[0001] 优先权声明

[0002] 本申请要求获得2012年12月19日提交的题为“用于高效和高通量产生转基因事件的改良大豆转化方法(IMPROVED SOYBEAN TRANSFORMATION FOR EFFICIENT AND HIGH-THROUGHPUT TRANSGENIC EVENT PRODUCTION)”的美国临时专利申请系列号61/739,349的申请日的权益。

[0003] 本公开涉及一般意义上的植物育种。提供了用于大豆转化的方法。本公开的方法可用于转基因大豆的高效率并且高通量的生产，和转基因大豆产品的产业开发。

[0004] 背景

[0005] 大豆(Glycine max)是最重要的农业作物之一，全世界每年的作物产量超过2亿公吨，估计价值超过400亿美元。大豆占全球油料种子生产的超过97％。因此，提高这种有价值的作物的质量和产量的可靠而高效的方法具有显著的利益。

[0006] 用于改良大豆的传统育种方法已经受到限制，因为大部分的大豆栽培种仅源于少数几个亲本系，导致种质育种基础较窄。Christou等，TIBTECH8:145-151(1990)。现时的研究工作主要致力于在用植物基因工程技术来提高大豆产量。转基因方法旨在将期望的基因导入到作物植物的可遗传种系中，以产生优良的植物品系。这种策略已经成功地增加了其它几种作物植物对疾病、昆虫和除草剂的抗性，同时提高了营养价值。

[0007] 已经开发出了多种用于将基因转移到植物组织中的方法，包括高速微喷射、显微注射、电穿孔和直接DNA摄取。最近，土壤杆菌介导的基因转化已经被用于将感兴趣的基因导入到大豆中。然而已经证明，大豆对转基因工程而言是一个具有挑战性的系统。大豆的高效转化和外植体的再生是难以实现的，并且经常难以重复。

[0008] 根癌土壤杆菌是一种致病性的土栖细菌，具有固有的将其DNA(称为T-DNA)转移到宿主植物细胞内、并诱导宿主细胞产生可用于细菌营养的代谢物的能力。使用重组技术，可以将一些或全部的T-DNA用感兴趣的基因取代，产生可用于转化宿主植物的细菌载体。土壤杆菌介导的基因转移通常针对植物培养物中未分化的细胞，但也可以针对从植物叶片或茎获取的已分化细胞。已经开发了多种用于大豆的土壤杆菌介导的转化方法，它们可以根据被转化的外植体组织加以松散的分类。

[0009] 美国专利No.7,696,408，Olhoft等人公开了一种子叶节(cotyledonary node)方法，用于转化单子叶植物和双子叶植物。“子叶节”方法涉及从5-7日龄大豆幼苗通过在子叶节的正下方切割除去下胚轴，切开并分离剩余的带有子叶的下胚轴节段，并从子叶除去上胚轴(epicotyl)。将子叶外植体在腋芽和/或子叶节的区域中造伤口(wounded)，并与根癌土壤杆菌在黑暗中培养五天。该方法需要在体外萌发种子，并且制造伤口步骤(wounding step)会引入显著的变数。

[0010] 美国专利No.6,384,301，Martinelli等人公开了向来自从大豆种子切下的大豆胚的活分生组织中进行土壤杆菌介导的基因传递，随后用选择剂和激素培养分生外植体，并诱导芽形成。与“子叶节”方法相似，优选地在感染之前对分生外植体致伤。

[0011] 美国专利No.7,473,822，Paz等人公开了一种改良的子叶节方法，称作“半种子外植体”法。使成熟的大豆种子吸胀，表面灭菌，并沿着种脐切开。在感染之前，胚轴和芽被完全除去，但没有其它的伤口出现。进行土壤杆菌介导的转化，选择潜在转化体，并在选择培养基上再生外植体。

[0012] 使用这些方法的转化效率仍然相对较低，“子叶节”法在0.3％-2.8％的量级，“分生外植体”法为1.2-4.7％，“半种子外植体”法为3.2％-8.7％(整体4.9％)。本领域的典型转化效率为大约3％。

[0013] 改良的“分割种子”转基因程序可以加速未来转基因大豆产品的产生和发展。用于将转基因稳定整合到大豆组织中的高效且高通量的方法将促进育种进程，并具有提高作物的产量的潜力。

[0014] 公开

[0015] 本公开涉及转化植物细胞的方法。更特别地，本公开涉及用于转化大豆(Glycine max)的方法，其使用土壤杆菌介导转化分割的大豆种子，其中分割的大豆种子保留一部分胚轴。

[0016] 附图简述

[0017] 图1显示了pDAB9381的质粒图，根据特定的实施方案，该构建体可用于土壤杆菌介导的大豆外植体的转化。

[0018] 图2显示了pDAB107533的质粒图，根据特定的实施方案，该构建体可用于土壤杆菌介导的大豆外植体的转化。

[0019] 图3显示了在不同比例草甘膦下培养的大豆子叶的照片。此外，提供了描绘了对不同比例的草甘膦有至少一半子叶变黄的外植体的百分比的图。

[0020] 图4显示了pDAB105958的质粒图。

[0021] 序列表

[0022] 附随的序列表中列举的核酸序列是使用如37C.F.R.§1.822定义的核苷酸碱基的标准字母缩写显示的。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是应当理解的是，任何对所显示的链的提述包括了互补链。在附随的序列表中：

[0023] SEQ ID NO:1显示了用于本公开的质粒构建体pDAB9381中的YFP植物转录单元(PTU)。

[0024] SEQ ID NO:2显示了用于本公开的质粒构建体pDAB9381中的PAT植物转录单元(PTU)。

[0025] SEQ ID NO:3显示了用于本公开的质粒构建体pDAB107553中的DGT-28植物转录单元(PTU)。

[0026] SEQ ID NO:4显示了用于本公开的质粒构建体pDAB107553中的PAT植物转录单元(PTU)。

[0027] SEQ ID NO:5显示了用于本公开的质粒构建体pDAB105958中的HPT植物转录单元(PTU)。

[0028] SEQ ID NO:6显示了用于本公开的质粒构建体pDAB105958中的PAT植物转录单元(PTU)。

[0029] 实施本发明的模式

[0030] 本文公开了用于高效率且高通量地转化大豆的方法。采用所公开的大豆转化方法所致的转化频率显著高于先前已知的方法，并且可导致高达20.3％的转化频率。该新型大豆转化系统的效率是其它方法(即“子叶节”法和“半种子外植体”法)的大约3-8倍，并可作为提高转基因大豆植物产业开发的基础。

[0031] 一般地，本公开的实施方案涉及一种用于转化包含部分胚轴的分割的大豆种子的新方法。该新型方法是对其它已知转化方法的改良，导致高效产生转基因大豆植物。

[0032] 在一个实施方案中，公开了一种用转基因转化大豆的新方法。本方法的实施方案包括纵向分割大豆种子获得分割的大豆种子，其中一部分胚轴保持附着在分割的大豆种子上。接着，使用转化方法用至少一个转基因转化该包含部分胚轴的分割的大豆种子。从被转化的包含部分胚轴的分割的大豆种子中选择大豆转化体。

[0033] 在本公开的一个实施方案中，在分割大豆种子之前，使大豆种子吸胀(imbibe)。大豆种子可以吸胀14-16小时。此外，大豆种子可以吸胀其它备选的时长。例如，大豆种子可以吸胀6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,或48小时的时间。

[0034] 在本公开的第二个实施方案中，大豆种子沿着大豆种子的种脐纵向分割。

[0035] 在一个实施方案中，大豆种子被分割，使得胚轴仍然附着于大豆种子的节端(nodal end)。大豆种子保留的胚轴可以包括胚轴种子结构的任何部分。这样，在分割的大豆种子时保留的任何部分或量的胚轴在本公开的范围内。实施方案包括在分割的大豆种子时保留的胚轴的任何部分，包括胚轴的任何全长部分(full length portion)或任何非整1 2
体部分(partial portion)。例如，在分割的大豆种子时可保留1/4,/3,1/2,/3,3/4,或完整的胚轴。

