首页 / 国际专利分类库 / 纺织;造纸 / 造纸;纤维素的生产 / 具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸

具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸
申请号 CN201710470220.4 申请日 2011-09-29 公开(公告)号 CN107345226A 公开(公告)日 2017-11-14
申请人 诺维信股份有限公司; 发明人 M.斯维尼; M.沃古利斯;
摘要 本 发明 涉及具有 纤维 素分解增强活性的多肽的变体。本发明亦涉及编码变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。
权利要求

1.一种变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77，179，181，和183的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
2.权利要求1的变体，其为具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的变体，选自下组：
(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少
75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少
96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件下，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少
82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少
99％，或100％序列同一性；和
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其具有纤维素分解增强活性。
3.权利要求2的变体，其与具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少
92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于
100％序列同一性。
4.权利要求1-3任一项的变体，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少
65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于100％序列同一性。
5.权利要求1-4任一项的变体，其包含一个或多个选自下组的取代或由其组成：I75V，F77L，F191I，I181L，和I183V。
6.权利要求1-4任一项的变体，其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+F179I+I181L+I183V或由其组成。
7.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-6任一项的变体。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7的多核苷酸。
9.一种产生变体的方法，其包括：
(a)在适于表达所述变体的条件下培养权利要求8的宿主细胞；和
(b)回收所述变体。
10.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用权利要求7的多核苷酸转化。
说明书全文

具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸

[0001] 本发明是基于申请日为2011年9月29日，申请号为“201180057773.8” (国际申请号为PCT/US2011/054036)，发明名称为“具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸”的专利申请的分案申请。
[0002] 对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
[0003] 该发明是在由能源部授予的Cooperative Agreement DE-FC36-08GO18080 下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。
[0004] 对相关申请的交叉引用
[0005] 该申请要求2010年9月30日提交的美国临时申请系列号61/388,527的权益，其通过提述并入本文。
[0006] 涉及序列表
[0007] 本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
[0008] 发明背景

技术领域

[0009] 本发明涉及具有纤维素分解增强活性的多肽变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。

背景技术

[0010] 纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
[0011] 将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
[0012] WO 2005/074647，WO 2008/148131，WO 2011/035027公开了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656and WO 2010/065830公开了来自橙橘嗜热子囊菌 (Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2007/089290公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2009/
085935，WO 2009/085859， WO 2009/085864，和WO 2009/085868公开了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 
2010/138754公开了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/005867公开了来自嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/
039319公开了来自嗜热子囊菌属菌种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/041397公开了来自青霉属菌种(Penicillium sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/041504公开了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2008/151043公开了通过将可溶性活化二价金属阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物来增加该多肽的活性的方法。
[0013] 在本领域中，改善具有纤维素分解增强活性的多肽增强木素纤维素原料的酶降解的能力会是有利的。
[0014] 本发明提供了具有改善的性质的具有纤维素分解增强活性的多肽。

发明内容

[0015] 本发明涉及分离的β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77，179，181，和183的一个或多个(例如几个)位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
[0016] 本发明亦涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。
[0017] 本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。
[0018] 本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：
[0019] (a)在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；
[0020] (b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
[0021] (c)从发酵回收所述发酵产物。
[0022] 本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种) 发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物糖化。附图说明
[0023] 图1显示通过连苯三酚和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合；连苯三酚，烟曲霉GH61B野生型多肽，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶；以及连苯三酚，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V，和烟曲霉CEL3A β- 葡糖苷酶所致的磷酸溶胀的纤维素(0.5％w/w)的转化。
[0024] 图2A和2B显示烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+ F77L+F179I+I181L+I183V对里氏木霉纤维素酶组合物和烟曲霉CEL3A β- 葡糖苷酶的组合在50℃或55℃转化经预处理的的玉米秸秆(PCS)的作用。
[0025] 图3A和3B显示GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+ F179I+I181L+I183V对高温纤维素酶组合物和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合在50℃，55℃，60℃或65℃PCS的作用。
[0026] 图4A和4B显示通过差示扫描量热法所得的烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的Td(变性温度)。
[0027] 定义
[0028] 乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯 (alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是TM使用含有0.01％TWEEN  20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5,25℃每分钟释放1 微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
[0029] 等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0030] α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L- 阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L- 阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5 中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd., Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过  HPX-87H柱层析(Bio-Rad 
Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
[0031] α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，
40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或 4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
[0032] β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D- 葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据 Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH 4.8，在含有 0.01％ 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基 -β-
D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
[0033] β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β- 木糖苷酶定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01％ 20的100mM柠
檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
[0034] cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
[0035] 纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology 15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？,Biochem.Soc.Trans. 26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh 等,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288；以及Tomme等,1988,
Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
[0036] 纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
[0037] 纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如， Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编), pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume 65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
[0038] 在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
[0039] 在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
[0040] 在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
[0041] 在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
[0042] 在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
[0043] 纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
[0044] 纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用 Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
[0045] 就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的 PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过 HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
[0046] 编码序列：术语“编码序列”意指直接指定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、 GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0047] 调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明的变体的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。
[0048] 内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin) 中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006, Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH 5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
[0049] 表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0050] 表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。
[0051] 家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0052] 阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4- 羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或 FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5 mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在 pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
[0053] 片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纤维素分解增强活性。在一个方面，所述片段含有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少200个氨基酸残基，例如至少210个氨基酸残基，或至少220个氨基酸残基。
[0054] 半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom, D.和Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology, 2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5进行测量。
[0055] 高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、 200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的 Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS 在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0056] 宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。
[0057] 增加的热活性：术语“增加的热活性”意指与亲本的热依存性活性概貌相比，变体更高或更宽的温度依存性活性概貌。变体增加的热活性在一个或多个(例如几个)特定温度相对于亲本增强对反应的催化。更具热活性的变体会导致对于催化反应所需时间的减少和/或所需酶浓度的减少。变体相对于亲本的增加的热活性可在例如一个或多个(例如几个)温度的条件下进行评估。例如，所述一个或多个(例如几个)温度可为25℃至95℃范围内的任何温度，例如25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，或95℃(或在此之间)，pH范围为3至8，例如3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5， 7.0，7.5，或8.0(或在此之间)。
[0058] 在一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在 pH 3.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和65 ℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 
3.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.0和90℃确定。
[0059] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 3.5和90℃确定。
[0060] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.0和90℃确定。
[0061] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 4.5和90℃确定。
[0062] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.0和90℃确定。
[0063] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 5.5和90℃确定。
[0064] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.0和90℃确定。
[0065] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 6.5和90℃确定。
[0066] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.0和90℃确定。
[0067] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 7.5和90℃确定。
[0068] 在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和40℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和45℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0 和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热活性在pH 8.0和90℃确定。
[0069] 相对于亲本的变体的增加的热活性可使用本领域中对于具有纤维素分解增强活性的多肽任何已知的酶测定来确定。参见，例如WO 2005/074647， WO 2008/148131WO 2005/074656，WO 2010/065830，WO 2007/089290，WO 2009/085935，WO 2009/085859，WO 
2009/085864，WO 2009/085868和WO 2008/151043，其通过提述并入本文。或者，相对于亲本的变体的增加的热活性可使用任何对于变体的实用测定法来确定，其中将变体的性能与亲本相比较。举例而言，可使用实施例12或14中所述的实用测定法。
[0070] 在一个方面，所述变体的热活性比亲本至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少25倍，和至少50倍更具热活性。
[0071] 具有增加的热活性的变体可或可不显示相对于亲本增加的热稳定性。例如，变体可具有相对于亲本改善的热活性，但并不具有增加的热稳定性。
[0072] 增加的热稳定性：术语“增加的热稳定性”意指相对于亲本，变体在某温度一定时间的温育之后更高的纤维素分解增强活性的保留。变体相对于亲本的增加的热稳定性可例如在一个或多个(例如几个)温度的条件下评估。例如，所述一个或多个(例如几个)温度可为45℃至95℃范围的任何温度，例如 45，50，55，60，65，70，75，80，85，或95℃(或在此之间)，pH为3至8 的范围，例如3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，或8.0(或在此之间)，进行合适时间的温育，例如1分钟，5分钟，10分钟，15分钟， 30分钟，45分钟，或60分钟，使得所述变体保留剩余活性。
[0073] 在一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 
3.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和90℃确定。
[0074] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和90℃确定。
[0075] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和90℃确定。
[0076] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和90℃确定。
[0077] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和90℃确定。
[0078] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和90℃确定。
[0079] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和90℃确定。
[0080] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和90℃确定。
[0081] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和90℃确定。
[0082] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和90℃确定。
[0083] 在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和50℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和55℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和60℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和65℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和70℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和75℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0 和80℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和85℃确定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和90℃确定。
[0084] 在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本1 分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本5分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本10分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本15分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本30分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本45分钟来确定。在上述每一个方面，变体相对于亲本的热稳定性可通过温育变体和亲本60分钟来确定。
[0085] 变体相对于亲本增加的热稳定性可通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域中的标准方法(参见，例如Sturtevant,1987,Annual Review of Physical Chemistry 38:463-488)来确定。变体相对于亲本增加的热稳定性可使用任何本领域中已知的对于具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的酶测定来确定。参见例如WO 2005/074647，WO 2008/148131WO 
2005/074656，WO 2010/065830，WO 2007/089290，WO 2009/085935，WO 2009/085859，WO 
2009/085864，WO 2009/085868和WO 2008/151043，其通过提述并入本文。或者，变体相对于亲本的增加的热稳定性可使用任何对于变体的实用测定法来确定，其中将变体的性能与亲本相比较。举例而言，可使用实施例12或 14中所述的实用测定法。
[0086] 在一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽的热稳定性比亲本至少 1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少25倍，和至少50倍更具热稳定性。
[0087] 具有增加的热稳定性的变体可或可不显示相对于亲本增加的热活性。例如，变体可具有相对于亲本在升高的温度温育之后改善的重新折叠的能力，但不具有增加的热活性。
[0088] 分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地从一种或多种或全部与其天然结合的天然存在的成分移除的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于见于自然界的该物质和经人力修饰的物质；或(4)任何经人力修饰而相对于与其自然结合的成分增加该物质的量的物质(例如，编码该物质的基因的多重拷贝；较与与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可存在于发酵液样品。
[0089] 低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、 200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的 Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS 在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0090] 成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸-21至-1是信号肽的SignalP 程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至229。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
[0091] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维素分解增强活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至859。在另一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至859中含有的cDNA序列。
[0092] 中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS 在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0093] 中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、 0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％ SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0094] 突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
[0095] 核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。
[0096] 可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
[0097] 亲本或亲本具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“亲本”或“亲本具有纤维素分解增强活性的多肽”意指一种具有纤维素分解增强活性的多肽，对其进行改变以产生本发明的变体。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽或其变体，或它们的片段。
[0098] 具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50 mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃和合适的pH，例如5.0或5.5历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS 中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的 2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的
1.5L(Novozymes A/S,  Denmark)的混合物作为纤维素分解
活性的来源。
[0099] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
[0100] 预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
[0101] 序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
[0102] 就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS 软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0、5.0.0版或更高版本的Needle 程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol. Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版) 取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
