在植物中生产蛋白质 |
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| 申请号 | CN201480041937.1 | 申请日 | 2014-06-13 | 公开(公告)号 | CN105452470A | 公开(公告)日 | 2016-03-30 |
| 申请人 | 杰.尔.辛普洛公司; | 发明人 | 理查德·C·皮特; C·罗门思; 罗伯特·克雷蒂安; 严华; 小隅旭子; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及以安全可控的方式在植株中生产异源肽和异源 蛋白质 的方法和构建体。本发明一方面提供了用下述表达盒转化 马 铃薯植株，使马铃薯植株产生异源蛋白质的方法，这种表达盒包含：编码所关注蛋白质或肽的基因，标记基因，能够抑制马铃薯 块 茎特异蛋白(patatin)表达的核苷酸序列，以及能够抑制CD4B表达的核苷酸序列，和/或能够过表达P19的核苷酸序列。本发明另一方面提供了用下述表达盒转化马铃薯植株，使马铃薯植株产生异源蛋白质的方法，这种表达盒包含：编码所关注蛋白质或肽的基因，标记基因，转运肽序列，和能够抑制ADP 葡萄糖 焦磷 酸化 酶表达的核苷酸序列。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种在转化的马铃薯植株中生产异源蛋白质的方法，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 在植物中生产蛋白质[0002] 本专利申请要求提交于2013年6月14日的美国临时专利申请61/835,274的优先权，该专利申请全文以引用方式并入本文。 技术领域背景技术[0004] 到目前为止，来源于有机小分子的药物，例如抗生素、镇痛剂和激素，主要通过合成或在微生物中生产。然而，随着基因组学和蛋白质组学的发展，新型药物疗法开始涉及较大的蛋白质分子。由于蛋白质在细胞生物学和发育中起到关键作用，所以许多蛋白质具有治疗潜力。 [0005] 虽然可通过合成生产约30个氨基酸的短肽链，但较大的蛋白质最好由活细胞生产。目前，人们使用无菌微生物和哺乳动物细胞培养物生产各种大型蛋白质。然而，由于细胞培养体系价格昂贵且维护困难，所以基于植物的表达体系可提供更低的生产成本及更易 于管理的大规模生产。 发明内容[0006] 本发明的目的是提供在马铃薯植株中生产所关注异源肽或蛋白质的方法。本发明的一个方面提供了一种在转化的马铃薯植株中生产异源蛋白质的方法，该方法包括以下步 骤：(a)使用表达盒转化植株，所述表达盒包含(i)能够抑制马铃薯块茎特异蛋白(patatin)表达的核苷酸序列，(ii)能够抑制CD4B表达的核苷酸序列，(iii)标记基因和(iv)编码所关注蛋白质或肽的基因；(b)在限定的条件下培养转化的植株；以及(c)提取关注的蛋白质。本发明还提供了一种方法，其中能够抑制马铃薯块茎特异蛋白表达的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:3和SEQ ID:4示出的马铃薯块茎特异蛋白反义序列和正义序列。本发明还提供了另 一种方法，其中能够抑制CD4B表达的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6示出的 CD4B反义序列和正义序列。该方法还可包括选自以下基因的标记基因：GFP、EGFP、GUS、LUX、CAH、SPT、NPTII、HPT、APHIV、BAR、PAT、CHS、AHAS和类黄酮合成基因。 [0007] 本发明还提供了一种方法，其中所关注蛋白选自：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR疫苗、MMRV疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗、黄热病疫苗、细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬病疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗(corona vaccine)、蛔虫/钩虫疫苗、驱虫药疫苗、RNFN疫苗和艾滋病疫苗。 [0008] 本发明的另一个方面是一种在转化的马铃薯植株中生产异源蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用表达盒转化植株，所述表达盒包含(i)能够抑制马铃薯块茎特异 蛋白表达的核苷酸序列，(ii)能够过表达P19的核苷酸序列，(iii)标记基因和(iv)编码所 关注蛋白质或肽的基因；(b)在限定的条件下培养转化的植株；以及(c)提取关注的蛋白质。 本发明还提供了一种方法，其中能够抑制马铃薯块茎特异蛋白表达的核苷酸序列包括用 SEQ ID NO:3和SEQ ID:4示出的马铃薯块茎特异蛋白反义序列和正义序列。本发明还提供 了另一种方法，其中能够过表达P19的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:2示出的P19序列。该方法还可包括选自以下基因的标记基因：GFP、EGFP、GUS、LUX、CAH、SPT、NPTII、HPT、APHIV、BAR、PAT、CHS、AHAS和类黄酮合成基因。 [0009] 本发明还提供了一种方法，其中所关注蛋白选自：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR疫苗、MMRV疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗、黄热病疫苗、细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬病疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗、蛔虫/钩虫疫苗、驱虫药疫苗、RNFN疫苗和艾滋病疫苗。 [0010] 本发明的另一个方面是一种在转化的马铃薯植株中生产异源蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用表达盒转化植株，所述表达盒包含(i)能够抑制马铃薯块茎特异 蛋白表达的核苷酸序列，(ii)能够抑制CD4B表达的核苷酸序列，(iii)能够过表达P19的核 苷酸序列，(iv)标记基因和(v)编码所关注蛋白质或肽的基因；(b)在限定的条件下培养转 化的植株；以及(c)提取关注的蛋白质。本发明还提供了一种方法，其中能够抑制马铃薯块茎特异蛋白表达的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:3和SEQ ID:4示出的马铃薯块茎特异蛋白 反义序列和正义序列。本发明还提供了一种方法，其中能够抑制CD4B表达的核苷酸序列包 括用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6示出的CD4B反义序列和正义序列。本发明还提供了另一种 方法，其中能够过表达P19的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:2示出的P19序列。该方法还可包括选自以下基因的标记基因：GFP、EGFP、GUS、LUX、CAH、SPT、NPTII、HPT、APHIV、BAR、PAT、CHS、AHAS和类黄酮合成基因。 [0011] 本发明还提供了一种方法，其中所关注蛋白选自：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR疫苗、MMRV疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗、黄热病疫苗、细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬病疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗、蛔虫/钩虫疫苗、驱虫药疫苗、RNFN疫苗和艾滋病疫苗。 [0012] 在另外的实施例中，本发明提供了一种在转化的马铃薯植株中生产异源蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使用表达盒转化植株，所述表达盒包含(i)能够抑制ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)表达的核苷酸序列，(ii)转运肽，(iii)标记基因和(iv)编码所关 注蛋白质或肽的基因；(b)在限定的条件下培养转化的植株；以及(c)提取关注的蛋白质。 [0013] 在一个优选的实施例中，能够抑制AGP表达的核苷酸序列包括用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11示出的AGP反义或正义序列。优选地，抑制AGP表达由会聚启动子驱动。在本发明的一个优选的方面，会聚启动子是颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)启动子和AGP启动子。 [0014] 本发明还提供了一种方法，其中转运肽是用SEQ ID NO:8示出的GBSS转运肽，或用SEQ ID NO:9示出的二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)转运肽。本发明的方法还可包括选自以 下基因的标记基因：GFP、EGFP、GUS、LUX、CAH、SPT、NPTII、HPT、APHIV、BAR、PAT、CHS、AHAS和类黄酮合成基因。 [0015] 优选地，所关注蛋白选自：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR疫苗、MMRV疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗、黄热病疫苗、细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬病疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗、蛔虫/钩虫疫苗、驱虫药疫苗、RNFN疫苗和艾滋病疫苗。 [0016] 上述一般说明和详细说明均为示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明的进一步解释，其中本发明如权利要求所述。对于本发明的详细理解，通过下述具体实施方式并结合附图给出参考。通过以下本发明的详细说明，其他目的、优点和创新性特征对于本领域的技术人员是显而易见的。 附图说明[0017] 图1：含有GUS基因和GUS基因沉默构建体pSIM789的植株的组织化学染色的烟叶圆片(leaf punch)。框出的叶样品描绘了染色的GUS阳性对照(顶部)和野生型(底部)植株。 [0018] 图2：示出了马铃薯中儿茶酚的分析结果。与未转化的对照组(顶部前四个样品)的块茎相比，含有设计用于沉默多酚氧化酶-5(PPO5)基因的沉默构建体的转基因品系F10的 块茎显示出降低的多酚氧化酶-5活性。 [0019] 图3：来自未转化的马铃薯(左)和过表达绿原酸诱导物(CAI)基因的马铃薯(右)的块茎，后者的过表达使得绿原酸、花青素和类黄酮的合成增至四倍。 [0020] 图4：PPO5基因沉默的RNA印迹分析。从温室生长的PPO5基因沉默的转基因植株和对照组的块茎组织中分离总RNA(20μg)，并与PPO5探针(上图)和内部基准18S rRNA探针(中图)进行杂交。转录物的预测大小为1.95-kb(参见Genbank登录号U22921)。下图示出了如通过溴化乙锭(EB)可视化的总RNA的量。EC、FC、JC、GC和HC是来自未转化的常规品种中的对照样品。在每个泳道上方标记各个转基因事件样品。数据表明，黑斑碰伤耐受性与PPO5基因的有效沉默有关(参见例如，Rommens,C.M.,Ye,J.,Richael,C.,Swords,K.,2006,J Agric Food Chem 54:9882-9887(Rommens,C.M.、Ye,J.、Richael,C.、Swords,K.，2006年，《农业化学与食品化学杂志》，第54卷，第9882-9887页))。 [0021] 图5：VTC2基因在转基因马铃薯中表达的RNA印迹分析。从温室生长的转基因事件和对照组(C1-C8)的块茎组织中分离总RNA(20μg)，并与VTC2探针(上图)进行杂交。下图示出了如通过溴化乙锭(EB)可视化的总RNA的量。 [0022] 图6：GFP基因在马铃薯茎外植体中的表达。使用绿荧光蛋白(GFP)基因转化马铃薯植株。当使用强组成型启动子进行过表达时，可在转基因马铃薯植株中观察到高水平GFP表达。 [0023] 图7：与未转化的马铃薯花、叶和茎相比，GUS基因在转基因马铃薯花、叶、茎中高水平表达。 [0024] 图8：用于将所关注基因(例如GFP)转位到支持最优基因表达的位点的共转化构建体。 [0025] 图9：对照载体pSIM1903的图谱。 [0026] 图10：T-DNA边界内含有2x 35S启动子驱动的P19R43(SEQ ID NO:2)P19突变体的载体pSIM1927图谱。 [0027] 图11：所选pSIM1927品系的GFP定量。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成33种过表达P19R43的品系。所有品系均在温室中生长 正常而无明显多向性效应。以空载体品系(pSIM1361)和亲本品系(pSIM1903)为对照，目视 筛选出累积了块茎特异性GFP的转基因品系。选出12个显示高GFP表达的品系进行GFP定量。 与空载体品系中的量相比，在12个转基因品系的10个中检测到GFP的量增加了20％至60％。 [0028] 图12：所选pSIM1927品系的蛋白质印迹分析。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成33种过表达P19R43的品系。所有品系均在温室 中生长正常而无明显多向性效应。以空载体品系(pSIM1361)和亲本品系(pSIM1903)为对 照，目视筛选出累积了块茎特异性GFP的转基因品系。选出12个显示高GFP表达的品系进行 蛋白质印迹分析。与空载体品系中的量相比，在12个转基因品系的10个中检测到GFP的量增加了20％至60％。 [0029] 图13：所选pSIM1927品系的RNA印迹分析。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成33种过表达P19R43的品系。所有品系均在温室中 生长正常而无明显多向性效应。以空载体品系(pSIM1361)和亲本品系(pSIM1903)为对照， 目视筛选出累积了块茎特异性GFP的转基因品系。为了确认P19基因的表达，使用P19探针分析了来自显示高GFP表达的七个品系的RNA。在三个品系中检测到了P19转录物，这三个品系包括GFP表达水平最高的两个品系。这些结果将RNA沉默的突变p19抑制子的表达与GFP蛋白 质表达升高相关联，表明RNA沉默的抑制子P19的抑制提高了植株中的蛋白质产量。 [0030] 图14：含有马铃薯块茎特异蛋白基因沉默表达盒的载体pSIM1934的图谱。 [0031] 图15：pSIM1934品系的GFP定量。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成30种pSIM1934转基因品系。标有1361的泳道表示空载体对 照，而标有1903的泳道是GFP亲本对照。在所有pSIM1934实验品系中均未观察到GFP积累。 [0032] 图16：所选pSIM1934品系的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成30种pSIM1934转基因品系。标有 1903的泳道是GFP亲本对照，而标有1361+1903的泳道表示空载体对照和GFP亲本对照的组 合。在10个品系中，大多数马铃薯块茎特异蛋白(大约40kDa谱带)因沉默而被消除。 [0033] 图17：含有CD4B沉默表达盒的载体pSIM1939的图谱。 [0034] 图18：所选pSIM1939品系的GFP定量。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成26种pSIM1939转基因品系。标有1361的泳道表示空载 体对照，而标有1903的泳道是GFP亲本对照。与亲本品系(pSIM1903)相比，七种转基因品系显示GFP积累增至2到3倍。 [0035] 图19：所选pSIM1939品系的RNA印迹分析。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成26种pSIM1939转基因品系。标有1361的泳道表示 空载体对照，而标有1903的泳道是GFP亲本对照。与亲本品系(pSIM1903)相比，显示GFP积累增至2到3倍的七种转基因品系的RNA印迹分析在所有品系中均未检测到CD4B转录物，因此 确认了CD4B基因的沉默。这些结果将CD4B蛋白酶的沉默与重组蛋白(GFP)产量增至2到3倍 关联起来，表明CD4B的块茎特异性沉默可用于提高重组蛋白产量。 [0036] 图20：pSIM1949-2x35S::EGFP基因对照载体的图谱。 [0037] 图21：载体pSIM1947的图谱。pSIM1947携带2x35S:GBSSTP-eGFP表达盒与GBSS->sAGP<-AGP表达盒。GFP表达由GBSS转运肽驱动，而AGP沉默由GBSS启动子从一个方向、AGP启动子从相反方向驱动。 [0038] 图22：载体pSIM1948的图谱。pSIM1948携带2x35S:RbcsTP-eGFP表达盒与GBSS->sAGP<-AGP表达盒。GFP表达由二磷酸核酮糖羧化酶转运肽驱动，而AGP沉默由GBSS启动子从一个方向、AGP启动子从相反方向驱动。 [0039] 图23：GFP在马铃薯幼叶中的表达。使用pSIM1947(图21)或pSIM1948(图22)转化马铃薯植株。使用荧光显微镜选择体外生长的强表达GFP的转基因苗，并通过与使用对照载体pSIM1949(图20)转化的对照品系相比评估GFP表达。