ToTV抗性植物 |
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| 申请号 | CN200780027876.3 | 申请日 | 2007-06-01 | 公开(公告)号 | CN101494969B | 公开(公告)日 | 2013-03-20 |
| 申请人 | 孟山都投资股份有限公司; | 发明人 | 保卢斯·科内利斯·马里斯; 阿妮塔·阿夫克·德哈恩; 约翰内斯·亨德里克斯·玛丽亚·巴藤; 约翰内斯·弗朗西斯库斯·约翰娜·玛丽亚·范登霍伊维尔; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种番茄 植物 ，其基因组内部具有赋予番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因的至少一个等位基因，所述病毒已经于2004年11月24日保藏在德国 微 生物 和细胞培养中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHunder)，其保藏号为ToTV-E01(DSM 16999)。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于选择抗番茄灼烧病毒(ToTV)的番茄植物的方法，所述病毒已经于2004年11月 |
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| 说明书全文 | ToTV抗性植物技术领域[0001] 本发明涉及病毒抗性植物(或抗病毒的植物)以及生产这些植物的方法。具体地，该方法涉及抗番茄灼烧病毒(ToTV)的植物、生产这些植物的方法以及由此获得的植物和植物部分。 背景技术[0002] 番茄(Solanum lycopersicum，以前为Lycopersicon esculentum)易感大量病毒种属，其中一些最常见的番茄病毒包括番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV；番茄斑萎病毒属)、凤果花叶病毒(Pepino mosaic virus，PepMV；马铃薯x病毒属)和番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV；菜豆金黄花叶病毒属)。这些疾病对植物造成的损害从叶子变色、坏死斑至严重的产量损失和植物死亡不等。 [0003] 对于以商业育种工作者来说，能够提供抗性植物(resistantplant)是最重要的，而对于某些经济上损害性最严重的病毒，已经生产了抗性植物品种。然而，有时可能一直会有对农作物带来相当损害的新病毒出现。 [0004] 在1996年，报道了一种新的番茄病毒，其从1993年开始感染美国和意大利的番茄植物，被命名为番茄褪绿传染性病毒(Tomatoinfectious chlorosis virus，TICV；毛形病毒属；Duffus et al.、1996)。1998年报道了相同种属的另一种新型番茄病毒。已证实这种病毒从1989年开始感染美国的番茄植物，被命名为番茄褪绿病毒(Tomatochlorosis virus，ToCV；Wisler et al.、1998)。且已证实这两种新病毒均通过白蝇传播，而该昆虫是一种非常有效的疾病传播媒介。 [0005] 人们通常认为，已知病毒的地理分布将增加，且部分由于不同病毒整合形成新毒株或新病毒而导致新病毒不断出现。培育抗性品种在这些疾病的成功控制(治疗)中可以发挥重要作用。 [0006] 最近，在西班牙的番茄植物上发现了一种新病毒，其引起的症状(局部地称为疾病“灼烧”)并不能归于任何已知病毒。植物叶子出现坏死斑，果实上出现褐色环，且表现出生长减慢。血清学试验(ELISA)表明存在凤果花叶病毒(PepMV)。电子显微镜研究表明的确存在马铃薯X病毒(potexvirus)典型的杆状颗粒。然而，在受感染叶组织中也发现了球形病毒颗粒。研究者能够从与PepMV的复合物中分离该新病毒。该新病毒暂时命名为番茄灼烧病毒(Tomato torrado virus，ToTV)、于2004年11月24日保藏在德国微生物和细胞培养中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbHunder)，保藏号为ToTV-E01(DSM 16999)，且作为影响番茄的疾病如“灼烧”(西班牙)、“枯萎”或“巧克力”(墨西哥和危地马拉)的致病因子(病原体，causative agent)。人们认为该病毒还能够引起与在其他茄属的番茄中所引起症状类似的疾病症状，特别是在辣椒属(Capsicum spp.，Pepper)和茄子(Solanummelongena，aubergine)中。 [0007] 目前，还没有携带对该新病毒的特异抗性的植物，同时需要开发这种抗性植物。 发明内容[0008] 现在，本发明发明人已经发现抗ToTV的番茄植物。他们发现，该植物暴露于所述病毒后，不出现疾病症状，且不能在这些植物中检测到该病毒颗粒或病毒RNA。如下文所指出的，将该反应(应答)定义为抗性。这样的植物在开发抗该新病毒的商用培植番茄品种时极具价值，特别是当负责该抗性特征或与其相关的遗传元件或者在杂交过程中互换的遗传元件可以在育种过程中进行追踪和监测时。这种监测有助于改善育种效率，且可大大改善新开发的抗性品种上市的时间。通过杂交试验，发现负责对ToTV抗性的基因在抗性植物中以纯合型(同型结合地，homozygously)存在，而杂合植物则易感ToTV感染。因此，发现ToTV抗性由一种隐性基因(recessivegene)赋予。然而，包含两种形式等位基因的植物，即杂合植物对于植物育种工作者也同样有用，因为其可在杂交和自交中用作母本，以生成纯合型子代植物。 [0009] 因此，在第一个方面，本发明涉及一种番茄植物，其基因组内部具有可赋予对番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因的至少一个等位基因，所述病毒已经于2004年11月24日保藏在德国微生物和细胞培养中心，保藏号为ToTV-E01(DSM 16999)。迄今为止，人们尚不了解抗ToTV的番茄植物。 [0010] 经过后续的实验，本发明发明人发现这些抗ToTV植物中的抗性紧密连锁(连接，link to)于多种AFLP标记物。不希望受任何理论限制，且尽管这些标记物中大多数在基因组上的定位尚未确定，但认为负责该特性的基因位于4号染色体上。因此，在所述第一方面的一个优选实施方式中，包含赋予番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因的等位基因位于与AFLP标记物P 14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330和/或P13/M38-F-311/313，优选AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313连锁的基因组区域。 [0012] 在所述第一方面的另一个优选实施方式中，所述等位基因以纯合子形式(homozygous form)存在，从而得到表达该抗性表型的植物。 [0013] 在所述第一方面的另外一个优选实施方式中，所述番茄植物是一种番茄种属的植物，优选培植的番茄植物。 [0014] 在所述第一方面的另外一个优选实施方式中，所述抗性表示为将所述植物暴露于至少最低感染剂量的ToTV后对该病毒感染的抗性。本领域技术人员将理解，可通过对易感性植物进行常规实验而确定最低有效剂量。 [0015] 在所述第一方面的另外一个优选实施方式中，所述植物在涉及ToTV感染的抗性生物分析中加以鉴定，或者其中所述植物通过筛查是否存在至少一个连锁于所述ToTV抗性基因的所述等位基因的分子标记物而加以鉴定。 [0016] 在所述第一方面的另外一个优选实施方式中，所述植物通过一种涉及筛查是否存在至少一个连锁于所述ToTV抗性基因的所述等位基因的方法而生产。 [0017] 另一方面，本发明涉及源自本发明的植物的植物部分。植物部分的实例包括但不限于花粉、胚珠、叶子、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶子、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、幼枝、根茎、种子、原生质体、胼胝体等的单个细胞和组织。优选所述部分是果实或种子。