基因沉默 |
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| 申请号 | CN200580040336.X | 申请日 | 2005-09-23 | 公开(公告)号 | CN101389755B | 公开(公告)日 | 2014-06-11 |
| 申请人 | J.R.西姆普罗特公司; | 发明人 | C·M·T·罗门斯; H·颜; O·布格里; K·M·M·斯沃兹; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于产生下调或阻止期望的目标多核苷酸表达的核酸产物的独特策略和构建体。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包含表达盒的构建体，所述表达盒包含(i)与第一多核苷酸可操作连接的第一启动子和(ii)与第二多核苷酸可操作连接的第二启动子，其中(a)第一和第二多核苷酸都不与终止子可操作地连接，(b)第二多核苷酸与第一多核苷酸反向互补，和(c)第一启动子启动的转录的方向朝向第二启动子，第二启动子启动的转录的方向朝向第一启动子，其中所述第一多核苷酸与目标序列的至少20个连续核苷酸在序列上100％相同。 |
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| 说明书全文 | 基因沉默[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 这个常规美国专利申请要求2004年9月24日提交的美国临时申请系列号60/612,638，2004年10月20日提交的60/619,959、2005年2月16日提交的60/653,609、 以及2005年4月5日提交的60/668,071的优先权，通过引用将所有这些并入本申请。 [0003] 发明领域 [0004] 本发明涉及用于产生下调或防止期望的目标多核苷酸表达的核酸产物的独特构建体。 [0005] 发明背景 [0006] 基因表达的抑制可以通过构建体来实现，所述构建体引发转录后的或转录的基因沉默。通过染色质修饰、RNA裂解、翻译抑制或通过迄今未知的机制，这些沉默机制可以下调期望的多核苷酸或基因表达。参见Meister G.和Tuschl T.，Nature，vol.431，pp.343-349， 2004。 [0007] 一般为此使用的构建体含有期望的多核苷酸，所述多核苷酸与目标基因的至少一部分具有序列同一性，所述目标基因与启动子或终止子可操作地连接。公认地，启动子启动 转录，而终止子在特定位点结束转录并介导多腺苷酸化。这种转录产物加工对于转录产物 的稳定性和其从核到细胞质的转运是重要的。 [0008] 就此而言，终止子在常规的基因沉默构建体中起重要作用。例如，WO 99/53050描述了一种包含启动子、多核苷酸和终止子的构建体，所述多核苷酸包含与目标基因同源的 第一序列和与目标基因反向互补的第二序列。常规构建体的终止子不一定必须位于紧邻期 望的多核苷酸的下游。例如，Mette和同事描述了含有期望的多核苷酸的质粒，所述多核苷 酸通过潮霉素基因与可操作地连接的终止子分离(Mette et al.，EMBO J 18：241-8，1999； Mette et al，EMBO J 19：5194-201，2000)。 [0009] 设计用来沉默基因的其他常规构建体含有在启动子和终止子之间有义或反义取向的多核苷酸。这种常规的基因沉默构建体一般产生大小相似的RNA转录产物，所述大小 通过从转录开始到终止裂解位点和聚腺苷酸化尾部的距离来确定。 [0010] 本发明涉及新的策略和构建体，用于比常规构建体普遍更有效的基因沉默。此外，本发明涉及用于基因沉默的新的策略和构建体，使用多核苷酸，所述多核苷酸不与启动子 和终止子可操作地连接，而与两个会聚取向(convergently-oriented)的启动子可操作地 连接。 [0011] 发明概述 [0012] 本发明的策略和构建体的特点在于特定的特征。例如，本发明的构建体可以不包含如涉及3′-末端形成和多聚腺苷酸化的终止子之类的DNA区。可选择地，构建体可以包 括非功能性终止子，其是天然状态下无功能的或其已经被修饰或突变而变成无功能的。 [0013] 构建体的特征还可以在于启动子位于期望的多核苷酸两侧的排列。因此，本发明的构建体可以包含两个或多个启动子，它们位于一个或多个期望的多核苷酸的两侧，或位 于期望的多个拷贝的多核苷酸的两侧，从而期望的多核苷酸的每条链都被转录。也就是说， 一个启动子可以定向来启动期望的多核苷酸的5′-末端的转录，而第二个启动子可操作 地定向来启动同一期望多核苷酸的从3′-末端的转录。相对地，定向的启动子可以位于期 望的多个拷贝的的多核苷酸两则。因此，“拷贝数”可以变化，从而构建体可以包含期望的多核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100，或超过100个拷贝，或期间的任何整数，最终定向以诱导会聚转录的启动子位于期望核苷酸两侧。 [0014] 可选择地，第一启动子可以可操作地连接到例如“盒A”中的第一多核苷酸，第二启动子可以可操作地连接到例如“盒B”中的第二多核苷酸。每个盒的多核苷酸可以包含 也可以不包含相同的核苷酸序列，但可以具有与感兴趣的目标核酸一定百分比的序列同一 性。盒可以串联排列，即，由此它们在构建体中相互邻近。此外，例如，盒B可以按照与盒A 反向互补的取向来定向。因而，在这种排列中，从盒B的启动子的转录将在朝向盒A的启动 子的方向上进行。因 此，排列盒来诱导“会聚转录(convergent transcriptian)”。 [0015] 如果两个盒都不包含终止子序列，则这种构建体通过会聚转录可以产生不同长度的RNA转录产物。 [0016] 因而，在这种情况下，存在着部分或完全地转录的RNA转录产物的亚群，其包含来自相应的盒的、转录的期望多核苷酸的部分或全长序列。可选择地，在不存在功能性终止子 的情况下，转录可以通过期望的多核苷酸的末端来产生比期望的多核苷酸的长度更长的转 录产物。 [0017] 因而，在包含期望的多核苷酸的两个拷贝的构建体中，其中多核苷酸之一可以按照也可以不按照与另一个反向互补的反向来定向，其中多核苷酸可操作地连接到启动子来 诱导会聚转录，并且在所述构建体中不存在功能性的终止子，从一个期望的多核苷酸启动 的转录机制可以继续来转录期望的多核苷酸的另一个拷贝，反之亦然。期望的多核苷酸的 多个拷贝可以按照各种排列(permutation)来定向：在构建体中存在期望多核苷酸的两个 拷贝的情况下，例如，拷贝可以都按相同的方向、按相互相反的取向、或相互反向互补的取 向来定向。 [0018] 在其中期望多核苷酸之一按照与另一个多核苷酸反向互补的取向来定向的排列中，可以产生RNA产物，其不仅包含第一多核苷酸的“有义”序列，还包含来自第二多核苷酸的“反义”序列。如果第一和第二多核苷酸包含相同或基本上相同的DNA序列，则单个RNA 转录产物可以包括相互互补、可以退火的两个区域。因此，这样转录的单个RNA转录产物可 以形成部分或完全的发夹双链体结构。 [0019] 另一方面，如果产生两个拷贝的这种长转录产物，各来自一个启动子，则将存在两个RNA分子，每一个将具有与另一个互补的序列区域。因此，第一RNA转录产物的“有义” 区可以与第二RNA转录产物的“反义”区退火，反之亦然。在这种排列中，可以形成另一种 RNA双链体，其由两个独立的RNA转录产物组成，与由单个自我互补的RNA转录产物形成的 发夹双链体不同。 [0020] 可选择地，期望多核苷酸的两个拷贝可以按照相同的方向来定向，从而，在转录读通(read-through)的情况下，从一个启动子产生的长RNA转录产物可以包括，例如，期望 多核苷酸的第一拷贝的有义序列，以及期望多核苷酸的第二拷贝的有义序列。因此，从另 一 个会聚定向的启动子产生的RNA转录产物可以包含期望多核苷酸的第二拷贝的反义序 列以及第一多核苷酸的反义序列。从而，可能两个RNA转录产物将都不含有精确互补的区 域，并因而两个RNA转录产物不可能自身折叠来产生发夹结构。另一方面，两个单独的RNA 转录产物可以相互杂交和退火来形成RNA双链体。 [0021] 一方面，本发明提供了一种构建体，其缺乏终止子或缺乏前面是编码自剪接核酶的DNA区的终止子，但其包含与可操作地连接到第一多核苷酸的第一启动子和可操作地连 接到第二多核苷酸的第二启动子，由此(1)第一和第二多核苷酸互相具有至少一些序列同 一性，(2)第一启动子被定向使得由这个启动子启动的转录方向朝向第二启动子，反之亦 然，和(3)这种会聚排列产生长度普遍不同的一系列RNA转录产物。 [0022] 期望的多核苷酸可以是相互的理想或非理想重复，或相互的理想或非理想反向互补重复。对于包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的构建体的构建体来说，第二多核苷酸可 以在核苷酸序列上与第一多核苷酸完全或部分相同，并按照相对第一多核苷酸的正向或反 向互补的取向来定向。因而，第一和第二多核苷酸可以是相互的理想重复。另一方面，第二 多核苷酸可以是第一多核苷酸的非理想重复，也就是说第二多核苷酸可以与第一多核苷酸 具有序列同一性，但在序列上不是完全地或部分地相同，即，第二多核苷酸是一种非理想的 重复。该第二多核苷酸也可以被定向为正向重复或者置于相对第一多核苷酸的反向互补取 向上。 [0023] 所述的任何多核苷酸，例如期望的多核苷酸，或第一或第二多核苷酸，例如，可以与于目标序列的至少一部分相同，或可以具有与目标序列的至少一部分的序列同一性。当 期望的多核苷酸包含与目标序列的片段同源的序列时，即，它与目标序列的至少一部分具 有序列同一性，则期望的是，所述片段的核苷酸序列特异于所述目标基因，和/或存在于所 述期望的多核苷酸中的目标核酸的部分理想或非理想序列，具有足够的长度以具有针对目 标序列的特异性。因此，与目标序列的一部分具有序列同一性的、期望的部分多核苷酸可以 包含目标序列的同种型或同源物特征性结构域、结合位点或核苷酸序列。因此，可设计靶向 细胞中目标核酸最佳的期望的多核苷酸。 [0024] 在另一个实施方式中，期望的多核苷酸包含与目标核酸的DNA或RNA序列具有序列同一性的、优选的在4和5,000个核苷酸之间、更优选的在50和1,000个核苷酸之 间、最优选的在150和500个之间的序列。所述期望的多核苷酸可以具有在序列上与目标 序列中的序列100％相同的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或超过500个连续核苷酸，或其中的任何整数个，或者期望的多核苷酸包含与目标序列的序列具有约99％、98％、97％、96％、 95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、 80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、 65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、 50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、 35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、8％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、 20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、 4％、3％、2％、1％的核苷酸序列同一性的序列。换句话说，期望的多核苷酸可以与目标序列的全长序列或目标序列的片段同源或具有同源性。 [0025] 因此，本发明提供了包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸与目标序列具有同源性，并因而在严格或中度杂交条件下与在此描述的目标序列的一部分杂交。与多 核苷酸的一“部分”杂交的多核苷酸指与参考多核苷酸的至少约15个核苷酸、更优选的至 少约20个核苷酸、再更优选的至少约30个核苷酸、再更优选30个以上的核苷酸杂交的多 核苷酸(DNA或RNA)。对于本发明来说，具有同源性的两个序列，即，期望的多核苷酸和目 标序列，当它们在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt′s溶液和100μg非特异性载体DNA的 杂交溶液中形成双链复合物时，可以杂交。参见Ausubel et al，section 2.9，supplement 27(1994)。这种序列可以在“中度严格”杂交，其被定义为60℃的温度、在6×SSC、0.5％ SDS、5×Denhardt′s溶液和 100μg非特异性载体DNA的杂交溶液中。对于“高度严格” 杂交，温度提高到68℃。在中度严格杂交反应之后，在2×SSC加0.05％SDS的溶液中在室 温下洗涤五次，随后用0.1×SSC加0.1％SDS在60℃洗涤1小时。对于高严格的，洗涤温 度提高到一般约68℃的温度。杂交的核苷酸可以是使用具有10,000cpm/ng的比放射性的 放射性标记的探针检测的那些，在此杂交的核苷酸在-70℃暴露于X射线底片不超过72小 时之后清楚地可见。 [0026] 在一个实施方式中，本发明的构建体可以包含产生核酸的表达盒，与不含有所述构建体的细胞相比，所述核酸降低由含有所述构建体的细胞正常表达的目标基因的表达 水平的99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、 85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、 70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、 55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、 40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、 25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、 10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％。 [0027] 本发明的任何多核苷酸，不管是“期望的多核苷酸”、“第一”多核苷酸、“第二”对核苷酸，都可以与目标序列具有一定百分比的序列同一性。如在此解释的，目标序列可以是，但不限于，基因的部分或全长序列、调节元件，例如启动子或终止子、外显子、内含子、非翻译区、或目标基因序列的上游或下游的任何序列。因而，本发明的多核苷酸可以包含在序 列的长度上与目标序列相同的序列。另一方面，本发明的多核苷酸可以包含与目标序列具 有序列同一性的序列。因此，本发明的期望的多核苷酸与目标序列的序列可具有约99％、 98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、 83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、 68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的核苷酸序 列同一性。 [0028] 在另一个实施方式中，期望的多核苷酸包含来自目标启动子的序列。所述目标启动子可以是细胞基因组中天然存在的，也就是，所述目标启动子对于所述细胞基因组是内 源的，或可以通过转化导入到该基因组中。来自多核苷酸的启动子可以是功能上有活性的， 可以含有TATA盒或TATA盒样序列，但转录起始或任何转录的序列都不超过转录起点。可 选择地，来自多核苷酸的启动子可以是通过例如TATA框的缺失而功能上失活的。这种衍生 的启动子可以仅代表目标启动子的部分。 [0029] 在另一个实施方式中，期望的多核苷酸包含特异于内含子的序列，所述内含子对于细胞基因组是内源的。 [0030] 在另一个实施方式中，期望的多核苷酸包含是终止子的部分的序列，所述终止子对于细胞基因组是内源的。 [0031] 在另一个实施方式中，所述构建体含有在目标组织中功能上有活性的两个相同的启动子。在另一个实施方式中，所述构建体包含两个不同的启动子，它们每一个在目标组织 中是功能上有活性的。 [0032] 本发明的构建体可以进一步包含在盒A和盒B之间的一个或多个其他的多核苷酸。例如，在5′-到3′-取向上，构建体可以包含(i)第一启动子，(ii)期望的多核苷 酸，(iii)另外的多核苷酸间隔区，例如，内含子，(iv)期望的多核苷酸的反向互补拷贝，和(v)第二启动子，其中所述第一和第二启动子分别与所述期望的多核苷酸和所述互补拷贝 可操作地连接，并且被定向来诱导会聚转录。 [0033] 另外的间隔区多核苷酸可以是任何长度。也就是，所述间隔区多核苷酸可以是长度上2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或500个以上的核苷酸，或中间的任何整数。如果在两个期望的多核苷酸之间的间隔区多核苷酸足够长，转录可 以不从一个启动子进行到另一个。也就是说，无论什么理由，虽然转录机制位于不含功能上 有活性的终止子元件的间隔区中，而转录可以停止。因而，产生的转录产物可以包含第一期 望的多核苷酸的全长序列和内含子的部分序列，但没有第二期望的多核苷酸的部分。因此， 有可能用间隔区多核苷酸来设计在此描述的构建体，所述间隔区多核苷酸防止转录从一个 期望的多核苷酸进行到另一个。在这种情况下，如果期望的多核苷酸之一被定向作为另一 个的反向互补拷贝，则防止转录通读因而避免自我互补的RNA转录产物的合成。 [0034] 根据(i)启动子和期望的多核苷酸的会聚排列，(ii)期望的多核苷酸的拷贝数，(iii)构建体的终止子区的缺乏，和(iv)产生的转录产物的互补性和长度，可以从当前构 建体产生各种RNA分子群体。 [0035] 因而，本发明的单个构建体可以产生(i)单链的“有义”RNA转录产物，(ii)单链的“反义”RNA转录产物，(iii)由自身退火的单链RNA转录产物形成的发夹双链体，或(iv) 由相互退火的两个不同RNA转录产物形成的RNA双链体。可以设计单个构建体来从每个会 聚排列的启动子产生仅有义的或仅反义的RNA转录产物。 [0037] 就此而言，来自任何物种的任何类型的细胞均可以暴露于本发明的构建体或用本发明的构建体稳定地或短暂地转化。因而，可以用本发明的构建体转化细菌细胞、病毒细 胞、真菌细胞、藻类细胞、蠕虫细胞、植物细胞、昆虫细胞、爬行动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞或哺乳动物细胞。因此，目标序列可以位于这些细胞类型的任一种的核或基因组中。因 此，目标序列可以位于细胞基因组的基因中。因而，目标序列可以位于基因的调节元件、基 因的外显子、基因的内含子、基因的5′-非翻译区或基因的3′-非翻译区的至少一种中。 在一个实施方式中，基因的调节元件是基因的启动子或增强子元件的至少一种。 [0038] 可选择地，目标序列可以位于RNA转录产物中，所述RNA转录产物在这些细胞之一中存在并且可能或可能不由该细胞正常地产生。也就是说，包含目标序列的RNA转录产物 可以从对于宿主细胞而言是外源的来源产生。例如，包含目标序列的RNA转录产物可以是 病 毒来源的但存在于植物细胞中。 [0039] 本发明还包含期望的构建体对细胞基因组或分离的核酸制备物的试管内、体外、植物外和体内的暴露和整合。 [0040] 例如，本发明的构建体可以被插入含有转化植物细胞所必需的T-DNA边界元件的农杆菌(Agrobacterium)衍生的转化质粒。因而，可以用这种转化构建体来转化植物细胞 的培养物，成功地转化的细胞生长成表达会聚运行的启动子/多核苷酸盒的期望的转基因 植物。 [0041] 启动子可以是组成型的或诱导型启动子或其排列。例如，“强”启动子可以是从病毒分离的那些，例如，水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus)、玉米 条纹病毒(maize streak virus)、木薯叶脉病毒(cassava vein virtts)、紫茉莉病毒 (mirabilis virus)、peanutchlorotic streak caulimovirus、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus)和小球藻病毒(chlorella virus)。其他启动子可以从细菌克隆，例如，胭 脂碱合酶和章鱼碱合酶基因的启动子。存在各种诱导型启动子，但一般地，诱导型启动子 是温度敏感性启动子、化学诱导的启动子或时序启动子。具体地，诱导型启动子可以是Ha hsp17.7 G4启动子、小麦wcs 120启动子、Rab 16A基因启动子、α淀粉酶基因启动子、pin2 基因启动子或羧化酶启动子。 [0042] 本发明的另一个方面是包含表达盒的构建体，所述表达盒包含(i)与第一多核苷酸可操作连接的第一启动子和(ii)与第二多核苷酸可操作连接的第二启动子，其中(a)第 一或第二多核苷酸都不与终止子可操作地连接，(b)第二多核苷酸的至少部分在核苷酸序 列上与第一多核苷酸的序列的至少部分基本上同一，但以与第一多核苷酸不同的取向定位 于盒中，和(c)从第一启动子启动的转录的方向朝向第二启动子以及从第二启动子启动的 转录的方向朝向第一启动子。 [0043] 在一个实施方式中，第二多核苷酸的至少部分定向为第一个多核苷酸的至少部分的反向互补拷贝。 [0044] 在另一个实施方式中，两种多核苷酸都不可操作连接的、终止转录的序列是在基因的3′-末端、涉及该基因的转录产物的3′末端形成和多聚腺苷酸化的序列。 [0045] 在优选的实施方式中，涉及3′-末端形成和多聚腺苷酸化的序列是终止子。 [0046] 在另一个实施方式中，所述表达盒不包含(i)nos基因终止子，(ii)T-DNA基因7的3′非翻译序列，(iii)花椰菜花叶病毒的主要包含体蛋白基因的3′非翻译序列，(iv)豌 豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚基的3′非翻译序列，(v)马铃薯遍在蛋白-3基因的3′ 非翻译序列，或(vi)马铃薯蛋白酶抑制因子II基因的3′非翻译序列，(vii)opine基因的 3非翻译序列，(viii)内源基因的3非翻译序列。 [0047] 在一个实施方式中，第一多核苷酸包含一种序列，所述序列与目标基因或者与该目标基因相连的调节元件、目标基因的外显子、目标基因的内含子、目标基因的5′-非翻 译区、或目标基因的3′-非翻译区的至少一个具有序列同一性。 [0048] 在另一个实施方式中，第一多核苷酸包含与目标序列的序列具有约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、 82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、 67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、 52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、 37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、8％、27％、26％、25％、24％、23％、 22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、 6％、5％、4％、3％、2％、1％的核苷酸序列同一性的序列。 [0049] 在一个实施方式中，目标基因是与木质素生物合成相关的COMT基因、与木质素生物合成相关的CCOMT基因、与木质素生物合成相关的任何其他基因、与淀粉磷酸化相关的 R1基因、与淀粉磷酸化相关的磷酸化酶基因、与多酚的氧化相关的PPO基因、与果胶降解相 关的多聚半乳糖醛酸酶基因、与过敏原的产生相关的基因、与脂肪酸生物合成相关的基因 例如FAD2。 [0050] 在另一个实施方式中，(a)目标基因的调节元件是与该目标基因相连的启动子或增强子元件，或(b)第一多核苷酸包含与目标基因的内含子具有序列同一性的序列，其中 所述内含子包含SEQ IDNO：44的序列。 [0052] 在一个实施方式中，目标序列位于编码RNA转录产物的DNA序列中。 [0053] 在另一个实施方式中，第一和第二启动子是在植物中有功能的。 [0054] 在优选的实施方式中，所述表达盒位于适合于细菌介导的植物转化的质粒的转化-DNA边界序列(transfer-DNA bordersequence)之间。 [0055] 在又一 个实 施方式 中，所述 细菌是 农杆 菌、根瘤 菌或叶 瘤杆 菌(Phyllobacterium)。在一个实施方式中，所述细菌是根癌农杆菌、三叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌、紫金牛叶瘤杆菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)、苜蓿中华根瘤菌(SinoRhizobium meliloti)和百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)。 [0056] 在一个实施方式中，所述构建体进一步包含位于第一和第二多核苷酸之间的间隔区多核苷酸。所述间隔区多核苷酸长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、300、400、500或超过500个核苷酸。 [0057] 在另一个实施方式中，所述第一启动子是近-组成型启动子(near constitutivepromoter)、组织特异性启动子或诱导型启动子，并且其中第二启动子是近-组成型启动 子、组织特异性启动子或诱导型启动子。 [0058] 在特定实施方式中，组成型强启动子选自由马铃薯遍在蛋白-7启动子、马铃薯遍在蛋白-3启动子、番茄遍在蛋白启动子、苜蓿petE启动子、苜蓿Pal启动子、油菜napin启 动子、玉米遍在蛋白启动子、稻遍在蛋白启动子、甘蔗遍在蛋白启动子、稻肌动蛋白启动子、核酮糖小亚基启动子和核酮糖激酶启动子。 [0060] 在一个实施方式中，所述可诱导启动子是温度敏感的启动子、化学诱导的启动子或时序启动子。 [0061] 在一个实施方式中，所述诱导型启动子选自Ha hsp17.7G4启动子、小麦wcs l20启动子、Rab 16A基因启动子、α-淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子和羧化酶启动子。 [0062] 本发明的另一个方面是包含表达盒的转化质粒，所述表达盒在5′到3′方向上包含与第一期望的多核苷酸(2)可操作连接的第一启动子(1)，其邻接至少一个任选的间 隔区多核苷酸(3)，其中所述间隔区多核苷酸之一的3′-末端邻接第二期望的多核苷酸 (4)，其与第二启动子(5)可操作地连接，其中所述表达盒中的期望的多核苷酸都不与任何 已知的转录终止子可操作连接。 [0063] 在一个实施方式中，第一期望的多核苷酸的至少部分处于反义取向，和其中第二期望的多核苷酸的至少部分被定向为第一期望的多核苷酸的反向互补。 [0064] 在另一个实施方式中，第一期望的多核苷酸的至少部分处于有义取向，和其中第二期望的多核苷酸的至少部分定向为第一期望的多核苷酸的反向互补。 [0065] 在另一个实施方式中，第一期望的多核苷酸的至少部分是启动子序列。 [0066] 在进一步的实施方式中，启动子序列来源于选自(1)淀粉相关R1基因启动子，(2)多酚氧化酶基因启动子，(3)脂肪酸脱饱和酶12基因启动子，(4)微粒体的Ω-6脂肪酸 脱饱和酶基因启动子，(5)棉花硬脂酰-酰基-载体蛋白Δ9-脱饱和酶基因启动子，(6) 油酰基磷脂酰胆碱Ω6-脱饱和酶基因启动子，(7)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)咖啡 酸/5-羟基阿魏酸3/5-O-甲基转移酶(COMT)基因启动子，(8)紫苜蓿咖啡酸/5-羟基阿 魏酸3/5-O-甲基转移酶(COMT)基因启动子，(9)蒺藜苜蓿咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移 酶(CCOMT)基因启动子，(10)紫苜蓿咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移酶(CCOMT)基因启动子， (11)主要苹果过敏原Mal d1基因启动子，(12)主要花生过敏原Ara h2基因启动子，(13) 主要大豆过敏原Gly m Bd 30K基因启动子，和(14)多聚半乳糖醛酸酶基因启动子的启动 子。 [0067] 在一个实施方式中，(i)第一和第二启动子的是至少一个是GBSS启动子，和(ii)第一期望的多核苷酸的是来自多酚氧化酶基因的序列。 [0068] 在另一个实施方式中，第一和第二启动子是GBSS启动子。 [0069] 在一个实施方式中，第一启动子是GBSS启动子，第二启动子是AGP启动子。 [0070] 本发明的另一个方面是降低通常能在植物细胞中表达的基因的表达的方法，包括使植物细胞暴露于在此描述的任何构建体，其中所述构建体维持在细菌菌株中，其中所述 期望的多核苷酸包含与所述植物细胞基因组中的目标序列具有序列同一性的序列。 [0071] 在一个实施方式中，所述细菌是菌株根癌农杆菌、三叶草根瘤菌(Rhizobiumtrifolii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、紫金牛叶瘤杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)、苜蓿中华根瘤菌(SinoRhizobium meliloti)和百脉根中间根瘤菌 (MesoRhizobium loti)。 [0072] 本发明的另一个方面是包含表达盒的构建体，所述表达盒在5′到3′方向上包含(i)第一启动子，(ii)包含与目标基因的启动子序列的至少一部分具有序列同一性的序 列的第一多核苷酸，(iii)包含与目标基因的启动子的至少部分的反向互补物具有序列同 一性的序列的第二多核苷酸，和(iv)第二启动子，其中所述第一启动子与第一多核苷酸的 5′-末端可操作地连接，所述第二启动子与第二多核苷酸的3′-末端可操作地连接。 [0073] 本发明的另一个方面是包含表达盒的构建体，所述表达盒在5′到3′方向上包含(i)第一启动子，(ii)包含与目标基因的启动子序列的至少一部分具有序列同一性的序 列的第一多核苷酸，(iii)包含与目标基因的启动子的至少部分的反向互补物具有序列同 一性的序列的第二多核苷酸，和(iv)终止子，其中所述第一启动子与所述第一多核苷酸的 5′-末端可操作地连接所述第二多核苷酸与所述终止子可操作地连接。 [0074] 本发明的另一个方面是包含SEQ ID NO：40或42中所示的序列的植物转化质粒。 [0075] 本发明的另一个方面是降低块茎中冷诱导的糖化的方法，包括在块茎的细胞中表达在此描述的任何构建体，其中(a)第一多核 苷酸包含R1基因的部分的序列，(b)第二多 核苷酸是相比所述第一多核苷酸的第一多核苷酸的反向互补物，(c)第一和第二启动子之 一或两者是GBSS或AGP，(d)所述构建体在细胞中的表达降低所述块茎细胞基因组中R1基 因的转录和/或翻译，从而降低块茎中冷诱导的糖化。在一个实施方式中，所述第一多核苷 酸包含在SEQ ID NO：23或24中所示的序列。在另一个实施方式中，所述块茎是马铃薯。 在另一个实施方式中，所述第一多核苷酸包含SEQ ID NO：23或24的序列的两个拷贝。 [0076] 本发明的另一个方面是增强块茎中对黑斑擦伤的耐受性的方法，包括在块茎的细胞中表达在此描述的任何构建体，其中(a)第一多核苷酸包含多酚氧化酶基因的部分的序 列，(b)第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互补物，(c)第一和第二启动子的之一或 两者是GBSS或AGP，(d)所述构建体在细胞中的表达降低所述块茎细胞基因组中多酚氧化 酶基因的转录和/或翻译，从而增强所述块茎对黑斑擦伤的耐受性。在一个实施方式中，所 述第一多核苷酸包含SEQ IDNO：26或27的序列。在另一个实施方式中，所述块茎是马铃薯。 在另一个实施方式中，所述第一多核苷酸包含两个拷贝的SEQ ID NO：26或27的序列。 [0077] 本发明的另一个方面是提高含油植物中油酸水平的方法，包括在含油植物的种子的细胞中表达在此描述的任何构建体，其中(a)第一多核苷酸包含Fad2基因的部分的序 列，(b)第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互补物，(c)第一和第二启动子的之一或 两者是napin基因、Fad2基因或硬脂酰-ACP脱饱和酶基因启动子，以及(d)所述构建体在 细胞中的表达降低所述含油植物的种子中Fad2基因的转录和/或翻译，从而提高所述种子 的油含量。在一个实施方式中，所述第一多核苷酸包含在SEQ ID NO：28中所示的序列。在 另一个实施方式中，所述napin基因启动子的序列包含SEQ ID NO：30中所示的序列。 [0078] 在一个实施方式中，所述硬脂酰-ACP脱饱和酶基因启动子的序列包含SEQ ID NO：31中所示的序列。 [0079] 在另一个实施方式中，所述Fad2基因启动子的序列包含SEQ ID NO：32中所示的序列。 [0080] 在一个实施方式中，所述含油植物是芸苔(Brassica)植物、油菜植物、大豆植物、棉花植物或葵花植物。 [0081] 本发明的另一个方面是降低植物中木质素含量的方法，包括在植物的细胞中表达在此描述的任何构建体，其中(a)第一多核苷酸包含咖啡酸/5-羟基阿魏酸3/5-O-甲基转 移酶(COMT)基因的部分的序列，(b)第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互补物，(c) 第一和第二启动子之一或两者是petE或Pal基因启动子，(d)所述构建体在细胞中的表达 降低在所述植物的细胞中COMT基因的转录和/或翻译，从而降低植物中的木质素含量。在 一个实施方式中，所述细胞处在所述植物的脉管系统中。在优选的实施方式中，所述植物是 苜蓿植物。在另一个实施方式中，所述第一多核苷酸包含在SEQ ID NO：33或37中所示的 序列。 [0082] 本发明的另一个方面是降低植物的果实中果胶的降解的方法，包括在植物的果实细胞中表达在此描述任何构建体，其中(a)第一多核苷酸包含多聚半乳糖醛酸酶基因的部 分的序列，(b)第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互补物，(c)第一和第二启动子都 是果实特异性启动子，以及(d)所述构建体在所述果实细胞中的表达降低所述植物的细胞 中多聚半乳糖醛酸酶的转录和/或翻译，从而降低果实中果胶的降解。在一个实施方式中， 所述第一多核苷酸包含在SEQ IDNO：39中所示的序列。 [0083] 本发明的另一个方面是降低由植物产生的食物的过敏原性的方法，包括在植物的细胞中表达在此描述的任何构建体，其中(a)第一多核苷酸包含编码过敏原的基因的部分 的序列，(b)第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互补物，(c)所述构建体的表达降低 所述过敏原的转录和/或翻译，从而降低由所述植物产生的食物的过敏原性。 [0084] 在一个实施方式中，(a)所述植物是苹果植物，(b)所述食物是苹果，(c)所述第一多核苷酸包含来自Mal d I基因启动子的序列，以及(d)所述构建体在所述苹果植物中的 表达降低所述苹果中Mal d I的转录和/或翻译。 [0085] 在另一个实施方式中，(a)所述植物是花生植物，(b)所述食物是花生，(c)所述第一多核苷酸包含来自Ara h 2基因启动 子的序列，以及(d)所述构建体在所述花生植物中 的表达降低所述花生中Ara h 2的转录和/或翻译。 [0086] 在另一个实施方式中，(a)所述植物是大豆植物，(b)所述食物是大豆，(c)所述第一多核苷酸包含来自Gly m Bd基因启动子的序列，以及(d)所述构建体在所述大豆植物中 的表达降低所述大豆中Gly m Bd的转录和/或翻译。 [0087] 本发明的另一个方面是下调植物中多个基因的表达的方法，包括在植物的细胞中表达构建体，所述构建体包含在SEQ ID NO：40中所示的序列，其下调所述植物细胞中多酚 氧化酶、磷酸化酶L基因和R1基因的表达。 [0088] 本发明的另一个方面是下调植物中多个基因的表达的方法，包括在植物的细胞中表达构建体，所述构建体包含在SEQ ID NO：42中所示的序列，其下调所述植物细胞中多酚 氧化酶、磷酸化酶L基因和R1基因的表达。 [0089] 本发明的另一个方面是包含期望的启动子的构建体，所述期望的启动子(i)在其5′-末端可操作地连接到第一启动子以及(ii)在其3′-末端可操作地连接到第二启动 子，其中所述期望的启动子与感兴趣的基因组中的目标启动子具有序列同一性。 [0090] 本发明的另一个方面是一种构建体，其包含由多核苷酸分隔的期望的启动子的两个会聚定向的拷贝，其中所述期望的启动子与感兴趣的期望基因组中的目标启动子具有序 列同一性。在一个实施方式中，分隔所述会聚定向的启动子的所述多核苷酸是内含子。 [0091] 本发明的另一个方面是一种构建体，其包含与启动子和终止子可操作地连接的两个期望的启动子，其中所述期望的启动子与感兴趣的基因组中的目标启动子具有序列同一 性。在一个实施方式中，所述两个期望的启动子，在它们各自的长度的至少一部分上，相互 具有序列同一性，并且其中所述期望的启动子之一被定向为另一个的反向互补物。 [0092] 在另一个方面中是一种构建体，其包含与启动子和终止子可操作地连接的两个期望的启动子，其中所述期望的启动子与感兴趣的基因组中的目标启动子具有序列同一性。 在一个实施方式中，所述两个期望的启动子，在它们各自的长度的至少一部分上，相互具有 序 列同一性，并且其中所述期望的启动子之一被定向为另一个的反向互补物。 [0093] 在另一个方面中，提供了一种构建体，其包含感兴趣的多核苷酸的四个正向重复，其之前是所述感兴趣的多核苷酸的反义DNA片段。这种构建体如pSIM1111所示。 [0094] 本发明还提供了降低苜蓿植物中内源基因的表达水平的方法，包括将盒导入苜蓿细胞中，其中所述盒包含两个以相互会聚的取向排列的苜蓿特异性启动子，其中在所述盒 中所述启动子的活性降低内源苜蓿基因的表达水平，其在苜蓿基因组中与启动子可操作地 连接，所述启动子具有与所述盒中的启动子之一的至少一部分具有序列同一性的序列。在 一个实施方式中，所述启动子的至少一个的序列在SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：55中所示。 [0095] 本发明还提供了降低Comt基因的表达的方法，包括在基因组中包含Comt基因的 细胞中表达Comt基因片段或Comt启动子片段。 [0096] 本发明还提供了降低Comt基因或Ccomt基因的表达的方法，包括在基因组中包含Comt基因或Ccomt基因的细胞中表达在此描述的任何构建体的构建体，其中第一多核苷酸 包含Comt基因或Comt基因启动子或Ccomt基因或Ccomt基因启动子的序列。 [0098] 附图1是二元载体的T-DNA的示意图，其(a)代表阴性对照(pSIM714)和(b)包含代表常规的沉默构建体的构建体，pSIM374、pSIM718和pSIM755。“B”是指转化-DNA边 界序列；“T”是指终止子序列；“hptII”是赋予植物潮霉素抗性的抗性基因；“P1”是指启动子序列，在这个实施例中，是与转基因gus植物中驱动功能上有活性的β-葡糖醛酸酶 (gus)基因的启动子相同的启动子，“P2”是指功能上也有活性但不同于P1的启动子序列； “gus-S”是指gus基因片段；“gus-A”是指gus基因片段的反向互补物；“I”是指内含子。 对于gus-S和gus-A，实心粗箭头表示与通过表达gus基因产生的转录产物的部分具有同一 性的RNA转录产物(的部分)；打点的粗箭头表示与gus基因转录产物的反向互补物的一 部分具有同一性的RNA 转录产物(的部分)；细线表示同源于或反向互补于另一个序列例 如构建体的内含子的转录产物的部分。对此，左侧的尖空箭头(其表示盒中的“gus-A”元 件)表示gus-A元件在所述表达盒中被定向为gus-S的反向互补物，右侧的尖箭头。因此， P1和P2启动子被定向，从而来自每个启动子的转录以会聚的方式前进，即，P1的转录向P2 前进，反之亦然。 [0099] 附图2描绘了包含构建体的二元载体的T-DNA的示意图，所述构建体相似于常规的沉默构建体，只是它们缺少终止子，pSIM728、pSIM140和pSIM758。对于gus-S和gus-A， 实心粗箭头表示与通过表达gus基因产生的转录产物的部分具有同一性的RNA转录产物的 部分；打点的粗箭头表示与gus基因转录产物的反向互补物的一部分具有同一性的RNA转 录产物的部分；细线表示同源于或反向互补于另一个序列例如构建体的内含子的转录产物 的部分。 [0100] 附图3描绘了包含“无终止子碰撞转录”(TFCT)构建体的T-DNA的示意图。具体地，它说明了pSIM715、pSIM717、pSIM756和pSIM771的T-DNA。标明的元件和实心和虚线箭 头的图解与附图1的图例中解释的相同。在pSIM717中，发自P1和P2的转录在内含子上 的通读产生了转录产物，其含有与gus基因转录产物的部分相同的5′-序列和与gus基因 转录产物反向互补的3′-序列。这些转录产物可以折叠来产生部分双链的RNA。根据P1 转录复合物不受阻碍地前进的能力，从P1启动子起始的RNA转录能够会聚地转录所述启动 子可操作连接的gus-S序列的下游的序列。