 少约50％v/v的甲酰胺和至少约0.01M至至少约0.15M的盐用于杂交以及至少约0.01M至至 少约0.15M的盐用清洗条件。一般而言，进行清洗，Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty (1962)JMol Biol5：109-118)。然而，随着错配碱基对的数目每增加1％，则双链体核酸分子 的Tm就下降1℃(Bonner和Laskey(1974)Eur J Biochem46：83-88)。甲酰胺在此类杂交条件 下是任选的。因此，严格度的特别优选水平定义如下：低严格度为6xSSC缓冲液，0.1％w/ vSDS，于25-42℃；中等严格度为2xSSC缓冲液，0.1％w/vSDS，于20℃至65℃范围内的温度； 高严格度为0.1xSSC缓冲液，0.1％w/vSDS，于至少65℃的温度。 [0308] 如本文中所用，术语″序列相似性″和″序列同一性″是指序列在比较窗口中基于核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的比较而相同或在功能上或结构上相似的程度。因此，″序列 同一性百分比″例如可通过如下步骤进行计算：在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列，测 定在其上在两个序列中都存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如 Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、I le、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数 (即，窗口大小)，然后将结果乘以100来产生序列同一性百分比。为了本公开内容的目的，″ 序列同一性″应理解为表示使用标准缺省值(如随软件所附的参考手册中使用的)通过 DNASIs计算机程序(对于windows，2.5版；可从Hitachi Software engineer ing Co.， Ltd.，South San Francisco，california，USA获得)计算的“匹配百分比”。关于序列相似 性，应用类似的注释。 [0309] 本文中教导的核酸分子还能够与其它遗传分子杂交。本文中提及″杂交″是指核酸链籍由碱基配对而与互补链联结的过程。杂交反应可以是敏感性的和选择性的，从而特定 目标序列即便在样品中以低浓度存在时亦可鉴定出。严格条件可通过例如预杂交和杂交浓 度中盐或甲酰胺的浓度，或通过杂交温度来确定，并且在本领域是公知的。例如，严格度可 通过降低盐的浓度，增加甲酰胺的浓度，或升高杂交温度，改变杂交时间来提高，如下文中 详细描述的。在可选择的方面，本发明的核酸通过它们在各种严格度条件(例如高、中和低) 下杂交的能力来定义。 [0310] 所述分离的核酸分子还可存在于载体(包括表达或转移载体)中，所述载体适用于植物细胞、微生物细胞和非人动物细胞的。″载体″包括多基因表达载体(MGEV)，例如PCT/ AU02/00123所描述的载体。 [0311] 根据后一方面，提供了包含具有2至8个结构域区段的多核苷酸的多基因表达载体(MGEV)，其中其中每一个结构域编码功能性蛋白质，每一个结构域通过接头区段连接至线 性序列中的下一个结构域，结构域和区段全都存在于相同阅读框架中，并且其中结构域的 至少一个是本文中描述的被修饰II类茄科防卫素。在一个实施方案中，至少一个其它结构 域是蛋白酶抑制剂或其前体。在另一个实施方案，至少一个结构域是本文中涉及的被修饰 II类茄科防卫素，并且至少一个结构域是蛋白酶抑制剂或其前体形式。″蛋白酶抑制剂″包 括丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 [0312] 可将编码所述被修饰的防卫素的核酸序列与适当的调控序列(启动子、终止子、转运肽等)组合整合进入DNA构建体或载体。还可将核酸有效地连接至异源启动子。对于一些 应用，可将编码被修饰的防卫素的核酸序列插入表达另一种蛋白质的编码区内以形成防卫 素融合蛋白，或可将其用于替代蛋白质的结构域以为该蛋白质提供抗病原体活性。可将所 述核酸序列置于可以为组成型或诱导型启动子(通过例如环境条件、病原体的存在、化学药 品的存在所刺激)的同源或异源启动子的控制之下。转运肽对于所述被修饰的防卫素可以 是同源的或异源的，并且被选择用来确保分泌至期望的细胞器或细胞外空间。转运肽可与 特定的防卫素天然关联。可将这样的DNA构建体克隆或转化进入允许所编码的被修饰防卫 素或防卫素的活性部分表达的生物系统。适当的生物系统包括微生物(例如，巴斯德毕赤酵 母表达系统、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、内生菌 (endophyte)例如木质棍状杆菌犬齿亚种(Clavibacter xyli subsp.cynodontis(Cxc))； 酵母；病毒；噬菌体；等)、培养细胞(例如昆虫细胞、哺乳动物细胞)和植物。在一些情况下，随后提取和分离表达的防卫素以待使用。 [0313] 本文中教导的被修饰防卫素可用于抗击植物和动物(包括哺乳动物，例如人)的病原体疾病。因此，所述被修饰的II类茄科防卫素具有园艺和农业应用以及用作动物包括哺 乳动物例如人使用的药剂。还提供了抗击病原体的方法，通过该方法使所述病原体暴露于 本文中描述的被修饰的防卫素。可以以组合物的形式使用该被修饰的防卫素。可单独地使 用被修饰防卫素或与化学杀病原体剂、抗病原体蛋白和/或II型丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶 抑制剂或其前体形式组合地使用。 [0314] 虽然本文中描述的被修饰防卫素对于保护植物免受病原体感染、生长、维持或传播是有用的，但被修饰防卫素还可用作药剂，包括局部药剂，用于非植物，例如动物，包括哺 乳动物例如人。 [0315] 因此，本文中教导的另一个方面是组合物，其包含本文中描述的被修饰防卫素和一种或多种药学上或兽医学上或园艺学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和/或一种或多 种其它抗病原体剂例如化学杀病原体剂、蛋白质性质的抗病原体剂和/或蛋白酶抑制剂或 其前体形式。在一个实施方案中，组合物以喷雾剂、雾化剂(mist)、微颗粒或纳米颗粒、水溶 液、粉剂、乳膏、软膏剂、凝胶、加固绷带、液体、制剂、涂剂(paint)或其它适当的分配介质(distribution medium)的形式，包括组合物的口服形式存在。 [0316] 对于药物应用，可将被修饰防卫素(包括源自其的任何产物)用作杀抗原体剂或病原体抑制剂(pathogenostat)以治疗哺乳动物感染(例如，以抗击酵母例如假丝酵母)。 [0318] 对于农业应用，可将被修饰防卫素用于在植物的生命过程中提高农作物的抗病性或疾病耐受性或用于收获后农作物的保护。暴露于所述肽的病原体被抑制。该被修饰防卫 素可根除已在植物上建立的病原体或可保护植物免受未来的病原体攻击。肽的根除剂作用 是特别有利的。″植物″包括农作物植物例如高粱、小麦、大麦、玉蜀黍、棉花、稻、芸苔、玉米、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁(almond)、苹果、芦笋、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蚕豆、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、无花果、亚麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、坚果、梨，非洲稷(pearl millet)、马铃薯、油菜、黑麦草、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、芋头、茶叶、烟草、西红柿、黑小麦、块菌(truffle)和山药(yam)。 [0319] 植物病原体对被修饰防卫素的暴露可以以各种方式实现，例如： [0320] (a)可使用标准农业技术(例如喷雾法)，将被修饰防卫素施用于植物部分或植物的根周围的土壤或其它生长介质，或在播种其之前施用于植物的种子。可以化学合成防卫 素或可从经遗传修饰而表达所述蛋白质的微生物或植物提取防卫素。可将所述蛋白质以组 合物(其包含与固体或液体稀释剂以及任选地各种佐剂例如表面活性剂混合的防卫素)的 形式施用于植物或植物生长培养基。固体组合物可以以可分散性粉剂、粒剂或颗粒形式存 在。 [0321] (b)可将包含经遗传修饰而表达所述抗病原体的防卫素的微生物的组合物施用于植物或植物在其中生长的土壤。 [0322] (c)可将经遗传修饰而表达抗病原体的防卫素的内生菌引入植物组织(例如，通过种子处理方法)。内生菌被定义为能够与植物宿主建立非致病性内共生关系的微生物。对植 物进行内生菌增强的保护作用的方法已描述在Crop Genetics International Corporation拥有的一系列专利申请(例如，国际申请公开号WO90/13224、欧洲专利公开号 EP-125468-B1、国际申请公开号WO91/10363、国际申请公开号WO87/03303)中。可对内生菌 进行遗传修饰以产生农业化学药品。国际专利申请公开号WO94/16076(ZENECA Limited)描 述了使用已被遗传修饰而表达植物来源的抗真菌肽的内生菌。 [0323] (d)可将编码抗病原体防卫素的DNA引入植物基因组，使得所述肽在植物体内表达(DNA可以是cDNA、基因组DNA或使用标准核酸合成仪制造的DNA)。 [0324] 对于包含本文中描述的被修饰防卫素的组合物，通常包括载体、赋形剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂和/或固体或液体添加剂。任选地，还包括另一种抗病原剂。 [0325] 组合物可采取多种形式，这取决于期望的施用方法。一般而言，但非排他地，将局部组合物用于植物和动物。在制备组合物时，可使用常用介质，例如水、甘油、油、醇、防腐剂和/或着色剂。组合物可采取液体制剂的形式，例如悬浮剂、酏剂和溶液。还可使用载体例如 淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。组合物还可以以粉剂、胶囊剂和片剂形式存在。 [0327] 当通过气溶胶或喷雾剂施用时，按照农业和药物配制领域内公知的技术制备所述组合物，可使用苯甲醇或其它适当的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物 和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂，将组合物制备为盐水中的溶液。 [0328] 取决于使用的具体防卫素、施用模式、待治疗的病原体和病原体感染的严重度，所述被修饰防卫素的有效剂量可变化。因此，根据许多因素包括植物或受试者的类型、物种、 年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗的病况的严重度；施用途径以及使用的具体防卫素来 选择利用被修饰防卫素的给药方案。普通技术的园艺家、内科医生、临床医生或兽医可容易 地确定和开具防止、对抗或阻止病原体感染进展所需的防卫素的有效量。本文中还涉及缓 释制剂。 [0329] 提供了具有适当包衣的锭剂核芯。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，所述溶液可任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡喀烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶 液(1acquer solution)和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加至片剂或锭 剂包衣中以便鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。 [0330] 防卫素制剂包括由明胶制备的推入配合胶囊(push-fit capsule)以及由明胶和塑化剂例如甘油或山梨醇制备的软密封胶囊中。推入配合胶囊可包含与填充剂例如乳糖、 粘合剂例如淀粉和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。 在软胶囊中，活性化合物可被溶解或悬浮于适当的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙 二醇中。此外，可添加稳定剂。 [0331] 被修饰的防卫素组合物或编码所述被修饰防卫素组合物的表达载体还可包含另一种抗病原体物质，例如另一种防卫素或抗病原体蛋白质或肽，或化学杀病原体剂或蛋白 酶抑制剂或其前体形式。 [0332] 本文中教导的另一个方面包括用于治疗或预防植物感染病原体的方案或方法，所述方案或方法包括单独地或与另一种抗病原体剂一起地给植物或其部分或给植物周围的 土壤或生长支持介质施用抗病原体有效量的包含本文中描述的被修饰防卫素的组合物。 [0333] 另一个方面提供了用于治疗或预防感染或侵染了病原体的动物(包括哺乳动物，例如人受试者)的方案或方法，所述方案或方法包括给受试者施用抗病原体有效量的包含 本文中描述的被修饰防卫素的组合物。 [0334] 术语″施用″包括接触和暴露。可将被修饰防卫素单独地或与促进被修饰防卫素进入病原体的其它抗病原体剂或药剂一起使用。 [0335] 在又一个实施方案中，可按照多种已知的方法(土壤杆菌Ti质粒、电穿孔、显微注射、基因枪(microprojectile gun)等)利用重组DNA构建体转化植物细胞。可在适当的情况 下将转化细胞再生成其中新的核物质被稳定地整合进入基因组的完整植物。可以以该方式 获得转化的单子叶和双子叶植物，虽然后者通常更容易再生。此类原代转化体的一些后代 遗传了编码该抗病原体防卫素的重组DNA。 [0336] 本公开内容还提供了对病原体具有提高的抗性、并且包含表达被修饰II类茄科防卫素的重组DNA的植物。这样的植物可在标准植物育种杂交中用作亲代来开发具有病原体 (包括真菌)抗性的杂种和品系。 [0337] 重组DNA是已通过转化引入植物或其祖先的DNA(通常是异源的)。重组DNA编码被表达来递送至病原体攻击的位置(例如叶)的被修饰II类茄科防卫素。 [0338] 当本发明的被修饰防卫素在转基因植物或其后代中表达时，病原体在植物中被病原体攻击的位置上或远离所述位置的地方暴露于防卫素。具体地，通过使用适当的基因调 控序列，可使防卫素在其最有效时以及在其最有效的位置体上体内产生。例如，可在其中其 通常不大量表达但其中疾病抗性很重要的植物的部分内(例如在叶中)产生防卫素。 [0339] 可产生的遗传修饰植物的实例包括田间作物、谷类、水果和蔬菜，例如：玉米、大豆、高粱、小麦、大麦、玉蜀黍、棉花、芸苔、稻、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁、苹果、芦笋、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蚕豆、芸苔、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、无花果、亚麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、坚果、梨，非洲稷、马铃薯、油菜、黑麦草、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、芋头、茶叶、烟草、番茄、黑小麦、块菌和山药。 [0340] 病原体可以是在植物上、植物中或植物附近生长的任何病原体。在本说明书中，抗性包括当与野生型植物相比较时增强的对病原体的耐受性。抗性可以是从对病原体作用的 耐受性的略微增加(此时病原体被部分抑制)至完全的抗性从而植物不受病原体的存在影 响(此时病原体被严重抑制或杀死)之间变化。针对特定病原体的抗性水平升高或针对更广 谱病原体的抗性均可构成抗性的改善。在植物转化或随后杂交后选择显示抗性提高的转基 因植物(或从其衍生的植物)。 [0341] 本公开内容提供了用于产生显示抗病原体活性的遗传修饰植物或其后代的方法，所述方法包括产生包含表达编码被修饰防卫素的核酸的细胞的植物，如本文中所教导的， 表达水平足以使被修饰防卫素展示抗植物病原体的保护作用。 [0342] 可将本发明的被修饰防卫素单独地或与一种或多种来自任何组防卫素的其它防卫素组合地使用。因此，本文中提供了用于产生显示抗病原体性质的植物的方法，所述方法 包括产生遗传修饰的植物或其后代，其中包含表达与另一种防卫素组合的本文中教导的被 修饰II类茄科防卫素的细胞。这样的植物对于促进病原体产生抗性的风险减小。″协同作 用″包括通过使用两种或更多种防卫素来对抗对单种防卫素的抗性。 [0343] 可使用例如肽或蛋白质合成仪，使用一个或多个氨基酸残基的标准逐步添加，基于其氨基酸序列产生本发明的被修饰防卫素。或者，可通过重组方法制备被修饰防卫素。可 将被修饰防卫素单独地或与其它抗病原体剂(无论是由细胞提供的还是局部或全身性施用 的)组合地使用。 [0344] 如上文中所指出的，本发明的被修饰防卫素显示提高的或增强的抗病原体活性。在一个具体实施方案中，病原体是真菌病原体。 [0345] 因此，在一个具体实施方案中，提供了人工产生的II类茄科防卫素，所述防卫素包含II类茄科防卫素主链，其在主链的环1B区域被通过单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺 失修饰，产生具有抗真菌活性的防卫素，其中所述主链可任选地在主链的其它地方例如在C 末端CTPP中包含单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。本公开内容还涉及人工产生的防 卫素用于制造抗病原体药剂的用途，所述人工产生的防卫素包含来自II类茄科防卫素的主 链氨基酸序列，在II类茄科防卫素的N末端部分上的第一β-链与α-螺旋之间具有环1B区域 或其等同环，其中所述环1B区域已被单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失所修饰。 [0346] 此外，另一个方面是包含与SEQ ID NO：52具有至少约70％相似性的C末端区域的II类茄科防卫素用于制造人工产生的防卫素的用途，所述人工产生的防卫素包含被修饰的 环1B区域，并且所述人工产生的防卫素显示抗病原体活性。 [0347] 本文中还提供了用于在植物上或植物中或者在植物或其根周围的土壤中减少或控制病原体侵染的方法，所述方法包括给所述植物或植物的根或土壤局部施用本公开内容 的被修饰防卫素。或者，所述方法包括产生表达所述被修饰防卫素的遗传修饰植物以及包 含该被修饰防卫素的被修饰植物的后代。 [0348] 另一个方面提供了用于在动物上或动物中减少或控制病原体侵染的方法，所述方法包括给动物上的潜在受感染表面区域局部施用本发明的被修饰II类茄科防卫素。在一个 实施方案中，动物是哺乳动物，包括人。因此，本文中涉及动物(特别地哺乳动物，例如人)的 抗病原体药剂。在一个实施方案中，药剂以粉剂、喷雾剂、雾化剂、纳米颗粒、凝胶、糊剂、加固绷带、涂剂(paint)、气溶胶(aerosol)、drench或其它液体形式存在。抗病原体制剂还可 以是缓释组合物。制剂可用于治疗被感染的受试者或用作预防剂。 [0349] 如本文中所述，″包含″与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，具有开放性含义，并且不排除另外的、未引述的要素或方法步骤。如本文中所述，″由……组成″排除所述要素中未指明的任何要素、步骤或成分。如本文中所述，″基本上由……组成″不排除不实质性影响 所述对象的基本和新型特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何引述，特别地在组 合物的组分的描述中或装置的组件的描述中，理解为包括基本上由和由引述的组分或组件 组成的那些组合物和方法。可在本文中未明确公开的任何组件、限制不存在的情况下实施 在本文中适当地举例说明性描述的本公开内容。 [0350] 当本文中公开一组替代物时，应理解这些组和所有亚组的所有单个成员，包括组成员的任何异构体和对映体以及可使用替代物形成的化合物的种类是分别地公开的。当请 求保护化合物时，应理解无意将本领域已知的化合物，包括本文中公开的参考资料中公开 的化合物包括在内。当在本文中使用Markush组或其它分组时，意欲将组内的所有个体成员 和组的所有可能的组合和亚组合单个地包括在本公开内容中。 [0351] 当在本文中引述范围时，意欲包括所述范围内的所有亚范围以及所述范围内的所有整数值，就如同每一个亚范围和整数值被引述一样。 [0352] 本说明书包括各个方面。这些方面包括下列： [0353] 1.一种人工产生的防卫素，其包含来自II类茄科防卫素的在所述II类茄科防卫素的N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间具有环区域的主链氨基酸序列，其中所述通过氨基酸 的置换、添加和/或缺失修饰所述环区域以产生具有抗病原体活性的防卫素。 [0354] 2.方面1的人工产生的防卫素，其中所述环区域是环1B。 [0355] 3.方面2的人工产生的防卫素，其中II类茄科防卫素上的所述环1B经修饰而产生序列X1X2X3X4X5X6，其中X是氨基酸残基，并且其中： [0356] X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0357] X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0358] X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0359] X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0360] X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式；和/或 [0361] X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式； [0362] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0363] 4.方面3的人工产生的防卫素，其中II类茄科防卫素上的所述环1B经修饰而产生序列X1X2X3X4X5X6，其中X是氨基酸残基，并且其中： [0364] X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R； [0365] X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y； [0366] X3是W、Y、H、L、G、F或P； [0367] X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G； [0368] X5是S、K、Y、F、G或H；和/或 [0369] X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y； [0370] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0371] 5.方面4的人工产生的防卫素，其中所述环1B包含序列X1X2X3X4X5X6，其中： [0372] X1是N、H、Q、D、K或E； [0373] X2是R、H、T、K或G； [0374] X3是F、H、Y或W； [0375] X4是P、K、S或R； [0376] X5是G或F；和/或 [0377] X6是P、V、I或N。 [0378] 6.