[0036] 在进一步的实施方案中，对保留部分胚轴的分割的大豆种子进行转化，方法是用携带一个或多个位于构建体内的转基因的根癌土壤杆菌菌株接种该分割的大豆种子。额外的实施方案可以包括其它的转化方法。例如，高速微喷射介导的转化法、显微注射介导的转化法、电穿孔介导的转化法、或直接DNA摄取介导的转化方法，或者任何其他的植物转化方法，被认为在本公开的范围内。

[0037] 在本公开的实施方案中，保留部分胚轴的分割的大豆种子被转化，借此将转基因导入到大豆细胞内。将转基因导入到大豆细胞内可以产生稳定转化或瞬时转化的大豆植物细胞。在这一实施方案的一个方面中，一个或多个转基因可以被转化到大豆植物细胞中。在进一步的实施方案中，转基因包含启动子、开放阅读框、和3'非翻译区。开放阅读框架能够编码基因，其中该基因是标志物基因、农艺基因、或任何其它类型的基因。

[0038] 在一个实施方案中，使用选择剂选择被转化的保留部分胚轴的分割的大豆种子。选择剂的实例包括，但不仅限于，草铵膦(glufosinate)、膦丝菌素、2,4-D、卡那霉素、潮霉素和草甘膦。

[0039] 本公开的实施方案涉及从包含部分胚轴的分割的大豆种子再生一个或多个外植体。外植体的再生通常在选择培养基上进行，但也可以在本领域已知的其他类型培养基中进行。当成功再生外植体时，可以通过在合适的培养基上进行组织培养而诱导形成一个或多个芽。作为本公开进一步的实施方案，该一个或多个芽可以被培养成完整、能育的大豆植物。所述芽包括被转化的胚系细胞(germline cell)。

[0040] 在本公开随后的实施方案中，完整、能育、成熟的大豆植物可以和另一大豆植物有性杂交，产生大豆后代植物。在本公开的另一个实施方案中，分离从转化的包含部分胚轴的分割的大豆种子产生的外植体，并将其推进到细胞-组织培养基中进行芽诱导(2周无选择和2周有选择)、芽伸长(有选择)，和生根(无选择)。推进转基因大豆外植体经过这些细胞培养阶段后，将产生转基因植物。通过分子分析确认转基因植物含有稳定整合在大豆基因组中的转基因。然后令特定的转基因大豆植物在温室中生长至成熟。在实验中，与子叶法相似，45％的T1后代被发现具有稳定整合的、可以被遗传给后代的大豆植物转基因拷贝。TM
转基因向后代的遗传能力通过使用除草剂LIBERTY 的除草剂筛选和分子分析加以确认。

[0041] 除非另外指出，否则术语“一”、“一个”在本文中用于指示至少一个。

[0042] 如本文所使用的，术语“外植体”是指从供体植物(例如从供体种子)移出或分离的大豆组织，在体外培养，并且能够在合适的培养基中生长。

[0043] 如本文所使用的，术语“子叶”可以一般地指种子植物胚的胚叶或“初生叶(primary leaf)”。子叶在本领域中也被称为“种子叶”。双子叶物种，例如大豆，具有两个子叶。“子叶节”是指种子或幼苗中子叶在胚上的附着点，并可以一般地指与附着点相关联的组织。

[0044] 如本文所使用的，术语“下胚轴”是植物胚或幼苗位于子叶下方和根或胚根(胚胎根)上方的部分。在种子中，下胚轴可见于子叶节正下方，并且还可以称为“子叶下茎(hypocotyledonous stem)”或“胚茎(embryonic stem)”。如本文所使用的，下胚轴可以指位置，也可以指其中所见的组织。“上胚轴”是植物胚或幼苗位于子叶上方和第一真叶下方的部分。在种子中，上胚轴可见于子叶节正上方，并且还可以称作“胚芽(embryonic shoot)”或“未来芽(future shoot)”等不同名称。如本文所使用的，上胚轴可以指如上所述的位置，也可以指在该位置中所见的组织。

[0045] 如本文所使用的，术语“胚轴”(embryonic axis)或(embryo axis)是指植物胚胎的主要部分，并且一般地包括上胚轴和下胚轴。

[0046] 如本文所使用的，术语“遗传修饰的”或“转基因的”植物是指包含预先选择的DNA序列的植物细胞、植物组织、植物部分、植物种质或植物，其中预先选择的DNA通过转化被导入到该植物细胞、植物组织、植物部分、植物种质或植物的基因组中。

[0047] 如本文所使用的，术语“转基因”、“异源”、“导入的”或“外来”DNA或基因是指重组的DNA序列或基因，其不是在该重组DNA或基因的受体植物的基因组中自然存在的，或者存在于受体植物基因组中与未转化植物不同的位置或环境(association)。

[0048] 如本文所使用的，术语“植物”是指整个植物、植物组织、植物部分，包括花粉、种子或胚、植物种质、植物细胞、或植物群。可以在本发明的方法中使用的植物类别不仅限于大豆，而是可以一般地包括任何可适于转化技术的植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

[0049] 如本文所使用的，术语“转化”是指将核酸或片段转移并整合到宿主生物中，导致在遗传上稳定的继承。含有被转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。已知的转化方法包括根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌介导的转化、磷酸钙转化、聚凝胺转化、原生质体融合、电穿孔、超声方法(例如，声致穿孔)、脂质体转化、显微注射、裸TMDNA、质粒载体、病毒载体、基因枪(微粒轰击)、碳化硅WHISKERS 介导的转化、气雾剂发射，或PEG转化以及其它可能的方法。

[0050] 关于遗传修饰植物的产生，用于植物基因工程的方法是本领域众所周知的。例如，已经开发了大量用于植物转化的方法，包括双子叶植物及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Goto-Fumiyuki等,Nature Biotech17:282-286(1999)；Miki等,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,67-88页(1993))。另外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可以在例如Gruber等,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,89-119页(1993)中获得。

[0051] 有大量的技术可用于将DNA插入到植物宿主细胞中。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌作为转化剂用卸甲的T-DNA转化，磷酸钙转染，聚凝胺转化，原生质体融合，电穿孔，超声方法(例如，声致穿孔)，脂质体转化，显微注射，裸DNA，质粒载体，病毒载体，基因枪(微粒轰击)，碳化硅晶须介导的转化，气雾剂发射，或PEG，以及其他可能的方法。

[0052] 例如，可以使用诸如电穿孔和植物细胞原生质体显微注射等技术将DNA构建体直接引入到植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用如DNA粒子轰击等生物射弹方法(参见，例如，Klein等(1987)Nature 327:70-73)将DNA构建体直接导入到植物组织中。用于植TM物细胞转化的其它方法包括通过碳化硅WHISKERS 介导的DNA摄取显微注射(Kaeppler等.(1990)Plant Cell Reporter 9:415-418)。作为替代，可以通过纳米颗粒转化将DNA构建体导入到植物细胞中(参见，例如美国专利申请No.12/245,685)。

[0053] 另一种已知的植物转化方法是微射弹(microprojectile)介导的转化，其中DNA被携带在微射弹的表面上。在该方法中，用生物射弹装置将表达载体导入到植物组织中，该生物射弹装置可以将微射弹加速到足以穿透植物细胞壁和细胞 膜 的 速 度。Sanford 等 ,Part.Sci.Technol.5:27(1987),Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988),Sanford,J.C.,Physiol.Plant 79:206(1990),Klein等,Biotechnology 10:268(1992)。