[0103] (同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
[0104] 就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS 软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,见上文)，优选3.0.0、5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的 EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用 -nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
[0105] (同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
[0106] 亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/ 或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的片段。在一个方面，所述亚序列含有SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列的至少600个核苷酸，例如至少630个核苷酸，或至少660个核苷酸。
[0107] 变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有纤维素分解增强活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维素分解增强活性至少20％，例如至少40％，至少 50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少100％。
[0108] 非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、 0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％ SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0109] 非常低严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS 在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0110] 含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)- 吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O- 甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和 D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖 (heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova 等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
[0111] 在本发明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
[0112] 木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和 Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food和Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006, Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova, Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal 321:375-381。
[0113] 总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal of Biotechnology 23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01％ X-100(4-(1,1,3,3-四
甲基丁基) 苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的 0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
[0114] 就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever,1972,A  new reaction for  colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem 47: 273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
[0115] 木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶 (1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM 磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0 微摩尔天青精。
[0116] 野生型多肽：术语“野生型多肽”意指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的具有纤维素分解增强活性的多肽。
[0117] 发明详述
[0118] 本发明涉及分离的多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置 75，77，179，181，和183的一个或多个(例如几个)位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
[0119] 变体命名规则：
[0120] 就本发明而言，使用公开于SEQ ID NO:2中的成熟多肽以确定在其它具有纤维素分解增强活性的多肽中对应的氨基酸残基。将其它具有纤维素分解增强活性的多肽的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:2中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch， 1970，J.Mol.Biol.48：443-453)(如用EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice 等，2000，Trends Genet 16:276-277)的Needle程序执行，优选为5.0.0版或之后的版本)确定SEQ ID NO:2所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和 EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵
[0121] 在另一个具有纤维素分解增强活性的多肽中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用数种计算机程序使用其各自的缺省参数进行的多个多肽序列的比对来确定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(根据log期望的多重序列比较，multiple sequence comparison by log-expectation；3.5版或之后的版本；Edgar, 2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)，MAFFT(6.857版或之后的版本； Katoh等,2005,Nucleic Acids Research 33:
511-518；Katoh和Toh,2007, Bioinformatics 23:372-374；Katoh等,2009,Methods in Molecular Biology 537: 39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)和采用ClustalW的 EMBOSS EMMA(1.83或之后；Thompson等,1994,Nucleic Acids Research 
22: 4673-4680)。
[0122] 当其它多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽歧异到传统的基于序列的比较无法检测出其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其它配对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25: 3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol. Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:
874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure 
prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为预测所查询序列(query sequence)的结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可接着用于生成所述多肽的同源性模型，且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
[0123] 对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering.11:739-747)进行比对，且这些算法的实施可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000, Bioinformatics 16:566-567)。
[0124] 在描述本发明的变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
[0125] 取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
[0126] 缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
[0127] 插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
[0128] 在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：
[0129]亲本: 变体:
195 195 195a 195b
G G-K-A
[0130] 多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。
[0131] 不同的改变。当可在一个位置引入不同的改变时，所述不同改变由逗号分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指下述变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
[0132] 变体
[0133] 本发明提供了变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77， 179，181和183的一个或多个(例如几个)位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
[0134] 在一个实施方案中，所述变体与具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少 87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少
91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少
99％，但少于100％的序列同一性。
[0135] 在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少 83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，如至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于100％的序列同一性。
[0136] 在一个方面，本发明的变体中取代的数量为1-5，如1，2，3，4，或5 个取代。
[0137] 在另一个方面，变体在对应于位置75，77，179，181，和183的一个或多个(例如几个)位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置75，77， 179，181，和183的两个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置 75，77，179，181，和183的三个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置75，77，179，181，和183的四个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于位置75，77，179，181，和183的每个位置包含取代。
[0138] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置75的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp， Tyr，或Val，优选用Val取代。在另一个方面，在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V。
[0139] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置77的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp， Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp， Tyr，或Val，优选用Leu取代。在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L。
[0140] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置179的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置179的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp， Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp， Tyr，或Val，优选用Ile取代。在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F179I。
[0141] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置181的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置181的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp， Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp， Tyr，或Val，优选用Leu取代。在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I181L。
[0142] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置183的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置183的位置的氨基酸用Ala，Arg，Asn，Asp， Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp， Tyr，或Val，优选用Val取代。在另一个方面，所述变体包含或组成为取代 SEQ ID NO:2的成熟多肽的I183V。
[0143] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75和77的位置的取代，如上述的那些。
[0144] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75和179的位置的取代，如上述的那些。
[0145] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75和181的位置的取代，如上述的那些。
[0146] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75和183的位置的取代，如上述的那些。
[0147] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77和179的位置的取代，如上述的那些。
[0148] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77和181的位置的取代，如上述的那些。
[0149] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77和183的位置的取代，如上述的那些。
[0150] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置179和181的位置的取代，如上述的那些。
[0151] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置179和183的位置的取代，如上述的那些。
[0152] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置181和183的位置的取代，如上述的那些。
[0153] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，和179的位置的取代，如上述的那些。
[0154] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，和181的位置的取代，如上述的那些。
[0155] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，和183的位置的取代，如上述的那些。
[0156] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，179，和181 的位置的取代，如上述的那些。
[0157] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，179，和183 的位置的取代，如上述的那些。
[0158] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，181，和183 的位置的取代，如上述的那些。
[0159] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77，179，和181 的位置的取代，如上述的那些。
[0160] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77，179，和183 的位置的取代，如上述的那些。
[0161] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置179，181，和183 的位置的取代，如上述的那些。
[0162] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77，181，和183 的位置的取代，如上述的那些。
[0163] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，179，和 181的位置的取代，如上述的那些。
[0164] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，179，181，和 183的位置的取代，如上述的那些。
[0165] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，181，和 183的位置的取代，如上述的那些。
[0166] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，179，和 183的位置的取代，如上述的那些。
[0167] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置77，179，181，和 183的位置的取代，如上述的那些。
[0168] 在另一个方面，所述变体包含或组成为在对应于位置75，77，179，181，和183的位置的取代，如上述的那些。
[0169] 在另一个方面，所述变体包含或组成为一个或多个(例如几个)选自下组的取代：I75V，F77L，F179I，I181L，和I183V。
[0170] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L。
[0171] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F179I。
[0172] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+I181L。
[0173] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+I183V。
[0174] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+F179I。
[0175] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+I181L。
[0176] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+I183V。
[0177] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F179I+I181L。
[0178] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F179I+I183V。
[0179] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I181L+I183V。
[0180] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+F179I。
[0181] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+I181L。
[0182] 在另一个方面，所述变体包含或组成为取SEQ ID NO:2的成熟多肽的代I75V+F77L+I183V。
[0183] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F179I+I181L。
[0184] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F179I+I183V。
[0185] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+I181L+I183V。
[0186] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+F179I+I181L。
[0187] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+F179I+I183V。
[0188] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F179I+I181L+I183V。
[0189] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+I181L+I183V。
[0190] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+F179I+I181L。
[0191] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F179I+I181L+I183V。
[0192] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+I181L+I183V。
[0193] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+F179I+I183V。
[0194] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 F77L+F179I+I181L+I183V。
[0195] 在另一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代 I75V+F77L+F179I+I181L+I183V。
[0196] 本发明的变体可进一步在一个或多个(例如几个)其它位置包含改变，例如缺失、插入和/或取代。
[0197] 氨基酸改变可为性质上较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope) 或结合域(binding domain)。
[0198] 保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
[0199] 或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
[0200] 能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法 (Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且就具有纤维素分解增强活性的多肽测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271: 4699-4708。具有纤维素分解增强活性的多肽的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol. 224:899-904；Wlodaver等,
1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也能够从与相关多肽的同一性分析来推断。
[0201] 所述变体可组成为200至220个氨基酸，例如205至220，210至220，和215至220个氨基酸。
[0202] 在一个实施方案中，所述变体具有增加的热活性。
[0203] 在一个实施方案中，所述变体具有增加的热稳定性。
[0204] 在一个实施方案中，所述变体具有增加的热活性和增加的热稳定性。
[0205] 亲本具有纤维素分解增强活性的多肽
[0206] 所述亲本具有纤维素分解增强活性的多肽可为(a)多肽，其与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60％序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)或(i)或(ii)的全长互补链；或(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其 cDNA序列具有至少60％序列同一性。
[0207] 在一个方面，所述亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少 83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少 96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的序列同一性，并具有纤维素分解增强活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
[0208] 在另一个方面，所述亲本包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个方面，所述亲本包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，所述亲本包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸22至250。
[0209] 在另一个方面，所述亲本为SEQ ID NO:2的成熟多肽含有至少200个氨基酸残基，例如至少210个氨基酸残基或至少220个氨基酸残基的片段。
[0210] 在另一个方面中，所述亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位变体。
[0211] 在第二个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii) 的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
[0212] SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少 400个核苷酸，至少
500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、
35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
[0213] 可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码亲本。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
[0214] 就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于下述：(i)SEQ ID NO:1，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(iii)其cDNA序列，(iv)其全长互补链，或(v)它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
[0215] 在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA 序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸64至859或其cDNA 序列。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽，其成熟多肽，或它们的片段的多核苷酸。在另一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO: 1或其cDNA序列。
[0216] 在另一个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1 的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至859。
[0217] 所述亲本可为杂合多肽，其中一个多肽的区域融合于另一个多肽的区域的N端或C端。
[0218] 所述亲本可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们处于符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583； Dawson等,1994,Science 266:776-779)。
[0219] 融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J. Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol. 63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503；和Contreras等,1991, Biotechnology 9:378-381；Eaton等,
1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie 等,1995,Biotechnology 13:982-987；
Carter等,1989,Proteins:Structure, Function,and Genetics 6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World 4: 35-48中的位点。
[0220] 所述亲本可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的亲本由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，所述亲本是胞外分泌的。
[0221] 所述亲本可以是具有纤维素分解增强活性的细菌多肽。例如，所述亲本可为革兰氏阳性细菌多肽例如具有纤维素分解增强活性的芽孢杆菌属  (Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属 (Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如具有纤维素分解增强活性的弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属  (Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
[0222] 在一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌 (Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌  (Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
[0223] 在另一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的似马链球菌 (Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌 (Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp. 