植物部分的其他优选实施方式包括用于无性繁殖的部分，包括优选的部分如小孢子、花粉、胚珠、叶子、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎枝条、茎、枝条、幼枝、根茎、原生质体、胼胝体和拟分生组织等。 [0018] 另一方面，本发明涉及用于选择本文所定义的抗番茄灼烧病毒(ToTV)的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤： [0019] a)提供所述病毒的接种物； [0020] b)使番茄植物暴露于所述接种物； [0021] c)给予足够的孵育时间，以及 [0022] d)如果随着孵育时间的推移，所述植物中未形成感染，则选择所述番茄植物。 [0023] 另一方面，本发明涉及用于选择其基因组包含赋予如本文所定义番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因的至少一个等位基因的方法，所述方法包括一个步骤即筛查番茄植物基因组中与AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330和 /或P13/M38-F-311/313，优 选AFLP 标 记 物 P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313连锁的基因组区域的存在。 [0024] 另外一方面，本发明涉及用于生产番茄植物的方法，包括通过实施根据本发明的用于选择番茄植物的方法，而选择基因组内包含至少一个赋予如本文所定义的番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的等位基因(或基因的等位基因)的植物，并使所述选定植物与自身或另一种番茄植物杂交而产生种子，以及将所述种子培育成番茄植物。 [0025] 另一方面，本发明涉及用于生产如本文所定义的抗番茄灼烧病毒(ToTV)的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤： [0026] a)通过实施根据本发明的用于选择番茄植物的方法而选择基因组内包含赋予所述番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因的至少一个等位基因的植物； [0027] b)使所述选定植物与另一种番茄植物或自身杂交而产生种子； [0028] c)将所述种子培育成番茄植物以生成子代植物； [0029] d)可选地重复步骤b)和c)的杂交和培育步骤，以及 [0030] e)从子代植物中选择其中所述等位基因以纯合子形式存在的植物。 [0031] 在所述方法的优选实施方式中，步骤e)中的选择通过筛查所述子代植物的DNA中与AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330和/或P13/M38-F-311/313，优选AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313连锁的所述基因组区域的纯合子形式存在与否而实施。可替代地，步骤e)中的选择通过利用所述ToTV病毒的抗性生物分析或如本文所描述的任何其他恰当的方法而实施。 [0032] 在所述方法的另一种优选实施方式中，所述番茄植物是番茄种的一种植物，更优选一种培植的番茄植物。 [0033] 在其他方面，本发明涉及一种可通过本发明所述方法获得的番茄植物，以及涉及源自所述新发明的番茄植物的植物部分，优选果实或种子。在可替代的优选实施方式中，所述植物部分包括适于无性繁殖的植物部分。 [0034] 在其他方面，本发明涉及赋予ToTV抗性的等位基因的用途，该等位基因位于与番茄4号染色体上的AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330、P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900，优选AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900连锁的基因组区域中： [0035] -用于选择ToTV抗性番茄植物，或者 [0036] -用于通过增加所述品种中抗性等位基因的存在频率而在ToTV易感性番茄品种中赋予ToTV抗性。 [0037] 在其他方面，本发明涉及ToTV抗性植物用于增加所述植物产量和/或用于防止所述植物由于ToTV感染而导致产量损失的用途，其中所述ToTV抗性植物的特征在于，位于与番茄4号染色体上的AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330、P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900，优选AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900连锁的基因组区域中存在纯合型等位基因。 [0038] 在其他方面，本发明涉及本发明的ToTV抗性植物的种子的用途，用于生产ToTV抗性植物或用于防止植物中或植物种群中发生灼烧疾病(torrado disease)(或者相关疾病，例如枯萎或巧克力斑病)的用途。 [0039] 在其他方面，本发明涉及包含至少一个赋予ToTV抗性的等位基因或者赋予ToTV抗性等位基因是纯合型的植物的应用，其中作为ToTV抗性番茄植物或者在旨在提供具有由所述等位基因纯合型导致的ToTV抗性表型的其他植物的育种项目中用作亲本植株，所述等位基因位于与番茄4号染色体上的AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330、P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900，优选AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313，最优选AFLP标记物P11/M35-F-216和/或P13/M38-F-311/313和/或COSII/CAPS标记物C2_At5g25900连锁的基因组区域中。 [0040] 在其他方面，本发明涉及标记物P11/M35-F-216、P13/M38-F-311/313和/或C2_At5g25900用于检测植物中赋予ToTV抗性的等位基因是否存在的用途。这种用途通常涉及核酸检测方法，包括分离DNA、用标记物特异性引物扩增所述分离的DNA以及检查所扩增DNA片段的预期长度(碱基对，bp)，可选地，在消化所述扩增的DNA片段之后，以表明存在与抗性等位基因相关的核苷酸多态性的步骤。 [0042] 图1示出了番茄基因组中代表4号染色体的示意图，并指出了多个熟知标记物的最近期定位。 [0043] 图2示出了用特异性限制内切酶消化的PCR片段的琼脂糖凝胶，以表明存在或不存在用于ToTV抗性的抗性等位基因，如实施例2中详细阐述的。 具体实施方式[0044] 如本文中使用的，术语“等位基因”表示基因的一种或多种可替代形式中的任何一种，所有等位基因均涉及至少一种性状或特征。在二倍体细胞或有机体中，指定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应位置。因为本发明涉及的方法包括鉴定基因组区域的步骤，该基因组区域可包括一种或多种基因以及调节性序列，因此在某些情形中，其可更精确地称为“单倍体或单倍型(haplotype)”(即染色体节段的一个等位基因)而非“等位基因”，然而，在那些情形中，术语“等位基因”应该理解为包括术语“单倍体”。 [0045] 本文中，“基因”定义为有机体内占据染色体上特定位置且包含用作特定特性或性状的遗传指示的由DNA序列组成的遗传单位(hereditary unit)。 [0046] 本文中，“位点或座位(locus)”定义为在给定物种染色体上指定基因占据的位置。 [0047] 如本文中使用的，术语“杂合或杂合子(heterozygous)”表示同源染色体上对应位置上存在不同等位基因的遗传情形。 [0048] 如本文中使用的，术语“纯合或纯合子(homozygous)”表示同源染色体上对应位置上存在相同等位基因的遗传情形。 [0049] 如在本文中使用的，术语“分子标记物”指在用于使核酸序列特征差异可视化的方法中采用的指示剂。