[0054] 或者，基因转移和转化方法包括，但不仅限于，通过氯化钙沉淀的原生质体转化、聚乙二醇(PEG)-或电穿孔介导的裸DNA摄取(参见Paszkowski等.(1984)EMBO J3:2717-2722,Potrykus等.(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm等.(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82:5824-5828；和Shimamoto(1989)Nature 338:274-276)，和植物组织的电穿孔(D’Halluin等.(1992)Plant Cell 4:1495-1505)。

[0055] 一种广泛采用的用于将表达载体导入到植物中的方法基于土壤杆菌的自然转化系统。Horsch等,Science227:1229(1985)。根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌是已知可用于遗传转化植物细胞的致病土壤细菌。根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述可以在下列文献中获得，例如Gruber等,前文,Miki等,前文,Moloney等,Plant Cell Reports 8:238(1989),和美国专利No.4,940,838和5,464,763。

[0056] 如果使用土壤杆菌进行转化，则应当将待插入的DNA克隆到专门的质粒中，即，或者克隆到中间载体中或者克隆到二元载体中。中间载体不能在土壤杆菌中复制自己。中间载体可以利用辅助质粒(接合)转移到根癌土壤杆菌中。日本烟草超双元系统(Japan Tobacco Superbinary system)是这种系统的一个实例(综述见，Komari等,(2006)，收录于Methods in Molecular Biology(K.Wang,编辑)No.343:Agrobacterium Protocols(第2版 ,第 1卷 )HUMANA PRESS Inc.,Totowa,NJ,15-41页；和 Komori等 .(2007)Plant Physiol.145:1155-1160)。双元载体在大肠杆菌和土壤杆菌中都可以复制自己。它们包括被T-DNA边界区框定的选择标记基因和接头或多接头。它们能够直接转化到土壤杆菌中(Holsters,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌包括携带vir区的质粒。Ti或Ri质粒也包括转移T-DNA必需的vir区。vir区是将T-DNA转移到植物细胞内必需的。可能含有其它的T-DNA。

[0057] 当使用双元T-DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共培养程序(Horsch等.(1985)Science 227:1229-1231)用细菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒力功能(virulence function)将指导含有构建体和相邻标记的T链插入到植物细胞DNA中。一般地，使用土壤杆菌转化系统工程化双子叶植物(Bevan等.(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-384；Rogers等.(1986)Methods Enzymol.118:627-641)。土壤杆菌转化系统也可用于转化以及转移DNA到单子叶植物和植物细胞中。参见美国专利No.5,591,616；Hernalsteen 等 .(1984)EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren 等 .(1984)Nature311:763-764；Grimsley等.(1987)Nature 325:1677-179；Boulton等.(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；和Gould等.(1991)Plant Physiol.95:426-434。

[0058] 在将基因构建体导入到植物细胞内之后，可以令植物细胞生长，并且在分化组织例如芽和根出现时，可以产生成熟的植物。在一些实施方案中，可以产生多株植物。用于再生植物的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可以例如在下列文献中找到：Plant Cell and Tissue Culture,1994,Vasil和Thorpe编辑.Kluwer Academic Publishers，和Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111,1999Hall Eds Humana Press)。本文描述的遗传修饰植物可以在发酵培养基中培养或者在合适的培养基例如土壤中种植。在一些实施方案中，适用于高等植物的生长培养基可以包括任何用于植物的生长培养基，包括但不限于，土壤、砂、任何其它支持根生长的颗粒介质(例如，蛭石，珍珠岩等)或水培物，以及可优化高等植物的生长的合适的光、水和营养补充。

[0059] 通过任何上述转化技术产生的转化植物细胞可以被培养，再生出具有被转化的基因型、因而具有期望的表型的完整植物。这些再生技术依赖于在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操作，通常依赖于与期望的核苷酸序列一起被导入的杀生物剂和/或除草剂标志物。从培养的原生质体进行植物再生的描述见Evans等.,“Protoplasts Isolation and Culture”，收 录 于 Handbook of Plant Cell Culture,124-176 页 ,Macmillian Publishing Company,New York,1983；和 Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,21-73页,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得。这样的再生技术在Klee等.(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486中有一般的描述。

[0060] 除非另外具体定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员所公知的相同含义。分子生物学通用术语的定义可以在下列文献中找到，例如Lewin B.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和 Meyers R.A.(编 辑 ),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

[0061] 本领域的技术人员会意识到，报告或标记基因的用于选择转化细胞或组织或植物部分或植物的应用可以包含在转化载体或构建体中。可选择标志物的实例包括可赋予针对抗代谢物如除草剂或抗生素的抗性的那些，例如二氢叶酸还原酶，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13:143-149,1994；另见Herrera Estrella等,Nature 303:209-213,1983；Meijer等,Plant Mol.Biol.16:807-820,1991)；新霉素磷酸转移酶，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性
(Herrera-Estrella,EMBO J.2:987-995,1983 和 Fraley 等 .Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:4803(1983))；和潮霉素磷酸转移酶，其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene
32:481-485,1984；另见Waldron等,Plant Mol.Biol.5:103-108,1985；Zhijian等,Plant Science108:219-227,1995)；trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:8047,1988)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO；McConlogue,1987,收录于Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.)的抗性；和来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟菌素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338,1995)。

[0062] 其他的可选择标志物包括，例如，突变的乙酰乳酸合酶，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee等.,EMBO J.7:1241-1248,1988)，突变的psbA，其赋予对阿特拉津(atrazine)的抗性(Smeda等.,Plant Physiol.103:911-917,1993)，或突变的原卟啉原氧化酶(参见美国专利No.5,767,373)，或其它可赋予对除草剂如草铵膦抗性的标记。合适的可选择标志物基因的实例包括，但不仅限于，编码对下述化合物的抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等.,EMBO J.2:987-992,1983)；链霉素(Jones等.,Mol.Gen.Genet.210:86-91,1987)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等.,Transgenic Res.5:131-137,1996)；博莱霉 素(Hille等.,Plant Mol.Biol.7:171-176,1990)；磺胺(Guerineau等,Plant Mol.Biol.15:127-136,1990)；溴苯腈(Stalker等.,Science242:419-423,1988)；草甘膦(Shaw等.,Science 233:478-481,1986)；膦丝菌素(DeBlock等.,EMBO J.6:2513-2518,1987)，等等。

[0063] 使用可选择基因的一个选项是草铵膦抗性编码DNA，在一个实施方案中，可以是膦丝菌素乙酰转移酶(pat)，受木薯脉花叶病毒启动子控制的玉米优化pat基因或bar基因。这些基因赋予对双丙氨膦的抗性。参见(见,Wohlleben等.(1988)Gene70:25-37)；Gordon-Kamm 等 .,Plant Cell 2:603；1990；Uchimiya 等 .,BioTechnology
11:835,1993；White 等 .,Nucl.Acids Res.18:1062,1990；Spencer 等 .,Theor.Appl.Genet.79:625-631,1990；和Anzai等.,Mol.Gen.Gen.219:492,1989)。pat基因的一个版本是玉米优化的pat基因，在美国专利No.6,096,947中有描述。