因而，当在5′-到3′-方向上读取“顶部”， 即，pSIM717的有义链时，来自P1的可能含有插入内含子(“I”)的序列，以及gus-S元件 的反向互补物的序列。反向互补gus-S元件的“顶部”链序列是gus-S的反义。 [0101] 附图4描绘了包含“无终止子碰撞转录”(TFCT)构建体的T-DNA的示意图。具体地，它说明了pSIM754、pSIM773和pSIM767的T-DNA。标明的元件和实心和虚线箭头的图 解与附图1的图例中解释的相同，P1n指示TATA框上游的P1启动子的部分。这个序列不 是起启动子作用的。 [0102] 附图5描绘了包含“无终止子碰撞转录”(TFCT)构建体的T-DNA的示意图。具体地，它说明了pSIM782的T-DNA。标明的 元件和实心和虚线箭头的图解与附图1的图例中 解释的相同。gusI表示gus基因的内含子。 [0103] 附图6描绘了包含“无终止子碰撞转录”(TFCT)构建体的T-DNA的示意图。具体地，它说明了pSIM765、pSIM922F、pSIM922G、pSM774和pSIM775的T-DNA。标明的元件和实 心和虚线箭头的图解与附图1的图例中解释的那些相同。PPO表示烟草PPO基因的片段。 [0104] 附图7显示了含有RT-PCR产物的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。+＝阳性质粒对照；-＝阴性对照；M＝标记物；T1＝来自P1启动子的转录产物；T2＝来自P2启动子的转 录产物。 [0105] 附图8显示了RNA凝胶印迹的放射自显影图。用于杂交的探针来自gus基因。 [0106] 附图9显示了各种启动子片段的序列分析并鉴定了在基于启动子的沉默期间可被甲基化的89-bp序列。 [0107] 附图10描绘了质粒图谱。G：gus基因片段；H：hptII基因的表达盒；LB：左侧边界区；RB：右侧边界区；T：终止子；P1：P1启动子；P1n：缺少TATA框的非功能性P1启动子； P2：P2启动子；P3：P3启动子；GB：GBSS启动子；PP：PPO基因片段；PT＝烟草PPO基因的片 段。转录的方向用小的黑色实心箭头表示。 [0108] 优选实施方式的详细说明 [0109] 本发明的构建体可以通过将引发期望的多核苷酸的会聚转录用于有效地降低或阻止目标核酸的转录或翻译。因此，本发明的一个目标是提供产生核酸分子的构建体，所述 核酸分子阻止或降低基因的表达或基因产物的表达，例如RNA转录产物或蛋白质。 [0110] 这种构建体的一个特征是，与常规的沉默构建体相比，没有功能性的终止子插入到或可操作连接到期望的多核苷酸的3′-末端。很好地确定的是，终止子是核苷酸序列， 一般位于基因的3′-末端，其涉及从所述基因转录的RNA转录产物的裂解，并涉及该转录 产物的多聚腺苷酸化。一般地，终止子位于基因的终止密码子的下游。 [0111] 用于常规的沉默盒的构建、但从本发明的构建体中排除的终止子来自某些基因的3′-区域，常常还包括更为下游的非转录DNA 序列。选择使用哪个终止子常常只是便利 性的问题。因此，来自内源的或早先表征的基因的opine终止子或终止区已经被用于常规 的沉默构建体中。更频繁使用的终止子之一，例如，是农杆菌胭脂碱合成酶(nos)基因终止 子，其包含3′非翻译序列和一些额外的下游DNA。其他终止子包括： [0112] T-DNA基因7的3′非翻译序列(Genbank登记号V00090)。 [0113] 花椰菜花叶病毒的主要包含体蛋白基因的3′非翻译序列。 [0114] 豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚基的3′非翻译序列(Genbank登记号M21375)。 [0115] 马铃薯遍在蛋白-3基因的3′非翻译序列(Genbank登记号Z11669)。 [0116] 马铃薯蛋白酶抑制因子II基因的3′非翻译序列(Genbank登记号CQ889094)。 [0117] opine基因的3′非翻译序列。 [0119] 然而，对于本发明这些终止子都不，实际上，没有有功能的终止子直接可操作地连接到本发明的构建体的期望的多核苷酸。期望的多核苷酸也不直接可操作连接到之前是自 我剪接核酶编码序列的终止子。 [0120] 本发明的构建体的另一个特征是，它经由两个相对的启动子促进多核苷酸的一个或多个拷贝的会聚转录，所述多核苷酸直接地或不被直接地可操作连接到终止子。由于不 存在终止信号，从第一和第二启动子转录的RNA分子的库(pool)的长度可以是各种长度。 [0121] 偶尔地，例如，转录机制可能继续来转录通读过表示期望的多核苷酸序列的“末端”的最后的核苷酸。因而，在这种特定的安排下，通过下游序列的弱的和非故意的作用，例如，促进发夹形成，或者通过位于侧翼于转化DNA整合位点的植物DNA中的非故意的转录终 止子的作用，可以发生转录终止。 [0122] 因而，本发明的无终止子的碰撞转录(TFCT)构建体可以包括与第一多核苷酸可操作连接的第一启动子和与第二多核苷酸可操作连接的第二启动子，其中(1)第一和第二 多核苷酸相互间并与目标 序列具有至少一定的序列同一性，以及(2)所述第一启动子被 定向从而由这个启动子启动的转录的方向朝向第二启动子，反之亦然，(3)所述构建体产生 大小上一般不同的RNA分子，某些转录产物代表所述多核苷酸的至少部分的RNA对应物，其 他的包含所述多核苷酸和它的反向互补物两者的至少一些的对应物。 [0123] 期望的多核苷酸可以在两个不同的取向上与启动子连接。在一个取向上，例如“有义”，产生的RNA转录产物的至少5′-部分将与至少一个目标转录产物的至少部分具有序 列同一性。这种排列的实例在附图3中显示为pSIM717。在称为“反义”的其他取向上，预 测的转录产物的至少5′-部分将相同于或同源于至少一个目标转录产物的反向互补物的 至少部分。后者的排列的实例在附图3中显示为pSIM756。 [0124] 如在此使用的，“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的上下文中包括对两个序列中的残基的参比，所述序列当在指定的区域上进行最大相应性比对时是相同 的。当序列同一性百分比对蛋白质使用时，公认的是，不是同一的残基位置通常因保守性氨 基酸替换而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基 酸残基替换并因而不改变该分子的功能性质。在序列因保守性替换而不同时，可通过调高 序列同一性百分比来修正替换的保守性质。因这种保守性替换而不同的序列被称为具有 “序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。一般地，这包括将保守性替换计分为部分的而不是完全的错配，从而提高序列同一性百分比。因而，例如， 其中相同的氨基酸被给予1的分值，非保守性替换被给予0的分值，保守性替换被给予0和 1之间的分值。例如，根据Meyers和Miller，Computer Applic Biol.Sci.，4：11-17(1988) 的算法，例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，California，USA)中实现的，计算保守性替换的计分。 [0125] 如在此使用的，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳地对准的序列来确定的值，其中在所述比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含相比参考序列 (其不包含添加或删除)的添加或删除(即，缺口)，用于两个序列的最佳对准。通过确定 两个序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基位置的数量来产生匹配位 置的数目、用匹 配位置的数目除以比较窗口中位置的总数、将结果乘以100来产生序列同一性百分比，来 计算百分比。 [0126] 用于比较的序列对准的方法是本领域公知的。通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch，J.Mol. Biol.48：443(1970)的同源性对准算法；通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad. Sd.85：2444(1988))的类似方法的检索；通过这些算法的计算机化实施，包括但不限于： Intelligenetics，Mountain View，California的PC Gene程序中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；可以进行用于比较的最佳 序列对准，由Higgin和Sharp，Gene 73：237-244(1988)；Higgins和Sharp，CABIOS 5： 151-153(1989)；Corpet，et al，Nucleic AcidsResearch 16：10881-90(1988)；Huang，et al，Computer Applications inthe Biosciences 8：155-65(1992) 和 Pearson，et al， Methods in MolecularBiology 24：307-331(1994)很好地描述了CLUSTAL程序。 [0127] 可用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX；用 于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP；用于针对核苷酸数据库序列的蛋 白质查询序列的TBLASTN；以及用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。 参见，Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 19，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York(1995)；Altschul et al，J.Mol. Biol，215：403-410(1990)；和Altschul et al，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)。 [0128] 用于执行BLAST分析的软件是公众可获得的，例如通过国家生物技术信息中心 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这个算法包括，首先通过在查询序列中鉴定长度W的 短字来鉴定高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，高分序列对匹配或 满足某些正评估的阈值分T。T被称为邻近字分值阈值。这些最初的邻近字采样充当了开 始检索以发现含有它们的更长的HSP的种子。然后沿着每个序列的两个方向延伸所述字采 样，直到累积的比对计分可被提高。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配的残基对的奖励分； 总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)来计算累积的计分。对于氨基酸序列，使用计 分矩阵来计算累积的分数。当：累积的比对分数从其达到的最大值下降了数值X；由于一个 或多个负分数残基比对的积累，累积的计分达到零或低于零；或到达任何一个序列的结尾； 时，停止在每个方向上字采样的延伸。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感性和速 度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用的是字长度(W)11，期望值(E)10，100的截 断，M＝5，N＝-4，比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的是，字长度(W)3，期望值(E)10，和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：10915)。 [0129] 除了计算序列同一性百分之之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(1993))。 BLAST算法提供的一种相似性测量法是最小求和概率(the smallest sum probability) (P(N))，其提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间可能偶然出现匹配的概率的指示。 [0130] BLAST检索假定蛋白质可以被建模为随机序列。然而，许多实际的蛋白质包含非随机序列的区域，其可以是同多聚段(homopolymeric tracts)、短周期的重复、或一种或多 种氨基酸富集的区域。这种低复杂度的区域可以在无关的蛋白质之间对准，即使蛋白质的 其他区域是完全不同的。可以采用许多低复杂度过滤程序来降低这种低复杂度对准。例 如，SEG(Wooten and Federhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))和XNU(Claverie and States，Comput.Chem.，17：191-201(1993))低复杂度过滤器可以单独地或组合地采用。 [0131] 使用对准的CLUSTAL方法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝10)可以进行多种序列对准。使用CLUSTAL 方法的配对式对准的默认参数是KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。 [0132] 在此描述的任何或所有元件和DNA序列对于一种或多种植物基因组可以是内源的。