左图示出了白光下的叶，右图示出了使用GFP滤光器的叶。在转基因pSIM1947小植株的叶中检测到强GFP表达。pSIM1948小植株中 的GFP表达仅略强于对照品系中的GFP表达。这些结果表明，同时进行的由GBSS转运肽驱动 的蛋白质过表达和由会聚启动子驱动的AGP沉默能够有效提高重组蛋白产量。 [0041] 图25：含有ER-IL-2表达盒并在起始密码子前具有BamHI-NcoI限制位点且在终止密码子后具有SpeI位点的DNA2.0载体。 [0042] 图26：含有带组氨酸标签的人IL-表达盒的载体pSIM1936的图谱。 [0043] 图27：使用含靶向ER、经密码子优化的IL-2变体的pSIM1936载体转化的Bintje马铃薯品系的块茎中IL-2的产量。1936-18泳道表示未优化的阳性对照。对于每个变体，构建了25个独立的转基因品系。每种颜色代表用于转化的经密码子优化的IL-2变体。每个条代 表来自同一个独立转基因品系的三个单独块茎的平均IL-2水平。结果表明，在由两个经密 码子优化的变体获得的特异性转基因品系中，IL-2产量增至2到3倍。 [0044] 图28：使用含靶向ER、经密码子优化的IL-2变体的pSIM1936载体转化的Bintje马铃薯品系的块茎中IL-2的产量。1936-18泳道表示未优化的阳性对照。对于每个变体，构建了25个独立的转基因品系。每种颜色分组代表用于转化的经密码子优化的IL-2变体。每个 条代表来自同一个独立转基因品系的三个单独块茎的平均IL-2水平。结果表明，在由不同 密码子变体获得的特异性转基因品系中，IL-2产量增加了2.5倍。 [0045] 图29示出了不同种沉默、过表达和靶向策略对异源蛋白质产量(由GFP表达水平衡量)的影响。除针对CD4B沉默分析了10个品系之外，针对每种策略分析了25个品系。每个条代表用于进行GFP表达分析的三个单独块茎。每种颜色对应于不同种沉默、过表达或靶向策略，具体如下：红色条：沉默CD4B。橙色条：沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白。黄色条：沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白并过表达P19。绿色条：使用GBSS启动子和会聚AGP启动子沉默 AGP；用颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)转运肽将GFP表达靶向质体。蓝色条：使用GBSS启动子和会聚AGP启动子沉默AGP；用二磷酸核酮糖羧化酶转运肽将GFP表达靶向叶绿体。灰色条：使用GBSS启动子和会聚AGP启动子沉默AGP。橄榄绿色条：携带2x35S::EGFP表达盒的亲本品系(pSIM1903)对照。紫色条：携带2x35S::EGFP表达盒的对照品系(pSIM1949)。沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白(红色、黄色和橙色条)、或只沉默CD4B相比GFP对照，只略微提高了蛋白质水平。使用GBSS启动子和会聚AGP启动子沉默AGP，并利用颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)转 运肽驱动GFP表达(绿色条)，使蛋白质水平显著增加，增至4到6倍。沉默ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)，同时用二磷酸核酮糖羧化酶(Rbcs)靶向肽驱动GFP表达(蓝色条)，只导致一个品 系中的蛋白质显著增加。沉默ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)(灰色条)导致蛋白质表达显著增 加，在一些品系中增至3倍。 [0048] SEQ ID NO:1示出了来自马铃薯的马铃薯块茎特异蛋白的序列。 [0049] SEQ ID NO:2示出了P19突变体P19R43的序列。 [0050] SEQ ID NO:3示出了马铃薯块茎特异蛋白PATB1的反义序列。 [0051] SEQ ID NO:4示出了马铃薯块茎特异蛋白PATB1的正义序列。 [0052] SEQ ID NO:5示出了CD4B的反义序列。 [0053] SEQ ID NO:6示出了CD4B的正义序列。 [0054] SEQ ID NO:7示出了EGFP的序列。 [0055] SEQ ID NO:8示出了GBSS转运肽的序列。 [0056] SEQ ID NO:9示出了二磷酸核酮糖羧化酶转运肽的序列。 [0057] SEQ ID NO:10示出了ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)的反义序列。 [0058] SEQ ID NO:11示出了ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)的正义序列。 具体实施方式[0059] 在具体实施方式和随后的实例中，使用了许多术语。为了对说明书和权利要求书(包括这些术语的指定范围)有清楚、一致的理解，提供以下定义。如果未提供定义，则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。 [0060] 编码。如本文所用，“编码”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程，通过该过程细胞可将一系列氨基酸组装成特定的氨基酸序列，以产生有活性的酶。由于遗传密码的简并性，DNA序列中某些碱基的变化并不会改变蛋白质的氨基酸序列。因此，可以设想对DNA序列进行基本不会影响蛋白质功能特性的修饰。 [0061] 表达。表示由基因编码的蛋白质产物的产生。 [0062] 过表达。是指转基因生物体中产生的基因产物超出正常或非转基因生物体内产生的基因产物水平。 [0063] 序列同一性百分比。是指在比较窗口内比较两个最佳比对的序列所测得的值；为了对两个序列进行最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列部分相对参考序列(不含添加或 缺失)而言，可包含添加或缺失(即空位)。百分比的计算方式如下：测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，得到匹配位置数；将该匹配位置数除以比较窗口 内的总位置数；再将结果乘以100，得到序列同一性百分比。 [0064] 植物。如本文所用，表示可进行遗传学操作的任何含有纤维素的植物材料，包括但不限于分化或未分化的植物细胞、原生质体、完整植株、植物组织、或植物器官、或植物的任何部分，例如叶、茎、根、芽、块茎、果实、根茎等。 [0065] 控制表达。如本文所用，“控制表达”表示控制编码蛋白质的基因的表达。其影响是，与通常在野生型生物体中观察的其表达水平相比，序列的表达水平增加或减少。 [0066] 调控。如本文所用，“调控”涵盖了控制编码蛋白质的基因的表达。其影响是，与通常在野生型生物体中观察的其表达水平相比，序列的表达水平增加或减少。 [0067] 表达盒。如本文所用，“表达盒”是指多核苷酸序列的组合，包含一个或多个调控元件和一个或多个编码序列。例如，调控元件可为启动子。 [0068] 基因表达的正义抑制。如本文所用，“基因表达的正义抑制”是指使用多核苷酸降低或消除靶基因的表达。该多核苷酸被设计用于表达与“正义”取向的靶信使RNA的至少一部分相对应的RNA分子。该多核苷酸可对应于靶基因的编码序列的全部或一部分、靶基因的5'和/或3'非翻译区的全部或一部分，或者靶基因的编码序列和非翻译区的全部或一部分。 通常，正义抑制元件与靶基因具有实质的序列同一性。例如，它们可具有大于约65％的序列同一性、大于约85％的序列同一性，或者约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％的序列同一性。用于正义抑制的多核苷酸可以是任何长度，只要其允许抑制靶 序列。例如，该多核苷酸可含有15、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、 700、900个核苷酸或更长核苷酸。参见Hamilton et al.Curr Top Microbiol Immunol.197:77-89(1995)(Hamilton等人《，微生物学与免疫学的当前课题》，第197卷，第 77-89页，1995年)和美国专利No.5,283,184。 [0069] 基因表达的反义抑制。如本文所用，“基因表达的反义抑制”是指使用多核苷酸降低或消除靶基因的表达。该多核苷酸被设计用于表达与靶信使RNA的全部或一部分互补的RNA分子。该多核苷酸可对应于编码靶基因的序列的互补序列的全部或一部分、靶基因的5'和/或3'非翻译区的互补序列的全部或一部分，或者靶基因的编码序列和非翻译区的互补 序列的全部或一部分。另外，反义抑制元件与靶基因可完全互补(即与靶序列的互补序列 100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。例如，该多核苷酸与靶基因可具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补性。反义抑制可用于抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见例如，美国专利No.5,942, 657。此外，用于反义抑制的多核苷酸可与靶基因的一部分互补。一般来讲，可使用具有至少 25、50、100、200、300、400、450或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中内源性基因表达的方法如Liu et al.Plant Physiol.129:1732-1743(2002)(Liu等人，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页，2002年)和美国专利No.5,759,829和No.5,942,657中所述。 [0070] 基因表达的RNA抑制。如本文所用，“基因表达的RNA抑制”是指使用单链或双链RNA降低或消除靶基因的表达。将该单链或双链RNA设计为与靶信使RNA的全部或一部分互补。该多核苷酸可对应于编码靶基因的序列的互补序列的全部或一部分、靶基因的5'和/或3' 非翻译区的互补序列的全部或一部分，或者靶基因的编码序列和非翻译区的互补序列的全 部或一部分。该单链或双链RNA可通过影响靶RNA转录物的水平或者通过影响翻译并进而影 响所编码多肽的水平来降低或消除靶序列的表达水平。参见例如，美国专利No.7,713,735； Verdel et al.(2004)Science 303:672-676(Verdel等人，2004年，《科学》，第303卷，第 672-676页)；Pal-Bhadra et al.(2004)Science 303:669-672(Pal-Bhadra等人，2004年，《科学》，第303卷，第669-672页)；Allshire(2002)Science 297:1818-1819(Allshire，2002年，《科学》，第297卷，第1818-1819页)；Volpe et al.(2002)Science 297:1833-1837 (Volpe等人，2002年，《科学》，第297卷，第1833-1837页)；Jenuwein(2002)Science 297: 2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》，第297卷，第2215-2218页)；Hall et al.(2002)Science 297:2232-2237(Hall等人，2002年，《科学》，第297卷，第2232-2237页)。 [0071] 序列同一性。也称为“同一性”，在述及两个核酸序列或多肽序列时，是指当在指定区中比对最大相关性时两个序列中相同的残基。在结合蛋白质使用序列同一性百分比时，应认识到，不同残基位置的区别通常是保守氨基酸取代不同，其中氨基酸残基被其他具有 类似化学特性(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。在 序列因保守取代不同而不同的情况下，可上调序列同一性百分比，以便校正所述取代的保 守性。我们将因此类保守取代不同而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。执行这种调整的方法是本领域普通技术人员熟知的。该方法通常涉及：将保守取代评定为部分 错配，而不是完全错配，从而增大序列同一性百分比。因此，例如，在将相同的氨基酸评分为 1且将非保守取代评分为0的情况下，保守取代的评分介于0和1之间。保守取代的评分(例 如)根据Meyers and Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988)(Meyers和 Miller《，计算机应用生物科学》，第4卷，第11至17页，1988年)中的算法计算得到，该算法例如可用PC/GENE程序(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics, Mountain View,Calif.,USA))实施。 [0073] 所关注蛋白质。蛋白质通常是指较大的多肽，通常含有多于50个氨基酸。如本文所用，蛋白质涵盖任何所关注蛋白质。示例性和非限制性蛋白质包括水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、抗体以及人类和动物疫苗(包括减毒病毒疫苗、外壳蛋白疫苗和癌症疫苗)。 [0074] 转基因植物。是指掺入核酸序列的植物，所述核酸序列包括但不限于通常不存在于宿主植物基因组中的基因、非正常转录到RNA中或翻译到蛋白质中(“表达”)的DNA序列、或者希望引入到未转化的植物中的任何其他基因或DNA序列，例如通常可存在于未转化的 植物中，但人们想要对其进行遗传工程改造或改变其表达的基因。“转基因植物”类别包括原代转化体和例如通过标准基因渗入或其他育种程序而将转化体纳入其谱系中的植物。 [0075] 视觉表型。“视觉表型”是指植物具有可视觉检测的特性(例如颜色变化)，其可通过在植物中表达选择性标记基因获得。示例性的选择性标记包括查尔酮合酶(CHS)基因、花青素合成基因、乙酰羟酸合酶(AHAS)基因和类黄酮合成基因。 [0076] 块茎。增厚的、通常在地下的食物储存器官，缺乏球茎和鳞茎具有的基片和被膜状包覆。根和苗生长自块茎表面的生长芽，称为“芽眼”。马铃薯块茎产自马铃薯、落果薯(S.demissum)、无茎薯(S.acaule)、匍枝薯(S.stoloniferum)、二倍体栽培种富利亚薯 (S.phureja)、角萼薯种(S.gonicalyx)、窄刀薯(S.stenotomum)、腺毛薯(S.berthaultii)、S.brevicaule、S.bukasovii、S.canasense、S.gourlayi、薄叶薯(S.leptophyes)、 S.multidissectum、S.oplocense、稀毛薯(S.sparsipilum)、S.spegazzinii、S.sucrense、S.venturii、芽叶薯(S.vernei)。 [0077] 在一个实施例中，所关注肽和所关注蛋白质产自四倍体马铃薯植株(例如，马铃薯)，该四倍体马铃薯植株的叶片较大、块茎所含生物质较多，而且生长速度比二倍体马铃薯植株快。在另一个实施例中，所关注肽和所关注蛋白质产自块茎个头小、形状怪异且有色的二倍体(2n)马铃薯植株。例子包括马铃薯二倍体野生种(Solanum chacoense)登录号 414153、458312、458314、472819、498298以及南美马铃薯种(Solanum microdontum)登录号 500033、500035、500036、500038和558100，两者不可混淆，因为来自四倍体(4n)驯化的马铃薯(Solanum tuberosum)的更大、更均匀的块茎用于商业种植，供人食用。 [0078] 相似地，本申请人设计了在植物中以可控方式产生蛋白质的方法，该方法包括抑制至少一种内源性植物蛋白，例如马铃薯块茎贮藏蛋白，同时过表达所关注肽或所关注蛋 白质。例如，在不以任何方式限制的前提下，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于抑制马铃薯块茎特异蛋白基因的表达同时过表达所关注肽或所关注蛋白质。在另一个实施例 中，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于抑制AGP的表达同时过表达所关注肽或所关注蛋白质。为了防止人类误食此类植物，并方便选择包含所关注蛋白质的转基因植物，表达盒可包含赋予其独特颜色或其他独特属性的选择性标记基因，技术人员可根据这种独特的 颜色或属性进行选择。另外，可使用诱导型启动子进一步调节蛋白质产量。 [0079] 选择性标记基因包括但不限于：GFP、EGFP、GUS、LUX、CAH、SPT、NPTII、HPT、APHIV、BAR、PAT、CHS、AHAS和类黄酮合成基因。 [0080] 在另一种用于控制植物中蛋白质表达的方式中，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于抑制蛋白酶基因的表达同时过表达所关注肽或所关注蛋白质。例如，在不以任 何方式限制的前提下，可使用表达盒，由此抑制蛋白酶，从而产生所关注肽或所关注蛋白 质。 [0081] 相似地，在用于在植物中以可控方式产生蛋白质的另一种方法中，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于除了抑制蛋白酶外还抑制至少一种内源性植物蛋白例如马铃 薯块茎贮藏蛋白，同时过表达治疗性蛋白质。例如，在不以任何方式限制的前提下，可使用表达盒，由此除了抑制蛋白酶如CD4B外，还抑制马铃薯块茎特异蛋白基因的表达，同时过表达所关注肽或所关注蛋白质。 [0082] 在用于在植物中以可控方式产生蛋白质的另一种方法中，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于抑制至少一种内源性植物蛋白例如马铃薯淀粉生物合成蛋白的表达， 同时过表达治疗性蛋白质。