这些指示剂的实例为限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)、微卫星标记物(例如SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)标记物、酶切扩增多态序列(CAPS)标记物或同功酶标记物或者本文所述的限定特定遗传和染色体定位的标记物的组合。 [0050] 如本文中使用的，术语“番茄”表示番茄属的任何植物、品系或种群，包括但不限于樱桃番茄(Lycopersicon cerasiforme)、契斯曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii)、治理番茄(Lycopersiconchilense)、奇美留斯凯番茄(Lycopersicon chmielewskii)、番茄(Lycopersicon esculentum或Solanum lycopersicum)、多毛番茄(Lycopersicon hirsutum)、小 花 番 茄 (Lycopersicon parviflorum)、潘 那 利 番 茄 (Lycopersicon pennellii)、秘 鲁 番 茄(Lycopersiconperuvianum)、于 醋 栗 番 茄 (Lycopersicon pimpinellifolium)或类番番茄(Solanum lycopersicoides)。现代番茄的野生相关植物已归类到番茄种属内，如潘那利番茄、多毛番茄、秘鲁番茄、治理番茄、小花番茄、奇美留斯凯番茄、契斯曼尼番茄、樱桃番茄和于醋栗番茄。在过去的几年内，在番茄研究者和植物学家中，关于是否对这些种属的名称进行重新分类还存在争议。现代番茄的新提议科学名称是番茄(Solanum lycopersicum)。类似的，野生种的拉丁名称也可以更改。L.pennellii(潘那利番茄)可变为Solanum pennellii、L.hirsutum(多毛番茄)可变为S.habrochaites、L.peruvianum(秘鲁番茄)可分为S.′N peruvianum′和S.′Callejon de Huayles′、S.peruvianum、以及S.corneliomuelleri，L.parviflorum变为S.neorickii，L.chmielewskii变为S.chmielewskii，L.chilense可变为S.chilense、L.cheesmaniae可变为S.cheesmaniae或S.galapagense，且L.pimpinellifolium(醋栗番茄)可变为S.pimpinellifolium(Solanacea Genome Network(2005)Spooner and Knapp； http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum_nomenclature.html). [0051] 根据本发明所述的植物在自然界中存在。然而，其是作为技术过程的结果而鉴定的。本发明披露了两种鉴定这种植物的主要方法。在第一个方法中，该植物通过利用抗性生物分析而鉴定，该分析涉及将候选植物暴露于有效剂量的番茄灼烧病毒(ToTV)(通过在田地里进行机械传播或暴露)，如本文所述。如果候选植物保持无病状态，其疾病症状包括坏死斑，最终形成植物材料尤其是叶片的灼伤样完全坏死和植物死亡和/或果实上同心环形的坏死斑则称所述植物具有抗性。利用该方法鉴定的植物所包括的两个等位基因均包括可赋予番茄灼烧病毒(ToTV)抗性的基因，因此对该性状是纯合型。 [0052] 术语“抗ToTV”的意思包括对ToTV(包括deposited株ToTV-E01(DSM 16999))以及相关病毒的抗性。本发明上下文中的相关病毒不仅是属于相同分类学种属如ToTV的病毒，而且可以定义为其抗性由本文所述抗性等位基因赋予的病毒。 [0053] 本发明所述植物包括至少一种赋予ToTV抗性的基因。该基因的座位与本文鉴定的多种AFLP标记物连锁。然而，这些AFLP标记物中的多种在番茄基因组图谱上的定位尚不知晓。因此，该基因在基因组内的位置还未完全确定。因为标记物P14/M49-F-282位于4号染色体上，因此有力地表明了该座位位于4号染色体上。当比较公知标记物的位置与P14/M49-F-282的位置时，看起来该基因位于由CT264(Tomato EXPEN 2000 position 86cM)和标记物TG163(Tomato EXPEN 2000position 135cM)限定边界的区域内。因此，本发明的植物的特征可以在于4号染色体上在标记物CT264与TG163之间的位置上具有ToTV抗性基因。 [0054] 在对包括抗性和易感性植物的实验番茄种群中存在的标记物进行更详细分析时，发现在该种群中两个标记物是多态性的，且与抗性等位基因：COSII/CAPS标记物C2_At5g25900(参见实施例)和称为P13/M38-F-311/313的双等位基因标记物的存在与否紧密相关。这些标记物位于番茄的4号染色体上，且从观察到的重组频率可以计算出这些标记物分隔开大约3cM的距离。图1中给出了C2_At5g25900的位置。由于受试种群中缺乏已知图谱位置的其他多态标记物，因此未能确立P13/M38-F-311/313相对于C2_At5g25900的位置。因此，迄今可以推断的是，赋予番茄中ToTV抗性的基因与一个区域相关，该区域特征在于多态标记物C2_At5g25900(特别是当用MseI消化时可产生420bp和260bp片段的标记物，该标记物连接于抗性等位基因)和P13/M38-F-311/313(特别是P13/M38-F-313，其连锁于抗性等位基因)，所述区域覆盖4号染色体上代表约3cM、较优选0-10cM、更加优选0-3.6cM、最优选小于3cM的遗传距离的一段DNA。 [0055] 本领域技术人员将能够分辨该两个标记物在番茄遗传图上相对彼此的定向(例如，类似于图2，当每一个标记物与第三个标记物的距离均可确定时)。这些试验在属于本领域技术人员能力范围。 [0056] 已发现本发明的植物可抵抗病毒剂，其引起在墨西哥称为“枯萎(marchitez)”的番茄疾病，且认为该病毒剂与以登陆号DSM16999保藏并命名为番茄灼烧病毒(ToTV)的病毒相同。ToTV是西班牙语称为“灼烧”的类似疾病的病原体。研究发现，如本文中所述连锁于ToTV病毒抗性且以登陆号DSM 16999保藏的标记物，也连锁于“枯萎”抗性。所以，如本文中定义的植物对“灼烧”以及“枯萎”均有抗性。因而，如本文中所述植物可赋予对以下病毒的抗性： [0057] -所有可作为疾病的病原体而在番茄植物中引起与保藏病毒ToTV DSM 1699所引起疾病的症状相同或类似的疾病的病毒； [0058] -所有与ToTV属于相同分类单位的植物病毒(其中，分类等级仍需要确定)，优选相同科，较优选相同属，更优选相同种的植物； [0059] -ToTV DSM 16999 [0060] 在一种鉴定本发明天然植物的替代性方法中，通过筛查是否存在至少一个与所述ToTV抗性基因的所述至少一个等位基因连锁的分子标记物而鉴定植物。现在本发明披露了多种适用于该筛查分析的AFLP标记物，因为已发现它们不同程度地连锁于番茄植物中存在的抗性基因。恰当的分子标记物可选自由AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216、P21/M61-F-583、P25/M51-F-131、P15/M49-F-330和P13/M38-F-311/313组成的组，优选选自由AFLP标记物P14/M49-F-282、P11/M35-F-216和P13/M38-F-311/313组成的组、最优选选自由AFLP标记物P11/M35-F-216和P13/M38-F-311/313组成的组。实施例更加具体地描述了这些标记物与抗性特性之间的偶联。 [0061] 本发明进一步涉及用于一种鉴定抗ToTV植物或其部分的方法，现在存在多种鉴定抗ToTV植物的可能性。在这种方法的第一组实施方式中，可采用活性/传染性病毒或者全长传染性克隆，而在可替代性实施方式中可仅采用病毒检测装置(或方法)。 [0062] 用于利用活性/传染性病毒鉴定抗ToTV植物的方法的第一步包括使植物或植物部分例如叶或茎节段暴露于传染剂量的ToTV，目的在于实现感染。在多种情况下，该暴露涉及到建立物理接触。传染剂量可以因植物和受试ToTV-isolates不同而发生变化。理论上，约1-10个至约500-5000个所述病毒的病毒颗粒或其核酸将已足够。这种方式的感染可通过在健康植物上通过机械接种纯化病毒颗粒或病毒核酸而实现，或者例如通过经由暴露于已感染植物的被动接种而实现。 [0063] 可替代地，感染可通过以下方式获得，例如： [0064] -在受ToTV感染的根茎上培育健康幼枝，或者反过来也可以； [0065] -将健康植物暴露于含该病毒的传播媒介(包括受感染植物例如寄生植物如菟丝子种(Cuscuta spp.))； [0066] -将携带ToTV病毒基因组编码区的表达载体导入健康植物内； [0067] -采用农作物传染性克隆，例如包含携带ToTV病毒基因组编码区的表达载体的根癌农杆菌株(Agrobacterium tumefaciensstrains)。 [0068] 在本发明中，用于将植物或植物部分暴露于传染剂量ToTV的方法不限于任何特定的方法。 [0069] 如上文所述，感染可包括在健康植物上机械接种病毒。例如，患病叶片的一部分可直接擦在待感染植物的叶片上。在一种替代性过程中，接种可例如通过用研钵和研棒或任何恰当类型的匀浆器研磨含病毒的植物组织，优选表现出症状的嫩叶而制备，在例如适于接种的恰当缓冲液(例如0.03M的磷酸盐缓冲液、pH 7.7)中进行。研磨后，优选通过例如纱布过滤得到的组织匀浆(汁液，sap)。随后可接种该汁液，例如通过用一定量汁液温和地接触叶片。优选预处理叶片，以破坏下表皮并促进病毒进入。这一点可通过例如用碳化硅粉末预先撒在叶片上而实现。优选避免过度创伤。优选采用具有显微小角形粒子的碳化硅颗粒(400-500目)的碳化硅粉末。还可将碳化硅粉末直接加入该汁液中，其中，可省略预处理步骤。汁液可例如由食指、浸过汁液的泡沫或纤维垫或甚至通过用于研磨的研棒、玻璃刮刀、硬毛刷或喷枪而涂布。接种后，优选立即用水冲洗叶片。 [0070] 用于鉴定抗ToTV植物的方法的第二步包括在暴露后，如果i)所述植物或植物部分中的疾病症状仍然未出现或出现延迟或至少严重降低或相对于易感和/或敏感对照植物局部化，和/或ii)所述植物或植物部分中不存在ToTV病毒或ToTV基因组序列或至少在数量上所述植物中的ToTV病毒相对于易感的对照植物有所降低，则鉴定所述植物为抗ToTV植物。如本文中使用的，术语局部化意思为限于所接种的叶片。 [0071] 确定受染植物中ToTV所诱导疾病症状的形成可通过定量方法，例如其中可记录形成可辨别(例如可见)疾病症状所需时间，或者通过定量方法其中在推移特定时间后，检查该植物是否表现出症状，并指示症状的存在或严重度。 [0072] 除了确定ToTV所诱导疾病症状的形成之外，或作为其备选方案，根据待检测ToTV抗性的不同，可检测植物或植物部分中病毒的存在情况。为了检测受试植物中病毒的缺乏，原则上可采用任何方法。例如，可采用其中应用根据本发明所述ToTV特异性抗体、引物对或探针的方法。可替代地，可使受试植物的一部分与易感性指示植物(例如蓝香芥(N.hesperis)‘67A’)，以确定该受试植物中是否存在病毒。本领域技术人员将能理解，对于这些方法而言，重要的是排除受试植物表面的污染，以区分传播媒介、耐受性受试植物和抗性受试植物，因为仅需要确定植物细胞内病毒的存在情况。 [0073] 在实施用于鉴定抗ToTV植物的方法的第二步时，可得到下列结果。在成功接种后(例如，已在将引起易感且敏感的对照植物中感染的条件下建立植物-病毒接触后)，如果： [0074] i)疾病症状仍然未出现；或者未检测到病毒颗粒或病毒RNA：则植物是抗性的； [0075] ii)疾病症状推迟出现或严重度降低；或可检测到整体效价(滴度)较低的病毒颗粒或病毒RNA：则植物是部分抗性的； [0076] iii)疾病症状严重但保持在局部，限于接种的叶片且除接种组织外未引起系统性传播；或仅局部检测到病毒颗粒或病毒RNA：则植物是高度敏感的； [0077] iv)如果疾病症状仍然未出现；且可检测到病毒RNA：则植物是耐受性的。 [0078] v)如果植物出现疾病症状，且具有较高的整体病毒效价，则植物易感且敏感。这种植物的实例是可分离出本发明所述病毒的植物。在本发明所述的方法中，这些植物可作为恰当的对照植物。 [0079] 为了得到抗性植物，且从植物卫生的观点，仅认为结果i)、ii)和iii)是感兴趣的。为了获得适于生产无症状农作物和产品的植物，也可认为结局iv)是商业上尤其感兴趣的。 [0080] 在用于鉴定抗ToTV植物的方法的一个替代实施方式中，仅采用病毒检测方法。例如，抗ToTV植物可通过在有症状植物中观察或鉴定无症状植物，并通过实施病毒检测方法而确定所述植物中不存在病毒。当实施这种方法时，优选采用ToTV选择性多核苷酸或抗体。优选地，鉴定抗ToTV植物的方法需要采用该病毒或病毒选择性多核苷酸或抗体。 [0081] 现在，本发明披露了另外一种通过确定是否纯合子存在连锁于公认ToTV抗性基因的标记物而鉴定抗ToTV植物的方法，且提供了几个关于所述标记物的实施例。 [0082] 本发明进一步涉及生产抗ToTV植物或其部分的方法。一旦已经鉴定了一种抗ToTV植物，该植物可用作遗传物质的供体植物，该遗传物质从所述供体植物转移至受体植物，以提供所述含有该遗传物质的受体植物。遗传物质从供体植物转移至受体植物可通过本领域中任何已知的恰当方法而实现。多数情况下，遗传物质为基因组物质。然而，重要的是，转移供体植物基因组中至少赋予抗性的部分。如果缺乏用于鉴定供体植物基因组中哪个部分赋予ToTV抗性的方法，可通过转移全染色体而实现转移。优选地，抗ToTV植物在杂交中用作父本或母本植物，用于生产抗性子代植物，该子代植物从而接受来自抗性供体的基因组物质并用作受体植物。尽管严格讲杂交中的易感性亲本并不必须是受体植物，但在本文中，这种易感性亲本也将包含在术语受体植物中。 [0083] 在一种用于生产抗ToTV植物的方法中，原生质体融合也可用于将赋予抗性的基因组物质从供体植物转移至受体植物，即作为一种杂交所述植物的方式。原生质体融合是两种或多种原生质体(其细胞的细胞壁通过酶处理而去除)之间的诱导或自发结合，如体细胞杂交，以产生单个的双核或多核细胞。该融合细胞(其甚至可利用自然界中不能进行品种间杂交的植物种属而获得)可经组织培养入表现出期望特性组合的杂种植物内。更具体地，第一原生质体可从番茄植物或其他表现出对ToTV感染抗性的株系而获得。例如，可采用来自抗ToTV番茄品系的原生质体。第二原生质体可从易感性的第二株系，可选地从另一种植物种属或品种，优选从相同植物种属或品种而获得，其包含商业所需特性，例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。随后该原生质体利用常规原生质体融合步骤而融合，这在本领域中是已知的用来生成杂交体。 [0084] 可替代地，胚拯救(embryo rescue)可用于将赋予抗性的基因组物质从供体植物转移至受体植物，即作为一种形成杂交体的方式，其中植物不能产生可育性种子。在该过程中，植物的受精子房或未成熟种子经组织培养而生成新植物(该方法在Pierik、1999中详细描述)。 [0085] 因此，在一个实施方式中，生产抗ToTV植物的方法包括以下步骤：鉴定抗ToTV的供体植物或包括如本文所述抗性基因(载体植物)的至少一个等位基因的植物，以及使所述抗ToTV的供体植物或所述载体植物与受体植物杂交。接下来，通过进一步杂交和自交，可获得抗病毒的纯合型植物。 [0086] 一种生产抗ToTV植物的方法进一步包括通过实施上文所述用于鉴定抗ToTV植物的方法而从子代植物选择抗性植物的步骤。 [0087] 优选地，所述受体植物是番茄属的番茄植物，较优选具有商业所需特性的番茄植物。该受体植物可以为ToTV易感性植物、ToTV敏感性植物或ToTV抗性植物。如上文所解释的，利用该抗性特性为隐性的这个事实来确定植物的选择。本领域技术人员已注意到，现在已有多种解决这些问题的方法。 [0088] 此外，本发明一个方面是可利用本发明获得的抗ToTV植物或其部分。 [0089] 一种用于生产抗ToTV植物的方法，可包括通过杂交所述植物，使赋予抗性的核酸序列从抗ToTV的供体植物或具有杂合形式抗性基因的植物经基因渗入而转移到受体植物内。 [0090] 在一种称为谱系育种的方法中，表现出对ToTV抗性(纯合)的供体植物可与受体植物杂交，该受体植物优选表现出商业所需特性例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。所得到的植物种群(代表F1杂种)随后自交并允许结籽(F2种子)。然后筛查从F2种子培育的F2植物对ToTV的抗性或其中连锁于该抗性基因的标记物的纯合存在。因而，可用多种方式筛查子代种群。 [0091] 通过转基因法生产抗ToTV的番茄植物 [0092] 根据本发明另一方面，包含至少一个连锁于如本文所鉴定的ToTV抗性基因的标记物的核酸序列(优选DNA)可用于生产抗ToTV的番茄植物。