方面3的人工产生的防卫素，其中 [0379] X1是选自的氨基酸L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G； [0380] X2是选自的氨基酸S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G； [0381] X3是选自的氨基酸A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H； [0382] X4是选自的氨基酸K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S； [0383] X5是选自的氨基酸M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F；和 [0384] X6是选自的氨基酸V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N。 [0385] 7.方面3或4或5或6的人工产生的防卫素，其中II类茄科防卫素上的所述环1B被修饰成氨基酸序列HRFKGP(NaD2)、QHHSFP(Zea2)、DTYRGV(PsD1)、DKYRGP(MsDef1)、KTFKGI (SoD2)、KTWSGN和(DmAMP1)或由SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：79定义的环1B。 [0386] 8.方面1至7中任一项的人工产生的防卫素，其中所述II类茄科防卫素包含在最佳比对后与SEQ ID NO：52具有至少70％相似性的成熟结构域的C末端区域。 [0387] 9.方面8的人工产生的防卫素，其中所述II类茄科防卫素选自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20或SL549。 [0388] 10.方面9的人工产生的防卫素，其中所述II类茄科防卫素是NaD1。 [0389] 11.方面9的人工产生的防卫素，其中所述II类茄科防卫素是选自NsD1和NsD2的来自香甜烟草(Nicotiana sua veolens)的防卫素。 [0390] 12.方面2的人工产生的防卫素，其中来自图2中所列的非-II类茄科防卫素的环1B替代II类茄科防卫素上的环1B。 [0391] 13.方面7的人工产生的防卫素，其中所述环1B是来自NaD1的NTFPGI的被修饰形式，其中所述修饰包括如下修饰的一个或多个： [0392] 用选自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换N； [0393] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换T； [0394] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换F； [0395] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换P； [0396] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换G；和/或 [0397] 用选自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修饰形式的氨基酸残基置换I； [0398] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0399] 14.方面13的人工产生的防卫素，其中所述环1B是来自NaD1的NTFPGI的被修饰形式，其中所述修饰包括如下修饰的一个或多个： [0400] 用选自G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S和R的氨基酸残基置换N； [0401] 用选自K、R、G、H、L、N、F、I、S和Y的氨基酸残基置换T； [0402] 用选自W、Y、H、L、G和P的氨基酸残基置换F； [0403] 用选自K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G的氨基酸残基置换P； [0404] 用选自S、K、Y、F和H的氨基酸残基置换G；和/或 [0405] 用选自P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H和Y的氨基酸残基置换I； [0406] 其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不对应于修饰前的II类茄科防卫素环1B区域的氨基酸序列。 [0407] 15.方面1至14中任一项的人工产生的防卫素，其中所述主链II类茄科防卫素还包括主链上位于所述环区域外的氨基酸置换、添加和/或缺失。 [0408] 16.方面15的人工产生的防卫素，其中所述其它氨基酸置换、添加和/或缺失是C末端尾中的一个或多个氨基酸的置换。 [0409] 17.方面1至16中任一项的人工产生的防卫素，其中相较于主链II类茄科防卫素，所述人工产生的防卫素具有选自更广谱的抗病原体活性、增强的抗病原体活性、更大的稳 定性和/或更强的透化能力之中的增强的抗病原体活性。 [0410] 18.方面17的人工产生的防卫素，其中所述抗病原体活性是抗真菌活性的水平。 [0411] 19.方面17的人工产生的防卫素，其中所述抗病原体活性是抗昆虫活性的水平。 [0412] 20.方面18的人工产生的防卫素，其中所述真菌是植物真菌病原体。 [0413] 21.方面20的人工产生的防卫素，其中所述真菌是哺乳动物真菌病原体。 [0414] 22.方面21的人工产生的防卫素，其中所述真菌是人真菌病原体。 [0415] 23.方面20的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、玉蜀黍壳色单隔孢(Diplodia maydi s)、禾谷镰孢(Fusar ium graminearum)和轮枝样镰孢(Fusarium verticilloides)。 [0416] 24.方面20的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自玉米：玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾谷镰孢)、禾生刺盘孢、玉米狭壳柱孢(Stenocarpella maydi)(玉蜀 黍壳色单隔孢(Diplodia maydis))、亚粘团串珠镰孢(Fusarium moniliforme var.subglut inans)、轮枝样镰孢、玉蜀黍平脐蠕孢菌O、T(Bipolar i s maydi s O、T)(异 旋孢腔菌(Cochliobolis heterostrophus))、玉米大斑菌I、II和III、玉米尾孢 (Cercospora zeae-maydi s)、畸雌腐霉(Pythium i rregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、禾生腐霉(Pythium graminicola)、华丽腐霉(Pythium splendens)、终极腐 霉(Pythium ultimum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、曲霉属的种(Aspergillus spp)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、炭色长蠕孢(Helminthosporium carbonum)I、II和 III(炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum))、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍 节壶菌(Physoderma maydi s)、玉米叶点霉(Phyllosticta maydis)、玉米球梗孢 (Kabatiellamaydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydi s)、 玉米黑粉菌(Ustilago zeae)、玉米柄锈菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、 稻黑孢(Nigrospora oryzae)、草本枝孢(Cladosporium herbarium)、新月弯孢 (Curvularia lunata)、不等弯孢(Curvularia inaequalis)、苍白弯孢(Curvularia pallescens)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉米麦角(Claviceps sorghi)、大孢色二 孢(Diplodia macrospora)、水稻霜霉病(Sclerophthora macrospora)、高粱霜霉病菌 (Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉 蜀黍指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、 丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reili ana)、玉米壳锈菌(Physopella zeae)、玉蜀黍头孢 (Cephalosporum maydis)、顶头孢(Cephalosporum acremonium)；大豆：枝状镰孢…、茄腐 镰孢…、核盘菌、尖镰孢、Fusarium tucumaniae、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、大 豆疫霉(Phytophthora megaspermaf.sp.glycinea)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、菜 豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、菜豆间座壳大 豆种(Diaporthe phaseolorum var.sojae)(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))、菜豆间座 壳种花椰菜(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、大豆霜霉病 菌(Peronospora manshur ica)、束状刺盘孢(Colletotr ichum demat ium)(平头刺盘孢 (Colletotr ichum truncatum))、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆壳针孢 (Septoria glycines)、大豆生叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢(Alternaria alternata)、弥漫叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、大 豆瓶霉(Phialophora gregata)、大豆小丝壳(Glomerella glycines)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)；芸 苔：白锈菌(Albugo candida)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、油菜小球腔菌 (Leptosphaeriamaculans)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌、芸苔生球腔菌 (Mycosphaerella brassicicola)、终极腐霉(Pythium ul t imum)、寄生霜霉 (Peronospora paras i t ica)、尖镰孢(Fusar ium oxysporum)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、链格孢(Alternaria alternata)；棉花：棉花尖 镰孢(Fusar ium oxysporum