Zooepidemicus)多肽。
[0224] 在另一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的不产色链霉菌 (Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)多肽。
[0225] 所述亲本可为具有纤维素分解增强活性的真菌多肽。例如，所述亲本可为具有纤维素分解增强活性的酵母多肽如具有纤维素分解增强活性的假丝酵母属 (Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽。例如，所述亲本可为具有纤维素分解增强活性的丝状真菌多肽如具有纤维素分解增强活性的枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属  (Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、 Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属 (Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属  (Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属  (Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属 (Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属
(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属 (Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属 (Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
[0226] 在另一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的卡尔酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母
(Saccharomyces oviformis)多肽。
[0227] 在另一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的解纤维枝顶孢霉 (Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、 
Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢 (Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢 (Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium  torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉
(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、 Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉 (Trichoderma viride)多肽。
[0228] 在另一个方面，所述亲本是具有纤维素分解增强活性的烟曲霉多肽，例如包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽。
[0229] 可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect  and imperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
[0230] 这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen  und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心  (Centraalbureau Voor 
Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心
(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)。
[0231] 可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品鉴定和获得所述亲本。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA 或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
[0232] 变体的制备
[0233] 本发明还涉及用于获得具有纤维素分解增强活性的变体的方法，所述方法包括：(a)将在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77，179，181，和183的一个或多个(例如几个)位置将取代引入具有纤维素分解增强活性的亲本多肽，其中所述变体具有纤维素分解增强活性；和(b)回收所述变体。
[0234] 所述变体可使用本领域任何已知的任何诱变方法，如定位诱变、合成基因构建(synthetic gene  construction)、半合成基因构建(semi  synthetic gene construction)、随机诱变、改组(shuffling)等来制备。
[0235] 定位诱变是在编码亲本的多核苷酸上的一个或多个确定位点导入一个或多个(例如几个)突变的技术。
[0236] 定位诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定位诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行切割，然后将含有突变的寡核苷酸连接到所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末端能够彼此连接。参见，例如，Scherer和 Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；以及Barton等,1990, Nucleic Acids Res.18:7349-4966。
[0237] 定位诱变亦可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnol.19:773-776； Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。
[0238] 任何定位诱变方法可用于本发明。有许多可用的市售试剂盒可用于制备变体。
[0239] 合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等(2004，Nature 432:1050-1054)所述基于多通道微芯片(multiplex microchip-based)的技术，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在光可编程的(photo-programmable)微流芯片(microfluidic chip)上组装。
[0240] 可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/
06204)和区域定向诱变 (region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:
145；等,1988,DNA 7:127)。
[0241] 诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0242] 半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定位诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面而达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR 技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定位诱变引物扩增，还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR (non-error prone PCR)扩增。多核苷酸亚序列可随后进行改组。
[0243] 多核苷酸
[0244] 本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
[0245] 核酸构建体
[0246] 本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
[0247] 可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组 DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0248] 调控序列可为启动子，其由用于表达多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
[0249] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse 和Lereclus,1994,Molecular Microbiology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene 
69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因 (dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等, 1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific 
American,242:74-94中；和在 Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO 99/43835。
[0250] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉 TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria (WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei) 脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011,147。
[0251] 在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
[0252] 调控序列也可以是转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
[0253] 对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
[0254] 对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
[0255] 对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
[0256] 调控序列还可以是启动子下游和本发明的变体的编码序列上游的mRNA 稳定化区，其增加所述变体的表达。
[0257] 合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌 cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471)。
[0258] 调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的 mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
[0259] 对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
[0260] 对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
[0261] 调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与变体编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
[0262] 对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉 TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0263] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol. Cellular Biol.15:5983-5990描述。
[0264] 调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端相连的信号肽，并且指导所述变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述变体的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
[0265] 对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB  11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,
1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
[0266] 对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0267] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
[0268] 调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于变体N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原 (zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
[0269] 当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)变体 N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
[0270] 同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节序列包括lac、tac和 trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
[0271] 表达载体
[0272] 本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
[0273] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
[0274] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体 (minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段 (means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整 DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
[0275] 所述载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
[0276] 细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶， phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazole synthase)、amdS(乙酰胺酶)、 argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、 amdS、hph和pyrG基因。
[0277] 选择性标记可为WO 2010/039889中所述的双重选择性标记系统。在一个方面，所述双重选择性标记是hph-tk双重选择性标记系统。
[0278] 所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
[0279] 为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码变体的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000 碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0280] 为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子 (replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
[0281] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒 pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
[0282] 用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4, ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
[0283] 在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等, 1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
[0284] 可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
[0285] 用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
[0286] 宿主细胞
[0287] 本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码本发明的变体的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(例如几个)指导本发明变体的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码变体的基因及亲本的来源。
[0288] 宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
[0289] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
[0290] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
[0291] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
[0292] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
[0293] 可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau 和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如， Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 
6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler 和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。
可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,
1983,J.Mol.Biol.166: 557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16: 6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化、电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006, J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005, Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981, Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991, Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ. Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,
Microbiol.Rev.45: 409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
[0294] 宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
[0295] 宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门 (Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
[0296] 真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母 (ascosporogenous  yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母 
(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲 
(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,和Davenport  编,
Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
[0297] 酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母  (Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
[0298] 真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0299] 丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属 (Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
[0300] 例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌 (Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、 Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、 Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、 Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
[0301] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及 Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和 Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,  J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。
[0302] 产生方法
[0303] 本发明还涉及用于产生变体的方法，其包括：(a)在适于所述变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述变体。
[0304] 使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述变体的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果变体分泌到营养培养基中，该变体能够从所述培养基中直接回收。如果变体不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
[0305] 可以使用本领域已知的对于所述变体是特异性的方法来检测变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于测定变体的活性。
[0306] 变体可以通过本领域已知的方法回收。例如，变体可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了整个发酵液
[0307] 变体可以使用多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的变体，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编, VCH Publishers,New York,1989)。
[0308] 组合物
[0309] 本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。优选地，所述组合物富含此种变体。术语“富含”表明所述组合物的纤维素分解增强活性以例如至少1.1 的富集因子增加。
[0310] 所述组合物可包含本发明的变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如选自下组的一个或多个(几个)酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素 (expansin)、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0311] 所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。
[0312] 所述组合物可为发酵液配制物或细胞组合物，如本文中所述。因此，本发明亦涉及发酵液配制物和细胞组合物，其包含本发明的变体。在一些实施方案中，所述组合物是含有机酸的细胞杀灭的全培养液，杀灭的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。
[0313] 术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级或分级的内含物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含用过的培养基和例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和能成活的和/或不能成活的(viable and/or nonviable)微生物细胞。
[0314] 在一个实施方案中，所述发酵液配制物和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一个1-5碳的有机酸和/ 或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一个6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基缬草酸、苯乙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物。
[0315] 在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施方案中，从细胞杀灭的全培养液中移除所述杀灭的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些组分的组合物。
[0316] 所述发酵液配制物或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知的。
[0317] 所述细胞杀灭的全培养液或组合物可进一步包含一种或多种酶活性，如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、葡糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶酶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、果胶甲酰酯酶、β- 半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、阿魏酸酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶 (rhamnogalacturonan lyase)、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶 (rhamnogalacturonan acetyl esterase)、木半乳糖醛酸糖苷酶 (xylogalacturonosidase)、木半乳糖醛酸聚糖酶(xylogalacturonase)、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶、木质素过氧化物酶、锰依存性过氧化物酶、杂合过氧化物酶(其具有木质素过氧化物酶和锰依存性过氧化物酶的组合性质)、葡糖淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶和漆酶。
[0318] 在一个实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物包含纤维素分解酶，其包括但不限于(i)内切葡聚糖酶(EG)或1,4-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，其包括1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(亦称作纤维糊精酶)(EC 3.2.1.74)和1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH) (EC 3.2.1.91)，和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。
[0319] 所述细胞杀灭的全培养液或组合物可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级内含物。通常而言，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基和在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如纤维素酶和/或葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基，胞外酶，和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，在细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞可使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。
[0320] 如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
[0321] 本发明的全培养液配制物和细胞组合物可通过WO 90/15861或WO 2010/096673中描述的方法来产生。
[0322] 下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量和组合物使用的其它条件可给予本领域已知的方法来确定。
[0323] 用途
[0324] 本发明还涉及下述使用变体或其组合物的方法。
[0325] 本发明还涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在本发明的变体的存在下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法还包括回收已降解或转化的纤维素材料。所述纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可从不溶性纤维素材料使用任何本领域中公知的方法分离，如例如离心、过滤和/或重力沉降。
[0326] 本发明还涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的变体的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[0327] 本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(例如几种) 发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在本发明的变体的存在下用酶组合物糖化的。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。
[0328] 本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platform chemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
[0329] 根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规工艺完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。
[0330] 水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF 使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996, Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF 包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and 
development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF 在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd, L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66: 506-577)。在本文可以理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
[0331] 常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology 25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a  batch reactor process,Enz. 
Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol. Bioeng.25:53-
65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A. V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem. Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
[0332] 预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv. Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosic materials for  efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin. /Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18；Mosier 等,2005,Features of promising  technologies  for  pretreatment  of 
lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,
2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,
Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。
[0333] 纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调节/调理(conditioning)。
[0334] 常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。
[0335] 可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
[0336] 蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在 140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟， 1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,  Bioresource Technology  855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,
Appl.Microbiol. Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。
[0337] 化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。
[0338] 经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl. Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol. 113-
116:509-523；Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。
[0339] 在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,
Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
[0340] 还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
[0341] 用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从 1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等, 2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、 WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
[0342] 湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151； Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004, Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol. 81:1669-1677)。预处理优选以1-40％干物质，例如2-30％干物质，或5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
[0343] 湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
[0344] 氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli 等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol. Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141； Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物受切割。
[0345] 有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481； Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem. Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素和木质素。
[0346] 合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem and Biotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96: 673-
686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。
[0347] 在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200℃，例如165-190℃范围内的温度保持1至60分钟的时间。
[0348] 在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，例如20-70wt％或30-60wt％，如约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
[0349] 机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
[0350] 纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述结合：汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100 至400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约 100至300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
[0351] 因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
[0352] 生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C. E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial  conversion  of  lignocellulosic  biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994, Pretreating lignocellulosic biomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编, ACS Symposium Series 566,American Chemical Society,Washington,DC,第15 章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,
1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson  和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation  of 
lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-
331；和Vallander和Eriksson,1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv. Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
[0353] 糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将(例如经预处理的)纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明的变体的存在下进行。组合物的组分可以同时或顺序加入。
[0354] 酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶组分的活性，即对于酶组分最佳的条件下进行。水解可以以补料批式或连续的过程进行，其中将纤维素材料逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
[0355] 糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。
温度优选约25℃至约70℃，例如约 30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约pH 5.0至约pH 5.5的范围。干燥固体含量优选约5至约50wt％，例如约10至约40wt％，或20至约30wt％。
[0356] 酶组合物可包含任何可用于降解纤维素材料的蛋白。
[0357] 在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的蛋白：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽，半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
[0358] 在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶和一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。
[0359] 在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
[0360] 在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木质素分解酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是产生H2O2的酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素。
[0361] 在本发明的方法中，酶可在糖化，糖化和发酵，或发酵之前或之中添加。
[0362] 所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(例如几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(例如几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
[0363] 用于本发明方法中的酶可为任何适用于如例如发酵液配制物或细胞组合物，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
[0364] 具有本发明的酶和变体的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，纤维素分解和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素底物、纤维素底物的浓度、纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。
[0365] 在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶蛋白对于纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约 10mg，并且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
[0366] 在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的变体对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5 mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075 至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
[0367] 在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的变体对于纤维素分解酶蛋白的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1 至约0.5g，并且最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解酶蛋白。
[0368] 具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及任何可用于纤维素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽 (在本文中统称为具有酶活性的多肽)酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得的”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。
[0369] 具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属 (Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属 (Geobacillus)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、热酸菌属(Acidothermus)、 Thermobifidia或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属 (Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
[0370] 在一个方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
[0371] 在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
[0372] 在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
[0373] 具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、Chaetomidium、金孢子菌属、Claviceps、 Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽，其具有酶活性。
[0374] 在一个方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。
[0375] 在另一个方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、 Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
[0376] 还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
[0377] 酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达 (参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。
[0378] 在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如， CtecTM
(Novozymes A/S)、 CTec2(Novozymes A/S)、 CELLUCLAST (Novozymes A/S)、
NOVOZYMTM 188(Novozymes A/S)、 CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和 ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，  NL(DSM)、 S/L 
100(DSM)，ROHAMENTTM  7069W(   GmbH)，和 LDI(Dyadic 
International,Inc.)、  LBR(Dyadic International,Inc.)或
150L(Dyadic International, Inc.)。所述纤维素酶以固体的约0.001至
约5.0wt％，例如固体的0.025至约 4.0wt％，或固体的约0.005至约2.0wt％的有效量添加。
[0379] 可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；
Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
[0380] 可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene 45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665；SEQ ID NO:4)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene 63:11-22，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II； GENBANKTM登录号M19373；SEQ ID NO:6)；里氏木霉内切葡聚糖酶III (Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号 AB003694；SEQ ID NO:8)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994, Molecular TMMicrobiology 13:219-228；GENBANK 登录号Z33381；SEQ ID NO: 10)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research 18:5884)；川地曲霉(Aspergillus 
kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics 27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶 (Saarilahti等,1990,Gene 90:9-14)；尖TM
镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK 登录号 L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号 AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号 MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO:12)；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:14)；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶 (SEQ ID NO:16)；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:18)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:20)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:22)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7C 内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:24)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:26)；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO: 28)；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30)；以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:32； GENBANKTM登录号M15665)。上述的SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16， SEQ ID NO:
18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的内切葡聚糖酶分别由SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:
19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，和SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列编码。