[0064] 此外，可以使用有助于鉴定含有编码标记的多核苷酸的植物细胞的标志物。当序列的存在产生可测量的产物、并且能够产生该产物而不破坏植物细胞时，可打分的或者可筛选的标志物是有用的。实例包括β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码已知有各种生色底物的酶(例如，美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson等.The EMBO Journal第6卷第13期3901-3907页)；和碱性磷酸酶。在一个优选的实施方案中，所用的标志物是β-胡萝卜素或原维生素A(Ye等.,Science 287:303-305-(2000))。该基因已被用于提高稻米的营养，但在这种情况下，它被用来作为可筛选标志物，并且通过提供金色来检测与感兴趣基因连锁的该基因的存在。与使用该基因对植物提供营养贡献的情形不同，较少量的蛋白即足以实现标记的目的。其它可筛选的标志物一般包括花青素/黄酮基因(参见Taylor和Briggs,The Plant Cell(1990)2:115-127的讨论)，包括例如，R-基因座基因，其编码可调节植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物(Dellaporta等,收录于Chromosome Structure and Function,Kluwer Academic Publishers,Appels和Gustafson编辑,263-282页(1988))；控制类黄酮色素生物合成的基因，例如玉米 C1 基 因 (Kao 等 ,Plant Cell(1996)8:1171-1179；Scheffler 等 .Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2基因(Wienand等,Mol.Gen.Genet.(1986)203:202-207)；
B基因(Chandler等,Plant Cell(1989)1:1175-1183)，p1基因(Grotewold等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:4587-4591；Grotewold 等 ,Cell(1994)76:543-553；
Sidorenko等 ,Plant Mol.Biol.(1999)39:11-19)；青 铜 色 基 因 座 基 因 (Ralston等,Genetics(1988)119:185-197；Nash等,Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)，及其它。

[0065] 合适的标志物的进一步的实例包括青色荧光蛋白(CYP)基因(Bolte等.(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato等.(2002)Plant Physiol.129:913-42)，黄色荧光TM蛋白基因(来自Evrogen的PHIYFP ；见Bolte等.(2004)J.Cell Science 117:943-54)；
lux基因，其编码萤光素酶，其存在可以使用例如X-射线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、低光摄像机、光子计数相机或多孔发光法进行检测(Teeri等.(1989)EMBO J.8:343)；
绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen等.,Plant J.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，其中被标志物基因转化的植物细胞呈红色，因此可以目测选择(Dietrich等.(2002)Biotechniques2(2):286-293)。另外的实例包括β-内酰胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)，其编码已知有各种生色底物的酶(例如，PADAC，一种发色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其编码儿茶酚双加氧酶，其能够转化发色的儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta等.,Biotech.(1990)8:241)；酪氨酸酶基因(Katz等.,J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其编码能够氧化酪氨酸为DOPA和多巴醌的酶，其进一步缩合形成容易检测的化合物黑色素。显然，许多这样的标志物是可以获得，并且是本领域技术人员已知的。

[0066] 在某些实施方案中，核苷酸序列可以任选地与另一种感兴趣的核苷酸序列组合。术语“感兴趣的核苷酸序列”是指这样的核酸分子(也可称为多核苷酸)，其可以是转录的RNA分子以及DNA分子，编码期望的多肽或蛋白，但也可以指不构成完整基因，并且不一定编码多肽或蛋白质的核酸分子(例如，启动子)。例如，在某些实施方案中，核酸分子可以和另一种核酸分子组合或“堆叠”，所述另一种核酸分子可以提供针对草甘膦或另一除草剂的额外抗性或耐受性，和/或提供对选择昆虫或疾病的抗性和/或增强营养，和/或改良的农艺学特性，和/或在饲料、食品、工业、医药或其它用途上有用的蛋白质或其它产物。在植物基因组中“堆叠”两种或多种感兴趣的核酸序列可以通过，例如，使用两个或多个事件的常规植物育种，用含有感兴趣序列的构建体转化植物，再转化转基因植物，或通过同源重组介导的靶向整合添加新的性状来实现。

[0067] 这样的感兴趣的核苷酸序列包括，但不仅限于，下面提供的这些实例：

[0068] 1.赋予对害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)

[0069] (A)植物疾病抗性基因。植物防御常被植物中的疾病抗性基因(R)的产物与病原体中的相应无毒(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用所激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而构建抗特定的病原体菌株的植物。这样的基因的实例包括提供抗叶霉病菌抗性的番茄Cf-9基因(Jones等.,1994Science 266:789)，番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶，提供抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的抗性(Martin等.,1993Science 262:1432)，和提供抗丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos等.,1994Cell 78:1089)。

[0070] (B)苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或仿照其的合成多肽，例如Btδ-内毒素基因的核苷酸序列(Geiser等.,1986Gene 48:109)，和营养期杀虫(VIP)基因(见例如Estruch等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登记号为40098,67136,31995和31998。

[0071] (C)凝集素，例如多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme等.,1994Plant Molec.Biol.24:825)。

[0072] (D)维生素结合蛋白，例如可以用作针对昆虫害虫的杀幼虫剂的抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物。

[0073] (E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这样的基因的实例包括稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Abe等.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huub等.,1993Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani等.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。

[0074] (F)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮激素和保幼激素或其变异体，基于其的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶、保幼激素灭活剂(Hammock等.,1990Nature 344:458)。

[0075] (G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会破坏受影响的害虫的生理(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在点刻甲蠊(Diploptera punctata)中鉴定的allostatin(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹性神经毒素(美国专利No.5,266,361)。

[0076] (H)在自然界中由蛇、黄蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性(insectotoxic)肽(Pang,1992Gene 116:165)。

[0077] (I)负责高积累单萜、倍半萜烯、类固醇、羟肟酸、苯丙酸衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白分子的酶。

[0078] (J)参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的。这些基因的实例包括马蹄莲基因(PCT公开的申请WO93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC获得，登记号为3999637和67152)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer等.,1993Insect Molec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck等.,1993Plant Molec.Biol.21:673)。

[0079] (K)刺激信号转导的分子。这样的分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella等.,1994Plant Molec.Biol.24:757)和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess等.,1994Plant Physiol.104:1467)。

[0080] (L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见美国专利No.5,659,026和5,607,914；后者教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽。

[0081] (M)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如杀菌肽-β溶胞肽类似物(Jaynes等.,1993Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas Solanacearum)有抗性。

[0082] (N)病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化植物细胞中的积累赋予对该外壳蛋白基因的来源病毒及相关病毒所致的病毒感染和/或发病的抗性。已经对转化植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。参见例如Beachy等.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。

[0083] (O)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。例如，Taylor等，摘要#497，Seventh Int’l.Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions显示，在转基因烟草中通过产生单链抗体片段导致酶失活。

[0084] (P)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等.(1993)Nature 266:469，其显示，表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。

[0085] (Q)在自然界中由病原体或寄生物产生的发育阻滞蛋白(developmental-arrestive protein)。例如，真菌内α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定殖和植物营养物释放(Lamb等.,1992)Bio/Technology 10:1436)。Toubart等(1992Plant J.2:367)描述了编码豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。

[0086] (R)在自然界由植物产生的发育阻滞蛋白。例如可提供对真菌疾病的高抗性的大麦核糖体失活基因(Longemann等.,1992.Bio/Technology 10:3305)。

[0087] (S)RNA干扰，其中使用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默化响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，然后这些小的干扰RNA整合成靶向复合体，靶向复合体破坏同源的mRNA。参见例如Fire等,美国专利6,506,559；Graham等.6,573,099。

[0088] 2.赋予针对除草剂的抗性的基因

[0089] (A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂例如咪唑啉酮(imidazalinone)、磺酰苯胺或磺酰脲除草剂的抗性或耐受性的基因。在这个分类码中的示例性基因编码突变体乙酰乳酸合酶(ALS)(Lee等，1988EMBO J.7:1241)，也被称为乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(Miki等，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。

[0090] (B)编码针对草甘膦的抗性或耐受性的一种或多种另外的基因，所述抗性或耐受性由突变体EPSP合酶和aroA基因，或者通过基因例如GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)以及其他膦酰化合物如草丁膦(pat和bar基因；DSM-2)以及芳氧苯氧丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)的代谢失活而赋予。参见，例如，美国专利号4,940,835，其披露了赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以ATCC登录号39256获得，且所述突变体基因的核苷酸序列披露于美国专利号4,769,061。欧洲专利申请号0 333 033和美国专利号4,975,374披露了赋予针对除草剂例如L-草胺膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列提供于欧洲专利申请号0 242 246中。De Greef等在(1989)Bio/Technology 7:61描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类和环己二酮类例如烯禾啶(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子为Accl-S1、Accl-S2和Accl-S3基因，描述于Marshall等的(1992)Theor.Appl.Genet.83:435。