f.sp.vasinfectum)、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大孢链格孢(Alternaria macrospora)、 棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phoma exigua)(棉壳二胞菌(Ascochyta gossypii))、腐霉属的种、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Puccinia scheddardii、 Puccinia cacabata、Phymatotrichopsis omnivore；芸苔：油菜小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、核盘菌、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、黑斑病菌(Alternaria brasicicola)、芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、镰孢属(Fusarium)的种、腐霉属的种、疫霉属(Phytophthora)的种、链格孢属 (Alternaria)的种、寄生霜霉(Peronosporaparasitica)、Mycosphaerella capsellae(芸 苔假小尾孢(Pseudocercosporella capsellae))、白锈菌(Albugo candida)、大雄疫霉 (Phytophtohora megasperma var.megasperma)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、十字花科 白粉菌(Erysiphe cruciferarum)；小麦：麦根腐平脐蠕孢(Cochliobolus sat ivus)、 Drechs lera wirreganensis、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、 Phaeosphaeria avenaria f.sp.triticea、小麦小暗球壳(Phaeosphaeria nodorum)、布氏 禾白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tr itici)、冰草条黑粉菌(Urocys tis agropyri)、 烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、禾黑芽枝霉菌(Cladosporium herbarum)、禾谷镰 孢、燕麦镰孢(Fusar ium avenaceum)、尖镰孢(Fusarium culmorum)、小麦冠腐病菌 (Fusarium pseudograminearum)、小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)、Ascochyta tritici、谷头孢菌(Cephalospori um gramineum)、禾生刺盘孢、白粉病菌(Erys iphe graminisf.sp.tritici)、大麦抗禾柄锈菌(Puccinia graminisf.sp.trit ici)、小麦叶锈 菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)、小麦条锈菌(Puccinia striiformi s)、小麦叶 锈菌(Puccinia triticina)、水稻霜霉病(Sclerophthora macrospora)、冰草条黑粉菌 (Urocystis agropyri)、小麦黄斑枯叶菌(Pyrenophora tritici-repentis)、小麦不孕病 菌(Pyrenophora semeniperda)、小麦叶枯病菌(Phaeosphaer ia nodorum)、小麦颖枯病菌 (Septoria nodorum)、小麦叶斑病病原菌(Septoria tritici)、燕麦亮针抱菌(Septoria avenae)、小麦基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯丝核病菌 (Rhizoctonia solani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌 (Gaeumannomyces graminis var.tritici)、腐霉(Pythium spp)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、Pythium arrhenomannes、Pythium gramicola、终极腐霉(Pythium ultimum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、麦角菌(Claviceps purpurea)、Tapes ia yallundae、小麦光腥黑穗菌(Tilletia tritici)、Tilletia laevi s、小麦网腥黑穗病 菌(Tilletia caries)、小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)、小麦散黑粉病菌 (Ustilago tritici)、Wojnowicia graminis、麦根腐平脐蠕孢(Cochliobolus sativus)； 高粱：玉米大斑菌(Exserohilum turcicum)、炭疽病菌(Colletotrichum sublineolum)、高 粱尾孢(Cercospora sorghi)、Gloeo高粱尾孢(Cercospora sorghi)、高粱粗斑壳二孢 (Ascochyta sorghina)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、粱黑葱花霉(Perconia circinata)、串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、高粱平脐蠕孢菌(Bipolaris sorghicola)、长蠕孢菌(Helminthosporium sorghicola)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、高粱类斑点病菌(Ramulispora sorghi)、高粱紫 轮病菌(Ramulispora sorghicola)、Phyllachara saccari、玉米丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)(玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))、高粱散黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、苏丹草紫斑病(Claviceps sorghi)、 立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、枝顶孢霉(Acremonium strictum)、小麦霜霉病菌 (Sclerophthona macrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜 霉(Peronosclerospora philippinens is)、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾 谷镰孢、尖镰孢、雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、禾生腐霉(Pythium graminicola)；向日 葵：向日葵单轴霉(Plasmopara halstedii)、核盘菌、壳针孢菌(Septoria helianthi)、向 日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi)、百日 草链格孢菌(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、茎点霉黑茎病菌 (Phoma macdonaldii)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、匍枝根霉 (Rhizopus stolonifer)、Puccinia helianthe、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、顶头 孢霉菌(Cephalosporum acremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白 锈菌(Albugo tragopogoni s)；苜蓿：终极腐霉(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、华丽腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、瓜果腐 霉(Pythium aphanidermatum)、大豆疫病菌(Phytophthora megasperma)、三叶草霜霉菌 (Peronospora trifoliorum)、Phoma medicaginis var.medicaginis、苜蓿尾孢菌 (Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、苜蓿黄斑病菌 (Leptotrochila medicaginis)、尖镰孢、黑白轮枝菌(Vert icillium albo-atrum)、根腐 丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、Stemphylium herbarum、Stemphylium Alfalfa、三叶草 炭疽病菌(Colletotrichum tr ifolii)、苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)、条 纹单胞锈菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、草木樨壳 多孢菌(Stagonospora meliloti)、葱叶枯匍柄霉(Stemphylium botryosum)和 Leptotrichila medicaginis。 [0417] 25.方面24的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自禾谷镰孢、禾生刺盘孢、玉蜀黍壳色单隔孢、轮枝样镰孢、Cochlioholis heteros trophus、玉米大斑病菌、玉米尾孢菌、 Fusarium virguliforme、腐皮镰孢、核盘菌、尖镰孢、Fusarium tucumaniae、Phakopsora pachyrhizi。 [0418] 26.方面24的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自枝状镰孢、腐皮镰孢、核盘菌、尖镰孢、Fusarium tucumaniae。 [0419] 27.方面20的人工产生的防卫素，其中所述真菌是锈菌。 [0420] 28.方面21的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自链格孢属的种、曲霉属的种、假丝酵母属的种、镰孢属的种、发癣菌属的种、隐球酵母属的种、小孢霉属的种、青霉属的 种、丝孢酵母种、丝孢菌属的种、拟青霉属的种、支顶孢属的种和暗色霉。 [0421] 29.