因而，在本发明的一个特定实施方式中， 为最终的转移盒选择的所有元件和DNA序列 对于要转化的植物的基因组是内源的或天然的。例如，所有的序列可以来自马铃薯基因组。 可选择地，一种或多种元件或DNA序列对于不同于要转化的植物物种的植物基因组是内源 的，但在任何情况下在宿主植物细胞中起作用。这种植物包括马铃薯、番茄和苜蓿植物。本 发明还包括使用来自植物的一种或多种遗传元件，所述植物与要转化的植物是互交可孕 的。 [0133] 公众的关注在于制造遗传工程化的植物的全天然方法的开发，如Rommens等在WO2003/069980、US-2003-0221213、US-2004-0107455和WO2005/004585中公开的，通过引 用将它们全部合并在此。Rommens等教导了从植物鉴定和分离可用于细菌介导的植物转化 的遗传元件。因而，Rommens给出了植物衍生的转化-DNA(“P-DNA”)，例如，可以从植物基 因组分离并用于农杆菌T-DNA中来遗传地工程化植物。 [0134] 就此来说，本发明的“植物”包括但不限于被子植物和裸子植物，例如马铃薯、番茄、烟草、鳄梨、苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、糖豆、木薯、甘薯、大豆、豌豆、豆、黄瓜、葡萄、芸苔、玉米、草皮草、小麦、稻、大麦、高粱、燕麦、橡树、桉树、胡桃树和棕榈树。因而，植物可以是单子叶植物或双子叶植物。“植物”和“植物材料”还包括植物细胞、种子、植物子代、有性或无性产生的繁殖体、和这些的任一种的后代，例如插枝或种子。“植物材料”可以指植物 细胞、细胞悬浮培养、愈伤组织、胚、分生组织区、愈伤组织、叶子、根、苗、配子体、孢子体、花粉、种子、萌芽和小孢子。植物可以处于各种成熟阶段，可以在液体或固体培养基中，或在土壤中或在罐中的适合的培养基中、温室或田地中生长。导入的前导区、非转录尾区或基因序 列在植物中的表达可以是瞬时的或永久的。 [0135] 因而，可以根据本发明转化这些植物和植物材料的任一种。就此来说，进行植物的转化，通过转化，DNA被稳定地整合到植物细胞的基因组中。“稳定地”是指在细胞 基因组中和通过细胞基因组，多核苷酸的永久的、或非瞬时的保留和/或表达。因而， 稳定地整合的多核苷酸是在转化的细胞基因组中的固定成分，可以通过所述细胞或产 生的转化植物的连续产生子代来复制和繁殖。转化可以在天然的或仿真的条件下利用 本领域公知的各种方法来进行。参见，例如， METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，Bernard R.Glick and John E.Thompson(eds)，CRC Press，Inc.， London(1993)；Chilton，Scientific American，248)(6)，pp.36-45，1983；Bevan，Nucl.Acids.Res.，12，pp.8711-8721，1984；和Van Montague et al，Proc R Soc Lond B Biol Sci.，210(1180)，pp.351-65，1980.也可以使用“精细转化(Refined Transformation)” 和“精确培育(Precise Breeding)”技术来转化植物。参见，例如，Rommens等的 WO2003/069980、US-2003-0221213、US-2004-0107455、WO2005/004585、US-2004-0003434、US-2005-0034188、WO2005/002994和WO2003/079765，通过引用将它们全部合并在此。 [0136] 本发明的块茎类植物的一种或多种性状可以使用在此描述的转化序列和元件来修饰。“块茎”是加厚的、通常是地下的、食物存储器官，其缺乏阳茎基片和种皮样覆盖，其具有球茎和鳞茎。根和芽从块茎的表面上的生长芽，称作“芽眼”长出。某些块茎，例如 caladiums，在植物生长时大小减小，在芽眼出形成新的块茎。其他的，例如有块茎的秋海 棠，在生长季节种保存养分时大小增加，同时发育新的生长芽。块茎可以是皱缩的和坚硬 的或稍微肉质的。它们可以是圆形、扁平的、畸形的或粗糙的。块茎的实例包括，但不限 于ahipa、木薯(apio)、秘鲁胡罗卜、慈茹、竹芋、baddo、苦树薯(bitter casava)、巴西竹芋、木薯(cassava)、中国蓟、荸荠、椰子、cocoyam、芋、芋根、象耳、菊芋、goo、日本蓟、日本马铃薯、耶路撒冷蓟、豆薯、百合根、ling gaw、mandioca、manioc、墨西哥马铃薯、墨西哥豆薯、oldcocoyam、马铃薯、saa got、sato-imo、seegoo、sunchoke、sunroot、甜树薯、甘薯、tanier、箭叶黄体竽(tannia)、tannier、木薯块根、topinambour、莲藕、豆薯、薯蓣、和箭叶黄体芋(yautia)。马铃薯的实例包括，但不限于Russet马铃薯、Round White马铃薯、Long White马铃薯、Round Red马铃薯、Yellow Flesh马铃薯或Blue和Purple马铃薯。 [0137] 块茎可以分类为“微型块茎”、“小块茎”、“半成熟”块茎和“成熟”块茎。微型块茎时在组织培养基中生长的，大小很小的块茎。“很小”是指约0.1cm-1cm。“迷你块茎”是比微型块茎大，在土壤中生长的块茎。“半成熟”块茎来自开始衰老的植物，如果在 温室中生长约9周龄大小。“成熟”的块茎是来自已经经历了衰老的植物。成熟的块茎是，例如，约12周龄或更多周大小的块茎。 [0138] 在这点上，本发明的植物衍生的转化-DNA(“P-DNA”)边界序列在核苷酸序列上与任何已知的细菌衍生的T-DNA边界序列不相同，但它为基本上相同的目的起作用。也 就是说，P-DNA可被用于将一个多核苷酸转移和整合到另一个中。P-DNA可以代替常规的 T-DNA被插入到肿瘤诱导的质粒，例如，来自农杆菌的Ti质粒中，并与常规的转化质粒一样 在细菌菌株中维持。所述P-DNA可以被操作以含有期望的多核苷酸，所述期望的多核苷酸 将要经由细菌介导的植物转化整合到植物基因组中。参见Rommens等的WO2003/069980、 US-2003-0221213、US-2004-0107455和WO2005/004585，通过引用将它们全部并入本申请。 [0139] 因而，P-DNA边界序列与来自农杆菌例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的已知T-DNA边界序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20或更多核苷酸的不同。 [0140] P-DNA边界序列与农杆菌T-DNA边界序列在核苷酸序列上有不大于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、 82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、 67％、66％、65％、57％、54％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、 52％、51％、或50％的相似性。 [0141] 开发鉴定和分离来自植物，特别是马铃薯和小麦的转化DNA的方法，并利用US-2004-0107455中描述的边界基序共有物，上述文献通过引用将其并入本发明。 [0142] 在这点上，如果其以约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约74％、约73％、 约72％、约71％、约70％、约69％、约68％、约67％、约66％、约65％、约64％、约63％、 约62％、约61％、约60％、约59 ％、约58％、约57％、约56％、约55％、约54％、约53％、约52％、约51％、约50％、约49％、约48％、约47％、约46％、约45％、约44％、约43％、 约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、 约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约 22％、约21％、约20％、约15％、或约5％或至少约1％的转化频率促进与之相连的多核苷酸 向另一个核酸分子中，例如向植物染色体中的转移和整合则本发明的植物衍生的DNA，例如 在此公开的任何序列、裂解位点、区域或元件是功能性的。 [0143] 任何上述转化相关序列和元件可以被修饰或突变来改变转化效力。其他多核苷酸序列可以被添加到本发明的转化序列上。例如，它可以被修饰以具有5′-和3′-多克隆 位点，或其他的限制性位点。在此公开的裂解位点的序列，例如，可以被修饰以提高来自伴 随载体的主链DNA不整合到植物基因组中的可能性。 [0144] 任何期望的多核苷酸可以被插入到在此描述的任何裂解或边界序列之间。例如，期望的多核苷酸可以是对于植物物种是天然的野生型或修饰的基因，或可以是来自非植物 基因组的基因。例如，当转化马铃薯植物时，可以产生表达盒，其包含可操作连接到期望的 马铃薯基因或其片段上的马铃薯特异性启动子和马铃薯特异性终止子。所述表达盒可以含 有其他马铃薯遗传元件，例如按读码框融合到基因的5′-末端的信号肽序列，和马铃薯转 录增强子。本发明不局限于这样的排列，可以构建转化盒，使得在期望的多核苷酸与启动子 可操作连接时不与终止子序列可操作地连接。 [0145] 除了植物衍生的元件之外，所述元件也可以在例如真菌和哺乳动物中鉴定。这些物种的几种已经显示了对于农杆菌介导的转化是可接受的。参见， Kunik et al.，Proc Natl Acad Sci USA 98：1871-1876，2001和Casas-Flores et al，Methods Mol Biol 267： 315-325，2004，通过引用将其并入本申请。 [0146] 当从植物中鉴定和分离了转化相关序列或元件，例如在此描述的那些，并且如果该序列或元件随后被用于转化相同物种的植物，所述序列或元件可被描述为对于所述植物 基因组是“天然的”。 [0147] 因而，“天然的”遗传元件是指天然地存在于、或来源于、 或属于待转化植物的基因组的核酸。相同地，术语“内源的”也可以用于指明特定的核酸，例如，DNA或RNA或蛋白对于植物是“天然的”。内源的是指元件来源于所述有机体。因而，分离在待转化植物或植物品种的基因组的、或分离自与待转化植物品种性别上相容或互交可育的植物或物种的、任 何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA、或cDNA分子，对于所述植物物种是“天然的”，即，是天生的。换句话说，天然的遗传元件是植物育种家通过传统植物育种来改进植物所可以 使用的所有遗传物质。根据本发明，天然核酸的任何变体也认为是“天然的”。在这点上，“天然的”核酸可以分离自植物或其性别上相容的，也可以被修饰或突变从而产生的变体在核 苷酸序列上与从植物分离的未修改的、天然的核酸具有大于或等于99％、98％、97％、96％、 95％、94％、93％、92％、91％90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、 80％、79％、78％、77％、76％75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％67％66％65％、 64％、63％、62％、61％或60％的相似性。天然的核酸变体也可在核苷酸序列上具有少于约 60％、少于约55％，或少于约50％的相似性。 [0148] 分离自植物的“天然的”核酸也可编码由该核酸转录和翻译的、天然发生的蛋白产物的变体。因而，“天然的”核酸可以编码蛋白质，所述蛋白质在氨基酸序列上与未修改 的、在植物中表达的天然蛋白质相比，具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、 93％、92％、91％90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、 78％、77％、76％75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％67％66％65％、64％、63％、 62％、61％或60％的相似性，所述核酸分离自所述植物。 [0149] 在包含期望的多核苷酸的两个拷贝的无终止子构建体中，一个期望的多核苷酸可以被定向使其序列是另一个多核苷酸的反向互补物。附图3中pSIM717的示意图说明了这 种排列。也就是说，所述构建体的“顶部”、“上部”或“有义”链在5′-到3′-方向上将 包含(1)目标基因片段，和(2)目标基因片段的反向互补物。在这种排列中，与所述期望的 多核苷酸的反向互补物可操作连接的的第二启动子将可能产生RNA转录产物，其在序列上 至少部分地相同于从另一个期望的 多核苷酸产生的转录产物。 [0150] 期望的多核苷酸和它的反向互补物可以由任何长度的间隔DNA序列，例如内含子来分隔。期望的是，例如，通过在期望的多核苷酸的3′-末端和它的反向互补物的5′-末 端之间插入长内含子或其他DNA序列来降低从对向的启动子转录期望的多核苷酸的反向 互补物拷贝的机率。例如，对于pSIM717(附图3)来说，内含子(“I”)的大小可以被加长， 从而P1的转录复合物在被阻断或移位之前不可能到达gus-S的反向互补物的序列。因而， 可以有约50、100、250、500、2000或超过2000个核苷酸位于期望的多核苷酸的有义和反义 拷贝之间。 [0151] 本发明的期望的多核苷酸，例如，在此描述的“第一”或“第二”多核苷酸可以与结构基因或调节元件的全部或至少部分序列具有序列同一性。例如，第一多核苷酸可以与目标基因的编码或非编码序列、或与目标基因的启动子的一部分具有序列同一性。