[0091] (C)编码针对抑制光合作用的除草剂如三嗪(psbA基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibilla等在(1991)Plant Cell3:169描述了编码转化衣藻属(Chlamydomonas)的突变体psbA基因的质粒的用途。腈水解酶基因的核苷酸序列描述于美国专利号4,810,648，且含有这些基因的DNA分子可以ATCC登录号53435、67441和67442而获得。编码谷胱甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等在(1992)Biochem.J.285:173中描述。

[0092] (D)编码针对结合于羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性或耐受性的基因，所述酶催化其中将对羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸(homogentisate)的反应。这包括除草剂例如异噁唑类(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利号5,424,276)，尤其是异噁唑草酮(为针对玉米的选择性除草剂)、二酮腈类(EP496630、EP496631)，尤其是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮、三酮类(EP625505、EP625508、美国专利号5,506,195)，尤其是磺草酮、以及吡唑啉酯类(pyrazolinates)。在植物中产生过多HPPD的基因可以提供针对这种除草剂的耐受性或抗性，所述基因包括，例如，在美国专利号6,268,549和6,245,968以及美国专利申请公开号20030066102中描述的基因。

[0093] (E)编码针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且也可以赋予针对芳氧苯氧丙酸酯(AOPP)除草剂的抗性和耐受性的基因。这样的基因的例子包括酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(aad-1)基因，其被描述于美国专利号7,838,733中。

[0094] (F)编码针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且也可以赋予针对吡啶氧基生长素除草剂例如氟草烟或绿草定的抗性和耐受性的基因。这样的基因的例子包括酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因(aad-12)，其被描述于WO2007/053482 A2中。

[0095] (G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(参见，例如美国专利公开号20030135879)。

[0096] (H)提供针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(参见美国专利号5,767,373)。

[0097] (I)提供针对三嗪类除草剂(例如阿特拉津)和尿素衍生物(例如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因，所述除草剂与光系统Ⅱ反应中心的核心蛋白(PS II)结合(参见Brussian等，(1989)EMBO J.1989，8(4):1237-1245。

[0098] 3.赋予或贡献增值性状的基因

[0099] (A)修饰的脂肪酸代谢，例如，通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉蜀黍或芸苔属而增加所述植物的硬脂酸含量(Knultzon等，1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。

[0100] (B)减少的植酸含量

[0101] (1)导入植酸酶编码基因，例如黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因(Van Hartingsveldt等，1993Gene 127:87)，增强了植酸盐的分解，从而向转化的植物添加了更多游离磷酸盐。

[0102] (2)可导入降低植酸含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆进而再导入与负责玉米突变体(其特征为低植酸水平)的单个等位基因相关联的DNA来完成(Raboy等，1990Maydica 35:383)。

[0103] (C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这样的酶的例子包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza等，1988)J.Bacteriol.170:810、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz等，1985Mol.Gen.Genel.200:220)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(Pen等，1992Bio/Technology 10:292)、番茄转化酶基因(Elliot等，1993)、大麦淀粉酶基因(Sogaard等，1993J.Biol.Chem.268:22480)、以及玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher等，1993Plant Physiol.102:10450)。

[0104] 感兴趣的序列也可以是通过同源重组导入植物基因组的预定区域中的核苷酸序列。已经在本领域中描述了经由同源重组将多核苷酸序列稳定整合在植物细胞的特异性染色体位点中的方法。例如，描述于美国专利申请公开号2009/0111188 A1中的位点特异性整合涉及使用重组酶或整合酶来介导供体多核苷酸序列到染色体靶中的导入。另外，国际专利申请号WO2008/021207描述了锌指介导的同源重组，以将一种或多种供体多核苷酸序列稳定地整合在基因组的特定位置中。可以利用重组酶例如如在美国专利号6,720,475中描述的FLP/FRT、或如在美国专利号5,658,772中描述的CRE/LOX的用途而将多核苷酸序列稳定地整合到特异性染色体位点中。最后，大范围核酸酶(meganuclease)将供体多核苷酸靶向到特异性染色体位置中的用途描述于Puchta等的PNAS USA 93(1996)pp.5055-5060)中。

[0105] 用于在植物细胞内的位点特异性整合的其他不同的方法是普遍已知和适用的(Kumar等，Trends in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，已经在几种原核生物和低等真核生物中鉴定的位点特异性重组系统可适用于在植物中使用。这样的系统的例子包括但不限于：来自酵母鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)、以及噬菌体μ的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

[0106] 尽管本文描述了某些示例性土壤杆菌菌株，但是所讨论新型转化方法的功能性可以按照相同的标准推广到其它土壤杆菌菌株。可用于本文所述新型转化方法的其它菌株的实例包括，但不限于，根癌土壤杆菌菌株C58，根癌土壤杆菌菌株Chry5，发根土壤杆菌菌株，根癌土壤杆菌菌株EHA101，根癌土壤杆菌菌株EHA105，根癌土壤杆菌菌株MOG101，以及根癌土壤杆菌菌株T37。这样的菌株的修改版本在国际专利申请No.WO 2012/106222 A2中有更具体的描述。

[0107] 在实施方案中，将成熟的大豆种子在感染前灭菌。种子可使用氯气、氯化汞、在次氯酸钠中浸泡，在碳酸钠中浸泡，或其它本领域已知的合适方法进行灭菌。在实施方案中，种子用无菌水或其它合适的低渗溶液吸涨。种子吸涨6-24小时可软化种子，饱和子叶，并提高随后的芽诱导。也可以使用更长时间的吸涨，例如最长达48小时。

[0108] 如下制备分割的大豆种子：沿着种脐分割种子的子叶以分开子叶，然后除去种皮。在转化前，除去胚轴的一部分，留下一部分胚轴附着于子叶。通常，留下与子叶的节端连接的1/3-1/2的胚轴。

[0109] 在本公开的方法中不需要对分割的大豆种子致伤，但是有报道在使用其它方法，包括子叶节法和分生组织外植体法时，对分割的大豆种子致伤可以提高转化效率。可以通过切割、研磨、穿孔、超声处理、等离子体造伤或真空渗透来帮助对植物材料致伤。通常用含有合适基因构建体的土壤杆菌培养物接种包含部分胚轴的分割的大豆种子大约0.5至3.0小时，更典型地为大约0.5小时，随后是在合适的培养基上进行长达大约5天的共培养期。通过培养被转化的含有一部分胚轴的分割的大豆种子，产生出推定含有转基因拷贝的外植体。对这些外植体进行鉴定和分离，用于进一步的组织繁殖。

[0110] 芽诱导可以通过将外植体在合适的诱导培养基中培养大约两周时间，随后在含有合适选择剂如草铵膦的培养基中再培养2周而促成。优选地在没有选择剂的培养基和有选择剂的培养基之间轮换，但是其它在培养基中总是含有选择剂的方案也可以成功地采用。经过一段时间的芽诱导之后，可以切下含有一部分胚轴的组织分离物，将其转移到合适的芽伸长培养基中。在实施方案中，子叶可以被移除，并通过切割子叶的基部切除含有胚轴的平齐的芽垫(shoot pad)。见实施例2。

[0111] 通常，在转化后向切割种子的外植体施加一种或多种选择剂。选择剂杀死或阻滞非转化大豆细胞的生长，并可有助于清除残余的土壤杆菌细胞。合适的试剂包括草铵膦或双丙氨膦。其它合适的试剂包括，但不仅限于，除草剂草甘膦或除草剂2,4-D，它可同时作为选择剂和芽诱导激素。此外，选择剂可以包括多种抗生素，包括壮观霉素、卡那霉素、新霉素、巴龙霉素、庆大霉素、和G418，这取决于所使用的可选择标志物。根据所使用的试剂不同，选择1-7天可能是适当的。