一旦在恰当的供体番茄植物中鉴定出，则该包含ToTV抗性基因的核酸序列可通过任何可利用的方法转移至恰当的受体植物中。例如，所述核酸序列可通过使ToTV抗性供体番茄植物与易感性受体番茄植物杂交(即通过基因渗入)、通过转化、通过原生质体融合、通过重双单倍体技术或通过胚拯救或通过任何其他核酸转移系统而转移，可选地，随后选择包含纯合或杂合基因和/或表现出ToTV抗性的子代植物。对于转移包含ToTV抗性基因的核酸序列的转基因方法，该核酸序列可利用本领域中已知的方法而从所述供体植物分离，且如此分离的核酸序列可通过转基因方法例如借助载体或用任何其他恰当的转移元件如涂布有所述核酸的弹道粒子(ballistic particle)而转移到受体。 [0093] 植物转化通常涉及构建将在植物细胞内发挥作用的表达载体。在本发明中，这种载体包括含ToTV抗性基因的核酸序列，该载体可包括赋予ToTV抗性的基因，其处于调节元件如启动子的控制之下或与其可操作性连接。该表达载体可包含一个或多个这种可操作性连接的基因/调节元件组合，只要该组合所含基因中至少一个编码ToTV抗性。该载体可为质粒形式，且可单独或与其他质粒一起使用，以利用本领域中已知的转化方法如农杆菌属转化系统提供抗ToTV的转基因植物。 [0094] 表达载体可包括至少一种标记基因，可操作性连接于调节元件(如启动子)，其允许包含该标记物的转化细胞通过阴性选择(通过抑制不含可选择标记基因的细胞生长)或者通过阳性选择(通过筛查由该标记基因编码的产物)而恢复(回收，recover)。几种用于植物转化的常用可选择标记基因在本领域中已经为人所知，包括例如编码可通过代谢去除选择性化学试剂(其可为抗生素或除草剂)的酶的基因或者编码对抑制剂不敏感的已改变靶标的基因。已知本领域中有几种阳性选择方法，例如甘露糖选择。可替代地，无标记物的转化可用来获得不含所提到标记基因的植物，用于该转化的技术在本领域中已经为人所知。 [0095] 一种用于将表达载体导入植物内的方法基于天然农杆菌属转化系统(参见例如Horsch et al.，1985)。根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物的致病土壤细菌，其可遗传转化植物细胞。根瘤土壤杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒各自均携带负责植物遗传转化的基因(参见例如Kado、1991)。将表达载体导入植物组织内的方法包括用根瘤土壤杆菌直接感染植物细胞或与植物细胞共同培育(Horsch et al.、1985)。Gruber和Crosby，1993以及Moloney等，1989提供了对用于农杆菌属介导的基因转移的农杆菌属载体系统和方法的描述。还可参见美国专利5,591,616。对植物表达载体和报告基因及转化过程的一般性描述以及对农杆菌属介导的基因转移的农杆菌属载体系统和方法的描述可在Gruber and Crosby，1993查到。培养植物组织的一般方法由例如Miki et al.，1993和Phillips、et al.，1988提供。用于分子克隆技术和恰当表达系统的适当参考手册是Sambrook andRussell(2001)。 [0096] 另一种用于将表达载体导入植物内的方法基于微粒介导的转化，其中DNA携带于微粒表面上。表达载体通过遗传转化(生物弹道，biolistic)装置导入植物组织内，该装置将微粒加速至300-600m/s的速度，其足够穿透细胞壁和膜(参见Sanford et al.，1987，1993；Sanford，1988，1990；Klein et al.，1988，1992)。另一种用于将DNA导入植物内的方法是借助于靶细胞超声处理(参见Zhang et al.、1991)。可替代地，脂质体或质体融合已用来将表达载体导入植物内(见例如Deshayes et al.、1985和Christou et al.、1987)。 已有报道利用CaCl2沉淀反应、聚乙烯醇或聚L-鸟氨酸将DNA直接摄入原生质体内(参见例如，Hain et al.1985 and Draper et al.，1982)。还描述了原生质体和全细胞以及组织的电穿孔(D′Halluin et al.、1992 and Laursen et al.、1994)。 [0097] 转化番茄靶组织后，上述可选择标记基因的表达可允许利用本领域中为人熟知的再生和选择方法优先选择所转化细胞、组织和/或植物。如本文所定义的标记物也可用于该目的。 [0098] 通过非转基因方法生产ToTV抗性番茄植物 [0099] 在一个用于生产ToTV抗性番茄植物的替代性实施方式中，原生质体融合可用于将核酸从供体植物转移至受体植物。原生质体融合是两个或多个原生质体(该细胞的细胞壁通过酶处理而去除)之间诱导或自发结合，例如体细胞杂交，以产生单个的双核或多核细胞。该融合细胞(其甚至可利用自然界中不能进行品种间杂交的植物种属而获得)可经组织培养入表现出期望特性组合的杂种植物内。更具体地，第一原生质体可从番茄植物或表现出ToTV感染抗性的其他株系而获得。例如，可采用来自如实施例部分所指出的抗性品系中任何一种的原生质体。第二原生质体可从第二种番茄或其他植物品种优选从包含商业所需特特性的番茄品系获得，所述特性例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。随后该原生质体利用本领域中已知的常规原生质体融合步骤而融合。 [0100] 可替代地，胚拯救可用于将抗性基因从供体植物转移至受体植物。胚拯救可用作从杂交体分离胚芽的步骤，其中植物未能产生可育性种子。在该过程中，植物的受精子房或未成熟种子经组织培养而生成新植物(Pierik、1999)。 [0101] 本发明还涉及生产抗ToTV番茄植物的方法，包括以下步骤：按照本发明上文所述，检测供体番茄中是否存在与ToTV抗性基因相关的等位基因，并将包含所述如此检测到的等位基因的核酸序列从所述供体植物转移至ToTV易感性受体番茄植物。所述核酸序列的转移可通过本文上述方法中的任何一种来实施。 [0102] 该方法的一个优选实施方式包括通过杂交所述植物使所述来自ToTV抗性供体番茄植物的核酸序列基因渗入到ToTV易感受体番茄植物。从而该转移可恰当地通过利用常规育种技术而实现。ToTV抗性基因优选通过利用标记辅助育种(marker-assistedbreeding，MAS)而基因渗入到商用番茄品种中。标记辅助育种或标记辅助选择涉及到将一种或多种分子标记物用于鉴定和选择包含一种或多种编码所需特性的基因的子代植物。在本发明情况中，该鉴定和选择优选基于选择与本文所鉴定抗性基因相关的标记物。 [0103] ToTV抗性番茄植物和种子 [0104] 可通过本发明所述方法获得的ToTV抗性番茄植物或其部分也是本发明的一个方面。 [0105] 根据本发明所述ToTV抗性番茄植物可为任何遗传类型，如同系繁殖、杂种、单倍体、双单倍体、单性结实(parthenocarp)或转基因。此外，对于该抗性特征，本发明所述植物可为杂合或纯合型，优选纯合型。尽管可将本发明中鉴定的等位基因转移至任何植物，以提供ToTV抗性植物，但本发明所述方法和植物优选与茄科，较优选与番茄相关。 [0106] 同系繁殖的ToTV抗性番茄株系可利用重复选择和回交(backcrossing)、自交和/或双单倍体或任何其他用来产生亲本品系的技术而培育。在一种选择和回交的方法中，ToTV抗性可通过使回归亲本与第一供体植物(其不同于回归亲本(recurrent parent)，本文中称为“非回归亲本(non-recurrent parent)”)基因渗入靶受体植物(称为回归亲本)中。回归亲本是无抗性植物或者具有较低ToTV抗性水平的植物，其具有商业需要特性例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特征等。非回归亲本表现出ToTV抗性，且包含编码ToTV抗性的核酸序列。该非回归亲本可为与回归亲本杂交结实(cross-fertile)的任何植物品种或同系繁殖品系。将回归亲本与非回归亲本之间杂交得到的子代与该回归亲本回交。然后筛查所得到的植物种群，且该种群可以多种不同方式进行筛选。例如，该种群可利用本文已述的抗性分析或视野筛选(field screen)进行筛选。表现出抗ToTV表型的F1杂种植物包含编码ToTV抗性必需的核酸序列，且具有商业所需特性，随后可经选择、自交和选择直至多代(直到5、6、7或8代)，从而使该番茄植物逐渐同系繁殖。可对2-5代或更多代开展该持续自交和选择过程。