例如，在不以任何方式限制的前提下，可使用表达盒，由此抑制ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)的表达，同时过表达所关注肽或所关注蛋白质。 [0083] 在用于在植物中以可控方式产生蛋白质的另一种方法中，本申请人设计了一种表达盒，该表达盒用于抑制至少一种内源性植物蛋白例如马铃薯淀粉生物合成蛋白的表达， 同时通过转运肽过表达所关注蛋白质。例如，在不以任何方式限制的前提下，可使用表达 盒，由此抑制ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)的表达，同时通过转运肽(例如二磷酸核酮糖羧化酶转运肽或GBSS转运肽)在转化的马铃薯植株的特定位点靶向产生所关注肽或所关注蛋白 质。 [0084] 所关注肽和所关注蛋白质包括但不限于：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR疫苗、MMRV疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗、黄热病疫苗、细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗、蛔虫/钩虫疫苗、驱虫药疫苗、RNFN疫苗、裂谷热病毒(RVFV)和艾滋病疫苗。 [0085] 本文所用的所有技术术语是生物化学、分子生物学和农业中的常用术语，并可被本发明所属领域的普通技术人员所理解。可在以下文献中找到这些技术术语：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook and Russel,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001(《分子克隆：实验室 手册》，第3版，第1-3卷，Sambrook和Russel编辑，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2001年)；Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,New York,1988(《最新分子生物学实 验方法汇编》，Ausubel等人编辑，纽约格林-威利联合出版公司，1988年)(定期更新)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,5th ed.,vol.1-2,ed.Ausubel et al.,John Wiley&Sons,Inc., 2002(《分子生物学简短实验设计：分子生物学现有实验设计方法概要》，第5版，第1-2卷，Ausubel等人编辑，约翰威立父子出版公司，2002年)；Genome Analysis:A Laboratory Manual,vol.1-2,ed.Green et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997(《基因组分析：实验室手册》，第1-2卷，Green等人编辑，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1997年)。涉及植物生物技术的方法在本文中有所描述，并在如下专著中有详细描述，例如Methods in Plant Molecular Biology:A Laboratory Course Manual,ed.Maliga et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995(《植物分子生物学实验指南》，Maliga等人编辑，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1995年)。使用PCR的各种技术在如下文献中有所描述，例如Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,San Diego,1990 (Innis等人《，PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社，圣地亚哥，1990年)和Dieffenbach and Dveksler,PCR Primer:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2003(Dieffenbach和Dveksler《，PCR技术 实验指南》，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2003年)。PCR引物对可通过已知技术从已知序列得到，例如使用用于该目的的计算机程序，例如0.5版Primer，1991年，马萨诸塞州剑桥的怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge,MA)。化学合成核酸的方法在例如Beaucage and Caruthers,Tetra.Letts.22: 1859-1862(1981)(Beaucage和Caruthers《，四面体通讯》，第22卷，第1859-1862页，1981年)和Matteucci and Caruthers,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)(Matteucci和Caruthers， 《美国化学会志》，第103卷，第3185页，1981年)中有所讨论。 [0086] 限制性酶消化、磷酸化、连接和转化是按照Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press (Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第二版，1989年，冷泉港实验室出版社)中所述进行的。除非另外指明，否则用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料均购自威斯康星州 密尔沃基的奥德里奇化学公司(Aldrich Chemicals,Milwaukee,WI)、密歇根州底特律的 DIFCO实验室公司(DIFCO Laboratories,Detroit,MI)、马里兰州盖瑟斯堡的英杰公司 (Invitrogen,Gaithersburg,MD)或密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)。 [0087] 术语“编码”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程，通过该过程细胞可将一系列氨基酸组装成特定的氨基酸序列，以产生有活性的酶。由于遗传密码的简并性，DNA序列中某些碱基的变化并不会改变蛋白质的氨基酸序列。因此，可以设想对DNA序列进行基本不会影响蛋白质功能特性的修饰。 [0088] 在本说明书中，“表达”表示由基因编码的蛋白质产物的产生。“过表达”是指转基因生物体中产生的基因产物超出正常或非转基因生物体内产生的基因产物水平。 [0089] 本发明另外的实施例 [0090] 除上述示例性方面和实施例外，通过对以下说明的研究，另外的方面和实施例将是显而易见的。 [0091] A.示例性蛋白质 [0092] 可使用本发明的构建体和方法表达或抑制任何蛋白质。 [0093] 根据本发明的方法，可使用多种技术抑制任何蛋白质，例如RNA干扰、反义、插入突变以及其他本领域已知的技术。具体地讲，本申请人设计了如下方法，所述方法包括以下步骤：抑制蛋白酶、贮藏蛋白或淀粉生物合成蛋白，并同时过表达所关注的治疗性蛋白质。在一个非限制性例子中，蛋白酶可被RNA干扰抑制，并使用诱导型启动子进行控制，以免对植物的正常生长和发育产生不利干扰。 [0094] 示例性的蛋白酶序列包括但不限于表1中所公开的内源性马铃薯蛋白酶序列： [0095] 表1：内源性马铃薯蛋白酶 [0096]马铃薯蛋白酶 GenBank登录号 马铃薯天冬氨酸 AY672651 马铃薯克隆188C11天冬氨酸蛋白酶前体样mRNA DQ241852 马铃薯组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶 AY450641 马铃薯克隆plbr2组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶 AY450638 马铃薯克隆plbr8ATP依赖型CLP蛋白酶 AY450635 半胱氨酸蛋白酶的马铃薯mRNA(cyp基因) AJ245924 马铃薯枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因 DQ066722 马铃薯液泡加工酶1(VPE1) EU605871 马铃薯液泡加工酶2(VPE2) EU605872 亮氨酸氨基肽酶的马铃薯LAP mRNA X67845 亮氨酸氨基肽酶的马铃薯LAP mRNA X77015 线粒体加工肽酶的马铃薯mRNA X66284 马铃薯克隆028E08线粒体加工肽酶样mRNA DQ284488 推定的天冬氨酸蛋白酶A22B(asp1基因) AM231414 [0097] 另外的示例性蛋白酶是CD4B，一种存在于叶绿体中的ATP依赖型蛋白酶ATP结合亚基clpA同源物。Clp蛋白酶具有胰凝乳蛋白酶样活性，在错误折叠的蛋白质的降解中起重要作用。参见Daniell et al.,Theor.Appl.Genet.112L 1503-1518(2006)(Daniell等人，《理论与应用遗传学》，第112L卷，第1503-1518页，2006年)。根据本发明，与CD4B未沉默的马铃薯相比，CD4B沉默的马铃薯可得到更高水平的蛋白质产量。 [0098] 马铃薯块茎特异蛋白是一种存在于马铃薯中的糖蛋白(序列用SEQ ID NO:1示出)。马铃薯块茎特异蛋白的主要功能是作为贮藏蛋白质。马铃薯块茎特异蛋白占马铃薯块茎中可溶性蛋白的高达40％，但也以低得多的水平存在于其他植物器官中。参见Hofgen et al.Plant Science,66:221-230,(1990)(Hofgen等人，《植物科学》，第66卷，第221-230页， 1990年)。 [0099] 根据本发明，与AGP未沉默的马铃薯相比，ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)沉默的马铃薯可得到更高水平的蛋白质产量。AGP产生ADP-葡萄糖，它是在植物中生物合成淀粉的前 体。本发明的构建体可包括有效连接至两个会聚启动子的全长AGP序列或其片段，使得AGP 的沉默由这两个启动子从相反方向驱动。在本发明的具体方面，GBSS启动子从一个方向驱 动AGP沉默，而AGP启动子从相反方向驱动AGP沉默。 [0100] 在另外的实施例中，根据本发明的蛋白质产量可通过以下方法进一步提高：过表达转录后基因沉默(PTGS)的病毒抑制子，同时抑制一种或多种内源性蛋白的表达，例如马 铃薯块茎特异蛋白、CD4B、AGP或其任意组合。PTGS的优选病毒抑制子是烟草丛矮病毒 (Tobacco blushy stunt virus)沉默抑制子P19。PTGS是一种核苷酸序列特异性RNA，可通 过RNA沉默阻止基因表达，从而限制植物中农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化效率。本 申请的发明人吃惊地发现，同时进行P19过表达和抑制一种或多种马铃薯内源性蛋白显著 提高了马铃薯块茎中外源性蛋白的产量。 [0101] 可使用上述本发明的沉默构建体表达或过表达任何蛋白质。在本发明的优选方面，可使用转运肽在所转化植物的所需位点提高蛋白质产量。合适的转运肽包括但不限于 GBSS转运肽和二磷酸核酮糖羧化酶转运肽。例如，在不以任何方式限制的前提下，本发明的构建体将在马铃薯植株中过表达所关注蛋白质或所关注肽，同时抑制一种或多种内源性蛋 白的表达，例如马铃薯块茎特异蛋白、CD4B、AGP或其任意组合。 [0102] 例如，在不以任何方式限制的前提下，可使用本发明方法和构建体表达的蛋白质有：白介素-2、水蛭素、胰岛素、干扰素、乳铁蛋白、血红蛋白、促红细胞生成素、表皮生长因子、抗体例如单链抗体，以及人类和动物疫苗(包括减毒病毒疫苗、外壳蛋白疫苗和癌症疫苗)。 [0103] 白介素-2是由正常外周血淋巴细胞产生的淋巴因子，并在暴露于抗原或其他刺激物后，诱导抗原或有丝分裂源刺激的T细胞增殖。参见Morgan et al.,Science 193:1007- 1008(1976)(Morgan等人，《科学》，第193卷，第1007-1008页，1976年)。它最初被称为T细胞生长因子，因为它能够诱导刺激的T淋巴细胞增殖，目前人们已经认识到，除了其生长因子特性外，它还可在体外和体内调控免疫系统细胞的多种功能，并已更名为白介素-2(IL-2)。 IL-2是淋巴细胞产生的介导免疫细胞相互作用和功能的若干信使调节分子之一。可使用本 文所述的方法在植物中产生IL-2，如以下例子中所示。 [0104] 水蛭素是药用水蛭(例如欧洲医蛭(Hirudo medicinalis))的唾液腺中天然存在的肽。水蛭素具有抗凝血性，这对水蛭以宿主血液为食的能力来说至关重要，因为它使血液可在血管外流动。 [0105] 水蛭素是凝血酶最有力的天然抑制剂，凝血酶可将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而引起血液凝固。由于其抗凝血活性，可将水蛭素用于治疗凝血障碍、皮肤血肿和浅表静脉曲张。然而，已证明从天然来源中提取大量水蛭素是很困难的。因此开发了通过重组DNA技术表达水蛭素的方法。市场上已存在若干种基于水蛭素的抗凝血药物产品，例如来匹卢 定(Lepirudin)、Thrombexx、Revasc和Iprivask(全部来源于酵母细胞)。相较于酵母体系，本技术提供了更低的成本和更易于管理的大规模生产。 [0106] 胰岛素是一种激素，它通过使得肝脏、肌肉细胞和脂肪组织从血液中吸收葡萄糖来调节碳水化合物和脂肪的代谢。然后将葡萄糖以糖原的形式储存在肝脏和肌肉中。机体 保持恒定水平的胰岛素，以除去血液中过量的葡萄糖。当无法控制胰岛素水平时，就出现了糖尿病。医学上可使用外部胰岛素来治疗某些类型的糖尿病。本技术以更大规模和更低成 本进行生产，为药用胰岛素的生产提供了有利方法。 [0107] 干扰素是宿主细胞响应于病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞)的存在而释放的蛋白质。除了“干扰”宿主细胞内的病毒复制外，干扰素还上调递呈至T淋巴细胞的抗原并增强未感染宿主细胞抵抗新的病毒感染的能力。干扰素的免疫作用已被用于治疗多种 疾病，例如光化性角化病和外生殖器疣。另外，干扰素治疗还可(与化疗和放疗结合)用于治疗多种癌症，包括白血病和淋巴瘤，例如毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、结节性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤。若干不同类型的干扰素获得批准用于人类，例如MultiferonTM(一般称为人类白细胞干扰素α)和聚乙二醇化的干扰素α。聚乙二醇化是将聚乙二醇聚合物链共价连接至另一个分子的过程，所述另一个分子通常是一种药物或治疗性蛋白。本技术提供了一 种以更低成本大规模生产干扰素的方法。 [0108] 乳铁蛋白，也称为乳运铁蛋白，是运铁蛋白家族的一种多功能蛋白。乳铁蛋白属于先天性免疫系统。除了其结合和运输铁离子的主要生物功能外，乳铁蛋白还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、催化、抗癌、抗过敏及辐射防护功能和性质。乳铁蛋白阻止细菌生物膜的形成。在囊胞性纤维症患者中观察到了由于乳铁蛋白活性降低引起的杀微生物活性的丧失和更多生物膜的形成。这些发现证实了乳铁蛋白在人类宿主防御，尤其是肺中的重要作用。具有次硫氰酸根离子的乳铁蛋白已被FDA授予孤儿药地位。因此，迫切需要能够以更低的成本大规模生产乳铁蛋白。本技术就提供了这样的生产方法。 [0109] 血红蛋白是所有脊椎动物的红细胞中运输氧的含铁金属蛋白。除氧气外，血红蛋白还参与其他气体的运输：它携带一部分人体的呼吸性二氧化碳(大约总量的10％)。血红 蛋白还可通过将重要的调节分子一氧化氮结合在球状蛋白的某个硫醇基团上来携带该分 子，并在释放氧气的同时将其释放。血红蛋白缺乏相关疾病由血红蛋白分子量下降引起，例如贫血，或由每个分子在相同氧分压下结合氧气的能力下降引起。无论什么原因，血红蛋白缺乏症降低了血液的携氧能力。为机体提供外部血红蛋白是治疗血红蛋白缺乏症的一种重 要方法。本技术提供了一种以更低成本大规模生产血红蛋白的方法。 [0110] 促红细胞生成素(也称为红细胞生成素或血细胞生成素)是一种糖蛋白类激素，其控制红血球生成或红细胞生成。促红细胞生成素通过保护红细胞免于凋亡来促进红细胞的 存活。促红细胞生成素还与各种生长因子配合参与前体红细胞的发育。在缺氧条件下，肾脏将产生和分泌促红细胞生成素以增加红细胞的产量。促红细胞生成素还参与刺激血管生成 和诱导平滑肌纤维增生。促红细胞生成素还显示出可通过抑制铁调素激素来增加铁的吸 收。医学上，促红细胞生成素已被用于治疗慢性肾脏疾病、脊髓发育不良以及癌症治疗(化疗和放疗)引起的贫血。本技术提供了一种以更低成本大规模生产促红细胞生成素的方法。 [0111] 表皮生长因子(或EGF)是一种生长因子，它通过与其受体EGFR结合而在细胞生长、增殖和分化的调节中起重要作用。表皮生长因子可存在于人类血小板、巨噬细胞、尿液、唾液、乳汁和血浆中。研究表明，EGF在精子形成、正常妊娠完成、乳腺发育和伤口愈合等许多生理过程中都很重要。这些生理过程相关的各种疾病病理可能与EGF缺乏症有关。与其他表达体系相比，本技术提供了一种以更低成本大规模生产EGF的有前景的方法。 [0112] 可使用本技术在植物中重组地生产抗体。例如，但非限制性地，可在马铃薯植株中生产单链抗体。 [0113] B.疫苗和感染治疗/预防 [0114] 除上述示例性蛋白质外，本技术还提供了一种生产人类和动物疫苗(包括减毒病毒疫苗、外壳蛋白疫苗和癌症疫苗)的有利替代方法。