[0112] 可使用合适的试剂激励已伸长的芽生根，这样的试剂包括但不限于各种浓度的生长素和细胞分裂素。例如，就生长素——吲哚3-丁酸(IBA)而言，可以在将植物材料转移到本领域技术人员已知的合适生根培养基之前，将其加到细胞组织培养基中。在暴露于IBA之后，根形成经历大约1-4周，更典型地1-2周。

[0113] 生长芽的培养可以用本领域公知的方法实现，以产生成熟的转基因大豆植物。见例如实施例2。

[0114] 成功的转基因事件的存在可以用本领域已知的技术加以确认，所述技术包括但不仅限于，在用土壤杆菌感染并共培养之后的任何阶段，对大豆中的整合的可选择标志物和TM报告基因构建体进行TAQMAN 、PCR分析、和Southern分析；对显示报告子构建体证据的植物或植物种质进行表型测定；或在合适的选择培养基上选择外植体。

[0115] 在实施方案中，本文公开的方法用于帮助育种程序，以开发表达感兴趣基因的近交大豆系和开发优良的大豆栽培种。包含稳定整合的转基因的近交大豆系可以和其它近交大豆系杂交，以产生表达感兴趣基因的杂交植物。将期望性状基因渗入到优良大豆系和杂交体中可以用本公开的方法和本领域已知的方法迅速地实现。

[0116] 提供本文所讨论的参考文献，包括出版物、专利和专利公开，仅仅是由于它们在本申请的申请日期之前被公开。本文的任何内容均不应被理解为承认本发明人没有资格基于发明在先而使这些公开内容被视为晚于本申请。

[0117] 提供了如下的实施例以举例说明本公开的某些特殊的特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限制于本文所举例的这些特定的特征或方面。实施例

[0118] 实施例1：载体构建

[0119] 使用本领域公认的方法构建了单个双元载体，标记为pDAB9381(图1)。pDAB9381含有两个植物转录单元(PTU)。第一个PTU(SEQ ID NO:1)的组成为：拟南芥泛素-10启动子(AtUbi10启动子；Callis等.,1990)，其驱动黄色荧光蛋白编码序列(PhiYFP；Shagin等.,2004)，该序列含有从马铃薯(Solanum tuberosum)分离的内含子、光特异性组织可诱导LS-1基因(ST-LS1内含子；Genbank登录号No.X04753)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-23 3′非翻译区(AtuORF23 3′UTR；Gelvin等.,1987)终止。第二个PTU(SEQ ID NO:2)被克隆在异戊烯基转移酶编码序列(ipt CDS；Genbank登录号No.X00639.1)内，其组成为：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子；Verdaguer等.,1996)，用于驱动膦丝菌素乙酰转移酶编码序列(PAT；Wohlleben等.,1988)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-13′非翻译区(AtuORF1 3′UTR；Huang等.,1990)终止。所得的双元载体含有可视报告基因和抗生素可选择标志物基因，并随后用于大豆的转化。

[0120] 使用电穿孔将双元载体pDAB9381移动到根癌土壤杆菌菌株EHA101和EHA105(Hood等.,1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。
分离单个克隆，并通过限制酶消化确认pDAB9381双元载体的存在。

[0121] 实施例2：使用含有一部分胚轴的分割种子进行土壤杆菌介导的大豆转化[0122] 种子准备 开发了一种新的土壤杆菌介导的大豆转化方案。成熟的大豆(Glycine max)Maverick栽培种种子用氯气过夜灭菌16个小时。用氯气灭菌之后，将种子置于开放TM容器中，放置在LAMINAR 层流罩内，以驱散氯气。接着，使用黑盒在24℃黑暗中用无菌H2O使灭菌后的种子吸涨16小时。

[0123] 分割的大豆种子的准备 包含部分胚轴的分割的大豆种子的规程要求准备这样的大豆种子材料：使用固定在手术刀上的#10刀片沿着种子的种脐纵向切割大豆种子材料，以分离和除去种皮，并将种子分割成两个子叶部分。仔细地部分除去胚轴，其中大约1/2–1/3的胚轴保留附着于子叶的节端(nodal end)。先前所述的转化方法在将成熟的种子分割成两个子叶部分时，导致胚轴的接近完全去除。

[0124] 接种 然后将含有胚轴的部分的分割的大豆种子浸没在含有pDAB9381双元质粒的根癌土壤杆菌菌株EHA 101或EHA 105的溶液中30分钟。在浸没包含胚轴的子叶之前，将根癌土壤杆菌溶液稀释到终浓度为λ＝0.6OD650。

[0125] 共培养 接种后，在用滤纸片覆盖的培养皿中让分割的大豆种子与根癌土壤杆菌菌株在共培养培养基(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.2.1.New Jersey,Humana Press,2006.Print.)上共培养5天。

[0126] 芽诱导 共培养5天后，将分割的大豆种子在液体芽诱导(SI)培养基中清洗，该培养基的组成为：B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁(Ferrous)、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、TM0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTIN 、200mg/L头孢噻肟和50mg/L万古霉素(pH
5.7)。然后，在芽诱导I(SI I)培养基上培养分割的大豆种子，该培养基的组成为：B5盐、B5维生素、7g/L Noble琼脂、28mg/L亚铁(Ferrous)、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L TM
MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTIN 、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素(pH 5.7)，使子叶的平侧(flat side)朝上，子叶的节端浸没在培养基中。培养2周后，将自经转化的分割大豆种子产生的外植体转移到芽诱导II(SI II)培养基中，该培养基含有SI I培养基并补充6mg/L草铵膦( )。

[0127] 芽伸长 在SI II培养基上培养2周后，从外植体除去子叶，并通过在子叶的基部进行切割，切出含有子叶的平齐芽垫。将来自子叶的分离芽垫转移到芽伸长(SE)培养基上。SE培养基的组成为：MS盐、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核糖苷、TM
50mg/L TIMENTIN 、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草铵膦、7g/L Noble琼脂TM
(pH 5.7)。每2周将培养物转移到新鲜SE培养基上。让培养物在24℃的CONVIRON 生长
2
室内，18h光照、光强为80-90μmol/msec的条件下生长。

[0128] 生根 对于从子叶芽垫发出的伸长芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长芽，并将伸长芽浸入1mg/L IBA(吲哚3-丁酸)中1-3分钟来促进生根。接着，将伸长芽转移到植物生长托盘(Phytatray)内的生根培养基中(MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L Noble琼脂，pH
5.6)。

[0129] 培养 在24℃、18h光周期的CONVIRONTM生长室中培养1-2周后，将已发根的芽转TM移到有盖的圣代杯(sundae cup)中的土壤预混物中，并放置在CONVIRON 生长室中(型号CMP4030和CMP3244,Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)的
2
长白昼条件下(16小时光照/8小时黑暗)，光强为120-150μmol/msec，恒温(22℃)恒湿(40-50％)，以便使小植株适应环境。生了根的小植株在中适应环境数周，之后转移到温室中进行进一步的环境适应并建立强壮的转基因大豆植物。

[0130] 实施例3：包含部分胚轴的分割的大豆种子通过土壤杆菌介导的转化的转基因事件的确认

[0131] 使用实施例2所述的新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法，产生了含有包含YFP和PAT PTU的T-链插入物的转基因大豆事件。

[0132] 使用该新型方法总共完成了6个独立的转化实验，其中EHA101和EHA105菌株各3个实验。对于在温室中生长的T0推定大豆转基因事件，进一步分别通过PAT和YFP PTU的TMTAQMAN 和PCR分析加以确认。表1和表2提供了平均转化频率的结果。总体上，新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割的大豆种子的转化方法导致前所未有的13.3％(范围:4.6％-20.5％)和20.3％(范围:14.0-26.5％)的转化效率。这些转化效率结果大大高于在本领域中描述的使用子叶节转化法(Zeng等.(2004),Plant Cell Rep22:478-482)和半种子转化法(Paz等.(2006),Plant Cell Rep 25:206-213)的大豆转化方法所报告的大豆转化效率。