方面24的人工产生的防卫素，其中所述真菌选自烟草赤星病菌、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、Aspergillus paraciticus、白色假丝酵母、都柏林假丝酵母、无名假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、希木龙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵 母、葡萄牙假丝酵母、挪威假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、维斯假丝酵母、尖镰 孢、茄腐镰孢、串株镰孢、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、Trycophyton interdigitales、断发毛 癣菌、新型隐球酵母、隐球酵母、Cryptococcus grubii、犬小孢霉、石膏样小孢霉、马尔尼菲青霉、白吉尔毛孢子菌、阿氏丝孢酵母、墨汁丝孢酵母、星状丝孢酵母、皮状丝孢酵母、 Trichosporon domesticum、粘性丝孢酵母、卵形丝孢酵母、茁芽丝孢酵母、Trichosporon loubieri、日本丝孢酵母、尖端赛多孢子菌、多育赛多孢、宛氏拟青霉、淡紫拟青霉、枝顶孢 霉、斑替枝孢霉、皮炎外瓶霉、Ramichloridiumobovoideum、Chaetomiumatrobrunneum、 Dactlaria gallopavum、平脐蠕孢属的种、嘴突脐孢以及、精美尖端节肿霉、印度毛霉菌、微 小根毛霉、米根霉、灰色小克银汉霉、Cokeromyces recurvatus、Saksenaea vas iformis、 总状共头霉、蛙粪霉、冠状耳霉/异孢耳霉、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、Coccidioides posadasii、荚膜组织胞浆菌、巴西芽生菌、波氏足肿菌和申氏孢子丝菌。 [0422] 30.方面19的人工产生的防卫素，其中所述昆虫选自巨座玉米螟、玉米螟蛾、缢管蚜的种、夜蛾属的种、小菜蛾和盲蝽属的种。 [0423] 31.一种组合物，所述组合物包含方面1至30中任一项的人工产生的防卫素，任选地还包含化学或蛋白质性质的杀病原体剂和/或丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其前体 形式。 [0424] 32.一种分离的核酸分子，其编码方面1至30中任一项的人工产生的防卫素。 [0425] 33.一种包含方面32的分离的核酸分子的基因构建体。 [0426] 34.一种遗传修饰植物或所述植物的后代，其产生方面1至30中任一项的人工产生的防卫素。 [0427] 35.方面34的遗传修饰植物或其后代或繁殖材料，其包含方面32的核酸分子或方面33的基因构建体。 [0428] 36.方面34或35的遗传修饰植物，其选自玉米、大豆、棉花、高粱、小麦、大麦、玉蜀黍、芸苔、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁、苹果、芦笋、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蚕豆、腰果、木薯、鹰嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、无花果、亚麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、坚果、梨、非洲稷、马铃薯、油菜、黑麦草、草莓，甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、芋头、茶叶、烟草、番茄、黑小麦、块菌和山药。 [0429] 37.一种用于产生展示增强的抗病原体活性的遗传修饰植物或其后代的方法，所述方法包括产生包含表达编码方面1至30中任一项的被修饰II类茄科防卫素的核酸的细胞 的植物，所述植物或其后代中的表达水平足以使所述被修饰防卫素展示抗植物病原体的保 护作用。 [0430] 38.一种控制植物上病原体侵染的方法，所述方法包括对所述植物、其根或所述植物周围的土壤局部施用方面31的组合物。 [0431] 39.一种控制动物受试者上病原体侵染的方法，所述方法包括对被所述病原体潜在侵染的动物的表面局部施用方面31的组合物。 [0432] 40.方面37或38的方法，其还施用化学杀病原体剂、蛋白质性质的杀病原体剂或者丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其前体形式。 [0433] 41.方面39的方法，其中所述动物是哺乳动物。 [0434] 42.方面31的方法，其中所述哺乳动物是人。 [0435] 43.人工产生的防卫素用于制造抗病原体药剂的用途，所述人工产生的防卫素包含来自II类茄科防卫素的、在所述II类茄科防卫素的N末端部分上的β-链1与α-螺旋之间具 有环区域的主链氨基酸序列，其中所述环区域通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加 而被修饰。 [0436] 44.方面43的用途，其中所述环区域是环1B。 [0437] 45.方面43或44的用途，其中所述病原体是真菌。 [0438] 46.方面43或44或45的用途，其还包括使用化学杀病原体剂、蛋白质性质的杀抗原体剂或者丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂或其前体形式。 [0439] 47.一种来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。 [0440] 48.一种来自香甜烟草的分离的防卫素，其具有SEQ ID NO：51[NsD2]所示的氨基酸序列或在最佳比对后与其具有至少70％相似性的氨基酸序列。 [0441] 49.一种分离的核酸分子，其包含编码方面47或48的防卫素的核苷酸序列。 [0442] 50.方面49的分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、能够在中等严格条件下与SEQ ID NO：48或50杂交的核苷酸序列以及在最佳比对后与SEQ ID NO： 46或48具有至少70％同一性的核苷酸序列之中的核苷酸序列。 [0443] 51.II类茄科防卫素用于制造人工产生的防卫素的用途，所述II类茄科防卫素包含与SEQ ID NO：52具有至少约70％相似性的其成熟结构域的C末端区域，所述人工产生的 防卫素包含被修饰的环1B区域并且所述人工产生的防卫素展示抗病原体活性。 [0444] 52.一种基因构建体，其包含方面32的核酸和编码蛋白酶抑制剂的核酸。实施例 [0445] 通过下列非限制性的实施例来进一步描述各个方面。在下文中描述此类实施例中使用的方法。 [0446] 从茄科花纯化防卫素 [0447] 为了从它们的天然来源分离II类防卫素，将不超过花发育的花瓣着色期的整个翼状猪笼草(NaD1、NaD2)或香花烟草(NsD1、NsD2)花研磨成细粉，如先前所描述的(Lay等人 2003，同上)，在稀硫酸中进行提取。简而言之，将花(760g的湿重)在液氮中冷冻，用研杵将 其在研钵中研磨成细粉，然后使用Ultra-Turrax匀浆器于50mM硫酸(3mL/g鲜重)中匀浆5分 钟。在4℃搅拌1小时后，通过Mifacloth(Calbiochem，San Diego，CA)过滤和离心(25, 000xg，15分钟，4℃)除去细胞碎片。随后通过添加10M NaOH将pH调整至7.0，在4℃搅拌提取 物1小时，随后离心(25,000xg，15分钟，4℃)以除去沉淀的蛋白质。将上清液(1.8L)用于利 用10mM磷酸钠缓冲液预平衡的SP Sepharose(Trademark)FastFlow(GE Healthcare Bio- Sciences)柱(2.5x2.5cm)。通过用20倍柱体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗涤而除去未 结合的蛋白质，随后用含有500mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)将结合的蛋白质洗脱 在3x10mL级分中。将来自SP Sepharose柱的级分经历反向高效液相色谱(RP-HPLC)。 [0448] 来自巴斯德毕赤酵母的NaD1纯化 [0449] 巴斯德毕赤酵母表达系统是公知的并且可从nvitrogen (Carlsbad，CA；参见提供商的公开pPI C9表达载体序列的毕赤酵母表达手册(Pichia Expression Manual))商购获 得。 [0450] 将单个pPIC9-NaD1巴斯德毕赤酵母GS115菌落用于接种在100mL培养瓶中的10mL BMG培养基(在Invi trogen毕赤酵母表达手册中描述的)中，在30℃的摇动培养箱(140rpm) 中温育过夜。将培养物用于接种在2L带挡板三角瓶中的500mL BMG，随后将所述三角瓶置于 30℃摇动培养箱(140rpm)中。当OD600达到2.0(～18h)时，通过离心(2,500x g，10分钟)收 获细胞，将其重悬浮于5L带挡板三角瓶中的1L BMM培养基(OD600＝1.0)中，在28℃摇动培 养箱中温育3天。通过离心(4750rpm，20分钟)将表达培养基与细胞分离，利用等体积的20mM 磷酸钾缓冲液(pH6.0)进行稀释。利用NaOH将培养基调整至pH6.0，随后将其施加到用10mM 磷酸钾缓冲液(pH6.0)预平衡的SP Sepharose柱(1cm x1cm，Amersham Biosciences)。随后 用100mL的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)清洗柱子，在10mL包含500mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲 液中洗脱结合的蛋白质。使用在下文中描述的40分钟线性梯度将洗脱的蛋白质经历RP- HPLC。收集蛋白质峰，通过SDS-PAGE分析蛋白质，利用抗-NaD1抗体进行免疫印迹。冷冻干燥 含有NaD1的级分，将其重悬浮于无菌milliQ超纯水中。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定 (Pierce Chemical Co.)(利用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准)测定毕赤酵母表达的 NaD1的蛋白质浓度。 [0451] 反向高效液相色谱 [0452] 使用附加有保护柱的制备性C8柱(22x250mm，Vydac)在偶联至检测器(166型，Beckman)的System Gold HPLC(Beckman)上进行反向高效液相色谱(RP-HPLC)。将蛋白质样 品加载在缓冲液A(0.1％[v/v]三氟乙酸)中，在40分钟内以10mL/分钟的流速利用0-100％ [v/v]缓冲液B(60％[v/v]乙腈，于0.089％[v/v]三氟乙酸中)的线性梯度进行洗脱。通过监 测在215nm的吸光度来检测蛋白质。收集蛋白质峰，通过SDS-PAGE进行分析。 [0453] 将来自NaD1纯化的每一个阶段的样品(30μL)添加至NuPAGE(注册商标)LDS样品上样缓冲液(10μL，Invitrogen)并且加热至70℃，进行10分钟。随后将样品加载至NuPAGE(注 册商标)预制4-12％[w/v]Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上，使用XCell-Surelock 电泳装置(Invitrogen)在200V下电泳分离蛋白质。通过考马斯蓝染色显现蛋白质或将其转 移至硝酸纤维素膜上以利用抗-NaD1抗体进行免疫印迹。 [0454] rNaD1的圆二色谱 [0455] 为了检查从巴斯德毕赤酵母(rNaD1)纯化的NaD1是否正确折叠，记录其远紫外圆二色性(CD)谱，将其与天然NaD1的远紫外圆二色性谱相比较。两个谱的相似性表明rNaD1的 结构相较于天然NaD1未显著改变。 [0456] NaD1的PCR诱变 [0457] 使用Phus ion(注册商标)定点诱变试剂盒(Finnzymes)进行NaD1的定点诱变。设计在5′末端磷酸化的寡核苷酸引物以掺入期望的突变。