例如，本技术可用于生产人类疫苗，例如炭疽疫苗、霍乱疫苗、DPT(白喉、百日咳和破伤风)疫苗、hib疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、HPV(人类乳头瘤病毒)疫苗、流感疫苗、日本脑炎疫苗、MMR(麻疹、腮腺炎和风疹)疫苗、MMRV(麻疹、腮腺炎、风疹和水痘)疫苗、肺炎球菌结合疫苗、肺炎球菌多糖疫苗、脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗、天花疫苗、结核病疫苗、伤寒疫苗和黄热病疫苗。 [0115] 本技术可用于生产动物疫苗，例如细小病毒疫苗、犬瘟热疫苗、腺病毒疫苗、副流感疫苗、百日咳疫苗、狂犬疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、冠状疫苗、蛔虫/钩虫疫苗和驱虫药疫苗。 [0116] 术语癌症疫苗是指阻止致癌病毒感染、治疗现有癌症，或者预防癌症在某些高风险个体中发展的疫苗。某些癌症，例如子宫颈癌和某些肝癌，是由病毒引起的。对抗这些病毒的传统疫苗例如HPV(人类乳头瘤病毒)疫苗和乙肝疫苗可以预防这些癌症。 [0117] 1.裂谷热病毒(RVFV) [0118] 另外，本技术可用于治疗和/或预防裂谷热病毒(RVFV)。RVFV是由蚊子传播的病毒，其周期性蔓延对撒哈拉以南非洲大部分地区的牲畜种群造成了灾难性的经济后果。在 人类中，RVFV感染导致脑炎、脊髓炎和脑膜炎、视网膜炎及视觉障碍，以及出血性肝坏死。最近的爆发已导致显著的人口死亡率，并且地理覆盖区域更广，蔓延到在非洲大陆以外的沙 特阿拉伯和也门，展示了其在新地区出现的能力。由于其不断增加的易感性、传播性和载体可塑性，并且易于雾化，RVFV已被疾病控制中心列为新兴传染病和A类管制病原。虽然被认为是一种新兴的威胁，但由于对RVFV的毒力机制相对知之甚少，目前还没有经过FDA批准的RVFV疫苗或治疗剂。因此迫切需要深入了解病毒复制途径和宿主细胞相关发病机理，以便 开发新型抗病毒治疗剂。 [0119] RVFV主要影响牲畜，表现为发烧以及成年动物自然流产和幼龄动物死亡率高的情况。在人类中，该病毒可引起一系列程度不同的疾病。在大多数情况下，患者出现轻微病状伴有发热、头痛、肌痛和肝脏异常。较少情况下，病情可发展为出血热或脑膜炎。此外，可发生眼部后遗症，造成视网膜损伤，包括失明。虽然约1％的感染者死于该疾病，但近年来死亡率上升(接近45％)，这可能是由于就医的人数增加造成的。流行国家之外的RVFV爆发会造 成严重的健康和农业问题。RVFV的国际传播是国家生物安全的重要关注问题，因此RVFV被 CDC和USDA列为A类控制病原。Bird et al.J.Am.Vet Med.Assoc.,234(7):883-893(2009) (Bird等人《，美国兽医学会志》，第234卷，第7期，第883-893页，2009年)。虽然利巴韦林在某些情况下可用作治疗剂，但存在不良副作用。 [0120] 因此，本申请设想了针对RVFV接种疫苗的方法和构建体。就这一点而言，并且如本领域已知的，灭活的、减毒活的和重组的疫苗可用于预防RVFV感染。同样，重组方法可用于产生抑制或换句话讲改变病毒复制和/或转录的蛋白质。此类蛋白质可使用本文所述的任一种方法在植物内产生。 [0121] 2.艾滋病病毒(HIV) [0122] 高效抗逆转录病毒疗法(HAART)已成功用于处理HIV感染。然而，HAART药物并不能消除体内的HIV病毒。HIV可在体内保持休眠状态。一旦其HAART治疗中断，患者可出现更多症状，并且更易感。Tat蛋白由HIV产生，它刺激HIV双链RNA的转录。Kim,J.B.and P.A.Sharp,J.Biol.Che.m,276(15):12317-12323(2001)(Kim,J.B.和P.A.Sharp《，生物化 学杂志》，第276卷，第15期，第12317-12323页，2001年)。Tat蛋白包含转导结构域和核定位信号，因此该蛋白质可进入细胞和细胞核。Campbell et al.,J.Biol.Chem.,279(46): 48197-481204(2004)(Campbell等人《，生物化学杂志》，第279卷，第46期，第48197-481204页，2004年)。 [0123] 因此，本申请设想了用于治疗HIV(包括阻止HIV感染)的方法和构建体。例如，但非限制性地，重组方法可用于产生抑制或换句话讲改变病毒复制和/或转录的蛋白质。此类蛋白质可使用本文所述的任一种方法在植物内产生。 [0124] 3.丙肝病毒 [0125] 据估计，世界各地每年有超过350,000人死于HCV相关的肝脏疾病。Perz et al.J.Hepatol.45:529-538(2006)(Perz等人，《肝脏病学杂志》，第45卷，第529-538页，2006年)。HCV是一种隐形杀手，其在受害者体内倍增时，他们往往无明显不适。该病毒发病较慢，引起流感样症状如发烧和疲劳，并逐步攻击肝脏从而引起肝硬化或肝癌。一般来讲，HCV是通过感染的血液传播的。相关疫苗正在开发中。 [0126] 因此，本申请设想了用于治疗和/或阻止HCV的方法和构建体。就这一点而言，重组方法可用于产生抑制或换句话讲改变病毒复制和/或转录的蛋白质。此类蛋白质可使用本文所述的任一种方法在植物内产生。 [0127] C.基因表达的抑制 [0128] 通过触发编码如治疗性蛋白的所需多核苷酸的会聚转录，核酸构建体可用于有效降低或防止靶核酸的转录或翻译。这种构建体的一个具体特征是，与传统的沉默构建体相 比，无功能终止子插入并有效连接至所需多核苷酸的3'端。 [0129] 示例性构建体的另一个特征是，它可以通过两个反向启动子促进多核苷酸的一个或多个拷贝的会聚转录，所述多核苷酸的一个或多个拷贝未直接有效连接至终止子。由于 缺少终止信号，从第一启动子和第二启动子转录的RNA分子的库长度可以是不同长度。有时候，例如，转录机制可越过表示所需多核苷酸序列“结束”的最后一个核苷酸继续转录。因此，在这一具体布置中，转录终止可能通过下游序列的微弱和非预期动作(如促进发夹形 成)发生，还可能通过位于植物DNA中侧接转移DNA整合位点的非预期转录终止子的动作发 生。 [0130] 因此，无终止子碰撞转录(TFCT)构建体可包含有效连接至第一多核苷酸的第一启动子和有效连接至第二多核苷酸的第二启动子，由此(1)第一多核苷酸和第二多核苷酸彼 此之间以及与靶序列之间具有至少一些序列同一性，并且(2)第一启动子取向为使得由该 启动子起始的转录的方向朝向第二启动子进行，并且反之亦然，(3)构建体产生通常大小不同的RNA分子、代表所述多核苷酸的至少一部分的RNA对应物的一些转录物，以及包含所述 多核苷酸及其反向互补序列二者的至少一些的对应物的其他转录物。参见例如，美国专利 No.7,713,735，其全文以引用方式并入本文。 [0131] 可将所需多核苷酸以两种不同取向连接至启动子。在一种取向中，例如“正义”，所得的RNA转录物的至少5'部分与至少一种靶转录物的至少一部分具有序列同一性。在另一种名为“反义”的取向中，预测转录物的至少5'部分与至少一种靶转录物的反向互补序列的至少一部分相同或同源。 [0132] 构建体的特征还可在于，启动子被布置成位于所需多核苷酸的任一侧。因此，本发明的构建体可包含两个或更多个启动子，所述启动子侧接一个或多个所需多核苷酸，或侧接所需多核苷酸的拷贝，使得所需多核苷酸的双链都得以转录。也就是说，一个启动子可取向为起始所需多核苷酸5'端的转录，而第二启动子可有效取向为起始同一所需多核苷酸3' 端的转录。相对取向的启动子可侧接所需多核苷酸的多个拷贝。因此，“拷贝数”可能不同，以使得构建体可包含最终由启动子侧接的所需多核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 30、40、50、60、70、80、90或100，或多于100个拷贝，或者其间的任意整数个拷贝，所述启动子取向为诱导会聚转录。 [0133] 作为另外一种选择，第一启动子可在如“盒A”中有效连接至第一多核苷酸，而第二启动子可在如“盒B”中有效连接至第二多核苷酸。每个盒中的多核苷酸可能包含或可能不包含相同的核苷酸序列，但可与所关注靶核酸具有一定百分比的序列同一性。这些盒可被布置成串联的，即，使得它们在构建体中彼此相邻。此外，盒B，例如，可取向为盒A的反向互补取向。因此，在这种布置下，盒B中启动子的转录将在朝向盒A中启动子的方向继续进行。 因此，所述盒被布置为诱导“会聚转录”。 [0134] 如果两个盒都不包含终止子序列，那么该构建体，借助于会聚转录的布置，可产生不同长度的RNA转录物。 [0135] 因此，在这种情况下，可能存在部分或完全转录的RNA转录物的亚群，所述亚群含有从相应盒转录的所需多核苷酸的部分或全长序列。作为另外一种选择，在功能终止子不 存在的情况下，转录机制可越过所需多核苷酸末端继续进行，以产生长于所需多核苷酸长 度的转录物。 [0136] 因此，在含有所需多核苷酸的两个拷贝的构建体中，在其中一个多核苷酸可能会或可能不会取向为另一个多核苷酸的反向互补方向的情况下，以及在所述多核苷酸有效连 接至启动子以诱导会聚转录，并且构建体中无功能终止子的情况下，从一个所需多核苷酸 起始的转录机制可继续转录所需多核苷酸的另一个拷贝，反之亦然。所需多核苷酸的多个 拷贝可取向为各种排列：在构建体中存在所需多核苷酸的两个拷贝的情况下，这两个拷贝 可(例如)都取向为相同的方向、彼此相反的取向，或者例如彼此反向互补的取向。 [0137] 在其中一个所需多核苷酸取向为另一个多核苷酸的反向互补取向的布置中，可产生不仅含有第一多核苷酸的“正义”序列，还含有第二多核苷酸的“反义”序列的RNA转录物。 如果第一多核苷酸和第二多核苷酸包含相同或基本相同的DNA序列，那么单RNA转录物可包 含两个彼此互补的区域，因此其可进行退火。因此，这样转录得到的单RNA转录物可形成部分或全部发夹双螺旋结构。 [0138] 另一方面，如果分别由每个启动子生成这一长转录物的两个拷贝，那么将存在两个RNA分子，它们彼此具有序列互补性区域。因此，第一RNA转录物的“正义”区可退火到第二RNA转录物的“反义”区，反之亦然。因此，在这种布置下，可形成另一个由两个独立RNA转录物组成的RNA双螺旋，其与由单个自身互补的RNA转录物形成的发夹双螺旋相对。 [0139] 作为另外一种选择，所需多核苷酸的两个拷贝可取向为相同的方向，以使得在转录通读情况下，从一个启动子产生的长RNA转录物可包括，例如，所需多核苷酸的第一拷贝的正义序列，以及所需多核苷酸的第二拷贝的正义序列。因此，从另一个会聚取向的启动子产生的RNA转录物可包括所需多核苷酸的第二拷贝的反义序列，以及第一多核苷酸的反义 序列。因此，很可能的是，两种RNA转录物都不含精确互补区，从而两种RNA转录物都不可能自折叠以产生发夹结构。另一方面，两个单独的RNA转录物可相互杂交和退火，以形成RNA双螺旋。 [0140] 因此，在一个方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体缺少终止子或者缺少前面是编码自剪接核酶的DNA区域的终止子，但包含有效连接至第一多核苷酸的第一启动子和有效连接至第二多核苷酸的第二启动子，由此(1)第一多核苷酸和第二多核苷酸彼此之 间具有至少一些序列同一性，(2)第一启动子取向为使得由该启动子起始的转录的方向朝 向第二启动子进行，并且反之亦然，(3)这一会聚布置产生一系列通常长度不同的RNA转录 物。 [0141] 所需多核苷酸彼此之间可完全或不完全重复，或者完全或不完全反向互补重复。就包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的构建体而言，第二多核苷酸与第一多核苷酸的核苷 酸序列可完全或部分相同，并且第二多核苷酸可取向为第一多核苷酸的正向取向或反向互 补取向。因此，第一多核苷酸和第二多核苷酸可彼此完全重复。另一方面，第二多核苷酸可以是第一多核苷酸的不完全重复，即第二多核苷酸和第一多核苷酸可具有一定的序列同一 性，但其序列不完全相同或部分相同，即第二多核苷酸是一种不完全重复。该第二多核苷酸还可取向为第一多核苷酸的直接重复或位于第一多核苷酸的反向互补取向。 [0142] 本文所述的任何多核苷酸，例如所需多核苷酸或第一多核苷酸或第二多核苷酸，例如可与靶序列的至少一部分相同，或者可与靶序列的至少一部分具有序列同一性。当所 需多核苷酸包含与靶序列的片段同源的序列，即所需多核苷酸与靶序列的“至少一部分”具有序列同一性时，可能理想的是，该片段的核苷酸序列特异于靶基因，和/或所需多核苷酸中存在的靶的部分完全或不完全序列具有足够的长度以赋予靶特异性。因此所需多核苷酸 中与靶序列的一部分具有序列同一性的部分可包含特征结构域、结合位点或通常根据靶序 列的同种型或同源物而为保守的核苷酸序列。因此，设计一种最适合于靶向细胞中靶核酸 的所需多核苷酸是可能的。 [0143] 在另一个实施例中，所需多核苷酸包括与靶核酸的DNA或RNA序列具有序列同一性的序列，所述序列优选地为4至5,000个核苷酸、更优选地为50至1,000个核苷酸、最优选地为150至500个核苷酸。所需多核苷酸与靶序列中的序列可具有至少15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、 400、500或多于500(或其间的任意整数)个连续核苷酸的序列同一性，即序列100％相同，或者所需多核苷酸包括的序列与靶序列的序列具有约99％、98％、97％、96％、95％、94％、 93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、 78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、 63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、 48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、 33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、 18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、 1％的核苷酸序列同一性。换句话讲，所需多核苷酸与靶序列的全长序列或靶序列的全长序列的片段可为同源的，或具有同源性。 [0144] 因此，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括多核苷酸，所述多核苷酸与靶序列具有同源性，从而可与本文所述的靶序列的一部分在严格杂交条件或中等杂交条件下杂交。所谓的与多核苷酸的“一部分”杂交的多核苷酸是指与参考多核苷酸的至少约15个核苷酸、更优选地至少约20个核苷酸、更优选地至少约30个核苷酸、甚至更优选地多于30个核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。为实现本发明的目的，两个具有同源性 的序列，即所需多核苷酸和靶序列，可在他们于6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100g非特异性载体DNA的杂交溶液中形成双链复合体时发生杂交。参见Ausubel et al., section 2.9,supplement 27(1994)(Ausubel等人，第2.9节，增刊27，1994年)。这种序列可以在“中等严格性”条件下杂交，“中等严格性”的定义是：杂交溶液含6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液和100μg非特异性载体DNA，温度为60℃。就“高严格性”杂交来说，杂交温度升至68℃。在中等严格性杂交反应后，用室温下的含0.05％SDS的2×SSC溶液洗涤核苷酸5次，随后用60℃的含0.1％SDS的0.1×SSC溶液洗涤1小时。就“高严格性”而言，洗涤温度通常升至68℃左右。杂交的核苷酸可以是可使用1ng比放射性为10,000cpm/ng的放射性标记探针 检测的那些，其中杂交的核苷酸在-70℃温度下暴露于X射线胶片不超过72小时后可被清晰 观察到。 [0145] 在一个实施例中，本发明的构建体可能包含表达盒，该表达盒产生的核酸能将含有该构建体的细胞正常表达的靶基因的表达水平相比不含该构建体的细胞，降低99％、 98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、 83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、 68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、 53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、 38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、 23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、 8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％。 [0146] 本发明的任何多核苷酸即“所需的多核苷酸”、“第一”多核苷酸、“第二”多核苷酸，与靶序列可具有某种程度的序列同一性(以百分比表示)。如本文阐释的那样，靶序列可为(但不限于)序列、基因的一部分或全长、调控元件(例如启动子或终止子)、外显子、内含子、非翻译区，或靶基因组序列的任何上游序列或下游序列。因此，本发明的多核苷酸所包含序列的长度可等于此类靶序列的长度。另一方面，本发明的多核苷酸所包含的序列与此类靶 序列可具有序列同一性。所以，本发明所需的多核苷酸与靶序列可具有约99％、98％、97％、 96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、 81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、 66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的核苷酸序列同一性。 [0147] 在述及两个核酸序列或多肽序列时，本文使用的术语“序列同一性”或“同一性”包括提到这两个序列中的残基，这些残基在指定区中比对最大相关性时是相同的。