[0133] 新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法导致转化效率增加到Zeng等.(2004)的大豆子叶节转化方法的转化效率的～3.7倍。先前文献报告指出，Zeng等.(2004)的大豆子叶节转化方法实现的转化效率高达5.9％。然而，新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法结果仍然出人意料地比先前文献中报道的大豆子叶节转化方法的转化效率更高效。

[0134] 类似地，新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法导致转化效率是Paz等(2006)的半种子转化方法的转化效率的～14倍。先前文献报告指出，Paz等(2006)的半种子转化方法导致3.8％的整体转化效率。然而，新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法结果仍然出人意料地比先前文献中报道的大豆半种子转化方法的转化效率更高效。

[0135] 表1:从包含部分胚轴的分割的大豆种子产生的转基因事件的第一次实验。平均转化频率是所有使用EHA101和EHA105土壤杆菌菌株完成的转化实验的结果

[0136]

[0137] 表2：从包含部分胚轴的分割的大豆种子产生的转基因事件的第二次实验。

[0138]

[0139] 实施例4：确定通过土壤杆菌介导转化具有部分胚轴的分割大豆种子产生的转基因事件的可遗传性(Heritability)

[0140] 将确认含有YPF和PAT转基因拷贝的T0大豆植物进行自体授精，对从总共247个转基因事件获得的T1种子进一步筛选可遗传性。将转基因T1大豆种子种植并培育在温室中。在发育的V1-V2期(在种植1-2个三叶苗之后大约10-14天)，用1.0％v/v草铵膦( (410g ae/haL；Bayer Crop Sciences LLC)溶液喷洒植物。此外，对T1大TM
豆植物使用TAQMAN 和PCR分析同时对PAT和YFP植物转录单元进行分子分析。根据草铵膦除草剂耐受性、pat和yfp转基因的存在确定，T1代有总共116个事件(47％)被确认是转基因(表3)。其余大豆事件没有将pat和yfp转基因从T0传递到T1代。这些T1大豆植物未能继承转基因是由于产生了包含被转化到非胚系大豆组织内的pat和yfp转基因的T0大豆事件。转基因整合到非胚系大豆组织中是一个常见的技术问题，在本领域已知的其它大豆转化方法中也普遍有描述，不是土壤杆菌介导转化含有部分胚轴的分割大豆种子的转化方法所独有的。

[0141] 表3：用包含部分胚轴的分割大豆种子产生的转基因大豆事件的可遗传性[0142]

[0143] 实施例5：使用含有部分胚轴的分割大豆种子进行土壤杆菌介导的大豆转化并使用草甘膦作为选择剂

[0144] 将上述大豆转化方案用于表达草甘膦耐受性状的转基因的转化和选择。DGT-28基因(国际专利公开No.WO2013116700)被纳入基因表达盒作为可选择标志物和除草剂耐受性状，并用于转化包含部分胚轴的分割大豆种子外植体。

[0145] 最开始，完成剂量响应研究。为了测试草甘膦对外植体的影响，从发芽起始阶段起，向所用的培养基添加草甘膦。测试的草甘膦范围是0.025-0.2mM。在组织培养基中加入这一浓度范围的草甘膦在大豆(Clemente等.,2000；Hinchee等.,1996；Martinell等.,2006；Martinell等.,1999；Martinell等.,2002)、烟草(Singer等.,1985)、棉花(Zhao等.,2006)和小麦(Hu等.,2003)中已有报道。对未经转化的大豆外植体的培养测试了5个浓度的草甘膦。加入SI-2培养基中的浓度是0.025mM,0.05mM,0.075mM,0.1mM和0.2mM。未转化的大豆外植体从SI-2培养基到组织培养方案完成的所有连续亚培养阶段中保持相同比率的草甘膦选择。在每个亚培养阶段计数健康外植体的数目。丢弃死亡的外植体，并将健康的外植体进一步亚培养到合适的培养基上。

[0146] 在含有各种浓度草甘膦的SI-2培养基上培养结束时(例如，大约2周时间)，外植体显示子叶黄化。黄化程度与施加到培养基中的草甘膦的剂量成正比。在含有草甘膦的培养基上外植体的生长也被阻滞。接着，除去子叶，并将外植体从SI-2培养基亚培养到SE培养基上。在SE培养基上进行另外2周的选择结束时，可以观察到当外植体暴露于不同水平草甘膦时，外植体的生长有显著差异。外植体生长的阻滞与草甘膦剂量的增加成比例。类似地，死亡外植体的数目也与草甘膦剂量的增加成比例。死亡外植体的数目随着草甘膦剂量的增加而增加。在本研究使用的最高剂量下(0.2mM)，在SE-1结束时仅有一个外植体存活。相比之下，在不含有草甘膦的对照培养基上几乎所有的外植体保持存活。尽管有一些外植体到SE-1结束为止能够在草甘膦的所有测试水平下存活，但是全部外植体在SE-2结束时，即选择6周之后，均已死亡(表4)。这些结果表明，即使在组织培养基中测试的最低剂量的草甘膦下(例如0.025mM)，也没有大豆外植体能够在6周的草甘膦选择后存活。随后，在土壤杆菌介导的转化的含有部分胚轴的分割的大豆种子外植体的选择方案中加入3个不同浓度的草甘膦(例如,0.025mM,0.05mM和0.1mM)。

[0147] 表4：剂量响应研究结果。表中提供了在含有一定范围草甘膦的不同类型培养基上经过了亚培养的每个阶段的外植体的数目

[0148]

[0149] 使用本领域公知的程序构建了单个双元载体，标记为pDAB107553(图2)。pDAB107553含有两个植物转录单元(PTU)。第一个PTU(SEQ ID NO:3)的组成为：拟南芥泛素-10启动子(AtUbi10启动子；Callis等.,1990)，其驱动dgt-28编码序列(DGT-28；
Shagin国际专利公开No.WO2013116700)，该序列含有叶绿体转运肽TraP23(Trap23；
国际专利公开No.WO2013116764)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-23 3′非翻译区(AtuORF233′UTR；Gelvin等.,1987)终止。第二个PTU(SEQ ID NO:4)的组成为：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子；Verdaguer等.,1996)，其用于驱动膦丝菌素乙酰转移酶编码序列(PAT；Wohlleben等.,1988)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-13′非翻译区(AtuORF1 3′UTR；Huang等.,1990)终止。所得的双元载体含有除草剂抗性可选择标志物/抗性基因和抗生素可选择标志物基因，随后用于大豆的转化。

[0150] 使用电穿孔将双元载体pDAB107553转移到根癌土壤杆菌菌株EHA105(Hood等.,1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。分离单个克隆，并通过限制酶消化确认pDAB107553双元载体的存在。

[0151] 使用实施例2所述的新型土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法，用携带pDAB107553的土壤杆菌菌株转化了成熟的大豆(Glycine max)Maverick栽培种种子。在包含部分胚轴的分割的大豆种子转化方法的选择方案中加入了三个不同浓度的草甘膦(例如,0.025mM,0.05mM和0.1mM)。

[0152] 随着转化实验进行到各个亚培养阶段，大豆外植体的健康恶化。在最高水平的草甘膦(例如0.1mM)下观察到最大的不良生理效应，随着草甘膦浓度降低，不良生理效应减小。在第一轮选择(即在SI-2培养基上2周)之后，在草甘膦选择下培养的大豆外植体可见子叶黄化。在越高比率的草甘膦下，大豆外植体的子叶黄化强度越突出(图3)。