利用下列温度模式在30个循环的 PCR反应中扩增整个模板质粒(pPIC9-NaD1)：98℃，30s；55℃，20s；72℃，4分钟，和在72℃进行10分钟的终延伸循环。随后使用T4DNA Quick连接酶在室温进行5分钟来环化所述线性 PCR产物，按照制造商的说明书将其转化进入化学感受态TOP10细胞。使用AOX3′引物测定构 建体的序列以确保突变已被正确掺入。 [0458] 电感受态巴斯德毕赤酵母的制备 [0459] 如Chang等人(2005)Mol Biol Cell16(10)：4941-4953所述制备电感受态巴斯德毕赤酵母GS115细胞(Invitrogen)。简而言之，收获在YPD(1％w/v Bacto酵母提取物，2％w/ v Bacto蛋白胨提取物和2％w/v葡萄糖)中生长过夜的细胞，在振荡的条件下在30℃利用含 有10mM DTT，25mM HEPES，pH8的YPD处理所述细胞。在水中洗涤细胞2次，随后在冰冷的1M山 梨醇中洗涤1次，再将它们重悬浮于1M山梨醇，分成80μL的等分于-80℃贮存。 [0460] 利用pPIC9构建体转化巴斯德毕赤酵母GS115 [0461] 将利用每一个pPIC9构建体转化的单个大肠杆菌TOP10菌落用于接种10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB，在摇动培养箱中在37℃温育过夜。使用Qiaprep(注册商标) miniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA，使用限制性内切酶SalI线性化所述质粒，进行过 夜。在冰上解冻感受态巴斯德毕赤酵母GS115细胞(80μL)，将1μg线性化DNA添加在冰冷却的 具有0.2cm空隙的Gene Pulser(注册商标)电穿孔小杯中。在1.5kV，25μF，400Ω(Gene Pulser，Bio-Rad Laboratories)下通过电穿孔引入DNA。将冰冷却的1M山梨醇(1mL)添加至 细胞中，随后将它们涂板在MD板(1.34％w/v酵母氮源，无氮基酸以及具有磷酸铵[US Biological，YNB]，4x10-5％w/v生物素，2％w/v葡萄糖)上，在30℃温育5天。随后选择阳性菌落，再涂板至新鲜MD板上。 [0462] rNaD1的表征 [0463] 图6A至D显示从花分离的rNaD1的免疫印迹、反相HPLC描迹、结构和rNaD1的抗菌丝生长的活性。 [0464] 氨基酸序列比较 [0465] 图3A和3B提供了各种II类茄科防卫素(包括NaD1)的氨基酸序列的图示。图4显示I类和II防卫素。这些比对中的环1B区域包含图3中的氨基酸10至15和图4中的氨基酸9至14。 本公开内容扩展至具有与NaD1的氨基酸32至51(图3)(SEQ ID NO：52)具有至少70％相似性 的C末端20个连续氨基酸残基的防卫素。实例提供于表4中。 [0466] 载体图谱 [0467] 图11显示pHEX138的载体图谱。 [0468] 用于植物内研究的生物测定法： [0469] 禾生刺盘孢(C.graminicola)接种物的制备： [0470] 从玉米(Pioneer Hi-Bred International，Inc.Johnston2Iowa，USA)分离禾生刺盘孢(US分离株Carroll-1A-99)。从在V8琼脂上生长约2-3周的生孢子培养物分离孢子。通 过在无菌水中括擦板表面来收集禾生刺盘孢的孢子，通过面纸(facial tissue)过滤而将 孢子与菌丝质(hyphal matter)分离。使用血球计数器测量滤出液中孢子的浓度。 [0471] 禾谷镰孢接种物的制备： [0472] 从玉米(Pioneer Hi-Bred International.Inc.Johnston，Iowa.USA)分离禾谷镰孢分离物(73B1A)。从在SNP琼脂板上生长约2-3周的生孢子培养物分离孢子。通过在无菌水 中板擦板表面来收集禾谷镰孢的孢子。使用血球计数器测量孢子的浓度。 [0473] 玉蜀黍植物的接种： [0474] 在出瓶后将用于生物测定的植物在温室中生长约9-10周。 [0475] 禾生刺盘孢的接种 [0476] 在玉蜀黍叶鞘的相对侧上产生2个长2.0mm的伤口，随后利用1x106个禾生刺盘孢孢子/mL涂覆伤口。随后用Glad Pressn'Seal封闭伤口3天。接种后10天，利用数字照相术测 量感染的面积。 [0477] 禾谷镰孢接种 [0478] 在玉蜀黍叶鞘的相对侧上产生2个长2.0mm的伤口，随后用浸渍在1x106个禾谷镰孢孢子/mL中的直径6mm的纸盘覆盖伤口。随后用Glad Pressn'Seal封闭伤口3天。接种后10 天，利用数字照相术测量感染的面积。 [0479] ELISA法 [0480] 蛋白质提取：从生长在温室中的植物切取叶鞘。在液氮中冷冻组织(50mg)，将其在混合磨(mixer mill)(Retsch MM300)中以30s-1的频率研磨2次，每次15秒。通过添加450μ L2％的不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％Tween20，涡旋20s来制备蛋白质提取物。将样品 离心10分钟，收集上清液。 [0481] 用100μL/孔的PBS中的一抗(100ng/孔的抗-NaD1，利用标准方法制备针对来自花烟草的花的纯化NaD1的多克隆抗体))温育ELI SA板(Nunc Maxisorp#442404)。在湿盒中在 4℃温育板过夜。随后利用PBS/0.05％v/v Tween20洗涤它们4次，每次2分钟。利用200μL/孔 3％w/v的PBS中的BSA(Sigma A-7030：98％ELISA级)封闭板，在25℃温育2小时。随后用PBS/ 0.05％v/v Tween20洗涤板4次，每次2分钟。 [0482] 随后将玉米鞘的蛋白质提取物(100μL/孔，稀释在PBS/0.05％v/vTween20中)施加到板上，随后将板在25℃温育2小时。随后用PBS/0.05％v/v Tween20洗涤板4次，每次2分 钟，随后施用100μL/孔的PBS中的二抗(75ng/孔生物素标记的NaD1抗体)。使用EZ-link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(Pierce)制备生物素标记抗体；使用2mL的蛋白A纯化的抗 体和2mg生物素试剂。将板在25℃温育1小时，随后用PBS/0.05％v/v Tween20洗涤板4次，每 次2分钟，施用100μL/孔的PBS中的NeutriAvidin HRP-缀合物(Pierce#31001；1∶1000稀释 度；0.1μL/孔)。将板在25℃温育1小时，随后用PBS/0.05％v/vTween20洗涤2次，每次2分钟，随后用H20洗涤2次，每次2分钟。在即将使用时，通过将1个ImmunoPure OPD片剂(Pierce# 34006)溶解在9mL H20中，随后添加1mL稳定的过氧化物缓冲液(10X，Pierce#34062)来制备 底物。以100μL/孔施用底物，将板在25℃温育，直至显色。通过施加50μL2.5M硫酸终止反应。 在板读数器(Molecular Devices)中测量在490nm的吸光度。 [0483] 免疫印迹分析 [0484] 从生长在温室中的植物切取叶鞘。在液氮中冷冻叶鞘组织(50mg)，将其在混合磨(Retsch MM300)中以30s-1的频率研磨2次，每次15秒。通过添加2％w/v不溶性PVPP (Polyclar)/PBS/0.05％v/v Tween20(75μL)和涡旋来提取样品。随后以14,000rpm将样品 离心10分钟，收集上清液。向上清液(21μL)中添加Novex NuPAGE4X LDS样品缓冲液(7.5μL) 和β-巯基乙醇(1.5μL)，在70℃加热10分钟。 [0485] 通过在Novex X Ce11I1mini-cell电泳仪中，在200V下于预制412％w/v聚丙烯酰胺梯度凝胶(Novex，NuPAGE bis-tr i s，MES缓冲液)上进行SDS-PAGE(进行35分钟)来分离 提取的叶鞘蛋白质。将预染色的分子量标记(Novex SeeBlue Plus2)用作标准。使用Novex X Cellmini-cell电泳仪，在具有10％v/v甲醇的NuPAGE转移缓冲液中，在30V下将蛋白质转 移至硝酸纤维素膜(Osmonics0.22微米NitroBind)，进行60分钟。转移后，将膜在异丙醇中 温育1分钟，随后于TBS中洗涤5分钟。 [0486] 将膜在室温于3％w/v BSA封闭1小时，随后在室温用一抗(成熟NaD1或HvCPI6抗体，1mg/ml的原液以1∶1000于TBS/1％w/v BSA中稀释)温育过液。将膜在TBST中洗涤5次，每 次10分钟，随后用缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗-兔IgG(Pierce，TBS中的1∶50,000稀释 物)在RT下温育60分钟。再进行5次10分钟的TBST洗涤，随后按照制造商的说明书，用 SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)温育膜。将膜暴露于ECL Hyperfilm (Amersham)。 [0487] [0488] 实施例1 [0489] I类防卫素的抗真菌活性 [0490] 从它们的天然来源(NaD2)纯化或使用巴斯德毕赤酵母表达系统(γ-玉米硫堇2(γ-zesthionin2)，γ-大麦硫堇(γ-hordothionin))(如方法中所描述的)表达3种I类防 卫素。基本如Broekaert等人(1990)FEMS Microbiol Lett69：55-60，1990中所述评估肽的 抗禾谷镰孢的抗真菌活性，将其与两种II类茄科防卫素(NaD1、NsD1)的所述抗真菌活性相 比较。通过无菌细薄棉布过滤，从生长在半浓度马铃薯右旋糖培养基(PDB)中的生孢子培养 物分离孢子。使用血细胞计数器测定孢子浓度，将其在y2x PDB中调整至5x104个孢子/mL。将 孢子悬浮物(80μL)和20μL过滤灭菌的(0.22甲注射器式滤器；Milli pore)蛋白质或水一起 添加至无菌96孔平底微量滴定板的孔中，达到0-10μM的终蛋白质浓度。短暂地摇动板，将其 在25℃于黑暗中放置28小时(不摇动)。通过使用微量滴定板读数器(SpectraMax Pro M5e； Molecular Devices)在595nm测量光密度来评估菌丝体的生长。以一式三份进行每一个测 试。结果(图7)显示测试的I类防卫素显示低抗真菌活性。 [0491] 实施例2 [0492] II类茄科防卫素上的NaD1环1B区域的修饰 [0493] 本实施例的第一方面是II类茄科防卫素的选择。筛选防卫素以鉴定具有如下C末端部分的防卫素，所述C末端部分包含SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列或在最佳比对后 与其具有至少70％相似性的氨基酸序列(表4)。图3显示比对的类型。SEQ ID NO：50代表末 端20个连续氨基酸，包括C端最末端的不变半胱氨酸残基。NaD1、NsD1、PhD2、NeThio1和 NeThio2是与SEQ ID NO：52具有100％相似性的防卫素的实例。 [0494] NaD1被选择作为II类茄科防卫素的主链。该防卫素包含具有氨基酸序列：NTFPGI(SEQ ID NO：12)的环1B。 [0495] 氨基酸残基NTFPGI的一个或多个被另一种氨基酸残基置换。可改变全部6个残基，或可改变其中的1或2或3或4或5个残基。这包括单个氨基酸置换或环1B交换。产生的改变的 实例包括下列序列(括号内标示其来源一起)： [0496] HRFKGP(NaD2)[SEQ ID NO：29]； [0497] QHHSFP(Zea2)[SEQ ID NO：30]； [0498] DTYRGV(PsD1)[SEQ ID NO：31]； [0499] PTWEGI(PsD2)[SEQ ID NO：32]； [0500] DKYRGP(MsDeF1([SEQ ID NO：33]； [0501] KTFKGI(SoD2)[SEQ ID NO：34]； [0502] KTWSGN(DmAMP1)[SEQ ID NO：35]； [0503] EGWXGK(VrD1)[SEQ ID NO：36]； [0504] GTWSGV(RsAFP2)[SEQ ID NO：37]；和 [0505] AGFKGP(g1-H)[SEQ ID NO：38]。 [0506] 其它实例包括选择选自SEQ ID NO：67至79的氨基酸序列。 [0507] 实施例3 [0508] 在NaD1的环变体存在下对禾谷镰孢生米的抑制 [0509] 在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达重组NaD1和环变体HXP4、HXP34和HXP35，如方法中所述进行纯化。基本上如Broekaert等人(1990)FEMS Microbiol Lett69：55-60中所述 评估这些肽抗禾谷镰孢的抗真菌活性。通过无菌细薄棉布过滤，从生长在半浓度马铃薯右 旋糖培养基(PDB)中的生孢子培养物分离孢子。使用血细胞计数器测定孢子浓度，将其在 y2x PDB中调整至5x104个孢子/mL。将孢子悬浮物(80μL)和20μL过滤灭菌的(0.22甲注射器 式滤器；Millipore)蛋白质或水一起添加至无菌96孔平底微量滴定板的孔中，达到0-10μM 的终蛋白质浓度。短暂地摇动板，将其在25℃于黑暗中放置28小时(不摇动)。通过使用微量 滴定板读数器(SpectraMax Pro M5e；Molecular Devices)在595nm测量光密度来评估菌丝 体的生长。以一式三份进行每一个测试。 [0510] 结果 [0511] 图8举例说明了环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗禾谷镰孢(Fgr)的相对抗真菌活性。在0.825ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1分别抑制禾谷镰孢的生长 41.7、14.6或34.5％。在1.65ppm上，所有3种环变体相较于NaD1更多抑制禾谷镰孢的生长约 70％。 [0512] 实施例4 [0513] 在NaD1的环变体存在下轮枝样镰孢生米的抑制 [0514] 将重组NaD1和环变体HXP4、HXP34和HXP35在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达，如方法中所述进行纯化。如实施例1中所述评估这些肽抗轮枝样镰孢的抗真菌活性。 [0515] 结果 [0516] 图9举例说明环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗轮枝样镰孢(Fve)的相对抗真菌活性。在3.25ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1分别更多抑制轮枝样镰孢的生 长40.9、29.4和5.1％。在6.5ppm下，所有3种环变体相较于NaD1更多抑制轮枝样镰孢的生长 至少67％。 [0517] 实施例5 [0518] 在NaD1的环变体存在下禾生刺盘孢生长的抑制 [0519] 将重组NaD1和环变体HXP4、HXP34和HXP35在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达，如方法中所述进行纯化。如实施例1中所述评估这些肽抗禾生刺盘孢的抗真菌活性。 [0520] 结果 [0521] 图10举例说明环变体HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1的抗禾生刺盘孢(Cgr)的相对抗真菌活性。在13ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相较于NaD1分别更多抑制禾生刺盘孢的生 长61.3、21.8或83.2％。 [0522] 实施例6 [0523] 转基因植物的产生 [0524] 通过根癌土壤杆菌介导的转化来产生表达HXP4的转基因芸苔(欧洲油菜，cv RI64)。用于转化的DNA二元载体(pHEX138)描述于图11。通过电穿孔将二元载体转移进入根 癌土壤杆菌，通过凝胶电泳确认质粒的存在。将土壤杆菌的培养物用于感染芸苔的下胚轴 部分。在25mg/L的抗生素卡那霉素上选择转基因苗。使用ELISA检测从叶提取的可溶性蛋白 质来选择表达HXP4的转基因植物。 [0525] 来自3个转化实验(cAT93、CAT94和CAT96)的7株植物(6个事件)具有可检测水平的HXP4(表5)。HXP4蛋白水平的范围为0.3至2.1ppm(ng HXP4/mg叶组织的鲜重)。 [0526] 表5 [0527]转基因芸苔株系 HXP4水平(ppm) 93.1.2 2.1 93.1.3 2.0 93.15.3 1.9 96.7.2 1.8 96.17.1 0.3 96.72.1 1.9 94.11.1 1.6 [0528] 利用油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)的温室生物测定 [0529] 将病原体油菜茎基溃疡病菌在室温在10％(v/v)V8琼脂板上生长1-2周。通过用无菌水(5mL)覆盖板，随后括擦琼脂的表面以取出孢子来分离器孢子。通过无菌薄纱织品过 滤，将孢子与菌丝质分离。使用血细胞计数器测定滤液中的孢子浓度，用水将终浓度调整至 6 7 1x10至1x10个器孢子/mL。 [0530] 将幼苗于小的种植盆中在温室内于22℃生长。在种植后约10天，用26号针刺伤每一个幼苗的两个子叶2次(2个瓣的每一个中一次)，用一滴孢子(5μL)接种受伤区域。用水接 种对照。将植物在高湿度条件下维持3天以促进孢子萌发。 [0531] 在接种后不超过20天评估疾病症状。使用数字图像的计算机软件分析(ImageJ)以mm2定量伤口大小。使用非参数法统计分析平均伤口大小。 [0532] 实施例7 [0533] 表达HXP4的转基因玉米植物的产生 [0534] 使用标准方案，例如美国专利号5,981,840；美国专利号7,528,293；美国专利号7,589,176；美国专利号7,785,828；Frame等人(2002)Plant Physiology129：13-22中描述的 那些方法，通过土壤杆菌介导的转化或颗粒轰击产生转基因玉米植物。通过电穿孔将二元 载体(包含GAT(作为选择标记)、遍在蛋白启动子(用于组成型表达)和在组成型遍在蛋白启 动子控制下的编码HXP4或NaD1的密码子最优化序列以及编码GAT(作为选择标记)的序列) 转移进入根癌土壤杆菌菌株中。通过将未成熟玉米胚浸没在土壤杆菌的悬浮液中，随后在 固体培养基上共培养一段时间来感染未成熟玉米胚。随后任选地使胚“静息”，在此期间将 它们在至少一种抑制土壤杆菌生长的抗生素存在下进行温育。随后通过在含抑制非转化细 胞生长的草甘膦的固体培养基上培养感染的胚来获得转化的愈伤组织。通过使用标准方 法，转化的愈伤组织随后能够再生成植物。 [0535] 通过例如ELISA筛选测定PCR阳性植物中HXP4和NaD1的表达水平。使用方法中描述的生物测定评估以大于10ppm水平表达HXP4或NaD1的植物中增加的对禾生刺盘孢的抗性。 [0536] 结果 [0537] 当与利用空载体转化的植物相比较时，以大于10ppm水平表达HXP4的植物显示损伤面积有26％的减小。以大于10ppm水平表达NaD1的植物相较于空载体对照未显示损伤面 积的减小(表8)。 [0538] 实施例8 [0539] 表达HXP4的转基因大豆植物的产生 [0540] 通过土壤杆菌介导的转化或通过颗粒轰击或其它标准方案例如美国专利号7,589,176；美国专利号7,528,293；美国专利号7,785,828中描述的那些方案产生表达HXP4的 转基因大豆植物。 [0541] 通过例如ELISA筛选对对于HXP4是PCR阳性的再生大豆植物评估HXP4表达水平。可评估能育转基因植物的基因拷贝数，在温室生物测定中测试选择的品系对于大豆真菌病原 体的抗性。 [0542] 随后在感染的土壤中在田间试验中和在其中用靶真菌、昆虫或锈菌病原体人工感染大豆植物的试验中评估显示对大豆真菌和锈菌及昆虫病原体有增强抗性的品系。 [0543] 实施例9 [0544] 表达HXP4的转基因小麦的产生 [0545] 通过土壤杆菌介导的转化或通过颗粒轰击或其它标准方案例如美国专利号7,785,828中描述的那些方案产生表达HXP4的转基因小麦植物。通过例如ELISA筛选对对于 HXP4是PCR阳性的再生小麦植物评估HXP4表达水平。可评估能育转基因植物的基因拷贝数， 在温室生物测定中测试选择的品系对于小麦真菌病原体的抗性。 [0546] 随后在感染的土壤中在田间试验中和在其中用靶真菌病原体人工感染小麦植物的试验中评估显示对小麦真菌病原体有增强抗性的品系。 [0547] 实施例10 [0548] 抗人真菌病原体黑曲霉的被修饰NaD1的活性 [0549] 在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达重组NaD1和环变体HXP4，如方法中所述进行纯化。如上所述评估所述肽抗黑曲霉的抗真菌活性。 [0550] 结果 [0551] 图12举例说明环变体HXP4相较于NaD1而言抗黑曲霉的相对抗真菌活性。在13ppm，HXP4相较于NaD1抑制黑曲霉的生长高20.6％。这可表达为HXP4高于NaD1的112％。在26ppm 和53ppm，HXP4相较于NaD1抑制生长高至少10％。 [0552] 实施例11 [0553] 抗隐球酵母属的种的被修饰NaD1的活性 [0554] 在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达重组NaD1和环变体HXP4，如方法中所述进行纯化。如上所述，评估肽抗新型隐球酵母的两个菌株和C.gatt i的一个菌株的抗真菌活性。 [0555] 结果 [0556] 图13A举例说明环变体HXP4相较于NaD1而言抗新型隐球酵母(C1065)的相对抗真菌活性。在13ppm，HXP4完全抑制此酵母的生长，然而NaD1仅抑制～16.7％。因此，HXP4的活 性超过NaD1的596％。在6.5ppm，两种蛋白质都未显示显著的活性。图13B举例说明NaD1和 HXP4抗新型隐球酵母的另一菌株(C2067)的相对抗真菌活性。在6.5ppm，HXP4抑制生长超过 80％，然而NaD1仅抑制生长少于4％。在抗C.gatti i方面(图13C)，HXP4在13ppm相较于NaD1 而言抑制生长高10％，在6.5ppm上相较于NaD1而言抑制生长高38％。 [0557] 实施例12 [0558] II类茄科防卫素的环1B区域的修饰，TPP3作为主链 [0559] 将TPP3(SEQ ID NO：5)选择作为II类茄科防卫素主链。该防卫素包含具有氨基酸序列：QTFPGL(SEQ ID NO：15)的环1B。将环1B序列改变成NaD2(HRFKGP)的序列[SEQ ID NO： 29]。在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达此嵌合蛋白质(HXP107)，如方法中所述进行纯化。 如实施例1中所述评估所述肽抗禾谷镰孢的抗真菌活性以及其抗昆虫活性。HXP107的氨基 酸序列示于SEQ ID NO：85。 [0560] 结果： [0561] HXP107蛋白保持了抗禾谷镰孢(Fgr)的抗真菌活性，IC50为0.5μM。该活性有利地与亲代蛋白质TPP3的活性相当，后者的I C50值为0.2μM。 [0562] 实施例13 [0563] II类茄科防卫素NsD1、C20和SL549的环1B区域的修饰 [0564] 将NsD1(SEQ ID NO：49)、C20(从辣椒属分离的)(SEQ ID NO：58)和SL549(从烟草属分离的)(SEQ ID NO：59)选择作为II类茄科防卫素主链。此类防卫素分别包含具有如下 氨基酸序列的环1B：NTFPGI(SEQ ID NO：12)、KYFKGL(SEQ ID NO：60)和NTFPGI(SEQ ID NO： 12)。将环1B中的一个或多个氨基酸残基用另一个氨基酸残基置换。可改变全部6个残基，或 可改变其中1或2或3或4或5个残基。这包括单个氨基酸置换或环1B交换。