[0381] 可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:34)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:36)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:38)；嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II (SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42)；土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A) (SEQ ID NO:44)；嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:46)；和嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:48)，烟曲霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:50)，和烟曲霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:52)。上述的SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:
42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50和 SEQ ID NO:52的纤维二糖水解酶分别由SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:
41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:51的成熟多肽编码序列编码。
[0382] 可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶 (SEQ ID NO:54)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:56)；巴西青霉IBT 20888β- 葡糖苷酶(SEQ ID NO:58)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:60)；和棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:62)。上述的SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，和SEQ ID NO:62的β-葡糖苷酶分别由SEQ ID NO: 53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，和SEQ ID NO:61的成熟多肽编码序列编码。
[0383] 其它可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括SEQ ID NO:64的米曲霉β- 葡糖苷酶变体融合蛋白或SEQ ID NO:66的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66的β-葡糖苷酶融合蛋白分别由SEQ ID NO:63和 SEQ ID NO:65编码。
[0384] 所述米曲霉β-葡糖苷酶可根据WO 2002/095014获得。烟曲霉β-葡糖苷酶可根据WO 2005/047499获得。巴西青霉β-葡糖苷酶可根据WO 2007/019442获得。黑曲霉β-葡糖苷酶可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275: 4973-4980获得。棘孢曲霉β-葡糖苷酶可根据Kawaguchi等,1996,Gene 173: 287-288获得。
[0385] 其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A., 1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem. J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。
[0386] 其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、 WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、 WO 2002/101078、WO 
2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、 WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 
2003/052118、WO 2004/016760、 WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 
2005/028636、 WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、 WO 
2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.5,457,
046、美国专利No.5,648,263以及美国专利No.5,686,593。
[0387] 在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽在根据 WO 2008/151043所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。
[0388] 在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液剂的存在下使用。
[0389] 所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’- 三羟基二苯甲酮；
顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
[0390] 所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色 离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素 (isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)； kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
[0391] 所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮； 5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)； 2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2- 酮；或它们的盐或溶剂合物。
[0392] 所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2- 苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤； 6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
[0393] 所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5- 甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2- 苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
[0394] 所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
[0395] 在一个方面此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素的糖单-6 -6 -6 -6 -6元的摩尔比例为约10 至约10，例如约10 至约7.5，约10 至约5，约10 至约2.5，约10 至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约 10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约
0.75μM 至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约
50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM 至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
[0396] 术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61 多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/ 或压力来处理木素纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液从剩余固体分离来产生。此类条件确定在通过纤维素酶制备物水解纤维素底物过程中，通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
[0397] 在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约 10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约 10-3至约10-2g每g纤维素。
[0398] 在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业性半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、 HTec(Novozymes A/S)、 Htec2(Novozymes A/S)、 (Novozymes  A/S)、 (Novozymes  A/S)、
HC(Novozymes  A/S)、 Xylanase(Genencor)、
XY(Genencor)、 XC(Genencor)、
TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000Xylanase(DSM)、DEPOLTM 333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、 DEPOLTM  740L(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOLTM 762P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)。
[0399] 可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉 (GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256；xyl 3SEQ ID NO:67[DNA序列]和SEQ ID NO:68[推导的氨基酸序列])、嗜松青霉(WO 2011/041405)、青霉属菌种(WO 2010/
126772)、土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/079210)和褐孢长毛盘菌GH10(WO 2011/057083)的木聚糖酶。
[0400] 可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458；SEQ ID NO:69[DNA序列]和SEQ ID NO:70[推导的氨基酸序列])、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的β-木糖苷酶(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的β-木糖苷酶(SwissProt登录号Q7SOW4)。
[0401] 可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉 (WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉 (Humicola insolens)DSM 1800(WO 2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina) (WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(Wo  2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号  q7s259)、颖枯壳针孢
(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)和土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/
042846)的乙酰木聚糖酯酶。
[0402] 可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于来自特异腐质霉 DSM 1800(WO 2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischer)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO 2009/127729) 和土生梭孢霉(WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。
[0403] 可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉 (Aspergillus niger)(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 
1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)和巨多孔菌(M. giganteus)(WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0404] 可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉 (Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号 Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus) (SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO 2010/014706)、橘灰青霉(WO 2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)和里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)的α-葡糖醛酸糖苷酶。
[0405] 用于本发明方法的具有酶活性的多肽可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure， L.(编)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.， Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。
[0406] 所述发酵可以是任何其结果为酶或蛋白表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵 (包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
[0407] 发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
[0408] 在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化) 和发酵可以是单独或同时的。
[0409] 在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
[0410] 术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
[0411] “发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖) 直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。
[0412] 可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl. Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
[0413] 能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
[0414] 以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母 (Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus) 的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物通过本领域已知方法可经遗传修饰而发酵戊糖。
[0415] 能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium  phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis， 1996，见上文)。
[0416] 其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candida sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.latic)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属 (Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株。
[0417] 在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母 (Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
[0418] 在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridium phytofermentans在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
[0419] 商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTM AFT和XR (NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA)，ETHANOL REDTM酵母(Red Star/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc.，USA)，FERMIOLTM(DSM Specialties)，GERT STRANDTM(Gert Strand AB，Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母 (Ethanol Technology，WI，USA)。
[0420] 在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0421] 通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem. Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ. Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation  by Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson 等，
1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1and TAL1genes encoding the  pentose  phosphate  pathway enzymes 
transketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper 等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle，FEMS Yeast Research 4:655-664； Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from  xylose and  other  sugars  by  recombinant Escherichia  coli，
Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998， Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58: 204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267:240-243；Deanda等，1996， Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering，
Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO 2003/062430， Xylose Isomerase)。
[0422] 在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
[0423] 本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
[0424] 通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96 小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约 32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，例如约pH 4-5、6或7。
[0425] 在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x 108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The  Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
[0426] 对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。
[0427] 发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore 等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
[0428] 发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、 1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