[0153] 当大豆外植体被保持在含草甘膦的培养基上时，观察到外植体在与培养基直接接触的植物组织表面上显示软化。外植体的表面变软，稠度变得类似稀奶油(creamy)。软化效果从SE-1阶段起往后变得非常显著。相应地，将外植体转移到不含草甘膦选择剂的培养基上。重复1和重复2的外植体中有一半在SE-1阶段结束时被转移到不含有任何草甘膦选择剂的培养基上。随后，在SE-2结束时，将所有外植体转移到不含任何草甘膦选择剂的培养基上(表5)。因为重复1和重复2中的软化非常明显，所以在SI-2阶段结束时，重复3的外植体中有一半被转移到不含任何草甘膦选择剂的培养基上。到SE-1阶段结束时为止，重复3外植体全部被转移到不含任何草甘膦选择剂的培养基上。

[0154] 表5：显示了经过每个亚培养阶段的外植体的数目。提供了处于选择下的每个培养阶段的外植体的数目，而下划线的数字显示了被转移到无选择的培养基上的外植体的数目

[0155]

[0156] 对于所有三个重复，当外植体被转移到不含草甘膦的培养基上时，外植体的软化效果并没有结束，并且外植体软化在随后的全部亚培养阶段均持续。这些结果表明，一旦外植体被暴露于草甘膦，该暴露便会触发组织软化，并且软化会持续，即使是随后将外植体转移到无草甘膦的培养基上也是如此。

[0157] 从外植体分离所有存活的芽的样品，并送交分子分析以确认它们是否是转基因的。在确认芽中存在或不存在转基因之后，将转基因大豆事件转移到生根培养基，并随后送至温室适应环境并在土壤中进一步培育。

[0158] 如表6所示，组织培养基中草甘膦的每种处理均导致转基因芽的产生。尽管对暴露于草甘膦的外植体有软化效果，但是在草甘膦的全部测试浓度下均产生了转基因芽。而且，将芽转移到生根培养基，许多芽成功地生了根。总体上，含有部分胚轴的分割大豆种子的转化的转化效率为5.3％-3.9％。然而，转基因植物有一些损失，这些植物不会产生根。此外，当转基因植物未能在温室中存活时，转化效率会降低。因此，对于能够在温室中存活并能够产生种子的生根转基因植物而言，转化效率为0.63％(例如，产生8株转基因植物)。从这些实验可知，使用包含部分胚轴的分割大豆种子并加入草甘膦作为选择剂的转化方法产生了转基因大豆植物。

[0159] 表6：显示了在这些实验中基于早期分析(生根之前)和就成功生根的转基因芽的数目而言评估的每个处理的转化频率

[0160]

[0161]

[0162] 实施例6：使用含有部分胚轴的分割大豆种子进行土壤杆菌介导的大豆转化并使用潮霉素作为选择剂

[0163] 利用上述的大豆转化方案转化并选择赋予潮霉素抗性的转基因。hpt基因(Gritz,L.和Davies,J.(1983)Gene 25(2-3)；179-188)合并到基因表达盒中作为可选择标志物，并用于转化包含部分胚轴的分割的大豆种子。

[0164] 首先完成剂量响应研究。为了测试潮霉素对外植体的影响，从发芽起始阶段起，向所用的培养基添加潮霉素。潮霉素对大豆Jack栽培种和大豆Maverick栽培种植物的测试范围是5mg/L-25mg/L。从两家不同供应商Sigma Aldrich(St.Louis,MO)和Phytotech(Shawnee Mission,KS)获得了5个浓度的潮霉素，并用于测试培养未经转化的大豆外植体。加入SI-2培养基中的浓度是5mg/L,10mg/L,15mg/L,20mg/L和25mg/L。未转化的大豆外植体在从SI-2培养基到组织培养方案完成的所有连续亚培养阶段中保持在相同比率的潮霉素选择。在每个培养阶段计数健康外植体的数目。丢弃死亡的外植体，并将健康的外植体进一步亚培养到合适的培养基上。

[0165] 在含有潮霉素的培养基上培养结束时，观察到当外植体暴露于不同水平的潮霉素时，外植体的生长有显著差异(表7)。外植体生长阻滞与潮霉素的剂量增加成比例。类似地，死亡外植体的数目也与潮霉素剂量的增加成比例。死亡外植体的数目随着潮霉素剂量的增加而增加。在本研究中使用的最高剂量下(10mg/L-25mg/L)，只有少量外植体存活。类似地，大量外植体能够在含有5mg/L潮霉素的培养基上存活。相比之下，在不含有草甘膦的对照培养基上，几乎全部的外植体均保持存活。尽管在SE-1结束时大量外植体能够在潮霉素的所有测试水平下存活，但是对于在含有浓度为10mg/L-25mg/L的潮霉素的培养基上培养的外植体，在SE-2阶段结束时，大部分外植体死亡。这些结果表明，测试的5mg/L的潮霉素剂量可被接受用于组织培养基。

[0166] 表7：剂量响应研究结果。表中提供了在含有一定范围潮霉素的不同类型培养基上经过了亚培养的每个阶段的外植体的数目

[0167]

[0168]

[0169] 使用本领域公知的程序构建了单个双元载体，标记为pDAB105958(图4)。pDAB105958含有两个植物转录单元(PTU)。第一个PTU(SEQ ID NO:5)的组成为：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子；Verdaguer等.,1996)，其驱动hpt编码序列(HPT；Gritz和Davies,1983)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-23 3′非翻译区(AtuORF23 3′UTR；
Gelvin等.,1987)终止。第二个PTU(SEQ ID NO:6)的组成为：拟南芥泛素10-启动子(AtUbi10启动子；Callis等.,1990)，其驱动膦丝菌素乙酰转移酶编码序列(PAT；
Wohlleben等.,1988)，并以根癌土壤杆菌开放阅读框-1 3′非翻译区(AtuORF1 3′UTR；
Huang等.,1990)终止。所得的双元载体含有除草剂抗性可选择标志物/抗性基因和抗生素可选择标志物基因，随后用于大豆的转化。

[0170] 使用电穿孔将双元载体pDAB105958转移到根癌土壤杆菌菌株EHA105(Hood等.,1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。分离单个克隆，并通过限制酶消化确认pDAB105958双元载体的存在。

[0171] 使用实施例2中所述的新的土壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法，用携带pDAB105958的土壤杆菌菌株转化成熟的大豆(Glycine max)品种Maverick种子。在包含部分胚轴的分割大豆种子转化方法的选择方案中加入了三个不同浓度的潮霉素(例如,8mg/L,5mg/L,和3mg/L)。

[0172] 在将大豆外植体保持在含有潮霉素的培养基上时，观察到外植体在与培养基直接接触的植物组织表面上显示软化。因此，在SE-3培养阶段，将外植体转移到不含潮霉素选择剂的培养基上(表8)。

[0173] 表8：显示了潮霉素的浓度和在每个选择阶段结束时存活的外植体数目[0174]

[0175]

[0176] 从外植体分离所有存活的芽的样品，并送交分子分析以确认它们是否是转基因的。在确认芽中存在或不存在转基因之后，将转基因大豆事件转移到生根培养基，并随后送至温室适应环境并在土壤中进一步培育。如表9所示，组织培养基中一半的潮霉素处理导致了转基因芽的产生。尽管对暴露于潮霉素的外植体有软化效果，但是在含有潮霉素选择剂的培养基上产生了转基因芽。从这些实验可知，使用包含部分胚轴的分割大豆种子并加入潮霉素作为选择剂的转化方法产生了转基因大豆植物。

[0177] 表9：显示了在这些实验中根据早期分析(生根之前)和成功产生转基因芽的数目评估的每个处理的转化频率

[0178]

[0179]

[0180] 尽管已经对本发明进行了详细描述，但是应当理解，这些细节完全是用于举例说明的目的，在不背离由以下权利要求限定的本发明精神和范围的前提下，本领域的技术人员能够做出各种修改。