在结合蛋白质使用序列同一性百分比时，应认识到，不同残基位置的区别通常是保守氨基酸取代不 同，其中氨基酸残基被其他具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因 此不会改变分子的功能特性。在序列因保守取代不同而不同的情况下，可上调序列同一性 百分比，以便校正所述取代的保守特性。我们将因此类保守取代不同而不同的序列称为具 有“序列相似性”或“相似性”。执行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。该方法通常涉及：将保守取代评定为部分错配，而不是完全错配，从而增大序列同一性百分比。因此，例如，在将相同的氨基酸评分为1且将非保守取代评分为0的情况下，保守取代的评分介于0和 1之间。保守取代的评分(例如)根据Meyers and Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,4: 11-17(1988)(Meyers和Miller，《计算机应用生物科学》，第4卷，第11至17页，1988年)中的算法计算得到，该算法例如可用PC/GENE程序(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics 公司(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA))实施。 [0148] 如本文所用，“序列同一性百分比”是指在比较窗口内比较两个最佳比对的序列所测得的值；为了对两个序列进行最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列部分相对参考序列(不含添加或缺失)而言，可包含添加或缺失(即空位)。百分比的计算方式如下：测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，得到匹配位置数；将该匹配位置数除 以比较窗内的总位置数；再将结果乘以100，得到序列同一性百分比。 [0149] 比对用于比较的序列的方法在本领域中是众所周知的。要对用于比较的序列执行最佳比对，可采用以下各项：Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.2:482(1981)(《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)中提出的局部同源性算法；Needleman和Wunsch在 J.Mol.Biol.48:443(1970)(《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)中提出的同源性比对算法；Pearson和Lipman在Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)(《美国国家科学院院 刊》，第85卷，第2444页，1988年)中提出的搜索相似度的方法；这些算法的计算机化实施，包括但不限于：用美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics, Mountain View,Calif)开发的PC/Gene程序实施CLUSTAL算法；用美国威斯康星州麦迪逊市 科学驱动路575号(575Science Dr.,Madison,Wis.,USA)遗传学电脑集团(Genetics Computer Group(GCG))开发的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)实施GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA算法。以下文献充分描述了CLUSTAL程序：Higgins and Sharp,Gene 73:237-244(1988)(Higgins和Sharp，《基因》，第73卷，第 237-244页，1988年)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年)；Corpet,et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988)(Corpet等人，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页，1988年)；Huang,et al.,Computer Applications in the Biosciences 8:155-65(1992) (Huang等人《，计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页，1992年)；Pearson,et al.,Methods in Molecular Biology 24:307-331(1994)(Pearson等人《，分子生物学方 法》，第24卷，第307-331页，1994年)。 [0150] 可用于搜索数据库相似度的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行 查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19,Ausubel, et al.,Eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)(《分子生物 学实验室指南》，第19章，Ausubel等人编辑，纽约格林-威利联合出版公司，1995年)； Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；以及Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389- 3402(1997)(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年)。 [0151] 公众可(例如)从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)获得用于执行BLAST分析的软件。这种算法涉及首先通过鉴别查询序列中长 度为W的短字来鉴别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时 匹配或满足一些正值阈值评分T。T称为邻近字评分阈值。这些初始邻近字命中充当启动搜 索的种子，用于发现含有这些命中的较长HSP。然后，这些字命中沿每个序列在两个方向上延伸，直到可增大累积的比对评分为止。对于核苷酸序列来说，使用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于0)和N(错配残基的罚分值；总是小于0)来计算累积评分。对于氨基酸序列来说，使用评分矩阵来计算累积评分。以下情况出现时，每个方向的字命中停止延伸：累积比对评分从最大实现值回落数量X；累积评分由于一个或多个负评分残基比对累积，变为零或零以下的值；或到达两个序列中任一序列的终点。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)11，期望值(E)10，截止值 100，M＝5，N＝-4和比较两条链作为缺省值。对氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(参见Henikoff&Henikoff(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院 刊》，第89卷，第10915页))。 [0152] 除计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两个序列的相似度执行统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad Sci.USA 90:5873-5877(1993)(Karlin和 Altschul《，美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页，1993年))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，其指示了两个核苷酸序列或氨基酸序列间偶然出现匹 配的概率。 [0153] BLAST搜索假定可将蛋白质模拟为随机序列。然而，多种实际的蛋白质包含非随机序列区域，这些非随机序列区域可为同聚束、短周期重复序列或富含一种或多种氨基酸的 区域。可比对无关蛋白质之间的这类低复杂性区域，即便这些无关蛋白质的其他区域完全 不同也是如此。可采用许多低复杂性过滤程序来减少这类低复杂性比对。例如，可单独采用或组合采用SEG(Wooten and Federhen,Comput.Chem.,17:149-163(1993)(Wooten和 Federhen《，计算化学杂志》，第17卷，第149-163页，1993年))和XNU(Claverie and States,Comput.Chem.,17:191-201(1993)(Claverie和States，《计算化学杂志》，第17卷，第191- 201页，1993年))低复杂性过滤程序。 [0154] 可使用CLUSTAL比对方法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5:151-153(Higgins和Sharp《，计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年))，利用缺省参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行序列的多重比对。使用CLUSTAL方法进行配对比对的 缺省参数是：KTUPLE 1，空位罚分＝3，WINDOW＝5，保留对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。 [0155] 因此，在不以任何方式限制的前提下，本申请人设想了在过表达编码所关注蛋白质的基因的同时，抑制编码蛋白质的内源性植物基因。例如，可使用会聚表达盒，在抑制马铃薯块茎特异蛋白(块茎内主要的贮藏蛋白)的同时，过表达所关注的治疗性蛋白质。这种 表达盒可包含赋予其独特颜色或其他独特属性的选择性标记基因，技术人员可根据这种独 特的颜色或属性进行选择，一来方便了选择，二来避免人类误食。此外，可用诱导型启动子进一步调节蛋白质受抑制和/或产生的程度，由此使得蛋白质受抑制和/或产生的程度不干 扰植物的正常生长发育。 [0156] D.核酸构建体中的调控元件 [0157] 本发明提供了用于调节转基因植物中的蛋白质产量的核酸分子及方法。在一个实施例中，如上文讨论过的那样，所关注的治疗性蛋白质能在马铃薯植株中过表达。 [0158] 表达载体至少包含一个有效连接至调控元件(例如启动子)的遗传标记，所述调控元件允许含有该遗传标记的转化细胞凭借负选择(即，抑制不包含选择性标记基因的细胞 生长)恢复，或凭借正选择(即，筛选由该遗传标记编码的产物)恢复。多种常用于植物转化的选择性标记基因是转化技术领域众所周知的，包括(例如)编码能以代谢方式解除选择性 化学试剂(可能是抗生素或除草剂)毒性的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的已改变靶标 的基因。一些正选择方法也是本领域已知的。 [0159] 一种常用于植物转化的选择性标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，该基因在植物调节信号控制下，能赋予植物对卡那霉素的抗性。Fraley,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)(Fraley等人，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第4803页，1983年)。另一种常用的选择性标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，该基因能赋予植物对抗生素潮霉素的抗性。Vanden Elzen,et al.,Plant Mol.Biol.,5:299(1985) (Vanden Elzen等人，《植物分子生物学》，第5卷，第299页，1985年)。 [0160] 源于细菌并能赋予植物对抗生素的抗性的另外一些选择性标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶基因、链霉素磷酸转移酶基因、氨基糖苷-3'-腺嘌呤基转移酶基因、博来霉素抗性决定子(Hayford,et al.,Plant Physiol.,86:1216(1988)(Hayford等人《，植物生理 学》，第86卷，第1216页，1988年)；Jones,et al.,Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)(Jones等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第210卷，第86页，1987年)；Svab,et al.,Plant Mol.Biol.,14:197(1990)(Svab等人，《植物分子生物学》，第14卷，第197页，1990年)； Hille,et al.,Plant Mol.Biol.,7:171(1986)(Hille等人，《植物分子生物学》，第7卷，第 171页，1986年))。其他选择性标记基因赋予植物对除草剂如草甘膦、草铵膦或溴草腈等的抗性(Comai,et al.,Nature,317:741-744(1985)(Comai等人，《自然》，第317卷，第741-744页，1985年)；Gordon-Kamm,et al.,Plant Cell,2:603-618(1990)(Gordon-Kamm等人，《植物细胞》，第2卷，第603-618页，1990年)；Stalker,et al.,Science,242:419-423(1988)(Stalker等人，《科学》，第242卷，第419-423页，1988年))。 [0161] 不源于细菌且用于植物转化的选择性标记基因包括(例如)小鼠二氢叶酸还原酶，植物中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶与植物中的乙酰乳酸合酶(Eichholtz,et al., Somatic Cell Mol.Genet.,13:67(1987)(Eichholtz等人《，体细胞和分子遗传学》，第13卷，第67页，1987年)；Shah,et al.,Science,233:478(1986)(Shah等人《，科学》，第233卷，第478页，1986年)；Charest,et al.,Plant Cell Rep.,8:643(1990)(Charest等人，《植物细胞报告》，第8卷，第643页，1990年))。 [0162] 另一类用于植物转化的标记基因需要筛选据推测已转化的植物细胞，筛出对毒性物质(如抗生素)有抗性的细胞，而不是对已转化细胞直接进行遗传选择。这些基因尤其可 用于量化或形象化基因在特定组织内表达的空间分布，并通常被称为报告基因，原因是它 们可以融合至用于研究基因表达的基因或基因调控序列。常用于筛选据推测已转化的细胞 的基因包括β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、β-半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因和氯霉素乙酰转移酶基因(Jefferson,R.A.,Plant Mol.Biol.Rep.,5:387(1987)(Jefferson,R.A.，《植物 分子生物学》，第5卷，第387页，1987年)；Teeri,et al.,EMBO J.,8:343(1989)(Teeri等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第8卷，第343页，1989年)；Koncz,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:131(1987)(Koncz等人《，美国国家科学院院刊》，第84卷，第 131页，1987年)；DeBlock,et al.,EMBO J.,3:1681(1984)(DeBlock等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第1681页，1984年))。 [0163] 用于可视化GUS活性的体内方法是可获得的，该方法无需破坏植物组织(Molecular Probes,Publication 2908,IMAGENE GREEN,pp.1-4(1993)(分子探针公司 2908号出版物，IMAGENE GREEN，第1-4页，1993年)；Naleway,et al.,J.Cell Biol.,115: 151a(1991)(Naleway等人，《细胞生物学杂志》，第115卷，第151a页，1991年))。然而，这些用于可视化GUS活性的体内方法灵敏性低、荧光背景值高，而且限制荧光素酶基因被用作选择性标记，所以，尚未证实这些体内方法可用于恢复已转化细胞。 [0164] 最近，已将编码绿荧光蛋白(GFP)的基因用作指示原核与真核细胞中基因表达的标记(Chalfie,et al.,Science,263:802(1994)(Chalfie等人《，科学》，第263卷，第802页， 1994年))。GFP和GFP突变体可以用作可筛选的标记。GFP突变体的一个例子是增强型绿荧光蛋白(EGFP)，该突变体具有增强的荧光和光稳定性。 [0165] 包含在表达载体中的基因必须由含调控元件(如启动子)的核苷酸序列驱动。转化技术领域熟知数种类型的启动子，也熟知可单独使用或可与启动子联合使用的其他调控元 件。 [0166] 如本文所用，“启动子”是指位于转录起点上游并参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别与结合以启动转录的DNA区域。“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子。 