[0429] 在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.,和Tsao，G.T.，1999， Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg， Germany，65:207-241；Silveira，M.M.,和Jonas，R.，2002，The biotechnological  production  of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam，P.,和 Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute， Process Biochemistry 30(2):117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.， 2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6):595-603。
[0430] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
[0431] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
[0432] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
[0433] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.,和Margaritis， A.，2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4):501-515。
[0434] 在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如， Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science and Technology 36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methane production:Areview。
[0435] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
[0436] 在另一个优选的方面，所述发酵产物似乎酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
[0437] 在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.,和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass，Appl. Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
[0438] 在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。
[0439] 回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
[0440] 去污剂组合物
[0441] 本发明的具有纤维素分解增强活性的变体多肽可添加至去污剂组合物并因此成为其成分。
[0442] 本发明的去污剂组合物可配制为例如手洗或机洗洗衣去污剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加组合物，和漂洗添加的织物软化剂剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制为供手洗或机洗的洗碗/碟操作。
[0443] 在一个具体方面，本发明提供了包含本发明的变体多肽的去污剂添加剂。所述去污剂添加剂以及所述去污剂组合物可包含一种或多种(例如几种)酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。
[0444] 一般而言所选酶的性质应与选定的去污剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，且该酶应以有效量存在。
[0445] 纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259 的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
[0446] 特别合适的纤维素酶为具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例为描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299的那些。
[0447] 商业上可获得的纤维素酶包括CELLUZYMETM和CAREZYMETM (Novozymes A/S)、CLAZINASETM和PURADAX HATM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
[0448] 蛋白酶：所述蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌属的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，和描述于WO 89/06270和WO 94/25583的镰孢属蛋白酶。
[0449] 可用的蛋白酶的实例为描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116 和WO 98/34946的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：27、 36、57、76、87、97、
101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、 224、235和274。
[0450] 优选的商业上可获得的蛋白酶包括ALCALASETM，SAVINASETM， PRIMASETM，DURALASETM，ESPERASETM，和KANNASETM(Novozymes A/S)， MAXATASETM，MAXACALTM，MAXAPEMTM，PROPERASETM，PURAFECTTM， PURAFECT OXPTM，FN2TM，和FN3TM(Genencor International Inc.)。
[0451] 脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。可用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属嗜热霉属 (Thermomyces))，例如来自如描述于EP 258 068和EP 305 216的疏棉状腐质霉 (细毛嗜热霉(T.Lanuginosus))或来自如描述于WO 96/13580的特异腐质霉的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，萤光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等,1993,Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
[0452] 其他实例为那些描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/
04079和WO 97/07202的脂肪酶变体。
[0453] 优选的商业上可获得的脂肪酶包括LIPOLASETM和LIPOLASE ULTRATM (Novozymes A/S)。
[0454] 淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，从GB 1,296,839更具体描述的地衣芽孢杆菌的特别菌株获得。
[0455] 可用的淀粉酶的实例为描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873 和WO 97/43424的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：15、 23、105、106、124、
128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、 209、243、264、304、305、391、408和444。
[0456] 商业上可获得的淀粉酶为DURAMYLTM，TERMAMYLTM， FUNGAMYLTM和BANTM(Novozymes A/S)，RAPIDASETM和PURASTARTM (from Genencor International Inc.)。
[0457] 过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinerius)及其变体的过氧化物酶，如描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257的那些。
[0458] 商业上可获得的过氧化物酶包括GUARDZYMETM(Novozymes A/S)。
[0459] 所述去污剂酶可通过添加含有一种或多种(例如几种)酶的单独的附加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂而包含于去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可例如配制为颗粒、液体、浆料等等。优选的去污剂添加剂剂型为颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆料。
[0460] 无尘颗粒可例如如US 4,106,991和4,661,452中所公开而产生，并可任选地通过本领域已知方法涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；乙氧化脂族醇，其中所述醇含有 12至20个碳原子，且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流动床技术施用的形成薄膜的涂覆材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制备物可例如通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可根据EP 238,216中公开的方法制备。
[0461] 本发明的去污剂组合物可为任何便利的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体去污剂可为水性的，通常含有高至70％的水和0-30％的有机溶剂，或可为非水性的。
[0462] 所述去污剂组合物包含一种或多种(例如几种)表面活性剂，其可为非离子型包括半极性型和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。所述表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。
[0463] 当其中包含阴离子型表面活性剂时，所述去污剂通常含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐，α-烯基磺酸盐，烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)，醇乙氧基硫酸盐，仲烷磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基或烯基琥珀酸或皂类。
[0464] 当其中包含非离子型表面活性剂时，所述去污剂通常含有约0.2％至约 40％的非离子型表面活性剂如醇乙氧化物，壬基苯酚乙氧化物，烷基聚糖苷，烷基二甲基胺氧化物，乙氧化脂肪酸单乙醇胺，脂肪酸单乙醇胺，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
[0465] 所述去污剂可含有0-65％去污剂助洗剂或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(layered silicate)(例如来自Hoechst的SKS-6)。
[0466] 所述去污剂可包含一种或多种(例如几种)聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯基吡啶-N-氧化物，聚乙烯基咪唑，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，延胡索酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
[0467] 去污剂可含有漂白系统，其可包含H2O2源如过硼酸或过碳酸，其可与形成过酸的漂白增强剂如四乙酰基乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧基苯磺酸(酯/盐)(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，所述漂白系统可包含例如酰胺，酰亚胺或砜类型的过氧酸。
[0468] 可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的酶稳定化，所述稳定剂例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。
[0469] 所述去污剂还可含有其他常规的去污剂成分如例如织物调理剂(fabric conditioner)包括黏土、增泡剂(foam boosters)、抑泡剂(suds suppressors)、抗腐蚀剂(anti-corrosion agents)、悬污剂(soil-suspending agents)、抗污物再沉积剂 (anti-soil redeposition agents)、染料(dyes)、杀细菌剂(bactericides)、光学增亮剂(optical brighteners)、助水溶剂(hydrotropes)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors) 或香料(perfumes)。
[0470] 在去污剂组合物中，任何酶可以以对应于0.01-100mg酶蛋白每升洗液，优选0.05-5mg酶蛋白每升洗液，特别是0.1-1mg酶蛋白每升洗液的量添加。
[0471] 在去污剂组合物中，本发明具有纤维素分解增强活性的变体多肽可以以对应于0.001-100mg蛋白，优选0.005-50mg蛋白，更优选0.01-25mg蛋白，甚至更优选0.05-10mg蛋白，最优选0.05-5mg蛋白，且甚至更优选0.01-1mg 蛋白每升洗液的量添加。
[0472] 本发明具有纤维素分解增强活性的变体多肽亦可组入WO 97/07202(通过提述并入本文)中公开的去污剂配制物。
[0473] 植物
[0474] 本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述变体。变体可从植物或植物部分回收。或者，可以按原样(as such)将含有该变体的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
[0475] 转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
[0476] 双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的 (cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0477] 植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实 (fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮 (epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体 (chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚 (embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
[0478] 同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
[0479] 表达变体的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个(例如几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
[0480] 表达构建体便利地是包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
[0481] 调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达变体而确定。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiol.86:506所述。
[0482] 对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18: 675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子 (Edwards和Coruzzi,1990,
Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织 (metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24: 863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.Plant Physiol.152:708-
711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39: 935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka 等,1993,Plant Physiol.102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol. Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.Genet. 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
[0483] 启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码变体的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
[0484] 选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
[0485] 将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射 (microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244: 1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
[0486] 目前根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是产生转基因双子叶植物(为了参考，见Hooykas和Schilperoort, 1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)的优选方法，并可用于转化单子叶植物的方法，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant  J.2:275-281；Shimamoto,1994,
Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162；Vasil等, 1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。供依照本发明使用的其它转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和 7,151,204中的那些(两者均通过提述并入本文)。
[0487] 转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
[0488] 除了直接用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码变体的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依照本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。
此类步骤的非限制性实例进一步描述于美国专利7,151,204号。
[0489] 植物通过回交转化方法生成。举例而言，该植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。
[0490] 可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不 (otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。
[0491] 本发明亦涉及产生本发明的变体的方法，其包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码变体的多核苷酸；和(b)回收所述变体。
[0492] 通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。实施例
[0493] 培养基
[0494] 2X YT平板包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，15 g的Bacto Agar，和去离子水加至1升。
[0495] PDA平板包含39g的马铃薯右旋糖琼脂和去离子水加至1升。
[0496] MDU2BP培养基包含45g的麦芽糖，1g的MgSO4·7H2O，1g的NaCl， 2g的K2HSO4，12g的KH2PO4，2g的尿素，500μl的AMG痕量金属溶液，和去离子水加至1升；将pH调整至5.0，然后用0.22μm过滤单元过滤灭菌。
[0497] AMG痕量金属溶液包含14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O， 0.5g的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。
[0498] M410培养基包含50g的麦芽糖，50g的葡萄糖，2g的MgSO4·7H2O， 2g的KH2PO4，4g的无水柠檬酸粉末，8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g 的AMG痕量金属溶液，0.5g的CaCl2，和去离子水加至1升(pH 6.0)。
[0499] LB培养基包含10g的Bacto-胰蛋白胨。5g的酵母提取物，10g的氯化钠，和去离子水加至1升。
[0500] LB平板包含10g的Bacto-胰蛋白胨。5g的酵母提取物，10g的氯化钠， 15g的Bacto-琼脂，和去离子水加至1升。
[0501] YPG培养基包含4g的酵母提取物，1g的K2HPO4，0.5g的MgSO4，15.0 g的葡萄糖，和去离子水加至1升(pH 6.0)。
[0502] YPM培养基包含1％酵母提取物，2％蛋白胨，和2％麦芽糊精。