在一个实 施方式中，所讨论的多核苷酸与目标基因或目标调节元件，例如目标启动子具有约100％、 约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、 约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、 约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约74％、约73％、约72％、约71％、约70％、 约69％、约68％、约67％、约66％、约65％、约64％、约63％、约62％、约61％、约60％、 约59％、约58％、约57％、约56％、约55％、约54％、约53％、约52％、约51％、约50％、 约49％、约48％、约47％、约46％、约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、 约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、 约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约 15％、或约5％或至少约1％的序列同一性。 [0152] 为了简化，在此使用的术语“期望的多核苷酸”没有限制，但包括在此使用的其他术语，例如“第一多核苷酸”和“第二多核苷酸”或用于本发明的构建体来降低目标基因或序列的表达的任何多核苷酸。因此，“期望的多核苷酸”可以是第一或第二多核苷酸，或两者。 [0153] 在更简单的形式中，本发明的构建体不含有所述多核苷酸的两个拷贝，而仅含有 一个拷贝。因而，多核苷酸在它的5′-和3′-端可操作连接到启动子。在这个特定的排 列中，将产生RNA转录产物，其包含来自DNA双链体的每条链的序列。这种排列的实例在附 图3中显示为pSIM772。 [0154] 无终止子的盒可以在细胞中作为染色体外的DNA分子存在，或者它可以通过各种机制的任一种整合到细胞的核、染色体或其他内源核酸中。如果无终止子的盒被稳定地整 合到细胞的基因组中，则有可能产生在随后的细胞或有机体后代中包含所述盒的细胞系、 细胞培养物、生物组织、植物或有机体。 [0155] 这种构建体在植物中的表达将降低或阻止基因的表达，所述基因与期望的多核苷酸的至少部分具有序列同一性或与之反向互补。本发明不受任何特定理论或机制的限制， 但转录产物可能直接地或间接地影响调节序列例如启动子的活性，所述调节序列与细胞中 目标基因的表达通常地相关；或者所述转录产物可能消极地影响目标细胞中内源产生的转 录产物的积累。从而，转录产物积累和转录产物翻译的任一种或两者可能通过本发明的表 达盒产生的转录产物的活性而被改变。 [0156] 本发明的植物可以是单子叶植物，例如，苜蓿、油菜、小麦、草皮草、玉米、稻、燕麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾、百合、洋葱、甘蔗和棕榈。可选择地，所述植物可以是双子百植物，例如，马铃薯、烟草、番茄、鳄梨、胡椒、糖豆、椰菜、木薯、甘薯、棉花、猩猩木、豆荚、苜蓿、大豆、豌豆、豆、黄瓜、葡萄、芸苔、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊和仙人掌。 [0157] 由本发明的无终止子表达盒产生的RNA分子的效果可以通过直接或间接地测量细胞中或所述表达盒存在的环境中目标核酸或蛋白质水平来评定。因此，本发明的表达盒 在下调、抑制、降低、或阻止或消除目标基因表达方面的效果可以通过目标基因产生的RNA 转录产物数量方面的降低、或目标基因蛋白质产物数量方面的降低，或这两者来鉴定。 [0158] 在此描述的无终止子构建体的期望的多核苷酸可以相同于、或与不同种类的DNA区具有序列同一性，例如(1)编码目标转 录产物的序列的至少部分，(2)编码目标转录产 物的基因的内含子的至少部分，(3)编码目标转录产物的基因的启动子的至少部分，(4) 编码目标转录产物的基因的终止子的部分，其中所述多核苷酸不是终止子，(5)基因的 3′-非翻译区，和(6)基因的5′-非翻译区。这些区域的任一种的一个或多个核苷酸可 以被突变、改变或替换以提高与目标序列的序列同一性，或另外用以提高或增强目标序列 的沉默。 [0159] 因而，目标序列的位置可以处在，但不限于，(i)细胞的基因组；(ii)细胞中正常产生的至少一种RNA转录产物；或(iii)质粒、构建体、载体或其他DNA或RNA载体中。含 有基因组或产生RNA转录产物的细胞可以是细菌、病毒、真菌、酵母、蝇、蠕虫、植物、爬行动物、鸟类、鱼类或哺乳动物的细胞。 [0160] 因此，目标核酸可以是通常从细胞核被转录到RNA、随后被翻译成编码多肽的一种目标核酸。可选择地，目标核酸可以不在特定细胞或细胞类型中实际表达。例如，目标核酸 可以是核、染色体或其他遗传物质中存在的基因组DNA序列，例如线粒体DNA的DNA序列。 这种目标核酸可以是，但不限于，调节区、基因的非翻译区、或非编码序列。 [0161] 可选择地，目标核酸可以对于宿主细胞是外来的，但有非宿主有机体呈现或表达。例如，目标核酸可以是对于侵入性寄生虫、病毒或细菌是内源的、或由它们表达的DNA或 RNA分子。 [0162] 此外，目标核酸可以是由疾病细胞呈现或表达的DNA或RNA分子。例如，疾病细胞可以是癌细胞，其表达通常不在非癌细胞类型中表达的RNA分子。 [0163] 在植物中，期望的多核苷酸可以与负责植物的特定性状的目标核酸具有序列同一性。例如，期望的多核苷酸可以产生转录产物，所述转录产物靶向并降低植物中多酚氧化酶 基因目标的表达，从而修饰与黑斑擦伤有关的一种或多种性状或表型。类似地，期望的多核 苷酸可以产生转录产物，所述转录产物靶向并降低植物中淀粉相关R1目标核酸或磷酸化 酶目标核酸的表达，从而修饰与冷诱导糖化有关的一种或多种性状或表型。 [0164] 本发明的构建体中的表达盒可以侧翼是一种或多种转化-DNA(“T-DNA”)边界序列。例如，在此描述的任何表达盒可以被 插入到农杆菌衍生的质粒，例如来自根癌农杆菌 的Ti质粒的T-DNA中。 [0165] 边界序列可以包含一种序列，所述序列类似于传统农杆菌T-DNA边界序列，但实际上是对于植物天然的序列，但其可以促进一个核酸向另一个中的转移和整合。例如，这种 植物衍生的转化-DNA(“P-DNA”)边界序列可以分离自马铃薯(SEQ ID NO：44)、番茄(SEQ ID NO：45-46)、胡椒(SEQ ID NO：47)、苜蓿(SEQ IDNO：48)、大麦(SEQ ID NO：49)和稻(SEQ ID NO：50)，在本申请的别处的序列表中显示。 [0166] 因而，在此描述的任一种表达盒可以被插入到由这种P-DNA边界序列划界的转化-DNA中，其能够将所述盒整合到另一个核酸，例如植物基因组或植物染色体中。 [0167] 因而，含有在此描述的表达盒的农杆菌质粒，所述表达盒不包含涉及RNA转录产物的3-末端形成和多聚腺苷酸化的DNA区，可以通过农杆菌介导的转化被稳定地整合到植 物的基因组中。因而，转化的植物的子代将继续表达与该表达盒相关的转录产物。 [0168] 用于启动期望的多核苷酸的转录的启动子可以是组成型、组织偏爱的或诱导型启动子或其排列。例如，“强”启动子包括马铃薯遍在蛋白-7和遍在蛋白-3启动子，和来自 玉米、稻和甘蔗的遍在蛋白启动子。它们还包括稻肌动蛋白启动子、各种核酮糖一小亚基启 动子、核酮糖激酶启动子和稻肌动蛋白启动子。主要在马铃薯块茎中表达的好的组织偏爱 启动子包括微粒结合淀粉合酶和ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的启动子。存在各种诱导型启 动子，但一般地，诱导型启动子是温度敏感性启动子、化学诱导的启动子或时序启动子。具 体地，诱导型启动子可以是Ha hsp17.7 G4启动子、小麦wcs 120启动子、Rab16A基因启动 子、α淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子或羧化酶启动子。 [0169] 因而，为了便于鉴定已经用无终止子表达盒成功转化的植物，期望在由转化-DNA边界序列划定的区域内包含可选择或可筛选的标记物。包含标记物是农杆菌介导的转化中 的标准过程，用来容易地鉴定成功转化的植物材料。例如，在附图1-4描绘的表达盒中，标 记物是潮霉素磷酸转移酶(“hptII”)，其为表达该标记物的植物赋予潮 霉素抗性。因而， 在这种盒中，终止子或涉及RNA转录产物的3-末端形成和多聚腺苷酸化的DNA区被可操作 地连接到hptII基因序列。可以使用其他可选择和可筛选标记物来代替hptII。 [0170] 实施例 [0171] 实施例1 [0172] 常规的沉默构建体 [0173] 通过靶向与玄参花叶病毒(figwort mosaic vitus)强组成型启动子可操作连接的β葡糖醛酸酶(gus)报告基因，测试各种沉默构建体的效力，所述启动子在此称为 “P1”(SEQ ID NO：1)。这种测试系统是严格的，因为gus蛋白是高度稳定的。因此，仅gus 转录产物相对大量减少才导致gus蛋白水平的表型可检测的降低。大多数沉默构建体含有 至少一个拷贝的、相同的304-bp gus基因片段(SEQ IDNO：2)，在有义或反义取向上与强启 动子可操作地连接，有时还连接农杆菌胭脂碱合酶基因的终止子。将沉默构建体插入到转 化载体的T-DNA边界之间紧靠潮霉素磷酸转移酶(hptII)选择标记物基因的表达盒。产生 的载体用于重新转化之前已经用含gus基因表达盒的T-DNA转化的烟草植物(参见附图1 和2)。 [0174] 制备以下转化载体来研究常规的沉默构建体中终止子元件的作用： [0175] pSIM714：阴性对照载体pSIM714，其不含有沉默构建体。 [0176] pSIM718：载体pSIM718，其含有与胭脂碱合酶基因的终止子(SEQ ID NO：3)可操作连接的‘有义’gus基因片段，其代表在例如美国专利5,283,184和5,231,020中描述的 策略。这个载体含有在有义取向上与启动子可操作连接的gus基因片段，其后与终止子相 连。 [0177] pSIM140：载体pSIM140，其与pSIM718相同，只是沉默构建体不含有终止子。 [0178] pSIM755：载体pSIM755，其含有含终止子的‘反义’构建体，其代表在例如美国专利5,107,065和5,759,829中描述的策略。这个载体含有在有义取向上与启动子可操作连 接的gus基因片段，其后与终止子相连。 [0179] pSIM758：载体pSIM758，其与pSIM755相同，只是沉默 构建体不含有终止子。 [0180] pSIM374：载体pSIM374，其含有含终止子的构建体，所述构建体包含有义和反义gus基因片段，其代表在例如WO 99/53050A1中描述的策略。该载体含有gus基因片段的两 个拷贝，一个处在有义取向上，另一个处在反义取向上，由SEQ ID NO：4中所示的内含子将 其分隔，并插入在启动子和终止子之间。 [0181] pSIM728和777：载体pSIM728，其与pSIM374相同，只是沉默构建体不含有终止子。载体pSIM777与pSIM728相同，只是P2启动子在表达盒的另一侧。 [0182] 将含有各种构建体的二元载体导入农杆菌中。使产生的菌株的10倍稀释的过夜生长培养物生长五到六小时，在2,800RPM沉淀重悬浮15分钟，用补充有蔗糖(3％， pH 5.7)的的MS液体培养基(PhytoTechnology，KS)洗涤，重悬于相同培养基中直到 0.2OD/600nm。然后用悬浮液感染表达gus基因、转基因的试管内生长的烟草(Nicotiana tabacum)植物的叶外植体。感染的外植体在含6g/L琼脂的共培养基(1/10MS盐，3％蔗糖， pH 5.7)上在Percival生长箱(16/8小时光周期)中在25℃稳定孵化两天，随后转移到含 timentin(150mg/L)和潮霉素(20mg/L)的M401/琼脂(PhytoTechnology)培养基上。将 产生的苗(shoot)转移到无激素的生根培养基中，对每个产生的植物的三片叶子染色用于 gus表达。 [0183] 表1显示了，用pSIM714重新转化的所有植物展现了与原始gus植物相同水平的gus表达，确认了，重新转化、单个细胞的增殖和再生对报告基因的表达无消极影响。 [0184] 表1还显示了代表三种不同的常规沉默方法的构建体以不同的效力引发了gus基因沉默。与文献中已经报道的相符，pSIM374是最有效的。用这种构建体重新转化的约一 半植物显示至少在一定程度降低了gus活性水平。两种其他的构建体证明了在仅约6％的 重新转化的植物中gus活性的降低。 [0185] 重要地，表1还展现了除去终止子显著地降低了沉默构建体的效力。例如，pSIM374比它的无终止子衍生物pSIM728有效六倍。无终止子的pSIM758几乎没有观察到 活性。 [0186] 可以断定，终止子在优化常规沉默构建体的活性方面起到 了关键作用。 [0187] 实施例2 [0188] 使用包含引发会聚转录的至少两个拷贝的 [0189] 目标基因片段的无终止子构建体有效地导致基因沉默 [0190] 制备以下转化载体来研究会聚转录对基因沉默的效果(也参见附图3)： [0191] pSIM715：载体pSIM715含有一种构建体，所述构建体包含由与启动子(P1)可操作连接的gus基因组成的第一节段，和在相反方向上由与称为‘P2’、在SEQ ID NO：5中所示 的花椰菜花叶病毒的组成型35S启动子可操作连接的相同gus基因片段组成的第二节段， 其中所述第一和第二节段由两个不同的内含子分隔。 [0192] pSIM717：载体pSIM717与pSM715相同，只是构建体的两个节段由单个内含子分隔。 [0193] pSIM789：载体pSIM789与pSIM717相同，只是P2启动子被P1启动子代替。 [0194] pSIM771：载体pSIM771与pSIM717相同，只是P1启动子被SEQ ID NO：6所示、在此被称为‘P3’的马铃薯遍在蛋白-7启动子代替如。 [0195] pSIM770：载体pSIM770与pSIM717相同，只是驱动选择标记基因表达的P2启动子被P1代替，沉默构建体的P1启动子被P2代替。 [0196] pSM772：载体pSIM772含有插入在两个不同方向取向的启动子P2和P3之间的gus基因片段。 [0197] pSIM756：载体pSIM756与pSIM717相同，只是gus基因片段相对于与它们紧密连接的启动子按照反向互补取向定向。 [0198] pSIM779：载体pSIM779是插入在两个会聚启动子之间的随机重复的gus基因片段实施例。 [0199] pSIM787：载体pSIM787与pSIM779类似，但是含有插入在会聚启动子之间的目标基因片段的四个正向重复。 [0200] pSIM1111与pSIM779相同，只是四个正向重复之前是不同于SEQ ID NO：2、如SEQID NO：7所示的gus基因的反义DNA片 段。 [0201] 对重新转化的gus植物的gus分析表明所有测试的无终止子构建体，pSIM715、717和756、771，在沉默gus基因方面比pSIM374更有效，所述构建成包含各含有在反向互补取 向上驱动gus基因片段的不同启动子的两个节段，pSIM374构建体代表了最好的常规方法。 此外，pSIM789也为许多双转化体赋予了有效的基因沉默。 [0202] 实验还显示了，使用单个gus基因片段(pSIM779)没有效果。这个结果表明，期望的多核苷酸的至少两个拷贝的会聚转录对于有效的沉默是重要的。 [0203] 实验还显示了具有两个正向重复的构建体(pSIM780)引发了基因沉默。然而，这种排列不象pSIM756的反向重复结构那样有效(表1)。此外，四个正向重复(pSIM787)比 两个正向重复更有效(表1)。 [0204] 为了研究无终止子沉默的分子基础，从已经用pSIM717重新转化的三株植物和用pSIM715重新转化的三株另外的植物分离RNA。在每种情况下，一株植物代表无效的沉默事 件，而另外两棵植物显示近完全的gus基因沉默。 [0205] 进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来研究来自pSIM715和pSIM717中使用的两种不同启动子的转录产物的产生。用于这些实验的第一引物(PG，SEQ ID NO：8中显示) 特异于gus基因片段的序列并与任一链产生的转录产物退火。设计第二引物以仅与其中的 一条链的内含子序列退火(pIF，如SEQ ID NO：9所示，其与P1启动子产生的转录产物中由 GBSS内含子衍生的间隔区序列退火，以及PIR，如SEQ ID NO：10所示，其与P2启动子产生的 转录产物退火)。有趣地，这些研究证明了非沉默的植物717-7和717-13的构建体仅含有 从两条链之一产生的转录产物，T1或T2(附图7)。相比之下，沉默的植物715-19、715-38、 717-55和717-36产生从两条链产生转录产物(附图7)。因此，仅当构建体的两个启动子 同时具有功能活性时才能实现有效的沉默。 [0206] 随后使用来自gus基因的放射性标记的探针的RNA凝胶印迹杂交表明，在715-38、715-55、717-12、717-36和717-19中有效的沉默与gus RNA积累的强烈下降有关。此外发 现，在完全沉默的植物 中由沉默构建体产生的转录产物一般是从约0.2kb到约1.0kb的大 小(附图8)。虽然RT-PCR揭示了存在着不仅包含多核苷酸还包含下游启动子序列的额外 的大转录产物，但在RNA凝胶印迹上几乎不能检测这种转录产物的存在。例如，与来自P1 启动子的探针杂交在可以观察到极其不清晰的成片电泳条带之前需要七天的曝光时间。 [0207] 实施例3 [0208] 马铃薯块茎中的沉默 [0209] 开发了各种载体来测试块茎中无终止子沉默。这些载体含有新霉素磷酸转移酶(nptII)基因表达盒作为选择标记系统(也参见附图6)。用于在马铃薯块茎中的基因沉默 的驱动启动子选自：(1)马铃薯遍在蛋白-7启动子，(2)微粒结合淀粉合酶(GBSS)基因的 强块茎和匍匐茎特异性启动子(SEQ ID NO：12)，和(3)马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP) 基因的块茎特异性强启动子(SEQ IDNO：13)。参见附图4的转移DNA图谱。 [0210] pSIM764：载体pSIM764含有‘块茎沉默’构建体，所述构建体包含由与GBSS启动子可操作连接的马铃薯块茎表达的PPO基因的154-bp非转录尾区(SEQ ID NO：14)组成的 第一节段，和在相反方向上由与GBSS启动子可操作连接的相同非转录尾区片段组成的第 二节段，其中所述第一和第二节段由SEQ ID NO：15中所示的马铃薯遍在蛋白-7基因的内 含子分隔。 [0211] pSIM765：载体pSIM765与pSIM764相同，只是PPO基因片段按相反方向定向。 [0212] pSIM217代表对照质粒，并含有在GBSS启动子和遍在蛋白终止子之间以反向重复插入的PPO基因的两个拷贝。 [0213] 使10倍稀释的过夜生长的培养物生长5-6小时，在2,800RPM沉淀重悬浮15分钟，用补充有蔗糖(3％，pH 5.7)的MS液体培养基(Phytotechnology)洗涤，重悬于相同培 养基中直到0.2OD/600nm。混合重悬浮的细胞，用于感染马铃薯品种“Ranger Russet”的 0.4-0.6mm节间节段。感染的茎在含6g/L琼脂的共培养基(1/10MS盐，3％蔗糖，pH 5.7) 上在Percival生长箱(16小时灯照)中22℃孵化两天，随后转移到含timentin(150mg/L) 和卡那霉素(100mg/L) 的愈伤组织诱导培养基(补充有3％蔗糖3、2.5mg/L玉米素核苷、 0.1mg/L萘乙酸和6g/L琼脂的CIM，MS培养基)上。在CIM上培养一个月后，将外植体转 移到含timentin(150mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的苗诱导培养基(SIM，补充有3％蔗糖、 2.5mg/L玉米素核苷、0.3mg/L赤霉酸GA3和6g/L琼脂的MS培养基)直到苗出现。将再生 周期结束时产生的苗转移到具有3％蔗糖、6g/L琼脂和timentin(150mg/L)的MS培养基。 将转基因植物转移到土壤并置于生长箱中(11小时光照，25℃)。三周后，分析至少3个小 块茎/株系的PPO活性。为此，在液氮中将1g马铃薯块茎粉碎，添加到含50mM邻苯二酚的 5ml 50mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷-磺酸))缓冲液(pH6.5)中，并在室温下旋转孵育约1 小时。沉淀固体部分，将上清液转移到另一个试管来测定PPO活性。为此，在液氮中粉碎1g 马铃薯块茎。然后将该粉未添加到5ml的含有50mM邻苯二酚的50mM MOPS(3-(N-吗啉代) 丙烷-磺酸)缓冲液(pH 6.5)中，在室温下旋转孵化约1小时。然后沉淀固体组分，将上 清液转移到另一个试管，通过测量经时OD-410的变化来测定PPO活性。实现表明，pSIM764 和765在马铃薯块茎中引发了有效的沉默(表2)。与WO 2003/069980中呈现的数据的比 较表明，如PPO对照物pSIM217所示本发明的方法比常规的基于终止子的基因沉默更有效。 [0214] 实施例4 [0215] 烟草中的多基因沉默 [0216] 制备两种构建体来研究沉默构建体内基因片段的位置的影响。为此，pSIM771的gus基因片段的两个拷贝被与烟草多酚氧化酶(PPO)基因的片段(SEQ ID NO：16)连接的 gus基因片段的两个拷贝代替(也参见附图6)。 [0217] pSIM774：载体pSIM774含有沉默构建体，具有与启动子紧密连接的gus基因片段和邻近的与中心内含子连接的PPO基因片段。 [0218] pSIM775：载体pSIM775含有沉默构建体，具有与启动子紧密连接的PPO基因片段和邻近的与中心内含子连接的gus基因片段。 [0219] 用这些载体重新转化gus植物期望与pSIM771一样有效地引发沉默。 [0220] 实施例5 [0221] 马铃薯中的多基因沉默 [0222] 通过靶向三个不需要的马铃薯块茎基因来实现多基因沉默。 [0223] 质粒pSIM1121(Russet Boise II)包含SEQ ID NO：17所示的全天然转化DNA，SEQID NO：17包含沉默构建体，所述沉默构建体包含两个拷贝的DNA节段，由马铃薯遍在蛋 白-7基因的内含子分隔并在两个会聚GBSS启动子之间反向重复定位，所述DNA节段包含 (i)野生马铃薯相关Solanum verrucosum Schltdl.TRHRG 193登记号码498062的块茎表 达的多酚氧化酶基因的非转录尾区的片段(参见，USDA，ARS，National Genetic Resources Program.GermplasmResources Information Network-(GRIN)[Online Database] NationalGermplasm Resources Laboratory，Beltsville，Maryland.Available：http:// www.ars-grin.gov2/cgi-bin/npgs/html/acchtml.pl？1392998，12September 2005)(SEQ ID NO：18)(ii)磷酸化酶L基因的前导区的片段(SEQ ID NO：19)，和(iii)R1基因的前导 区的片段(SEQ IDNO：20)。 [0224] 应用该质粒的产生了仅含天然DNA并展现以下新性状的转化的马铃薯植物：(1)由于块茎表达的PPO基因的沉默的擦伤耐受性，(2)由于磷酸化酶和R1基因的沉默的降低 的冷诱导的葡萄糖积累。 [0225] 实施例6 [0226] 高效启动子靶向 [0227] 制备以下转化载体来证明目标启动子的序列可用于目标基因的沉默表达(参见附图4)： [0228] pSIM773：载体pSIM773含有构建体，其包含第一节段，所述第一节段包含连接到P1的P3启动子，和第二节段，其按反向取向定向并且包含连接到P1的P2。所述第一和第 二节段由内含子分隔。 因而，这个构建体含有四个功能上有活性的启动子。中间的两个启 动子是相同的，代表目标启动子，并处于会聚取向。两个外部启动子相互不同并处于会聚取 向。所有四个启动子含有TATA框，并上溯到转录起始的上游碱基对。 [0229] pSIM1101：载体pSIM1101与pSIM773相同，只是P3启动子被nos终止子替代。 [0230] pSIM788：载体pSIM788与pSIM773相似，只是目标gus基因的两个中心P1启动子仅含有TATA框上游的序列(SEQ ID NO：21)，因而是无功能的启动子。 [0231] pSIM1120：载体pSIM1120与pSIM773类似，只是目标基因的两个中心启动子缺少TATA框并且不处于会聚取向而是离散取向。 [0232] pSIM1112：载体pSIM1112含有插入到会聚的P2和P3启动子之间的单个无功能的P1启动子。 [0233] pSIM1113：载体pSIM1113含有由内含子分隔的两个会聚的P1启动子。 [0234] pSIM754：对照载体pSIM754含有驱动P2启动子的表达的P1启动子，反之亦然。 [0235] 用pSIM773重新转化gus植物产生35株潮霉素抗性植物。PCR分析确认了pSIM773的转化DNA的存在。令人惊讶地，随后的gus染色揭示了极其有效的gus基因的完全沉默 (表1)。二十株植物(57％)没有显示任何可检测的gus表达。因而，使用pSIM773策略的 启动子靶向是非常有利的。 [0236] 用以离散方向插入到两个会聚驱动启动子之间的目标启动子获得了类似的结果，用pSIM1120重新转化的77％的植物显示了完全的gus基因沉默(表1)。 [0237] 表1显示了通过使用插入到会聚驱动启动子之间的单个目标启动子(pSIM1112)也实现了基因沉默。然而，这种方法不如采用以反向重复定向的目标启动子的两个拷贝的 方法有效。 [0238] 此外，pSIM1113的效力表明，驱动启动子并不总是必需的。通过仅采用两个会聚的目标启动子有可能有效地沉默基因(表1)。 [0239] 许多用pSIM1101重新转化的植物(44％)也显示了完全 的基因沉默(表1)。这个发现表明，基于启动子的沉默不需要会聚转录。 [0240] 常常发现常规的沉默方法在随后的子代中不能提供稳定的基因沉默。相比之下，由pSIM773代表的四启动子构建体得出了在沉默盒传播到下一代时完全地维持的完全沉 默。通过使双转化的烟草植物成熟，并随后测定T1子代中gus表达水平，表明了增强的稳 定性。这项研究显示，来自pSIM773植物并含有gus基因和沉默盒的子代植物100％的显示 了完全的gus基因沉默(表3)。相比之下，携带gus基因和pSIM374沉默盒的T1植物都没 有显示完全的gus基因沉默(表3)。通过分析携带gus基因和pSIM717的沉默盒的植物的 子代观察到中间表型(表3)。 [0241] 实施例7 [0242] 启动子靶向的序列要求 [0243] 以上实验证明了启动子序列可以有效地引发基因沉默。然而，它们不应被理解为意味着可以采用目标基因的任何启动子片段用于这个目的。 [0244] 为了研究对基于启动子的沉默的序列要求，制备两个载体，其包含反向重复插入在驱动启动子之间的部分P1启动子的两个拷贝。 [0245] pSIM1118：载体pSIM1118含有两个拷贝的SEQ ID NO：11所示启动子的上游300-bp片段。 [0246] pSIM1119：载体pSIM1119含有两个拷贝的SEQ ID NO：51所示P1启动子的中心300-bp区。 [0247] 用这两个不同的构建体重新转化gus植物分别产生34和20株植物，对它们进行组织化学分析。有趣地发现，分析的植物都没有显示任何降低的gus表达，表明采用的启动 子片段没有有效地引发基因沉默(表1)。 [0248] 附图9显示了各种启动子片段的序列分析。促进有效的基因沉默的片段存在于pSIM773、788、1101和1120中，不存在于pSIM1118和1119中。 [0249] 实施例8 [0250] 在含有两个拷贝的包含R1基因启动子片段的沉默构建体的 [0251] 马铃薯植物块茎中降低冷糖化 [0252] 马铃薯淀粉相关R1基因的启动子序列，包括前导区和起始密码子，在SEQ ID NO：22中示出。将两个拷贝的短(342-bp)R1启动子片段(SEQ ID NO：23)反向重复插入到两 个会聚定向的GBSS启动子(质粒pSIM1038中)或以会聚取向的GBSS和AGP启动子(质 粒pSIM1043中)之间。产生的二元载体用于生产转化的马铃薯植物。这些植物将发育块 茎，将块茎在4℃保存约一个月或更久。冷储藏的块茎的葡萄糖分析将表明，转化的植物比 未转化的对照植物积累了较少的葡萄糖。降低的葡萄糖积累将降低在薯条加工期间的颜色 形成，因而使得降低漂白时间和保持更多的原始马铃薯风味成为可能。此外，启动子介导的 R1基因沉默将限制淀粉磷酸化并因而降低与含马铃薯淀粉废水的释放有关的环境问题。转 化块茎的其他益处包括：(1)产生的炸薯条将含有更低量的、通过葡萄糖和天冬酰胺之间 的反应形成的毒性化合物丙烯酰胺，和(2)由专业的感应仪表评估可知产生的油炸食物将 显得松脆，这是由于淀粉的轻微改变的结果。 [0253] 通过采用SEQ ID NO：24所示的R1启动子的较短的(151-bp)部分，可以获得类似的结果。二元载体pSIM1056包含两个拷贝的反向重复插入到两个会聚定向的GBSS启动子 之间的这个片段，pSIM1062包含插入在会聚定向的GBSS和AGP启动子之间的这个片段。这 个载体用于产生25株转化的植物，其可以显示降低的冷诱导的葡萄糖积累和与该性状相 关的所有益处。 [0254] 实施例9 [0255] 在含有包含多酚氧化酶基因启动子片段的两个拷贝的沉默构建体的 [0256] 马铃薯植物块茎中增强的黑斑擦伤耐受性 [0257] 马铃薯块茎表达的多酚氧化酶基因的启动子的序列在SEQID NO：25中示出。将两个拷贝的200-bp PPO启动子片段(SEQ IDNO：26)反向重复插入在会聚的GBSS和AGP启动 子之间。用称为pSIM1046的包含该沉默构建体的二元载体产生25株转化的马铃薯植物。 使植物发育块茎，可以分析块茎的多酚氧化酶活性。这种分析将 显示如果与未转化的对照 物的中的水平相比，目标PPO基因的表达水平被降低。 [0258] 按类似的方法，含有插入在会聚的GBSS和AGP启动子之间的460-bp PPO启动子片段(SEQ ID NO：27)的质粒pSIM1045可用于降低PPO基因表达。 [0259] 类似的策略可用于其他作物物种来减少擦伤。例如，莴苣的叶表达的PPO基因的启动子可以用于减少莴苣叶中的擦伤，苹果的果实表达的PPO基因的启动子可以用于减少 苹果果实中的擦伤，小麦的种子表达的PPO基因的启动子可以用于减少小麦颗粒中的擦 伤。在所有这些和其他情况中，通过设计与已知的PPO基因序列退火的引物、并进行公知的 DNA分离方法例如逆反PCR，可以直接地分离启动子。 [0260] 实施例10 [0261] 在含有两个拷贝的包含Fad2基因启动子片段的沉默构建体的 [0262] 油菜植物种子中改善的油含量 [0263] 芸苔Fad2基因的启动子序列，包括前导区、内含子和起始密码子，在SEQ ID NO：28中显示。缺乏任何转录的序列的这个启动子的片段例如SEQ ID NO：29所示441-bp片段 的两个拷贝可以反向重复置于两个会聚定向的芸苔种子中表达的启动子之间。‘驱动’启动 子的实例是：SEQ ID NO：30所示napin(1.7S种子贮藏蛋白基因)的启动子或硬脂酰-ACP 脱饱和酶基因的启动子(SEQ ID NO：31)。 [0264] 沉默盒可以置于二元载体的转化DNA序列内，这个二元载体可用于转化芸苔。产生的以下植物将产生含有提高数量的油酸的种子。 [0265] 可用于沉默构建体来改善含油种子作物例如油菜、大豆、棉花和葵花中油含量的其他启动子包括脂肪酸生物合成途径的其他基因的启动子。例如，目标脂肪酸脱饱和酶12、 或微粒体ω-6脂肪酸脱饱和酶(FAD12)基因的启动子(例如，对于油菜的Genbank登记号 Nr.AF243045和对于大豆的AB188250)，例如SEQ ID NO：32所示的大豆FAD12启动子，可用 于提高作物例如油菜和大豆中的油酸水平。 [0266] 此外，棉花硬脂酰-酰基-载体蛋白Δ9-脱饱和酶和油酰基-磷脂酰胆碱Ω6-脱饱和酶基因的启动子可被用于在棉花中分别提供硬脂酸和油酸水平。这个启动子可以通 过使用目标基因的已知序列进行例如逆反PCR的方法来鉴定(Liu et al.，Plant Physiol 129：1732-43，2002)。新近分离的启动子的两个拷贝因而可以用于类似于pSIM773所显示 的策略，其中‘驱动者’种子特异性启动子可以外源DNA或天然DNA。 [0267] 实施例11 [0268] 在含有包含两个拷贝的Comt基因启动子片段的沉默构建体的 [0269] 苜蓿植物脉管系统中降低木质素含量 [0270] 紫苜蓿咖啡酸/5-羟基阿魏酸3/5-O-甲基转移酶(COMT)基因的启动子，包括前导区，在SEQ ID NO：33中示出。 [0271] 两个拷贝的缺少转录的序列的448-bp启动子片段(SEQ IDNO：34)反向重复插入到两个会聚定向的驱动启动子之间。第一驱动启动子是SEQ ID NO：35所示的petE基因的 启动子；第二启动子是SEQ ID NO：36所示的Pal基因的启动子。称为pSIM1117的包含这 个沉默构建体的二元载体被用于产生转化的苜蓿植物。分析植物的茎组织，显示了含有降 低的木质素水平。 [0272] 可以根据以下方案测定降低的木质素含量：(i)切下茎切片并将它们置于表面皿上，(ii)将切下的茎在室温下置于1％中5min，(iii)使用一次性的移液管弃去高锰酸钾溶 液，用水洗涤样品两次除去过量的高锰酸钾，(iv)添加6％HCl(V/W)，使切片的颜色从黑色 或暗褐色转为浅棕色，(v)如有必要，添加另外的HCl来促进暗色的去除，(iv)弃去HCl并 用水洗涤样品两次，(vii)添加几滴15％碳酸氢钠溶液(通常它不会完全地溶解)，从硬木 产生暗红色或红紫色(在S单元中更高)，从软木产生褐色(在G单元中更高)。 [0273] 检测十九株转化的苜蓿株系的降低的木质素含量，发现六株植物积累了木质素的S单元的降低的数量。 [0274] 代替COMT基因的启动子，还可能使用咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移酶(CCOMT)基因的启动子。这个启动子的序列，连同下游的前导区，在SEQ ID NO：37中示出。SEQ ID NO： 38中描述的缺少转录的序列的SEQ ID NO：29的片段可用于降低木质素含量。 [0275] 类似地，通过使用涉及木质素生物合成的基因的启动子可以降低树木中的木质素。也可以通过采用上述基于启动子的沉默方法，使用SEQ ID NO：59并降低玉米中的木质 素含量。 [0276] 实施例12 [0277] 含有包含两个拷贝的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子片段的沉默构建体 [0278] 的番茄植物果实的提高的货架期 [0279] 通过将两个拷贝的启动子片段反向重复插入在会聚的果实特异性驱动启动子之间，可以在番茄中将目标多聚半乳糖醛酸酶基因的启动子，例如SEQ ID NO：39所示的番茄 启动子用于降低果胶的破坏，从而减慢细胞壁降解、延迟软化、增强粘度性质、并提高货架 期。 [0280] 实施例13 [0281] 含有包含两个拷贝的编码过敏原的基因启动子片段的沉默构建体的 [0282] 植物的降低的食物过敏原性 [0283] 可以通过采用逆反PCR方法使用已知的基因序列(Gilissenet al.，J AllergyClin Immunol 115：364-9，2005)分离主要苹果过敏原Mal d 1基因的启动子，然后该启动 子可以用于开发含有低过敏原性水平的苹果品种。 [0284] 类似地，主要花生过敏原Ara h 2的启动子(Dodo et al.，CurrAllergy AsthmaRep 5，67-73，2005)可以使用逆反PCR方法来分离，并用于开发含有低过敏原性水平的花 生品种。 [0285] 此外，主要大豆过敏原Gly m Bd 30K的启动子(Herman etal.，Plant Physiol132，36-43，2003)可以使用逆反PCR方法来分离，并用于开发含有低过敏原性水平的花生 品种。 [0286] 实施例14 [0287] 基于基因和启动子片段的组合的多基因沉默方法 [0288] 质粒pSIM870(Russet Boise III)包含SEQ ID NO：40中描述的全天然转化DNA，分别包含(1)包含反向重复定位于两个会聚GBSS启动子之间的两个拷贝的DNA节段的第 一沉默盒，其中所述 DNA片段包含(i)Solanum verrucosum的块茎表达的多酚氧化酶基因 的非转录尾区的片段，(ii)磷酸化酶L基因的前导区的片段，和(iii)磷酸化酶L基因的 非转录尾区的片段(SEQ ID NO：41)，和(2)包含反向重复定位于AGP和GBSS基因的驱动 启动子之间的两个拷贝的R1启动子的第二沉默盒。 [0289] 质粒pSIM899(Russet Boise IV)包含SEQ ID NO：42中描述的全天然转化DNA，分别包含(1)包含反向重复定位于两个会聚GBSS启动子之间的两个拷贝的DNA片段的第一 沉默盒，其中所述DNA片段包含(i)Solanum verrucosum的块茎表达的多酚氧化酶基因的 非转录尾区的片段，和(ii)磷酸化酶L基因的前导区的片段，以及包含可操作地连接到AGP 启动子的R1基因的前导区的四个拷贝，其后包含R1基因的有义和反义片段的反向重复。 [0290] 用这三种质粒的任一种转化马铃薯，将产生与未转化的植物相比显示以下特征的植物：(1)块茎表达的多酚氧化酶基因的表达降低，和由此(i)可由xx测定的提高的块茎 多酚含量，和(ii)可由xx测定的对块茎黑斑擦伤的增强的耐受性，和(2)磷酸化酶和R1基 因的表达强烈降低，并由此(i)降低的淀粉磷酸化，以及含马铃薯淀粉废水的磷酸盐含量 降低，和(ii)由使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂(Megazyme，Ireland)测定的在冷藏 期间淀粉向葡萄糖的转变降低，引起(a)较少的焦糖化，并由此在油炸期间颜色形成降低， 使得在较高的温度保藏和/或漂白较短的时间周期成为可能，(b)较少的丙烯酰胺形式，和 (c)油炸脆度提高。 [0291] 实施例15 [0292] 内含子靶向 [0293] 用于产生TFCT构建体的多核苷酸可以含有产生目标转录产物的基因的内含子。靶向内含子的沉默可以通过使用在转基因烟草种表达的gus基因的内含子来证明。 [0294] 产生以下转化载体来证明目标内含子的序列可用于目标基因的沉默表达(还参见附图5)： [0295] 载体pSIM782，其含有一种构建体，所述构建体包含由与启动子(P1)可操作连接的gus基因的内含子组成的第一片段，和在 相反方向上由与第二组成型启动子(P2)可操 作连接的相同gus基因内含子组成的第二片段，其中所述第一和第二片段由一内含子分 隔。 [0296] 可以用于沉默基因的内含子的实例是Solanum vernei淀粉相关R1基因的内含子SEQ ID NO：44。R1基因沉默将降低保藏期间块茎种冷诱导的糖化的程度。 [0297] 实施例16 [0298] 终止子靶向 [0299] 用于产生TFCT构建体的多核苷酸可以包含目标基因的转录序列的下游的序列。通过使用在转基因烟草中表达的gus基因的下游的序列，可以对其进行证明。 [0300] 实施例17 [0301] 在含有两个拷贝的包含Comt基因的片段的沉默构建体的 [0302] 首蓿植物脉管系统中降低的木质素含量 [0303] 装配包含表达盒称为pSIM856的二元载体，所述表达盒包含SEQ ID NO：52和53中所示的两个Comt基因片段，反向重复定位于SEQ ID NO：54和55所示两个会聚苜蓿启动 子之间，从而所述启动子与第一反义片段、然后与有义片段可操作连接。将表达盒插入到来 自苜蓿的序列之间，所述来自苜蓿的序列如SEQ ID NO：56和57所示，作为农杆菌边界的替 换物起作用。将SEQ ID NO：58中所示的完整的转化DNA插入在主干中携带农杆菌ipt基 因的表达盒的质粒中。 [0304] 如Weeks和Rommens，美国专利申请US20050034188A1中描述的进行转化，通过引用将其并入本申请。检测两个转化的植物的木质素含量，都发现在S-单元中没有可见的积 累。 [0305] 表格 [0306] 表1.常规的和无终止子沉默构建体的效力 [0307] [0308]PSIM1119 20 20(100％) 0 0 0 pSIM1120 35 8(23％) 0 0 27(77％) [0309] 表2.马铃薯小块茎中的PPO活性。‘wt’＝未转化的野生型植物；‘401’＝携带仅包含nptII可选择标记基因的表达盒的转化DNA转化植物，‘OD’＝OD260测量值，‘S.E.’ ＝标准误差。 [0310] [0311] [0312] 表3 [0313]PSIM1118 34 34(100％) 0 0 0 亲本系 gus基因和沉默 构建体都PCR 阳性 部分沉默的 完全沉默的 374-18 25/50(50％) 24/25(96％) 0 717-54 35/50(70％) 28/35(80％) 3/35(9％) 773-4 23/50(46％) 0 23/23(100％) [0314] 序列 [0315] [0316] [0317] [0318] [0319] [0320] [0321] [0322] [0323] [0324] [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] [0330] [0331] |
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