受发育调控启动子的例子包括优先在某些组织(例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中启动转录的启动子。这种启动子被称为“组织偏好的”启动子。只在某种组织中启动转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要在一个或多个器官的某些细胞类型中驱动表达，例如在根或叶的脉管细胞中驱动表达。“诱导型”启动子为受环境控制的启动子。可能影响诱导型启动子驱动转录的环境条件的例子包括厌氧 条件或存在光。组织特异性启动子、组织偏好的启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子为在大多数环境条件下都有活性的启动子。 [0167] 诱导型启动子—诱导型启动子有效连接至在大豆中表达的基因。任选地，诱导型启动子有效连接至编码信号序列的核苷酸序列，这种信号序列将有效连接至在大豆中表达 的基因。存在诱导型启动子时，转录速率响应于诱导剂而增大。 [0168] 可以在本发明中使用任一种诱导型启动子。参见Ward,et al.,Plant Mol.Biol.,22:361-366(1993)(Ward等人，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页，1993年)。示例性诱导型启动子包括(但不限于)来自ACEI系统且响应铜的启动子(Mett,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:4567-4571(1993)(Mett等人，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页，1993年))；来自玉蜀黍且响应苯磺酰胺除草剂安全剂的In2基因 (Hershey,et al.,Mol.Gen Genetics,227:229-237(1991)(Hershey等人，《分子遗传学与 普通遗传学》，第227卷，第229-237页，1991年)；Gatz,et al.,Mol.Gen.Genetics,243:32- 38(1994)(Gatz等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第243卷，第32-38页，1994年))；或来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz,et al.,Mol.Gen.Genetics,227:229-237(1991)(Gatz等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页，1991年))。特别优选的诱导型启动子是能够响应于植物在正常情况下不会对其作出响应的诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子为来 自类固醇激素基因的诱导型启动子，其为糖皮质激素响应元件，转录活性由糖皮质激素诱 导(Schena,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10421-10425(1991)(Schena等人，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页，1991年))。 [0169] 其他启动子可从多种细菌克隆，例如胭脂碱合酶的启动子和章鱼碱合酶基因的启动子。诱导型启动子分为多种类型，但通常情况下，诱导型启动子可为温度敏感型启动子、化学诱导型启动子或瞬时型启动子。具体地讲，诱导型启动子可被(例如)乙醇、固醇、糖、乙烯、脱落酸、植物生长素、细胞分裂素、章鱼碱、胭脂碱、光、氧气、镉、铜及其他重金属中的任一种物质诱导。示例性诱导型启动子还包括(但不限于)Ha hsp17.7G4启动子、小麦wcs120 启动子、Rab 16A基因启动子、α-淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子和羧化酶启动子。 [0170] 组成型启动子—组成型启动子有效连接至在大豆中表达的基因；或者，组成型启动子有效连接至编码信号序列的核苷酸序列，这种信号序列将有效连接至在大豆中表达的 基因。 [0171] 可以在本发明中使用多种不同的组成型启动子。示例性组成型启动子包括(但不限于)来自植物病毒的启动子，例如来自CaMV的35S启动子(Odell,et al.,Nature,313: 810-812(1985)(Odell等人《，自然》，第313卷，第810-812页，1985年))；来自水稻肌动蛋白基因之类基因的启动子(McElroy,et al.,Plant Cell,2:163-171(1990)(McElroy等人， 《植物细胞》，第2卷，第163-171页，1990年))；泛素启动子(Christensen,et al.,Plant Mol.Biol.,12:619-632(1989)(Christensen等人，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页，1989年)；Christensen,et al.,Plant Mol.Biol.,18:675-689(1992)(Christensen等 人，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页，1992年))；pEMU启动子(Last,et al., Theor.Appl.Genet.,81:581-588(1991)(Last等人，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581- 588页，1991年))；MAS启动子(Velten,et al.,EMBO J.,3:2723-2730(1984)(Velten等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第2723-2730页，1984年))；玉蜀黍H3组蛋白启动子(Lepetit,et al.,Mol.Gen.Genetics,231:276-285(1992)(Lepetit等人，《分子遗传学与 普通遗传学》，第231卷，第276-285页，1992年)；Atanassova,et al.,Plant Journal,2(3): 291-300(1992)(Atanassova等人，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页，1992年))。ALS启动子为甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5'端的Xba1/Ncol片段(或与所述 Xba1/Ncol片段类似的核苷酸序列)，代表一种特别有用的组成型启动子。参见PCT专利申请WO 96/30530。另外的组成型启动子包括花椰菜花叶病毒启动子、玄参花叶病毒启动子，以及植物中的二磷酸核酮糖羧化酶活化酶基因的启动子。 [0172] 组织特异性启动子或组织偏好的启动子—组织特异性启动子有效连接至在大豆中表达的基因。任选地，组织特异性启动子有效连接至编码信号序列的核苷酸序列，这种信号序列将有效连接至在大豆中表达的基因。用有效连接至组织特异性启动子的所关注基因 转化的植物，只在或优先在特定组织中产生转基因的蛋白产物。 [0173] 可以在本发明中使用任一种组织特异性启动子或组织偏好的启动子。示例性组织特异性启动子或组织偏好的启动子包括(但不限于)根偏好的启动子，例如来自菜豆球蛋白 基因的启动子(Murai,et al.,Science,23:476-482(1983)(Murai等人《，科学》，第23卷，第 476-482页，1983年)；Sengupta-Gopalan,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3320-3324(1985)(Sengupta-Gopalan等人，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第3320-3324页，1985年))；叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab结合蛋白或二磷酸核酮糖羧化酶基因的启动子(Simpson,et al.,EMBO J.,4(11):2723-2729(1985)(Simpson等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第4卷，第11期，第2723-2729页，1985年)；Timko,et al.,Nature,318:579-582(1985)(Timko等人《，自然》，第318卷，第579-582页，1985年))；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子(Twell,et al.,Mol.Gen.Genetics,217:240-245(1989)(Twell等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第217卷，第240-245页，1989年))；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子(Guerrero,et al.,Mol.Gen.Genetics,244:161-168(1993)(Guerrero等人， 《分子遗传学与普通遗传学》，第244卷，第161-168页，1993年))；或花粉粒偏好的启动子，例如来自apg的启动子(Twell,et al.,Sex.Plant Reprod.,6:217-224(1993)(Twell等人， 《植物有性生殖》，第6卷，第217-224页，1993年))。 [0174] 凭借将编码信号序列的核苷酸序列有效连接至编码所关注蛋白质的基因的5'和/或3'区域，可实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体转运或者分泌到质外体中。位于结构基因5'和/或3'端的靶向序列可以在蛋白质合成与加工过程中决定编码的蛋白质最终在何处分到不同区室中。 [0175] 如果有信号序列，其会引导多肽进入胞内细胞器或亚细胞区室、或者分泌到质外体中。本领域知道多种信号序列。此类序列的一个例子是编码颗粒结合型淀粉合酶(GBSS) 基因序列的转运肽。另一个例子是源于核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo)基因的 小亚基的序列。若要了解其他例子，请参见Becker,et al.,Plant Mol.Biol.,20:49(1992)(Becker等人，《植物分子生物学》，第20卷，第49页，1992年)；Knox,C.,et al.,Plant Mol.Biol.,9:3-17(1987)(Knox,C.等人，《植物分子生物学》，第9卷，第3-17页，1987年)； Lerner,et al.,Plant Physiol.,91:124-129(1989)(Lerner等人《，植物生理学》，第91卷，第124-129页，1989年)；Frontes,et al.,Plant Cell,3:483-496(1991)(Frontes等人，《植物细胞》，第3卷，第483-496页，1991年)；Matsuoka,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:834(1991)(Matsuoka等人，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页，1991年)；Gould,et al.,J.Cell.Biol.,108:1657(1989)(Gould等人，《细胞生物学杂志》，第108卷，第1657页，1989年)；Creissen,et al.,Plant J.,2:129(1991)(Creissen等人，《植物学杂志》，第2卷，第 129页，1991年)；Kalderon,et al.,Cell,39:499-509(1984)(Kalderon等人，《细胞》，第39卷，第499-509页，1984年)；Steifel,et al.,Plant Cell,2:785-793(1990)(Steifel等人，《植物细胞》，第2卷，第785-793页，1990年)。 [0176] 视具体应用不同，可使用适当的启动子序列。举例来说，启动子既可以是组成型启动子、诱导型启动子，也可以是这两种启动子排列得到的启动子。比如，启动子可以是“强”启动子；“强”启动子可以是从病毒分离的启动子，所述病毒例如花椰菜花叶病毒、水稻东格鲁杆状病毒、玉蜀黍条纹病毒、木薯叶脉病毒、紫茉莉病毒、花生褪绿线条花叶病毒、玄参花叶病毒、小球藻病毒。在一个实施例中，申请人设想使用来自花椰菜花叶病毒的35S组成型启动子，这种启动子是本领域熟知的。 [0177] E.基因工程所用的马铃薯植株 [0178] 在本说明书中，“转基因植物”是指整合了核酸序列的植物，这种核酸序列包括(但不限于)通常情况下宿主植物基因组中没有的基因、非正常转录到RNA中或翻译为蛋白质(“表达”)的DNA序列、或者技术人员希望引入未转化植物中的任何其他基因或DNA序列，例如通常可存在于未转化植物中、但技术人员想要对其进行基因工程改造或改变其表达的基 因。“转基因植物”类别包括原代转化株，和(例如)采用标准基因渗入程序或另一种育种程序使其谱系中包含转化株的植物。 [0179] 所关注的肽和蛋白质可以在马铃薯的二倍体和四倍体植株(例如马铃薯(Solanum tuberosum))中产生。在此所用的术语“二倍体”和“四倍体”的定义是：每个细胞(生殖细胞除外)中的每种染色体都有两对或四对。二倍体马铃薯植株的块茎个头小、形状怪异且有 色。四倍体马铃薯植株的叶片较大、块茎所含生物质较多，而且生长速度比二倍体马铃薯植株快。四倍体马铃薯植株用于商业种植，供人食用。 [0180] F.基因工程方法 [0181] 可使用合适的基因工程技术把核酸构建体引入任一种植物细胞。可用本领域已知的各种方法对单子叶和双子叶的被子或裸子植物的细胞进行基因工程改造。例如，参见 Klein et al.,Biotechnology 4:583-590(1993)(Klein等人，《生物科技》，第4卷，第583- 590页，1993年)；Bechtold et al.,C.R.Acad.Sci.Paris 316:1194-1199(1993)(Bechtold等人，《法国科学院周报》，第316卷，第1194-1199页，1993年)；Bent et al., Mol.Gen.Genet.204:383-396(1986)(Bent等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第204卷，第 383-396页，1986年)；Paszowski et al.,EMBO J.3:2717-2722(1984)(Paszowski等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第2717-2722页，1984年)；Sagi et al.,Plant Cell Rep.13:262-266(1994)(Sagi等人，《植物细胞报告》，第13卷，第262-266页，1994年)。示例性方法包括(但不限于)转化法、电穿孔法、基因枪轰击法、磷酸钙沉淀法、聚乙二醇融合法、移入发芽的花粉粒、直接转化法(Lorz et al.,Mol.Genet.199:179-182(1985)(Lorz等人，《分子遗传学》，第199卷，第179-182页，1985年))，和本领域已知的其他方法。 [0182] 已开发了多种植物转化方法，包括生物的和物理的植物转化方案。参见例如Miki,et al.，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick and Thompson Eds.,CRC Press,Inc., Boca Raton,pp.67-88(1993)(Miki等人，《植物分子生物学及生物技术的实用方法》，“把外源DNA引入植物的程序”，Glick和Thompson编辑，波卡拉顿CRC出版社，第67-88页，1993年)。 此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法是可获得的。参见 例如Gruber,et al.，“Vectors for Plant Transformation，”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick and Thompson Eds.,CRC Press,Inc., Boca Raton,pp.89-119(1993)(Gruber等人，《植物分子生物学及生物技术的实用方法》，“用于转化植物的载体”，Glick和Thompson编辑，波卡拉顿CRC出版社，第89-119页，1993年)。 [0183] 农杆菌属介导转化法—这是一种以农杆菌属的天然转化体系为基础，将表达载体引入植物的方法。参见例如Horsch,et al.,Science,227:1229(1985)(Horsch等人《，科 学》，第227卷，第1229页，1985年)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌 (A.rhizogenes)为存在于土壤中、可从基因方面转化植物细胞的植物病原细菌。根瘤农杆 菌和发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒分别携带着负责植物遗传转化的基因。参见例如Kado, C.I.,Crit.Rev.Plant Sci.,10:1(1991)(Kado,C.I.，《植物科学评论》，第10卷，第1页， 1991年)。农杆菌属载体系统和农杆菌属介导的基因转化方法的描述，可参见上文提及的 Gruber等人和Miki等人的文献，以及Moloney,et al.,Plant Cell Reports,8:238(1989) (Moloney等人，《植物细胞报告》，第8卷，第238页，1989年)。