改变的实例包括下 列序列(括号中列明了其来源)： [0565] HRFKGP(NaD2)[SEQ ID NO：29]； [0566] QHHSFP(Zea2)[SEQ ID NO：30]； [0567] DTYRGV(PsD1)[SEQ ID NO：31]； [0568] PTWEG I(PsD2)[SEQ ID NO：32]； [0569] DKYRGP(MsDeF1([SEQ ID NO：33]； [0570] KTFKGI(SoD2)[SEQ ID NO：34]； [0571] KTWSGN(DmAMP1)[SEQ ID NO：35]； [0572] EGWXGK(VrD1)[SEQ ID NO：36]； [0573] GTWSGV(RsAFP2)[SEQ ID NO：37]；和 [0574] AGFKGP(g1-H)[SEQ ID NO：38]。 [0575] 在另一个实施方案中，环1B被选自SEQ ID NO：67至79的序列所置换。 [0576] 在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达重组环变体，如方法中所述进行纯化。如实施例1中所述评估所述肽抗真菌病原体例如禾谷镰孢，尖镰孢、禾生刺盘孢和轮枝样镰孢的抗 真菌活性。 [0577] 实施例14 [0578] HXP4与蛋白酶抑制剂抗禾谷镰孢和禾生刺盘孢的协同作用 [0579] 从Genscript获得编码大麦I型抑制剂CI-1B(SEQ ID NO：63)、花烟草I型抑制剂NaPin1A、番茄半胱氨酸蛋白酶抑制剂SlCys9(SEQ ID NO：64)、稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Os1a(SEQ ID NO：65)和大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂HvCPI6(SEQ ID NO：66)的成熟结构域 的DNA。使用Sac II和Sac I从载体pUC57切下插入物，使用Perfectprep试剂盒(Eppendorf) 从琼脂糖凝胶提取插入物，将其连接入pHUE，随后将其用于转化TOP10大肠杆菌细胞。分离 质粒DNA，随后用于转化大肠杆菌Rosetta-Gami B细胞。 [0580] 将大肠杆菌Rosetta-Gami B的单个菌落用于接种包含氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四环素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.05mg/mL)的2YT培养基(10mL，16g/L胰 蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaC1)，在摇动的条件下在37℃生长过夜。将该培养物用于 接种包含氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四环素(0.1mg/mL)和卡那霉素 (0.05mg/mL)的2YT培养基(500mL)，随后将其生长4小时至～1.0的光密度(600nm)。随后添 加IPTG(0.5mM的终浓度)，在16℃将培养物再生长16小时。通过离心(4,000g，4℃，进行20分 钟)收获细胞，将其重悬浮于天然裂解缓冲液(20mL/升细胞培养物，50mM NaH2PO4，300mM NaC1，10mM咪唑，pH8.0)，于-80℃下冷冻。随后解冻细胞，在4℃用溶菌酶(5mg/25mL重悬浮 细胞)处理20分钟。随后添加DNA酶I(125uL，2mg/mL，于20％v/v甘油，75mM NaCl中)和MgCl2 (125uL，1M)，在摇摆平台上将样品在室温温育40分钟。随后在冰上超声处理(80％w/v强度， Branson sonifier450)样品2次，每次30秒，随后进行离心(20,000g，4℃，进行30分钟)。随 后按照制造商的说明书，在非变性条件下，使用Ni-NTA树脂(1.5mL至～25mL非变性蛋白质 提取物，Qiagen)，利用固定化金属亲和层析(IMAC)从蛋白质提取物纯化六组氨酸标记的遍 在蛋白-融合蛋白(His6-Ub-NaCys1，2，3)。使用洗脱缓冲液(250mM咪唑，200mM NaCl，50mM NaH2P04，pH8.0)洗脱重组蛋白质。通过将洗脱的蛋白质用于利用50mM Tri s.Cl，100mM NaCl，pH8.0平衡的预装Sephadex G50凝胶过滤柱(PD-10，Amersham)来除去咪唑。 [0581] 使用去泛素化酶6H.Usp2-cc(Catanzariti等人(2004)，Protein Science73：1331-1339)从重组蛋白质切割除去六组氨酸标记的遍在蛋白。去泛素化蛋白酶抑制剂作为 未结合的蛋白，通过另一轮IMAC除去切割的标记。随后这可通过反向HPLC进一步纯化。 [0582] 将重组CI-1B、S1Cys9和Os1a在H2O中制备为原液(20μM)。来自牛胰腺的I-P型胰蛋白酶抑制剂(Anderson和Kingston(1983)，Proc.Natl.Acad.USA80：6838-6842)购自Sigma (T0256)，并且被稀释至20μM(于H2O中)的浓度。 [0583] 基本上如Broekaert等人，(同上)1990所描述的，测量HXP4和NaD1与丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合对禾谷镰孢或禾生刺盘孢(Colletotrichum graminco1a)生长的抑 制作用。从合成的缺乏营养的琼脂(SNPB，禾谷镰孢)或V8琼脂(禾生刺盘孢)上生长的生孢 子培养物分离孢子，使用血细胞计数器进行计数。 [0584] 其中如实施例1中所述在96孔微量滴定架中进行抗真菌测定。用10μL过滤灭菌(0.22μm注射器式滤器，Millipore)的NaD1(2.5μM)、HXP4(2.5μM)或水与10μL过滤灭菌的 (0.22μm注射器式滤器，Mil1ipore)蛋白酶抑制剂或水以及80μL5x104个孢子/mL(于1/2× PDB中)一起加载至孔中。将板在25℃进行温育。使用微量滴定板读数器(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)通过测量在595nm的光密度(A595)来测定真菌生长。以一式四份进 行每一个测试。 [0585] 结果 [0586] 当以相同浓度测试时，HXP4与蛋白酶抑制剂具有比NaD1更强的抗禾谷镰孢的协同作用。HXP4与蛋白酶抑制剂一起也协同抗禾生刺盘孢。协同作用计算示于表6和7，其中Ee是 按照Limpe1的公式(Richer等人Pestic Sci19：309-315)来自累加反应的预期作用(表达为 百分比抑制)，Io是观察到的百分比抑制。利用所有4种蛋白酶抑制剂均获得了协同作用，即 Io值高于Ee值。 [0587] 实施例15 [0588] HXP4和HvCP16抗禾谷镰孢的植物内协同作用 [0589] 使用实施例7中所述的方法产生表达HXP4，HvCPI6或HXP4+HvCPI6的转基因玉米植物，使用方法中描述的生物测定评估其增加的对禾谷镰孢的抗性。 [0590] 图15提供了用于在玉米中表达的HvCPI6构建体，图16提供了用于在玉米中表达的HXP4+HvCP16构建体。 [0591] 结果 [0592] 仅表达HXP4或仅表达HvCPI6的植物相较于用空载体转化的植物而言未显示伤口面积的减小。表达HXP4+HvCPI6的植物相较于空载体对照而言显示伤口面积减小45％(表 9)。 [0593] 实施例16 [0594] HXP4对亚洲大豆锈菌的作用 [0595] 从花烟草的花分离NaD1，在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达环变体HXP4，如方法中所述进行纯化。测试HXP4对亚洲大豆锈菌(豆薯层锈菌)的作用，将其与NaD1相比较。在 100、10、1和0.1ppm(于水中)的肽存在或不存在的情况下，将豆薯层锈菌夏孢子在置于琼脂 滴上的赛璐玢上生长。在第24小时和48小时，使用显微镜评估萌发、附着胞形成和附着胞后 结构的形成。每个处理检查3张膜，每张膜评估50个分离的幼体。 [0596] 结果 [0597] 检查对萌发(24小时；图14A)、附着胞形成(24小时；图14B)和附着胞后结构形成(48小时；图14C)的效果。在10ppm，HXP4抑制萌发的水平比NaD1更有效62％，然而附着胞形 成和附着胞后结构形成的抑制相较于NaD1而言更有效65％和59％。 [0598] 实施例17 [0599] 鉴定新型环1B序列的高通量筛选 [0600] 使用Phusion(注册商标)定点诱变试剂盒(Finnzymes)进行NaD1的定点诱变。设计在5′末端磷酸化的简并寡核苷酸引物以将6个随机氨基酸突变掺入环1B。 [0601] 将pHUE系统用于环1B变体文库的表达。根据实施例14中描述的方法略微改进表达和纯化，以使得能够在48孔板中表达和在96孔滤板中纯化。在35个循环(利用66℃的退火温 度，进行30秒)的PCR反应中扩增完整模板质粒(pHUE-NaD1)。随后使用T4DNA连接酶在16℃ 环化所述线性PCR产物，进行过夜，随后按照制造商的说明书将其转化进入电感受态 Rosetta-Gami B(DE3)细胞。将恢复的细胞涂板在含有氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素 (0.34mg/mL)、四环素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)的2YT琼脂上，在37℃温育过夜。 [0602] 将单个菌落接种在96孔板中的150μL含有氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四环素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)的2YT。将利用pHUE-NaD1转化的 Rosetta-Gami B(DE3)用作阳性对照。在持续摇动的条件下，将板在37℃、70％湿度下温育 过夜。将每孔50微升转移至2.5mL的2YT抗生素中，如实施例13中所述进行表达和纯化。 [0603] 测试蛋白质抗禾生刺盘孢的活性。将15微升的蛋白质溶液添加至105μL的孢子溶4 液以产生2x10个孢子/mL(于y2x马铃薯右旋糖液体培养基(包含0.5mM CaC12，25mM KC1) 中)的终浓度。将板在25℃温育，40小时后，通过使用微量滴定板读数器(SpectraMax Pro M5e；Molecular Devices)测量在595nm的光密度来测定真菌生长。通过测定用于表达的细 菌菌落的质粒DNA的序列来鉴定抑制真菌生长的水平等于或大于NaD1对照的蛋白质。发现 在筛选中鉴定的单个菌落具有与NaD1的环1B序列相同的环1B序列。选择几个菌落用于大规 模纯化和测试。如实施例14中所述表达蛋白质，如实施例1中所述测试其抗禾谷镰孢和禾生 刺盘孢的活性。环1B的序列标识符列于表10中。 [0604] 表6 [0605] HXP4相比NaD1而言与蛋白酶抑制剂组合抗Fgr的协同作用 [0606] [0607] 表7 [0608] HXP4与蛋白酶抑制剂组合抗Cgr的协同作用 [0609] [0610] 表8 [0611] 表达HXP4或NaD1的转基因玉米植物抗Cgr的保护作用 [0612] [0613] 表9 [0614] 表达HXP4与HvCPI6组合的转基因玉米植物抗Fgr的保护作用 [0615] [0616] 表10 [0617] 来自抑制禾生刺盘孢的生长的蛋白质的环1B序列 [0618] [0619] 本领域技术人员将理解，除文中明确指明的以外，本文中描述的公开内容可以变化和改动。应理解，本公开内容包括所有此类变化和改动。本公开内容还单个地或一起地包 括本说明书中提及或引述的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及此类步骤或特征的任意 两个或更多个的任何和所有组合。 [0620] 参考书目 [0621] 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