[0503] SC琼脂平板包含20g琼脂每升SC-URA培养基。
[0504] 含半乳糖的SC-URA培养基包含100ml的10X Basal盐，25ml的20％不含维生素的酪蛋白水解物，10ml的1％色氨酸，4ml的5％苏氨酸(经过滤灭菌，在高压灭菌之后添加)，和100ml的20％葡萄糖或100ml的20％半乳糖(经过滤灭菌，在高压灭菌之后添加)，和去离子水加至1升。
[0505] 10X Basal盐溶液包含75g的酵母氮基，113g的琥珀酸，68g的NaOH，和去离子水加至1升。
[0506] YP培养基包含10g酵母提取物，20g Bacto蛋白胨，和去离子水加至1升。
[0507] COVE盐溶液包含26g的KCl，26g的MgSO4·7H2O，76g的KH2PO4， 50ml的COVE痕量金属溶液，和去离子水加至1升。
[0508] COVE痕量金属溶液包含0.04g的NaB4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O， 1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，10g的 ZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升。
[0509] COVE平板包含342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，10ml的1.5M CsCl，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升。
[0510] COVE2平板包含30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升。
[0511] 木霉属痕量金属溶液包含216g的FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O， 27g的MnSO4·H2O，10g的CuSO4·5H2O，2.4g的H3BO3，336g的柠檬酸，和去离子水加至1升。
[0512] CIM培养基包含20g的纤维素，10g的玉米液冻干粉(corn steep solids)， 1.45g的(NH4)2SO4，2.08g的KH2PO4，0.28g的CaCl2，0.42g的MgSO4·7H2O， 0.42ml的木霉属痕量金属溶液，1-2滴消泡剂，和去离子水加至1升；将pH 调整至6.0。
[0513] 实施例1：具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的制备
[0514] 对烟曲霉部分基因组序列(The Institute for Genomic Research，Rockville， MD，USA)的tblastn检索(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402) 使用几种已知的GH61多肽，包括来自橙橘嗜热子囊菌的GH61A多肽 (GeneSeqP登录号AEC05922)作为查询序列(query)来进行。基于在氨基酸水平与查询序列的高水平的类似性，数个基因鉴定为推定的家族GH61同源物。选择一个大约850bp，与橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽在氨基酸水平具有高于 70％序列同一性基因组区进行进一步研究。
[0515] 烟曲霉NN051616如美国专利号7,244,605中所述生长并收获。将冻结的菌丝体用研钵和杵磨碎为精细粉末，并使用 Plant Maxi Kit (QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示分离基因组DNA。
[0516] 设计了下示的两个合成的寡核苷酸引物以从基因组DNA PCR扩增烟曲霉家族GH61B多肽基因。使用 Cloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)将片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO 2004/099228)，而无需进行限制性消化和连接。
[0517] 正向引物：
[0518] 5’-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3'(SEQ ID NO:71)
[0519] 反向引物：
[0520] 5’-TCACCTCTAGTTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAGGACCAG-3’(SEQ ID NO:72)
[0521] 粗体字母代表编码序列。剩余序列同源于pAlLo2的插入位点。
[0522] 使用五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应中，所述反应包含204ng 的烟曲霉基因组DNA，1X Pfx Amplification Buffer(Invitrogen Corp.，Carlsbad， CA，USA)，各1.5μl的10mM dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，2.5 单位的 Pfx DNA聚合酶
(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，和1μl的50mM MgSO4，最终体积为50μl。扩增使用
5333epgradient S(Eppendorf Scientific，
Inc.，Westbury， NY，USA)进行，其程序如下：1个循环，在94℃进行3分钟；和30个循环，每个在94℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟。然后将加热块维持在72℃15分钟，接着进行4℃浸泡循环。
[0523] 将反应产物通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠盐 (TAE)的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约850bp产物条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA， USA)根据生产商的指示进行纯化。
[0524] 然后将片段使用 Cloning Kit克隆入pAlLo2。将载体用Nco I 和Pac I消化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和 Gel Purification Kit
(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)纯化。将基因片段和消化的片段合并在一起进行反应，得到表达质粒pAG43，其中家族GH61B多肽基因的转录处于 NA2-tpi启动子的调控之下。NA2-tpi启动子是来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中其未翻译的前导序列被来自构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代。重组反应(20μl)包含1XBuffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X BSA(BD Biosciences，
Palo Alto，CA， USA)，1μl的 酶(稀释1:10)(BD Biosciences，Palo Alto，
CA，USA)， 166ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和110ng的烟曲霉GH61B多肽纯化的PCR产物。将反应物在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。将反应物用40μl的10mM Tris-
0.1M EDTA缓冲液稀释，并将2.5μl的稀释反应物用于转化大肠杆菌XL10
Gold感受态细胞(Stratagene，La Jolla， CA，USA)。含有pAG43(GH61B蛋白基因)的大肠杆菌转化体通过选择性酶消化进行鉴定，并使用 9600(QIAGEN  Inc.，
Valencia，CA，USA) 制备质粒DNA。
[0525] 862bp PCR片段的DNA测序用Applied Biosystems Model 377XL Automated DNA Sequencer(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和引物步移策略进行。使用下述载体特异性引物进行测序：
[0526] pAllo2 5Seq：5'-TGTCCCTTGTCGATGCG 3'(SEQ ID NO:73)
[0527] pAllo2 3Seq：5'-CACATGACTTGGCTTCC 3'(SEQ ID NO:74)
[0528] 审视核苷酸序列数据的品质，并将所有序列以PHRED/PHRAP软件 (University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助彼此进行比较。
[0529] 基于编码的蛋白对橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(GeneSeqP登录号 AEC05922)的类似性构建对于烟曲霉序列的基因模型。烟曲霉GH61B的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。基因组片段编码250个氨基酸的多肽，其由两个53和56bp的内含子打断。基因和成熟编码序列的的％G+C含量分别为53.9％和57％。使用SignalP软件程序 (Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测了21个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有229个氨基酸，其具有23.39kDa的预测分子量。
[0530] 米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6： 1419-1422的方法制备。将六μg的pAG43用于转化米曲霉JaL355。将二十六个转化体分离至单个PDA平板。
[0531] 将24个转化体的汇合的PDA平板各用5ml的0.01％ 20洗涤，并各自收集孢子。将八μl的各孢子储备分别添加至1ml的YPG，YPM，和M410 培养基24孔板中并在34℃温育。在3日温育之后，将来自四个转化体的7.5μl 的上清使用 无染色，8-
16％梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示进行分析。基于该凝胶，选择M410培养基作为最佳的培养基。在温育之后五日，将来自每个M410 培养的7.5μl的上清使用 无染色，8-16％梯度SDS-PAGE凝胶进行分
析。培养的SDS-PAGE概貌显示数个转化体具有大约25kDa的新的主要条带。
[0532] 将一个转化体(在PDA平板上生长)的汇合平板用5ml的0.01％ 20 洗涤，并接种入四个含有100ml的M410培养基的500ml Erlenmeyer烧瓶以生成培养液以供表征酶。在第5日收获这些烧瓶(300ml)，使用0.22μm EXPRESSTM Plus Membrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤，并在4℃储藏。
[0533] 将含有重组产生的具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的过滤的烧瓶培养液首先通过配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough， MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)进行浓缩，缓冲液交换入20mM Tris-HCl pH 8.0，然后使用HIGHLOADTM 26/60 SUPERDEXTM 75凝胶排阻柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)以750ml 的150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 8.0中的等张梯度进行纯化。基于 SDS-PAGE分析收集并汇集级分。使用Microplate BCATM Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA)确定蛋白浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0534] 实施例2：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的构建
[0535] 构建具有取代I75V，F77L，F179I，I181L，和I183V的具有纤维素分解增强活性的野生型烟曲霉GH61B多肽的变体。将来自质粒pAG43(实施例2)的野生型烟曲霉GH61B骨架作为起始模板，对其以数个单独步骤导入取代，生成中间体，直至获得具有最终目标氨基酸取代的下述质粒：pTH227(I75V+F77L+ F179I+I181L+I183V)。使用 XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene，La Jolla，CA，USA)通过PCR介导的反应生成突变，其中使用设计为具有目标变化的如表1所示的合成的寡核苷酸引物对以组入所需的取代。
[0536] 使用反向和正向引物对68337和68343和pAG43作为起始模板生成变体质粒pTH221。使用反向和正向引物对68335和68336以及变体质粒pTH221 作为起始模板来生成变体质粒pTH227。
[0537] 表1
[0538]
[0539]
[0540] 使用 9600制备所得的突变体质粒DNA，并将其使用3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)进行测序。
[0541] 实施例3：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V在米曲霉JaL250中的表达
[0542] 根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6:1419-1422的方法制备米曲霉JaL250(WO 99/61651)原生质体，并将其用5μg的pTH227(或作为对照的 pAllo2)进行转化。转化得到约20-25个转化体。然后将转化体孢子纯化至单个选择性PDA平板，并然后在含有
1ml的MDU2BP培养基的24孔培养平板中进行生长，并在34℃静态温育5日。在第5日收获培养液样品，并通过 8-16％Tris-glycine SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA) 进行分析。一旦来自每个孢子纯化的转化体的培养物汇合并形成孢子，通过将5ml的灭菌过滤的0.01％ 80(用玻璃蒸馏水稀释)施于每个PDA 平板的中央并使用
灭菌的涂布器将孢子涂布于溶液中来制备孢子储备。将来自对于每批通过SDS-PAGE鉴定为在预测的26kDa的分子量具有较深条带的最高生产转化体的孢子储备用于接种含有300ml的MDU2BP培养基的2升摇瓶。将摇瓶在34℃以220rpm搅拌温育5日。在温育之后，将培养液使用 0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)进行灭菌过滤以供纯化。根据对摇瓶培养液SDS-PAGE分析鉴定出的在26kDa具有最强条带的米曲霉菌株为TH168(烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V)。
[0543] 实施例4：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的纯化
[0544] 将重组产生的烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V 首先通过配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)进行浓缩，缓冲液交换入Tris-HCl pH 8.0，然后使用(自填充)75mlHigh Performance柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)用20mM 
Tris-HCl pH 8.0 中的800ml 0-600mM NaCl线性梯度进行纯化。收集级分，并基于SDS-PAGE 分析进行汇集。使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定蛋白浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0545] 实施例5：里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II的制备
[0546] 如下所述将里氏木霉家族GH5A内切葡聚糖酶II基因(SEQ ID NO:5 [DNA序列]和SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])克隆入米曲霉表达载体。
[0547] 设计如下所示的两个合成的寡核苷酸引物以从里氏木霉RutC30基因组 DNA PCR扩增内切葡聚糖酶II基因。使用 Plant Maxi Kit分离基因组DNA。使用IN-FUSIONTM PCR Cloning Kit将片段直接克隆入pAILo2 (WO 2004/099228)。
[0548] 正向引物：5’-ACTGGATTTACCATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCT-3’(SEQ ID NO:79)[0549] 反向引物：5’-TCACCTCTAGTTAATTAACTACTTTCTTGCGAGACACG-3’(SEQ ID NO:80)[0550] 粗体字母代表编码序列。剩余序列含有与pAlLo2的插入位点相比的序列同一性(WO 2004/099228)。
[0551] 将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，PCR反应包含200ng的里氏木霉基因组DNA，1X Pfx Amplification Buffer，6μl的10mM的dATP， dTTP，dGTP和dCTP混合物，2.5单位的 Pfx DNA聚合酶，和 1μl的50mM MgSO4，最终体积为50μl。将扩增反应在 5333(Eppendorf Scientific，Inc.，
Westbury，NY，USA) 中进行温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每个在94℃进行30秒，61℃进行30秒，和68℃进行1.5分钟。在35个循环之后，将反应在68℃温育10分钟，然后冷却至10℃。将1.5kb PCR反应产物在使用TAE缓冲液和0.1μg的溴乙锭每ml的0.8％ 琼脂糖凝胶 (Cambrex Bioproducts，Rutherford，NJ，USA)进行分离。在DARKREADERTM (Clare Chemical Research，Dolores，CO，USA)的协助下显影DNA片段。将 
1.5kb DNA条带用可丢弃的剃刀切出，并使用 DA旋转杯 (Millipore，
Billerica，MA，USA)根据生产商的指示纯化。
[0552] 将质粒pAlLo2通过用Nco I和Pac I的消化直链化。通过如上所述的凝胶过滤和超滤来纯化质粒片段。将纯化的PCR片段克隆入经直链化和纯化的 pAlLo2载体使用IN-FUSIONTM PCR Cloning Kit进行。反应(20μl)含有1X IN-FUSIONTM Buffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(稀释1:10)，100ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和100ng的里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II PCR产物。将反应物在室温温育30分钟。将2μl反应样品用于根据生产商的指示转化大肠杆菌XL10 Gold感受态细胞。在恢复期之后，将来自转化反应的两个100μl等分试样铺板于补充100μg氨苄青霉素每升的150 mm 2X YT平板。将平板在37℃温育过夜。将一组三个推定的重组克隆从选择平板回收，并使用
9600从每个平板制备质粒DNA。克隆通过Pci I/Bsp LU11I限制性消化进行分析。然后对一个具有预期的限制性消化样式的克隆进行测序以确认在克隆的插入物中无突变。选择克隆#3并命名为pAlLo27。
[0553] 米曲霉JaL250(WO 99/61651)原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法制备，并用5μg的pAlLo27(或作为对照的pAlLo2)转化。转化得到约50个转化体。将十一个转化体分离至单个PDA平板并在34℃温育5日。
[0554] 将汇合的孢子平板用3ml的0.01％ 80洗涤，并使用孢子悬液接种125ml玻璃烧瓶中的25ml的MDU2BP培养基。将转化体培养物在34 ℃以200rpm恒定振荡进行温育。
在接种后第五日，将培养物以6000x g离心，并收集其上清。将五微升的各上清与等体积的
2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，并加载于1.5mm 8％-16％Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUETM SafeStain(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)染色。培养液的SDS-PAGE概貌显示十一个转化体中的十个产生大约45kDa新的蛋白条带。将转化体编号
1，命名为米曲霉JaL250AlLo27，培养于发酵罐中。
[0555] 烧瓶培养基包含50g的蔗糖，10g的KH2PO4，0.5g的CaCl2，2g的 MgSO4·7H2O，2g的K2SO4，2g的尿素，10g的酵母提取物，2g的柠檬酸， 0.5ml的痕量金属溶液，和去离子水加至1升。痕量金属溶液包含13.8g的 FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·7H2O，8.5g的MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O， 3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。
[0556] 将一百ml的烧瓶培养基添加至500ml烧瓶。将烧瓶用两个来自PDA平板的米曲霉JaL250AlLo27的栓接种，并在34℃在定轨振荡器上以200rpm温育24小时。使用五十ml的烧瓶培养液接种3升发酵容器。
[0557] 发酵批次培养基包含10g的酵母提取物，24g的蔗糖，5g的(NH4)2SO4， 2g的KH2PO4，0.5g的CaCl2·2H2O，2g的MgSO4·7H2O，1g的柠檬酸，2g 的K2SO4，0.5ml的抑泡剂，0.5ml的痕量金属溶液，和去离子水加至1升。痕量金属溶液包含13.8g的FeSO4·7H2O，14.3g的ZnSO4·
7H2O，8.5g的 MnSO4·H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，3g的柠檬酸，和去离子水加至1升。发酵补料培养基包含麦芽糖。