还可参见1996年10月8日颁发的美国专利No.5,563,055(Townsend和Thomas)。 [0184] 在一个实施例中，可以使用农杆菌属菌种，例如根癌农杆菌和发根农杆菌，例如依据Nagel et al.,Microbiol Lett 67:325(1990)(Nagel等人《，微生物学快报》，第67卷，第325页，1990年)。简言之，农杆菌属可由植物表达载体经由(例如)电穿孔法转化；然后可采用(例如)大家熟悉的叶盘法将转化后的农杆菌属引入植物细胞。 [0185] 本领域技术人员都知道，可使用上文讨论的农杆菌属转化方法来转化双子叶植物。另外，de la Pena,et al.,Nature 325:274-276(1987)(de la Pena等人，《自然》，第 325卷，第274-276页，1987年)；Rhodes,et al.,Science 240:204-207(1988)(Rhodes等人，《科学》，第240卷，第204-207页，1988年)和Shimamato,et al.,Nature328:274-276(1989)(Shimamato等人，《自然》，第328卷，第274-276页，1989年)(这些文献都以引用方式并入本文)已使用农杆菌属转化了谷类单子叶植物。还可参见Bechtold,et al., C.R.Acad.Sci.Paris 316(1994)(Bechtold等人，《法国科学院周报》，第316卷，1994年)，该文献示出将真空渗入用于农杆菌属介导转化法。 [0186] 在一个实施例中，转化载体可包含源于农杆菌属的T-DNA元件的替代物，其特征为在5'-端存在“左边界”，而在3'-端存在“右边界”。因此，可从可食用植物中分离出转移DNA替代物，以便最大限度减少引入靶植物基因组的不期望核酸的量。这种植物转移DNA(P- DNA)还由支持一个多核苷酸转移到另一个多核苷酸中的左边界样序列和右边界样序列划 定。要实现本发明的目的，可使用T-DNA构建体或P-DNA构建体将需要的多核苷酸转移到植 物细胞内。技术人员应当理解，在某些情况下可能期望减少经由农杆菌属介导转化引入植 物基因组的不期望遗传元件的数量。所以，在这种情况下，技术人员可使用P-DNA，因为P-DNA及其边界样序列与植物基因组分离。参见例如美国专利No.7,598,430和No.7,928,292。 [0187] 直接基因转移法—现已开发出数种替代农杆菌属介导转化法的植物转化方法，统称为直接基因转移法。广泛适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导转化 法，使用该方法时，DNA携带在约1至4μm大的微抛射体的表面上。用生物射弹装置将表达载体引入植物组织中，该生物射弹装置把微抛射体加速到300至600m/s，该速度足以穿透植物细胞壁和细胞膜。Sanford,et al.,Part.Sci.Technol.,5:27(1987)(Sanford等人，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27页，1987年)；Sanford,J.C.,Trends Biotech.,6:299(1988) (Sanford,J.C.，《生物技术趋势》，第6卷，第299页，1988年)；Klein,et al.,Bio/Tech.,6: 559-563(1988)(Klein等人，《生物技术》，第6卷，第559-563页，1988年)；Sanford,J.C.,Physiol Plant,7:206(1990)(Sanford,J.C.，《植物生理学》，第7卷，第206页，1990年)； Klein,et al.,Biotechnology,10:268(1992)(Klein等人，《生物技术》，第10卷，第268页， 1992年)。还可参见1991年5月14日颁发的美国专利No.5,015,580(Christou等人)，和1994 年6月21日颁发的美国专利No.5,322,783(Tomes等人)。 [0188] 将DNA物理递送到植物的另一种方法是用超声处理靶细胞。Zhang,et al.,Bio/Technology,9:996(1991)(Zhang等人，《生物技术》，第9卷，第996页，1991年)。或者是用脂质体和原生质球融合将表达载体引入植物。Deshayes,et al.,EMBO J.,4:2731(1985) (Deshayes等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第4卷，第2731页，1985年)；Christou,et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:3962(1987)(Christou等人《，美国国家科学院院刊》，第 84卷，第3962页，1987年)。也报道过使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体。Hain,et al.,Mol.Gen.Genet.,199:161(1985)(Hain等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第199卷，第161页，1985年)；Draper,et al.,Plant Cell Physiol.,23:451(1982)(Draper等人，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页，1982年)。还描述了原生质体及完整细胞与组织的电穿孔法(Donn,et al.,Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC,A2-38,p.53(1990)(Donn等人，《国际植物组织培养协会第七届植物细胞与组织培养国际会议摘要》，第A2-38卷，第53页，1990年)；D’Halluin,et al.,Plant Cell,4:1495-1505(1992)(D’Halluin等人，《植物细胞》，第 4卷，第1495-1505页，1992年)；Spencer,et al.,Plant Mol.Biol.,24:51-61(1994) (Spencer等人，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页，1994年))。 [0189] 视植物物种不同，以及被选为转化目标细胞的植物细胞类型不同(例如源于幼苗的细胞类型，如下胚轴、子叶或胚性组织)，确切的植物转化方法可能有所不同。可从以下文献中找到植物物种特异性的转化方案：Biotechnology in Agriculture and Forestry 46:Transgenic Crops I(Y.P.S.Bajaj ed.),Springer-Verlag,New York(1999)(《农业与 林业生物技术》第46卷：I类转基因作物，Y.P.S.Bajaj编辑，纽约施普林格出版社，1999年)； Biotechnology in Agriculture and Forestry 47:Transgenic Crops II(Y.P.S.Bajaj ed.),Springer-Verlag,New York(2001)(《农业与林业生物技术》第47卷：II类转基因作 物，Y.P.S.Bajaj编辑，纽约施普林格出版社，2001年)。 [0190] 培育经转化的植物细胞，在分化出组织(如芽、根)后，再生得到成熟植物。典型做法是再生出多株植物。再生植物的方法为本领域技术人员所熟知，且通常由植物物种和细胞类型决定。与培养植物组织有关的进一步指导内容可参见(例如)：Plant Cell and Tissue Culture,1994,Vasil and Thorpe Eds.,Kluwer Academic Publishers(《植物细 胞和组织培养》，1994年，Vasil和Thorpe编辑，克鲁沃学术出版社)；Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111),1999,Hall Eds,Humana Press(《植物 细胞培养实验手册》(分子生物学方法丛书第111卷)，Hall编辑，1999年，胡马纳出版社)。 [0191] 为有助于技术人员选出由基因工程改造过的植物材料，一种可行方案是使用选择性/可筛选标记，这种标记可将由基因工程改造过的植物材料与不表达异源基因的其他植 物或植物组织区分开。筛选过程可能需要测定可筛选标记基因所编码蛋白质的表达水平。 此类标记的例子包括β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、绿荧光蛋白(GFP)基因和荧光素酶(LUX) 基因。同样，可使用编码对肥料、抗生素、除草剂或有毒化合物的抗性的基因来识别转化事件。选择性标记的例子包括氨腈水合酶基因(CAH)，编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶基因(SPT)，编码卡那霉素抗性和遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，编码潮霉 素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(HPT或APHIV)，编码磺酰脲类除草剂抗性的乙酰乳酸合酶 (a/s)基因，编码对抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂(例如草丁膦，商品名Liberty或Basta)的抗性的基因(BAR和/或PAT)，或本领域公知的其他类似基因。 [0192] 转基因植物可以杂交或自交，由此将需要的基因或核苷酸序列传递给后代植物。可使用标准技术例如PCR、酶测定或表型测定、ELISA或蛋白质印迹分析来筛查这种下一代 转基因植物的幼苗中是否存在需要的多核苷酸。或者，如果转化载体包含一个或多个选择 性/可筛选标记，则可从植物后代中选出对特定物质具有抗性或耐受性的植株，或表达独特表型如颜色、细毛或其他独特性状的植株。 [0193] G.在温室中培育植物用于在植物中连续生产靶蛋白 [0194] 使用本发明的方法可规避作物的自然生长周期带来的限制。由于可在温室内使用可控环境农业技术，在规定的环境条件下生产转基因植物，便可以在一年内任何时间，在可优化植物生物质产量的条件下培育出转基因植物。所以，使用本发明的方法能够不受季节 影响持续供应所关注蛋白质，而露天农业系统不可避免会受季节影响。一旦收获含有所关 注蛋白质的转基因植物，便立即用新获得的转基因植物替换掉原有植物，让本发明能够连 续实施。该系统可以连续高效地加工植物生物质，从而增大蛋白质年产率，并最大程度缩小与下游加工过程相关的设备的尺寸和投资成本。 [0195] H.蛋白质分离、纯化与定量 [0196] 取决于要产生的蛋白质的类型和位置，其他蛋白质提取方案对本领域普通技术人员来说也是已知的并且容易获得。例如，在不以任何方式限制的前提下，产生的蛋白质可位于植物的叶、茎或块茎中。同样，取决于治疗性蛋白质的预期用途，多种纯化方案和纯化试剂也是已知的并且容易获得。。 [0197] 提取、分离和纯化马铃薯块茎中的植物来源蛋白质的技术是本领域众所周知的。参见例如Maelville et al.,J.Bio.Chem.247:3445-3453(1972)(Maelville等人，《生物化学杂志》，第247卷，第3445-3453页，1972年)；Bryant et al.,Biochem.15:3418-3424, (1976)(Bryant等人，《生物化学》，第15卷，第3418-3424页，1976年)。通常情况下，马铃薯切片时保持外皮完好，在切出均匀薄片后，放入过滤器中压榨。调节压榨所得汁液的pH值，离心，然后分离滤液和滤渣。采用水洗和热处理完成纯化，合并澄清的滤液部分，冻干。将冻干粉末悬于水中，将其针对水进行透析，得到澄清的滤液，将滤液冻干，得到粗提物。可采用各种技术如HPLC法和质谱法分析粗提物。 [0198] 文献中也描述了提取、分离和纯化叶中蛋白质的方法。参见例如美国专利No.4,400,471和No.4,268,632。像烟草、菠菜、大豆、苜蓿之类植物的肉质叶通常含10％至20％的固形物，其余部分为水。固形物由水溶性部分和水不溶性部分构成，水不溶性部分主要由叶的纤维质结构材料构成。水溶性部分包括分子量(MW)较低的化合物，例如糖类、维生素、生物碱、香料、氨基酸；和分子量较高的其他化合物，例如天然蛋白与重组蛋白。植物组织水溶性部分中的蛋白质可进一步分成两个部分。一部分主要包含光合作用酶，即二磷酸核酮糖 羧化酶。二磷酸核酮糖羧化酶的分子量约为550kD。该部分通常称为“第一部分蛋白质”。二磷酸核酮糖羧化酶含量很高，可占到叶总蛋白量的25％，及叶中固形物的10％。另一部分包含肽、蛋白质与其他化合物的混合物，其中肽和蛋白质的分子量通常在约3kD至约100kD的 范围内，其他化合物包括糖类、维生素、生物碱和氨基酸。该部分统称为“第二部分蛋白质”。 第二部分蛋白质可以是原本就有的天然物质，也可以是异源的蛋白质和肽。转基因植物也 可包含分子量大于1000kD的植物病毒颗粒。 [0199] 分离植物蛋白质的基本过程的第一步通常是切碎叶组织，挤压叶肉，制得最初的植物提取物。该步骤通常在存在还原剂或抗氧化剂的条件下执行，以便抑制氧化，因为不期望发生氧化。最初的植物提取物包含多种蛋白质组分和含绿色色素的细小颗粒状物质，调 节其pH值，再加热。通常情况下，将最初的植物提取物的pH值调节到介于约5.3和约6.0之 间。该范围是经优化的以用于分离出第一部分蛋白质。加热可使含绿色色素物质凝固，且加热温度通常控制在接近50℃。然后，可温和离心去除凝固的含绿色色素物质，得到二级植物提取物。随后冷却该二级植物提取物，再保存在等于或低于室温的温度下。在很长一段时间后，例如24小时之后，二磷酸核酮糖羧化酶从棕色汁液中结晶出来。随后，可离心该提取物，使结晶的第一部分蛋白质与液体分离。第二部分蛋白质保留在液体中，在进一步酸化该液 体，使pH值接近4.5时，第二部分蛋白质可得到纯化。或者，替代冷却二级植物提取物的做法，可向该二级植物提取物添加足量聚乙二醇(PEG)，引起二磷酸核酮糖羧化酶从中结晶出来。可将结晶出来的蛋白质部分溶于某些缓冲剂，供其他分析用。 [0200] 本发明的转基因植物的特征是，治疗性蛋白质的产量相比野生型对照植物增加。可采用本领域已知的数种方法测定蛋白质的增量，这些方法包括(但不限于)蛋白质印迹分 析法、ELISA法和标准布拉德福(Bradford)测定法。 [0201] 可用纯化蛋白质制备药物制剂，这类药物制剂可用于治疗适应的疾病或病症。通常情况下，正如本领域知道的那样，将纯化蛋白质与可药用载体或稀释剂混合时，用到的纯化蛋白质的量不但足以发挥治疗效果，还不会对接受治疗的患者产生不良副作用。要配制 这种药用组合物，需将比重较重的这种蛋白质部分以治疗有效浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合在选定的载体或稀释剂中，这样才能减轻病症。然而，应当理解，可根据病症缓解的程度改变浓度和剂量。还应当理解，给予药物制剂或监督别人给予药物制剂的个人，可依据其判断在一段时间后调整为任一名特定受试者制定的具体剂量方案。 [0202] 药用溶液剂或混悬剂可包含(例如)无菌稀释剂，如水、乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素。可用载体包括水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等，用所述载体可形成溶液剂或混悬剂。如果需要，该药用组合物还可包含无毒的辅助物质，例如润湿剂、乳化剂、增溶剂、抗微生物剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、pH缓冲剂(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液)，以及这些物质的组合。 [0203] I.用转基因马铃薯生产可食用疫苗 [0204] 在植物中表达的疫苗蛋白可提供“可食用疫苗”，人类摄入含有这种疫苗的植物后，身体会受激出现免疫反应，继而对病毒免疫。参见例如Mason et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:11745-11749(1992)(Mason等人《，美国国家科学院院刊》，第 89卷，第11745-11749页，1992年)。借助化学工艺或基于发酵的工艺制造合成肽，生产成本和纯化成本都很高，所以无法将合成肽大规模用作口服疫苗。另一方面，在转基因植物中生产免疫原性蛋白提供了一种经济可行的替代方案。已尝试过产生能表达大肠杆菌(E.coli) 和变异链球菌(Streptococcus mutans)的细菌抗原的转基因植物。例如，Curtiss等人在 WO90/0248中报道了用大肠杆菌LT-B基因转化向日葵的技术。此外，还报道过烟草和马铃薯植株中LT-B基因的表达，以及LT-B基因组装成的结合GM1的五聚体(Haq等人，1995)。另外，Arntzen等人在WO96/12801中公开了用于独立表达与协同表达LT-A、LT-B的载体，这些载体任选地包含SEKDEL微粒体保留信号。 [0205] 用含疫苗基因的载体转化转基因植物，可制得可食用疫苗。可采用蛋白质印迹分析法、ELISA法和标准布拉德福测定法来检测疫苗的产量。转基因植物产生的疫苗无需处 理，可直接施用。 [0206] 或者，可将转基因植物冻干或脱水，除去其水分，用这种方式处理植物材料。可采用空气干燥、喷雾干燥或“冷冻干燥”，来完成“脱水”，其中，“冷冻干燥”是指将植物组合物快速冷冻，随后在冷冻状态(有时称升华状态)脱水，来制备干燥的植物组合物。该处理过程可能需要在真空下进行约1小时至72小时，真空压力足以在大致室温的温度下用环境温度的密封容器有效保存冷冻产品，优选小于约500毫托，更优选小于约200毫托，甚至更优选小于约1毫托。也可将植物材料放置在温度介于约60℃和200℃之间的烘箱内约1小时至72小 时，将其“脱水”。如果植物材料的重量不再随时间延长而变化，就认为植物材料已充分“冻干”或“脱水”。例如，放置在前述温度烘箱内的植物材料，由于水分蒸发，其重量会随时间推移而逐渐减轻。