这种育种和选择的结果是得到与ToTV抗性相关基因以及其他与商业感兴趣特性相关基因为遗传同源的品系。可利用上文所述分子标记物、杂交探针或多核苷酸中的一种或多种来开展MAS而非表型病理学筛查的生物分析，以鉴定包含编码ToTV抗性的核酸序列的子代。可替代地，MAS可用来证实从定量生物分析得到的结果。一旦作出恰当的选择，就可重复该过程。回交至该回归亲本且选择ToTV抗性的过程可重复约5代或更多代。从该过程得到的子代，对编码ToTV抗性的一种或多种基因而言是杂合的。然后，使末次回交世代自交，以提供纯合ToTV抗性的纯系繁育子代。 [0107] 本文所述的抗ToTV的同系繁殖番茄品系可用于其他杂交中，以生成抗ToTV的杂种植物。例如，本发明的第一种抗ToTV的同系繁殖番茄植物可与具有商业所需特性如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、所需果实特性等的第二种同系繁殖番茄杂交。该第二种同系繁殖番茄品系可抗或不抗ToTV，但优选具有至少一个用于ToTV抗性的等位基因，如与本文所定义标记物连锁的，使子代植物中至少50％表达抗ToTV表型。较优选地，该第二种同系繁殖番茄品系也抗ToTV，因此不管如何杂交，均保持抗性表型。以这种方式，本发明的第一种抗ToTV的同系繁殖番茄植物可用来将另一种可遗传特性基因渗入到第二种同系繁殖番茄植物品系中。 [0108] 本发明的另一方面涉及生产可生长成抗ToTV的番茄植物的种子的方法。在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：提供本发明的抗ToTV的番茄植物、使所述抗ToTV的植物与另一种抗ToTV的番茄植物杂交，并收集从所述杂交得到的种子，如果培育，所述种子生成抗ToTV的杂种番茄植物。 [0109] 在另一个实施方式中，该方法包括以下步骤：提供本发明的抗ToTV的番茄植物；使所述抗ToTV的植物与番茄植物杂交；收集从所述杂交得到的种子；使所述种子重新生成植物；通过本文所述方法中任何一种选择抗ToTV的植物；使所选植物自交达到足够代数，以获得固有可赋予植物以ToTV抗性的等位基因的植物；使如此得到的植物与具有所需表型特性的番茄植物回交达足够代数，以得到抗ToTV且具有所需表型特性的番茄植物；以及收集末次回交所得植物生成的种子，如果培育，所述种子生成抗ToTV的番茄植物。 [0110] 本发明的实施例将以举例而非限制的形式给出。 [0111] 实施例 [0112] 实施例1 [0113] 在番茄中鉴定与ToTV抗性基因连锁的标记物 [0114] 本实验的目标在于通过采用Bulk Segregant Analysis(BSA；Michelmore、R.W.、I.Paran and R.V.Kesseli、1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88：9828-9832)在番茄中鉴定与ToTV抗性连锁的AFLP标记物。 [0115] 已发现ToTV抗性是一种单基因隐性遗传性状。该分析在150个F2番茄杂交品种中进行，其中测定F3植物的表型。为了确定可靠的表型，对其中一小组F2植物，在F3植物上测定表型重复几次。根据重复测定表型获得的结果，表明18个个体有可靠的抗性，9种植物为可靠的易感。这些植物用于BSA。表1中列出了来自这些个体的表型信息。 [0116] 标记物鉴定和验证 [0117] 标记物命名 [0118] 通常指示AFLP引物组合的代码例如是P14/M49-F-282，其中P和M是共用的PstI和MseI引物序列或者通用引物(Vos et al.，1995；Bai et al.，2003)，其后是2个或3个额外的选择性碱基，如由两个数字扩展代码表示的。两个数字扩展代码如下：11：AA；13：AG；14：AT；15：CA；21：GG；25：TG；35：ACA；38：ACT；49：CAG；51：CCA；61：CTG。282bp是所得多态片段的大致大小(给定大小±2bp)。该大小通常四舍五入，但也可以小数给出。在所研究植物中扩增该片段。引物和接头序列(adapter sequence)由Bai et al.2003详细描述。 [0119] 标记物TG163(Expen 2000；SOL Genomics Network基因组学网；http://www.sgn.cornell.edu/index.p1)由下列序列的正向和反向引物组成： [0120] 正向序列： [0121] TCTGGGATCATATATGGGATCTTAGAATGCTGAAGTTTCCAGTC [0122] CTTGATCTCCCTGGACATACTCACTGGTAATACTCTGTGGCAAT [0123] AATGAAGCTGCTTGCCATCTCTTTAATTAGTTGAGTTTTTGATA [0124] TAAGATTATTGTCTGGTCCTTCAATGTGTGTCTCACTATGCTGC [0125] CTACAACTTAATGACTGCTAACTTTTTTTGTTAGGGTTTAGGGT [0126] TAGAAGTTTCTTTCTGGATTACCATTTCCTTATTGAGTAAATGC [0127] AGTTGATGTTTGTTCGCAGGACATGGACTGTCAAGTGCAATCC [0128] CGAACATGAAGACTTAATTCTGGTTCTTTCTCTTCATTTCCTTT [0129] ATCTGTTTGTCTACCCTATGTATCTGGAAAACATACTTGTGCAC [0130] ACTCTCACTGAGCC [0131] 反向序列： [0132] CTTAGAAGCTTCCGCATGAAAATGAACTGCAAACGTCATACTA [0133] GATAAAATTAAAGAGACCTCTTGCAAAATTCTACATTCCACCT [0134] CAGCAGCGTTAACTCCATCATGAACACATCAAGAATACAGATT [0135] TGGAGGGGGATATACTGGAGTGATACAAACATTAATAAAAGA [0136] GATGAGTAGTGTGGCAAAGGGATAATGAGCTCAAAAGATGGA [0137] TCACGAGTTCATACTTACTTCGAGTTGTACTGATTTATTTTCTT [0138] GGAAGATGAGGCTTGATTGATTCTACAACCACCTGTTAGGAA [0139] AAAAAATGCTAAATTAAAACATGAAAACACGTGGTGCCAATT [0140] CTCAACTTAAAATAAGACAACTCTATTAGACTATTCATCATGTA [0141] TTAGAAATAATAGCAAATTGCCAAGAATACATGCACACTCATG [0142] GGAACATTTTCTATGTTATCCTGAAATTGGCTCAGAAGTCCAA [0143] CACAAGAAAAGACACAGATG [0144] 生物材料 [0145] 共有300种F2植物的叶材料用于评估，其中，共有150种植物基于来自这些F2植物的F3植物的表型而测定表型(分型，phenotyped)。从这150种已确定表型的植物叶材料中分离基因组DNA(表1)，并从这些DNA样品生成用于AFLP指纹法的PstI/MseI模板。随后，通过在所有植物上应用引物组合P14/M50而生成试验指纹。 [0146] BSA以及在个体上进行验证 [0147] BSA通过在一批包含10个抗ToTV的个体和一批包含9个对ToTV易感性的个体上筛查96个引物组合开始(表2)。该筛查鉴定出了3种候选标记物(P11/M54-F-233/235(双等位基因)、P14/M49-F-282和P15/M49-F-330)，随后在32个个体上加以验证，其中包括总共18个可用的抗ToTV个体、9个ToTV易感性个体以及5个表型没有清楚评价的个体(表3)。基于该筛查，标记物P14/M49-F-282似乎是与ToTV抗性基因最紧密连锁的标记物。 [0148] 实施了第二次BSA，其中在R-批和S-批(分别由9个和8个个体构成)上筛查96个引物组合。该筛查鉴定出两种候选标记物(P21/M61-F-583和P25/M51-F-131)，将其与来自之前BSA筛查的一种标记物(P15/M49-F-330)在32个前述个体上进行验证(表3)。 其他筛查出的标记物中没有一个看起来是比第一轮BSA中所鉴定连锁最好的标记物P14/M49-F-282更紧密连锁。 [0149] 因为标记物P14/M49-F-282看起来是最紧密连锁的标记物，因此决定在所有150种测定表现的个体(phenotyped individual)上筛查该标记物。