所有水分都蒸发后，植物材料的重量不再改变，可以说植物材料已“脱水”。 不管使用何种干燥方法，优选的是充分脱除材料中所有水分的至少90％(按重量计)。可以 用与避孕多肽相容的可药用赋形剂乳化“冻干”或“脱水”的植物材料，由此进一步“处理”这种“冻干”或“脱水”的植物材料。合适的赋形剂包括(例如)水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及这些物质的组合。在这种情况下，“冻干”或“脱水”的植物材料至少包含40％、优选至少包含50％(按重量计)的赋形剂混合物。此外，如果需要，“冻干”或“脱水”的植物材料可包含微量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增强植物材料功效的辅助剂。在本文中，可将“冻干”或“脱水”植物材料与可药用霜剂、软膏、油膏或栓剂混合，由此进一步处理这种植物材料。在这种情况下，所述植物材料至少包含40％、优选至少包含50％(按重量计)的添加物。或者，可用液体(例如但不限于果汁、蔬菜汁、牛奶、水或其他疫苗制剂重构“脱水”植物材料，由此进一步处理这种植物材料，制得多价或多组分疫苗。 [0207] 下文给出实例来说明本发明。然而，应当理解，本发明并不限于这些实例中描述的具体条件或细节。本说明书全文涉及的任一篇参考文献及所有公开的文档，都以引用方式明确并入本文。 [0208] 实例 [0209] 下文示出了方法和构建体的具体实例。这些实例都只是示例性的，不对本发明构成限制。 [0210] 实例1靶向表达GFP [0211] 将EGFP基因融合到GBSS的信号肽(图21，SEQ ID NO:8)或融合到RuBisCo(二磷酸核酮糖羧化酶)的信号肽(图22，SEQ ID NO:9)，生成两个构建体，用于比较GFP在马铃薯中的表达水平。使用不含信号肽的EGFP基因制得对照载体pSIM1949(图20)。使用荧光显微镜 选择体外长成的强表达GFP的转基因苗。在转基因pSIM1947小植株的叶中检测到极强的GFP 表达，而pSIM1948小植株中的GFP表达只略强于对照构建体中的GFP表达，该对照构建体携 带不含信号肽的EGFP基因，如图23所示。这些结果表明，同时进行的由GBSS转运肽驱动的蛋白质过表达和由会聚启动子驱动的AGP沉默能够有效提高重组蛋白产量。 [0212] 实例2马铃薯块茎特异蛋白PATB1基因沉默 [0213] 申请人还设计了一些核酸构建体，这些核酸构建体使用由马铃薯块茎特异蛋白PATB1基因的核苷酸序列设计的引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)抑制马铃薯块茎特异蛋 白基因表达。为了以块茎特异性方式沉默马铃薯的马铃薯块茎特异蛋白基因，构建了 pSIM1934质粒(图14)。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的 亲本材料生成30种转基因品系。pSIM1934实验品系均未显示块茎中GFP表达增加(图15)。另外，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，10个实验品系中大部分马铃薯块茎特异蛋白(大约 40kDa谱带)因沉默而消除(图16)。 [0214] 实例3CD4B蛋白酶基因沉默 [0215] 申请人设计了一些核酸构建体，这些核酸构建体使用国际马铃薯基因组测序协会公开数据中cDNA序列PGSC0003DMG402014476的CD4B指定区(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6) 抑制CD4B(ATP依赖型蛋白酶ATP结合亚基clpA同源物)表达。为了以块茎特异性方式沉默马 铃薯CD4B基因，构建了pSIM1939质粒(图17)。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成26种转基因品系。分析块茎中的GFP积聚时，与亲本品系(pSIM1903)相比，七种转基因品系显示GFP积累增至2到3倍。(图18)。为确认CD4B基因沉默，对七种转基因品系执行RNA印迹分析，结果显示，与亲本品系(pSIM1903)相比，GFP积累增至 2到3倍。RNA印迹分析在所有品系中均未检测到CD4B转录物，因此确认CD4B基因沉默。这些结果将CD4B蛋白酶沉默与重组蛋白(GFP)产量增至2到3倍关联起来，表明CD4B的块茎特异 性沉默可用于提高重组蛋白产量。 [0216] 实例4在马铃薯中过表达人白介素2(IL-2) [0217] 申请人设计了在马铃薯中过表达所关注基因的核酸构建体。为了在马铃薯植株中过表达人白介素2(IL-2)，构建了pSIM1936质粒(图26)。表达盒 [0218] 将截短形式的人白介素2(IL-2)基因放置在马铃薯的马铃薯块茎特异蛋白内质网转运肽(N端)和内质网滞留信号(C端)之间(图24)。用DNA 2.0(美国美国加利福尼亚州门洛 帕克(Menlo Park,CA,USA))在克隆载体中生成含内质网转运肽的IL-2插入体，IL-2基因和 内质网滞留信号(v1-v48)的48种经密码子优化的变体。每种变体在起始密码子前都具有 BamHI-NcoI限制位点，且在终止密码子后具有SpeI位点(图25)。要让基因在植物中表达，将整个靶向内质网的基因盒插入马铃薯泛素启动子(Ubi7)和马铃薯泛素终止子(Ubi3T)之间 的pSIM1936质粒(图26)中。利用一步式三片段连接反应生成含有经密码子优化的不同IL-2 插入体的六种表达载体。每种变体的经密码子优化的IL-2插入体各不相同(V19、V21、V30、V43、V45、V47)。利用两步式连接反应，其中采用改造过的pSIM1936质粒，经由PCR诱变移除第二个Spe I位点生成另外十二种含有另外的经密码子优化IL-2插入体的表达载体。移除 包含整个表达盒(从启动子到终止子)的ApaI-XhoI片段(2,542bp)，制得空载体对照。使用 Klenow片段(美国马萨诸塞州伊普斯威奇的纽英伦生物技术股份有限公司(New England BioLabs,Inc,Ipswich,MA,USA))填充5'突出端，然后用T4DNA连接酶(美国宾夕法尼亚州匹 兹堡的赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,Pittsburg,PA,USA))进行平端连接。 [0219] 植物转化与生长 [0220] 将Bintje马铃薯母株摆放于品红(Magenta)盒内，盒中装有盐和维生素减半的M516培养基(美国堪萨斯州肖尼米申PhytoTechnology公司(PhytoTechnology,Shawnee Mission,KS,USA))、1.5％蔗糖、2.5g/l葡萄糖酸钙和2g/l结冷胶(pH 5.7)。在含50mg/l卡那霉素和100mg/l链霉素的LB培养基(LB肉汤拜浓度20g/l)中，在28℃下孵育农杆菌属菌株 LBA4404过夜。以9,500rpm的转速离心培养物10分钟，得到沉淀；将沉淀重悬在含3％蔗糖 (pH 5.7)、盐和维生素的正常的M404培养基(PhytoTechnology)中，在600nm处测量光密度 为0.2。从4周龄Bintje马铃薯母株上切下4至6mm长茎段，用含不同表达载体变体的农杆菌 悬液感染10分钟，然后取出。将外植体转移到共培养培养基(1/10M404培养基，含3％蔗糖和 7g/l琼脂(pH 5.7))中培养2天，再转移进诱导愈伤培养基(M404培养基，含3％蔗糖、7g/l琼脂、2.5mg/l玉米素核苷、0.1mg/l NAA、150mg/l特美汀和100mg/l卡那霉素(pH 5.7))。一个月后，将外植体转移进诱导芽的培养基(M404培养基，含3％蔗糖、7g/l琼脂、2.5mg/l玉米素核苷、0.3mg/l赤霉酸、150mg/l特美汀和100mg/l卡那霉素(pH 5.7))。使用选择性生根培养基(大量元素减半的M516培养基，含1.5％蔗糖、100mg/l卡那霉素、100mg/l特美汀和2g/l结冷胶(pH5.7))执行两次生根分析。将植物材料摆放于Percival生长室内，在24℃下度过16 小时的光周期。选出25株表型正常的抗卡那霉素幼苗，置于温室中培育。待植物生根后，置于两加仑装有阳光1号专业混合生长基质(Sunshine Mix#1)(美国马萨诸塞州亚加瓦姆阳 光园艺集团(Sun Gro Horticulture,Agawam,MA,USA))的盆内，每隔两周施用大量元素全 量(full strength)的Miracle Grow肥料(每加仑水加入1汤匙)三次。每加仑盆施加一杯营 养液(两加仑盆施加两杯)。植物在控制温度(最低18℃，最高27℃)的温室中生长3个月后，采集半熟的块茎。实验在夏季进行，未额外补充光照/生长时间。 [0221] 量化IL-2 [0222] 下面描述利用ELISA测定IL-2产量的方法：用4mm木塞穿孔器从块茎中心取出50mg样品。将样品置于盛有250μl检测缓冲液的1.5ml离心管内，用研磨杵研磨，使样品匀化。匀浆缓冲液和样品始终保持在冰上，然后在4℃下以9500rpm的转速离心20分钟。根据BD OptEIA人IL-2ELISA试剂盒II号方案(美国加利福尼亚州圣何塞碧迪生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA,USA))执行ELISA分析。用多模式检测器DTX 880(贝克曼库尔特 公司(Beckman Coulter))读取96孔板中样品的数据。从单个块茎各取一份样品，筛分每种 独立的品系。筛出IL-2产量最高的品系，从其中的三个单独块茎分别重新取得样品。在450/ 458nm处读取吸光度。 [0223] 结果 [0224] 图27示出独立转化的Bintje马铃薯品系的块茎中的IL-2产量，这些品系分别用6种经密码子优化的IL-2变体中的3种(V19、V21和V30)转化。1936-18为未优化的阳性对照。 对于每种变体，构建了25个独立的转基因品系。每种颜色分组代表一种用于转化的经密码 子优化的IL-2变体。每个条代表来自同一个独立转基因品系的三个单独块茎的平均IL-2水 平。结果表明，在由不同密码子变体获得的特异性转基因品系中，IL-2产量增至2到3倍。在另外的实验中(数据未示出)，特异性转基因品系的IL-2产量甚至增至11倍。 [0225] 类似地，图28示出独立转化的Bintje马铃薯品系的块茎中的IL-2产量，这些品系分别用12种经密码子优化的IL-2变体转化。1936-18为未优化的阳性对照。对于每种变体，构建了25个独立的转基因品系。每种颜色代表一种用于转化的经密码子优化的IL-2变体。 每个条代表来自同一个独立转基因品系的三个单独块茎的平均IL-2水平。结果表明，在由 不同密码子变体获得的特异性转基因品系中，IL-2产量增加了2.5倍。 [0226] 实例5在马铃薯中过表达其他所关注基因 [0227] 申请人用其他实施例表明，绿原酸诱导物(CAI)基因过表达刺激绿原酸、花青素和类黄酮增至四倍(图3)。 [0228] 类似地，使用本发明的方法在马铃薯中过表达维生素C生物合成(VTC2)基因(图5)。 [0229] 同样，在强组成型启动子过表达的情况下，GFP基因在马铃薯茎外植体中的表达水平显著增加(图6)；而且根据本发明的方法，可以在马铃薯的花、叶和茎中获得较高的GUS基因表达水平(图7)。 [0230] 实例6过表达RNA沉默抑制子P19 [0231] 一旦转基因植物宿主体内启动转录后基因沉默(PTGS)，该植物宿主的异源蛋白表达水平便会降低。植物病毒基因沉默抑制子(例如P19)表达能够减轻叶片对PTGS的响应，使异源蛋白表达水平提升至数倍(Circelli et al,2010Bioengineered Bugs 1:221-224 (Circelli等人，《生物工程昆虫》，第1卷，第221-224页，2010年))。申请人吃惊地发现，P19表达还增加了块茎中GFP的产量。 [0232] 构建了pSIM1927质粒(图10)，该质粒在T-DNA边界内包含由2x 35S启动子驱动的P19R43(SEQ ID NO:2)P19突变体。由最初使用pSIM1903载体(图9)转化的过表达GFP(SEQ ID NO:7)的亲本材料生成33种过表达P19R43的品系。所有品系均在温室中正常生长，无明 显多向性效应。以空载体品系(pSIM1361)和亲本品系(pSIM1903)为对照，目视筛选出累积 了块茎特异性GFP的转基因品系。选出12个显示较高GFP表达水平的品系，量化GFP，并执行蛋白质印迹分析和RNA印迹分析。检测结果显示，这12个转基因品系中有10个的GFP量较之 空载体品系的GFP量，增加了20％至60％(图11，图12)。 [0233] 为确认P19基因表达，使用P19探针分析了显示较高GFP表达水平的七个品系的RNA。在三个品系中检测到了P19转录物，这三个品系包括GFP表达水平最高的两个品系(图 13)。这些结果将突变的P19RNA沉默抑制子表达与GFP蛋白质表达水平升高关联起来，表明 抑制P19(一种RNA沉默抑制子)提高了植物中的蛋白质产量。 [0234] 实例7同步进行GFP过表达与马铃薯块茎特异蛋白及CD4B基因抑制 [0235] 为该实例构建的表达盒包含用于抑制马铃薯块茎特异蛋白和CD4B基因表达的组分。用包含该表达盒的载体转化过表达GFP的亲本材料，生成了约30种转基因品系。分析转基因植株块茎中聚积的GFP，观察到GFP产量比未转化品系、只抑制了马铃薯块茎特异蛋白 的转基因品系和只抑制了CD4B基因的转基因品系都高。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明， 大部分马铃薯块茎特异蛋白(大约40kDa谱带)消失。RNA印迹分析表明CD4B转录受到抑制。 GFP产量由于马铃薯块茎特异蛋白和CD4B基因表达同时受抑制而提高。 [0236] 实例8同步进行P19和GFP过表达与马铃薯块茎特异蛋白基因抑制 [0237] 为该实例构建的表达盒包含用于抑制马铃薯块茎特异蛋白基因表达并过表达P19的组分。用包含该表达盒的载体转化过表达GFP的亲本材料，生成了约30种转基因品系。转基因植株块茎中的GFP产量比未转化品系和只抑制了马铃薯块茎特异蛋白基因的转基因品 系都高。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析证实马铃薯块茎特异蛋白基因受到抑制。为确认P19基因表达，使用P19探针分析了显示较高GFP表达水平的多个品系的RNA。 [0238] 实例9同步进行GFP和P19基因过表达与马铃薯块茎特异蛋白及CD4B基因抑制 [0239] 为该实例构建的表达盒包含过表达P19和GFP、并抑制马铃薯块茎特异蛋白基因和CD4B基因的组分。用包含该表达盒的载体转化过表达GFP的亲本材料，生成了约30种转基因品系。转基因植株块茎中的GFP产量比未转化品系、只抑制了马铃薯块茎特异蛋白基因的转基因品系(实例8)和只过表达了GFP却未过表达P19的转基因品系(实例7)都高。 [0240] 实例10基因沉默效果和用马铃薯块茎生产蛋白质的过表达策略 [0241] 我们将GFP报告基因量化，由此确定各种基因沉默的效果和用马铃薯块茎生产重组蛋白的过表达策略。沉默策略与过表达策略如下：(a)只沉默CD4B，用35S启动子驱动GFP表达；(b)沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白基因，用35S启动子驱动GFP表达；(c沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白基因并过表达P19，用35S启动子驱动GFP表达；(d)沉默AGP，由GBSS转运肽靶向GFP表达并用35S启动子驱动GFP表达；(e)沉默AGP，由Rubisco转运肽靶向GFP表达并用35S启动子驱动GFP表达；(f)沉默AGP，用35S启动子驱动GFP表达。把用35S启动子驱动GFP表达的GFP pSIM1903构建体作为对照。表2汇总了这些策略。 [0242] 表2 [0243] [0244] [0245] 植物转化与生长 [0246] 如实例4所述那样摆放和转化Bintje马铃薯母株，不同的是，农杆菌悬液含有表2示出的不同种构建体。选用5mg/L潮霉素转化pSIM1903-2亲本品系。 [0247] 量化蛋白质 [0248] 就量化GFP来说，分析每种变体转化25个品系的结果，但只分析组成型CD4B沉默变体转化10个品系的结果。用4mm木塞穿孔器从块茎中心取出50mg样品。将样品置于盛有250μl检测缓冲液的1.5ml离心管内，用研磨杵研磨，使样品匀化。匀浆缓冲液和样品始终保持在冰上，然后在4℃下以9500rpm的转速离心20分钟。根据BioVision试剂盒(#K815-100)方案 (美国加利福尼亚州米尔皮塔斯生物视野股份有限公司(BioVision Inc.,Milpitas,CA, USA))量化GFP。用多模式检测器DTX 880(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))读取96孔 板中样品的数据。在450/458nm处读取吸光度。 [0249] 结果 [0250] 图29示出了不同种沉默、过表达和靶向策略对异源蛋白质产量(由GFP表达水平衡量)的影响。分析每种策略转化25个品系的结果，但只分析CD4B沉默策略转化10个品系的结果。每个条各代表分析了GFP表达的三个块茎。只沉默CD4B、或沉默CD4B和马铃薯块茎特异蛋白基因(红色、黄色和橙色条)相比GFP对照，只略微提高了蛋白质水平。使用GBSS启动子和会聚AGP启动子沉默AGP，并利用颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)转运肽驱动GFP过表达(绿色 条)，使蛋白质水平显著增加，增至4到6倍。沉默靶向肽的二磷酸核酮糖羧化酶(Rbcs)(蓝色条)只导致一个品系的蛋白质显著增加。沉默ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)(灰色条)导致GFP 含量显著增加，增至3倍。这些结果清楚表明，使用根据本发明的多种沉默、过表达和靶向策略，能够显著提高马铃薯块茎中异源蛋白的产量。 |
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