结果示于表5中。共鉴定出17个重组体(表4)。表型分为3类： [0150] -抗性(A)＝总感染率(％)低于25％ [0151] -隔离(H)＝总感染率(％)在25％-75％之间 [0152] -易感(B)＝总感染率(％)高于75％ [0153] 基于这种分类以及标记物P14/M49-F-282的表型，共鉴定出28个重组体，其对应该标记物与ToTV抗性基因之间约9.5cM的距离。这与所计算出的窗口大小(9cM)一致，其中该ToTV抗性基因位于标记物P14/M49-F-282与P11/M35-F-216之间(表3)。该计算基于用于BSA的品系(长散布重复片段，line)，且认为其表型最可靠。 [0154] 由于P14/M49-F-282(其看起来与所有受试标记物连锁最紧密)与基因座仍有一段较大距离，因此需要连锁更为紧密的标记物。所以，实施了第三次BSA筛查，其中筛查了72个引物组合，使得所筛查引物组合的总数达到263个。在该第三次筛查中，鉴定出9种候选标记物(在6个引物组合中)，其在8种抗性和8种易感性个体上加以验证(表3)。两个标记物(P11/M35-F-216和双等位基因标记物P13/M38-F-311/313)看起来是最紧密连锁的。应该强调，目前标记物P11/M35-216的位置是假设性的，因为其位置基于单个重组体。随后在更大组无可用表型信息的个体中筛查所述两个标记物P11/M35-F-216和P13/M38-F-311/313，包括17个重组体以及28个抗性且易感的个体(表5)。 [0155] 将标记物P13/M38-F-311连锁于敏感性等位基因。在该引物之间扩增的311个碱基对(bp)的片段具有以下序列(311个碱基中已经可靠地测定了278个)： [0156] AGCTCTTGCAAGTTGTTCATCTTCTTTCAGTTGTGATTCAC [0157] TATCTGCCAAAAATCAAAGAAAAGGAATAATTAGAAAATCAA [0158] GCAAATATAGTTTTGGTCAAGCAAATAAACAAGTATGGCTGGT [0159] TCTCAAAAATTGTCAAAGCTAAACTAATAAAAAGAAGCCAGA [0160] TTCCTCATAGAATGAAAAGTATTTCTATAGAACAACGCGCAAT [0161] ACCATGGATGAGCTAAATACACATACATGAAAGTACTCAGTAG [0162] CCTTGAACACATATGATGGGAAGT [0163] 将标记物P13/M38-F-313连锁于抗性等位基因。在该引物之间扩增的313个碱基对的片段具有以下序列(313个碱基中已经可靠地测定了284个)： [0164] AGCTCTTGCAAGTTGTTCATCTTCTTTCAGTTGTGATTCAC [0165] TATCTGCCAAAAATCAAAGGAAAGGAATAATTAGAAAATCAA [0166] GCAAATATAGTTTTGGTCAAGCAAATAAACAAGTATGGCTGGT [0167] TCTCAAAAATTGTCAAAGCTAAACTAATAAAAAGAAGCTAGA [0168] TTCCTCATAGAATGAAAAGTATTTCTATAGAACAACGCGCTAT [0169] ACCATGGATGAGCTAAACTACACATACATGAAAGTACTCAGTA [0170] GCCTTGAACACATATGATGGGAAGTTTACT [0171] 将标记物P11/M35-F-216连锁于抗性等位基因。在该引物之间扩增的216个碱基对的片段具有以下序列(216个碱基中已经可靠地测定了185个)： [0172] AATGAGGGAACATTCTTTTGGGCAAAGTGGCATTTTCTGA [0173] TAATCTTCTCACATTCAAGAATGGTATATAACTCTTTATGACTT [0174] CACAAATATCAACTGATCCATTTTGGACTGCAAAATTTGTGAA [0175] CTTCTTTTCCTCTGCCATAATTAGTAAATTATATTACCAAACAAT [0176] AAAATTGTTTACT [0177] 在种质系(germplasm lines)上筛查两种候选连锁标记物 [0178] 两种标记物P11/M35-F-216和P13/M38-F-311/313被鉴定为与ToTV抗性紧密连锁。应该注意到，基因与标记物之间的距离难以确定，因为表型的判读对所计算的距离影响较大。在一组共83个种质个体上筛查这些标记物。根据该筛查，标记物P11/M35-F-216似乎具有90.4％的预测值，而标记物P13/M38-F-311/313似乎具有96.4％的预测值(表6)。 [0179] ToTV抗性在番茄基因组上的定位 [0180] 实验证据以及番茄标记物的特有基因组图谱表明，标记物P14/M49-F-282定位于4号染色体上。因此，预期ToTV抗性的遗传基础位于4号染色体上。发现了4号染色体上的两个侧翼标记物：双等位基因标记物P13/M38-F-311/313和COSII/CAPS标记物C2_At5g25900(参见实施例2)。当用MseI消化COS II/CAPS标记物时，敏感(纯合易感)表型提供分别为360bp和260bp的两个片段，而(纯合)抗性表型提供分别为420bp和260bp的两个片段；表现全部三种片段的植物具有两种等位基因，且为杂合的(即，易感的)(参见图2，一个代表性的凝胶图，示出了由全部三种类型植物组成的受试种群的消化后PCR产物；从下向上迁移，大小标记物表示100、200、300bp等片段)。 [0181] 用 于 番 茄 属COSII/CAPS标 记 物C2_At5g25900的 单 一 基 因 序 列 (ID：SGN-U228314，基于2004年6月30日的数据；单一基因SGN-U332034，基于2007年4月5日的数据)如下： [0182] AAATTGGGCTGAAACTTATGGACCTATTTATTCCATCAAA [0183] ACCGGCGCAAATACAATTGTTGTACTCAGTTCTAGTGAACTTG [0184] CAAAGGAGGCTATGGTGACTAGATATTCATCCATCTCAACTAG [0185] AAAGCTAACAAACGCATTGAGAATCCTTACTTGTGATAAGAGT [0186] ATAGTCGCGATAAGTGATTACGATGAGTTTCACAAGACAGCGA [0187] AGCGCCACATACTGACCAGTGTTCTAGGACCAACTGCTCAGA [0188] AACGCTTCCGTATCCACAGGGACACCTTGGTAGAAAATGTGT [0189] CAAAGCAACTACATGATTTGGTTAGGACTGATCCTAACGAAGC [0190] AATTAATCTAAGGAAGTCATTTCAGTCGGAACTTTTTGGTTTA [0191] GCATTGAAACAAGCTTTGGG [0192] 结论 [0193] 通过在两批抗性且易感的个体上筛查共263个PstI/MseI PC以及随后的验证步骤，显示共有4种标记物(一个双等位基因)连锁于ToTV抗性。标记物与ToTV抗性基因之间的距离难以测定，但基于翻译出的表型以及标记物P14/M49-F-282的基因型，估计距离为9.5cM。这与所计算的窗口大小9cM一致，ToTV抗性基因位于其中。该计算基于人们认为表型最可靠的长散布重复片段。 [0194] 将标记物P11/M35-F-216和P13/M38-F-311/313(双等位基因)在83个种质个体上加以验证。根据该筛查，所述标记物分别具有90.4％和96.4％的预测值。可通过在ToTV座位的等位基因变异或重组而解释出现偏离个体。 [0195] ToTV抗性基因最可能位于4号染色体上，如由该染色体上存在标记物P14/M49-F-282所表明的。 [0196] 基于利用263种PC鉴定的数量相对较多的候选连锁标记物，ToTV抗性基因可能是来自野生番茄发作(accession)的基因渗入。 [0197] 表1：F2个体和用于ToTV抗性的表型的概述。(注：表型基于来源于这些F2个体的F3植物) [0198] [0199] 表1-续 [0200] [0201] 表2：在用于BSA的批次中使用的F2个体 [0202]* [0203] 仅在第一次BSA中使用的个体 [0204] 表3：使用BSA鉴定的标记物概述并且这些标记物随后在32个F2植物上进行筛查。标记物以最期望顺序排序。探究标记物P11/M35-F-216是否正确定位。 [0205] [0206] 表4：基于标记物P14/M49-F-282 [0207] [0208] 表5：使用三种连锁最好的标记物产生的数据。标记物P14/M49-F-282在150个表型品系上筛查而标记物P11/M35-F-216和双等位基因P13/M38-F-311/313在一个亚组上筛查。 [0209] [0210] 表6：通过在83个种质品系上筛查对ToTV抗性的两种候选连锁标记物产生的数据。 [0211] [0212] 实施例2 [0213] 利用标记物C2_At5g25900和限制性内切酶Mse I检测对ToTV的隐性抗性。 [0214] 样品： [0215] 来自受试种群每一种植物的番茄组织的DNA样品通过采用标准制备技术制备(microprep，例如参见Fulton TM、Chunwongse J、and Tanksley SD.(1995)Microprep Protocol for Extraction of DNAfrom Tomato and other Herbaceous Plants.Plant Molecular BiologyReporter 13(3)：207-209.)。 [0216] PCR化学试剂如下： [0217] -dNTP(2mM储存液)(Amersham Bioscience) [0218] -SuperTherm聚合酶(Integro) [0219] -正向引物(10ng/μl)5’TGC TAA TTG GGC TGA AAC TTA TGG [0220] -反向引物(10ng/μl)5’TGT TAG CTT TCT AGT TGA GAT GGA TG [0221] -10xPCR缓冲液25mM MgCl2 [0222] -加样缓冲液 [0223] -溴化乙锭(10mg/ml) [0224] -1xTE [0225] -0.5X TBE (Duchefa) [0226] -限制性内切酶Mse I(New England Biolabs) [0227] PCR混合物由以下组成(每个样品)： [0228] 2.0μl 10xPCR缓冲液(25mM MgCl2) [0229] 2.0μl dNTP混合物(2mM的每种dNTP)) [0230] 3.0μl 正向引物(10ng/μl) [0231] 3.0μl 反向引物(10ng/μl) [0232] 0.05μl SuperTherm聚合酶 [0233] 8.95μl H2O [0234] 1.1μl 模板DNA [0235] PCR热循环仪模式如下： [0236] 94℃3min；32个循环(94℃30s；65℃1min、以及72℃1min)；4℃保持。 [0238] 标记物评分： [0239] 评分1＝360bp+260bp ＝纯合，易感 [0240] 评分2＝420bp+360bp+260bp ＝杂合 [0241] 评分3＝420bp+260bp ＝纯合，抗性 [0242] 表型独立于杂种进行评分。 [0243] 结果和讨论： [0244] 图2中展示了该凝胶的照片，示出了由所有三种类型的植物组成受试群的已消化PCR产物；从下至上迁移，大小标记物表示100、200、300bp等片段)。 [0245] 表I： [0246] ToTV ToTV [0247] 标记物评分 表型 [0248] 2-杂合型 [0249] 植物1002 2 2 [0250] 植物1003 2 2 [0251] 植物1004 2 2 [0252] 植物1006 2 2 [0253] 植物1007 2 2 [0254] 植物1010 2 2 [0255] 植物1011 2 2 [0256] 植物1012 2 2 [0257] 植物1014 2 2 [0258] 植物1015 2 2 [0259] 表II： [0260] ToTV ToTV [0261] 标记物评分 表型 [0262] 3-抗性 [0263] 植物1016 3 3 [0264] 植物1017 3 3 [0265] 植物1018 3 3 [0266] 植物1019 3 3 [0267] 植物1037 3 3 [0268] 植物1038 3 3 [0269] 植物1040 3 3 [0270] 植物1041 3 3 [0271] 植物1042 3 3 [0272] 植物1043 3 3 [0273] 植物1044 3 3 [0274] 植物1045 3 3 [0275] 植物1046 3 3 [0276] 植物1047 3 3 [0277] 植物1048 3 3 [0278] 植物1049 3 3 [0279] 植物1051 3 3 [0280] 植物1052 3 3 [0281] 植物1054 3 3 [0282] 植物1055 3 3 [0283] 植物1061 3 3 [0284] 植物1062 3 3 [0285] 植物1064 3 3 [0286] 植物1065 3 3 [0287] 植物1066 3 3 [0288] 植物1067 3 3 [0289] 植物1068 3 3 [0290] 植物1069 3 3 [0291] 植物1070 3 3 [0292] 植物1071 3 3 [0293] 植物1072 3 3 [0294] 植物1073 3 3 [0295] 植物1074 3 3 [0296] 植物1075 3 3 [0297] 植物1076 3 3 [0298] 植物1077 3 3 [0299] 植物1078 3 3 [0300] 植物1079 3 3 [0301] 植物1080 3 3 [0302] 植物1081 3 3 [0303] 植物1082 3 3 [0304] 植物1083 3 3 [0305] 植物1084 3 3 [0306] 植物1089 3 3 [0307] 植物1090 3 3 [0308] 表III： [0309] ToTV ToTV [0310] 标记物评分 表型 [0311] 1-易感 [0312] 植物1020 1 1 [0313] 植物1021 1 1 [0314] 植物1022 1 1 [0315] 植物1024 1 1 [0316] 植物1025 1 1 [0317] 植物1026 1 1 [0318] 植物1027 1 1 [0319] 植物1028 1 1 [0320] 植物1029 1 1 [0321] 植物1030 1 1 [0322] 植物1031 1 1 [0323] 植物1032 1 1 [0324] 植物1033 1 1 [0325] 植物1034 1 1 [0326] 植物1035 1 1 [0327] 植物1036 1 1 [0328] 植物1056 1 1 [0329] 植物1057 1 1 [0330] 植物1058 1 1 [0331] 植物1059 1 1 [0332] 植物1085 1 1 [0333] 植物1086 1 1 [0334] 植物1087 1 1 [0335] 植物1088 1 1 [0336] 1-抗性 [0337] 植物1039 1 3 [0338] 植物1050 1 3 [0339] 植物1053 1 3 [0340] 3-易感 [0341] 植物1023 3 1 [0342] 未知 [0343] 植物1005 3 2？ [0344] 植物1008 3 2？ [0345] 植物1013 - 2 [0346] 标记物C2_At5g25900最初在86个品系中加以测试。这些品系中有三种由于表型不清楚或者没有标记物结果而无法进行分析(见表III中的“未知”)。 [0347] -10个品系评分为“2”，而表型为杂合易感。 [0348] -24个品系评分为“1”，而表型为纯合易感。 [0349] -45个品系评分为“3”，而表型为杂合抗性。 [0350] -该标记物评分(markerscore)与95％所测试材料中观察到的表型一致。 [0351] 结论： [0352] 可以推断该标记物可以可靠地(95％准确性)用于表型预测和抗性等位基因的检测。 [0353] 对标记物C2_At5g25900与抗性等位基因之间的遗传距离进行了部分绘图。基于该标记物，数据是非决定性的，并且与基因的距离仅能可靠地确定处于0和10cM的范围之间。 [0354] 当对相同样品测试标记物P13/M38-F-311/313时，共可解释55个样品中的2个重组体，表示该标记物与0cM至3.6cM之间的抗性基因之间的连锁。 |
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