[0558] 将总共1.8升的发酵批次培养基添加至Applikon Biotechnology三升玻璃夹套发酵器(glass jacketed fermentor)(Applikon Biotechnology，Inc.，Foster City，CA，USA)。将发酵补料培养基以0至4.4g/l/hr的速率剂量添加185 小时的时间。将发酵容器维持在34℃的温度，并使用Applikon 1030控制系统(Applikon Biotechnology，Inc.，Foster City，CA，USA)将pH控制在6.1+/- 0.1的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并通过在1100至1300rpm 旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。在发酵终止时，从容器收获全培养液，并以3000x g离心以去除生物质。将上清使用0.22μm EXPRESSTM Plus Membrane进行灭菌过滤，并储藏在4℃。
[0559] 将上清使用400ml SEPHADEXTM G25脱盐柱(GE Healthcare， Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示脱盐并缓冲液交换入20mM Tris-HCl pH 8.0。将经脱盐的里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II加载于MONOQTM HR 16/10离子交换柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)并用20mM Tris-HCl pH 8中的300ml线性0-300mM NaCl梯度来洗脱，并收集10ml级分。级分基于SDS-PAGE分析汇集。蛋白浓度使用Microplate BCATM Protein Assay Kit 确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0560] 实施例6：烟曲霉GH3A β-葡糖苷酶的制备
[0561] 烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:55[DNA序列]和SEQ ID NO:56[推导的氨基酸序列])根据美国专利号7,244,605制备。蛋白浓度使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0562] 实施例7：烟曲霉NN055679Cel7A纤维二糖水解酶I的制备
[0563] 对烟曲霉部分基因组序列(The Institute for Genome Research，Rockville， MD，USA)的tfasty检索(Pearson等，1997，Genomics 46:24-36)使用来自里氏木霉的Cel7纤维二糖水解酶蛋白序列(登录号P00725)作为查询序列来进行。基于在氨基酸水平与查询序列的高水平的类似性，数个基因鉴定为推定的家族GH7同源物。选择一个与检索序列具有显著同一性的基因组区进行进一步研究，并将相应基因命名为cel7A。
[0564] 设计了下示的两个合成的寡核苷酸引物以从WO 2005/047499中所述的烟曲霉的基因组DNA PCR扩增烟曲霉NN055679cel7A纤维二糖水解酶I基因(SEQ ID NO:49[DNA序列]和SEQ ID NO:50[推导的氨基酸序列])。
[0565] 正向引物：5'-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3'(SEQ ID NO:81)
[0566] 反向引物：5'-gggttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’(SEQ ID NO:82)
[0567] 大写字母代表编码序列。剩余序列分别在正向和反向序列中提供对于Sph I和Pac I的限制性内切核酸酶位点。使用这些引物，使用标准PCR方法扩增烟曲霉cel7A基因，并将反应产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用 Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA， USA)根据生产商的指示来纯化。
[0568] 用Sph I和Pac I消化片段，并根据标准步骤将其连接入亦用Sph I和Pac I消化的表达载体pAlLo2。将连接产物根据生产商的指示转化入大肠杆菌 XL10Gold感受态细胞。通过限制性消化检测出含有正确大小的质粒的大肠杆菌转化体，并使用
9600制备质粒DNA。来自该质粒的插入物的DNA测序用Perkin-Elmer 
Applied Biosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略进行。审视核苷酸序列数据的品质，并将所有序列在PHRED/PHRAP 软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下彼此比较。核苷酸序列显示为匹配通过TIGR确定的基因组序列(SEQ ID NO:49[DNA序列] 和SEQ ID NO:50[推导的氨基酸序列])。所得的质粒命名为pEJG93。
[0569] 米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法来制备，并用5μg的pEJG93(以及作为载体对照的pAlLo2)转化。转化得到100个转化体。将十个转化体分离至单个PDA平板。
[0570] 将十个转化体中的五个的汇合PDA平板用5ml的0.01％ 20 洗涤，并分别接种入125ml玻璃烧瓶中的25ml的MDU2BP培养基，并在 34℃，250rpm温育。在温育之后五日，将来自每个培养物的0.5μl的上清使用8-16％Tris-Glycine  SDS-PAGE凝胶
(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA) 根据生产商的指示来进行分析。培养物的SDS-PAGE概貌显示一个转化体具有大约70kDa的主要条带。将该转化体命名为米曲霉
JaL250EJG93。
[0571] 将一百ml的烧瓶培养基(实施例5)添加至500ml烧瓶。将烧瓶用来自 PDA平板的米曲霉JaL250EJG93的两个栓接种，并在34℃在定轨振荡器上以 200rpm温育24小时。使用五十ml的烧瓶培养液以接种3升发酵容器。
[0572] 将总共1.8升的发酵批次培养基(实施例5)添加至Applikon Biotechnology 三升玻璃夹套发酵罐。将发酵补料培养基(实施例5)以0至4.4g/l/hr的速率施用185小时的时间。将发酵容器维持在34℃的温度，并将pH使用Applikon 1030控制系统控制在6.1+/-0.1的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并将培养液通过在1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮来搅拌。在发酵终止时，将全培养液从容器收获，并以3000x g离心以去除生物质。将上清使用0.22μm EXPRESSTM Plus Membrane灭菌过滤，并储藏在4℃。
[0573] 将过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough， MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)浓缩并用 20mM Tris-HCl pH 8缓冲液交换，然后使用(自填充)75ml  High Performance柱(用20mM 
Tris-HCl pH 8.0中的750ml 0-600mM NaCl线性梯度)纯化，并收集10ml级分。将级分基于SDS-PAGE分析来汇集。蛋白浓度使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0574] 实施例8：烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II的制备
[0575] 烟曲霉NN055679纤维二糖水解酶II(CBHII)(SEQ ID NO:51[DNA序列] 和SEQ ID NO:52[推导的氨基酸序列])根据下述步骤制备。
[0576] 设计两个下示的合成的寡核苷酸引物以从基因组DNA PCR扩增烟曲霉家族6A糖基水解酶的全长开读框。使用 Cloning Kit(Invitrogen Corp.， Carlsbad，CA，USA)克隆PCR产物。使用IN-FUSIONTM Cloning Kit将片段克隆入pAILo2。
[0577] 正向引物：5’-ACTGGATTTACCATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’(SEQ ID NO:83)[0578] 反向引物：5’-TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGT-3’(SEQ ID NO:84)[0579] 粗体字母代表编码序列。剩余序列含有与pAlLo2插入位点相比的序列同一性。
[0580] 将五十皮摩尔的每个上述引物用于PCR反应，所述反应包含500ng的烟曲霉基因组DNA，1X ThermoPol Taq反应缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)，6μl的10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，0.1单位的Taq DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)，其最终体积为50μl。使用5333扩增片段，其程序为1个循环，在98℃进行2分钟；和35个循环，每个在96℃进行30秒，61℃进行30秒，和72℃进行2分钟。在35个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后冷却至
10℃直至进一步操作。为了去除Taq DNA 聚合酶产生的A-尾，将反应物在1单位的Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Corp.， Carlsbad，CA，USA)的存在下在68℃温育10分钟。
[0581] 将1.3kb PCR反应产物在使用TAE缓冲液和0.1μg的溴乙锭每ml的0.8％GTG-琼脂糖凝胶来分离。将DNA条带在DARK READERTM(Clare Chemical Research，Dolores，CO，USA)的协助下显影以避免UV-诱导的突变。将1.3kb DNA条带用可丢弃的剃刀切出，并用DA旋转杯根据生产商的指示来纯化。
[0582] 将纯化的1.3kb PCR产物克隆入 (Invitrogen Corp.， Carlsbad，CA，USA)。将二微升的纯化的PCR产物与1μl的2M氯化钠溶液和1μl的载体混合。将反应物在室温温育15分钟，然后使用2μl的反应物根
据生产商的指示转化大肠杆菌TOP10感受态细胞 (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)。
将每个转化反应的两个100微升的等分试样铺板于两个补充100μg的氨苄青霉素每ml的
150mm 2X YT平板上并在37℃温育过夜。
[0583] 使用八个重组菌落以接种含有补充100μg的氨苄青霉素每ml的3ml的 LB培养基的液体培养物。使用 9600从这些培养物制备质粒 DNA。克隆通过限制性消化来分析。将来自每个克隆的质粒DNA用Eco RI 消化，并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳来进行分析。八个克隆中的六个具有预期的限制性消化样式，并对克隆2，4，5，6，7和8进行测序以确认在克隆的插入物中无突变。对所示的5’和3’末端的序列分析表明克隆2，6和7 具有正确序列。选择这三个克隆以重新克隆入pAlLo2。将每个克隆的一微升等分试样与17μl的
1:10稀释0.1mM EDTA-10mM Tris pH 7.4混合并使用1 μl的该混合物以重新扩增烟曲霉糖基水解酶6A编码区。
[0584] 将五十皮摩尔的上述每个引物用于PCR反应，所述反应包含1μl的克隆 2，6和7的稀释混合物，1X Pfx Amplification Buffer，6μl的10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的混合物，2.5单位的 Pfx DNA聚合酶， 1μl的50mM MgSO4，最终浓度为50μl。使用5333扩增片段，其程序如下：1个循环，在98℃进
行2 分钟；和35个循环，每个在94℃进行30秒，61℃进行30秒，和68℃进行 1.5分钟。在35个循环之后，将反应物在68℃温育10分钟，然后冷却至10 ℃直至进一步操作。将1.3kb PCR反应产物在使用TAE缓冲液和0.1μg的溴乙锭每ml的0.8％GTG-琼脂糖凝胶来分离。将DNA条带TM
在DARK READER  Transilluminator的协助下显影以避免UV-诱导的突变。将1.3kb DNA条带用可丢弃的剃刀切出，并用 DA旋转杯根据生产商的指示来纯化。
[0585] 将载体pAlLo2通过用Nco I和Pac I消化来直链化。将片段通过如上所述的凝胶电泳和超滤来纯化。将纯化的PCR产物克隆入直链化和纯化的 pAlLo2载体用IN-FUSIONTM Cloning Kit进行。反应(20μl)包含1X IN-FUSIONTM Buffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(稀释1:10)，100ng 的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和50ng的烟曲霉GH6A纯化的PCR产物。将反应物在室温温育30分钟。使用反应物的2μl样品以根据生产商的指示来转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在恢复期之后，将来自转化反应的两个100μl等分试样铺板于补充100μg的氨苄青霉素每ml的150mm 2X YT 平板。将平板在37℃温育过夜。从选择平板随机选择一组八个推定的重组克隆，并从每个使用 9600制备质粒DNA。将克隆通过Pst I限制性消化来分析。八个克隆中的七个具有预期的选择性消化样式。然后对克隆 1，2和3进行测序以确认在克隆的插入物中无突变。选择克隆#2并命名为 pAlLo33。
[0586] 米曲霉JaL355原生质体根据Christensen等，1988，见上文的方法来制备，并用5μg的pAlLo33(以及作为载体对照的pAlLo2)带来转化。转化得到约 100个转化体。将十个转化体分离至单个PDA平板。
[0587] 将十个转化体中的五个的汇合PDA平板用5ml的0.01％ 20 洗涤并分别接种入125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基，并在34 ℃，250rpm温育。在温育之后五日，将来自每个培养物的0.5μl的上清使用 8-16％Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶
(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA) 根据生产商的指示进行分析。培养物的SDS-PAGE概貌显示一个转化体具有大约70kDa的主要条带。将该转化体命名为米曲霉JaL355AlLo33。
[0588] 将一百ml的摇瓶培养基(实施例5)添加至500ml烧瓶。将烧瓶用来自 PDA平板的米曲霉Jal355ALlo33的两个栓接种，并在34℃在定轨振荡器上在200rpm温育24小时。使用五十ml的烧瓶培养液以接种3升发酵容器。
[0589] 将总共1.8升的发酵批次培养基(实施例5)添加至Applikon Biotechnology 三升玻璃夹套发酵罐。将发酵补料培养基(实施例5)以0至4.4g/l/hr施用185 小时的时间。将发酵容器维持在34℃的温度，并将pH使用Applikon 1030控制系统控制在6.1+/-0.1的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并将培养液通过在1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮进行搅拌。在发酵终止时，从容器收获全培养液，并以3000x g离心以去除生物质。将上清使用0.22μm EXPRESSTM Plus Membrane灭菌过滤，并储藏于4℃。
[0590] 将培养液使用0.7μm玻璃过滤器GF/F(Whatman，Piscataway，NJ，USA) 过滤，然后使用0.22μm EXPRESSTM Plus Membrane过滤。将过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器浓缩(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)和用20mM Tris-HCl pH 8.0 缓冲液交换。
[0591] 将经脱盐的培养液加载于MONOQTM HR 16/10离子交换柱，并用20mM Tris-HCl pH 8中的300ml线性0-300mM NaCl梯度洗脱，并收集10ml级分。级分基于SDS-PAGE分析汇集。将汇集的级分调整至20mM Tris，pH 8.0中的1.2M(NH4)2SO4，然后施于75ml自行倾入的(self-poured)的PHENYL SEPHAROSETM 柱(GE Healthcare，
Piscataway， NJ，USA)，并用20mM Tris-HCl pH 8中的750ml线性1.2-0M(NH4)2SO4梯度进行洗脱，并收集10ml级分。将基于SDS-PAGE汇集的级分使用 10kDa MWCO离心浓
缩器(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA) 来浓缩。然后将浓缩的材料进一步使用HIGHLOADTM 26/60Superdex 75凝胶过滤柱以150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 8.0中的
200ml等张梯度来纯化。将级分收集并基于SDS-PAGE汇集，并使用 10kDa 
MWCO离心浓缩器浓缩。蛋白浓度使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0592] 实施例9：烟曲霉GH10木聚糖酶的制备
[0593] 根据WO  2006/078256使用米曲霉BECh2作为宿主来重组制备烟曲霉 NN055679GH10木聚糖酶(xyn3；SEQ ID NO:67[DNA序列]和SEQ ID NO: 68[推导的氨基酸序列])。
[0594] 将经过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough， MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)脱盐并用 25mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液交换。将经脱盐的材料施于400ml(手动倾入的 (hand-poured))Q-SEPHAROSETM Fast-FlowTM柱(GE Healthcare，Piscataway， NJ，USA)，用400ml 25mM Tris pH 8.5洗涤，并用25mM Tris pH 8.5中的1400 ml的0-600mM NaCl的线性梯度来洗脱，并收集10ml的级分。级分基于 SDS-PAGE汇集，并调整至1.5M(NH4)2SO4，20mM Tris pH 8.0，并施于75ml 自行倾入的PHENYL SEPHAROSETM 柱，用75ml 20mM 
Tris-HCl pH 8.0洗涤，并使用20mM Tris-HCl pH 8中的1500ml线性 1.5-0M(NH4)2SO4梯度洗脱，并收集10ml级分。将级分基于SDS-PAGE分析汇集，并使用配置有10kDa MWCO膜的
300ml搅拌室浓缩装置(stirred cell concentration device)(Millipore，Bedford，MA，USA)来浓缩，并脱盐入20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl。蛋白浓度使用Microplate TM
BCA  Protein Assay 用牛血清白蛋白作为蛋白标样来确定。
[0595] 实施例10：里氏木霉RutC30GH3β-木糖苷酶的制备
[0596] 里氏木霉RutC30β-木糖苷酶基因(SEQ ID NO:69[DNA序列]和SEQ ID NO:70[推导的氨基酸序列])通过使用Lambda XR  Library Construction Kit(Stratagene，La Jolla，CA，USA)根据生产商的指示筛选从里氏木霉RutC30基因组DNA制备的Lambda XR Library来分离。里氏木霉RutC30基因组DNA使用标准方法制备。
使用下示PCR引物扩增编码里氏木霉β-木糖苷酶的2300bp的DNA区段。
[0597] 正向引物：5’-gtgaataacgcagctcttctcg-3’(SEQ ID NO:85)
[0598] 反向引物：5’-ccttaattaattatgcgtcaggtgt-3’(SEQ ID NO:86)
[0599] 引物994768设计为从β-木糖苷酶起始位点之后的第一个碱基开始扩增，而引物994769设计为在5’端具有Pac I位点。
[0600] 将五十皮摩尔的上述每个引物用于PCR反应，所述反应包含50ng的来自Lamda Zap文库的质粒DNA，1μl的10mM dATP，dTTP，dGTP，和dCTP 的混合物，5μl的10XPfx DNA Polymerase Buffer，和1单位的 Pfx DNA聚合酶，最终体积为50μ
l。使用 5333扩增DNA片段，其程序如下：1个循环，
在95℃进行3分钟；和30个循环，每个在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72 ℃进行1分30秒。在30个循环之后，将反应在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步操作。
[0601] 2.3kb PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳来纯化，从凝胶切出，并使用 Gel Extraction Kit纯化。然后用Pac I消化 2.3kb PCR产物以便于插入pAlLo1(WO 2004/099228)。
[0602] 将pAlLo1载体用Nco I消化，然后使用T4DNA聚合酶(Roche Applied Science，Nutley，NJ，USA)根据生产商的指示填充。然后使用第二酶Pac I 来消化pAlLo1的5’端，并将反应物通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化以分离6.9kb载体片段。
[0603] 然后将2.3kbβ-木糖苷酶片段连接至6.9kb载体片段，并根据生产商的指示转化入大肠杆菌XL1-Blue Subcloning Competent Cells(Invitrogen Corp.， Carlsbad，CA，USA)。使用限制性消化分析筛选转化体以鉴定具有正确插入的那些。通过使用ABI 3700DNA Analyzer(Applied Biosystems，Foster City， CA，USA)和染料终止子化学(Giesecke等，1992见上文)的测序确认了新的表达载体pSaMe04。
[0604] 设计下示的两个合成寡核苷酸引物以从pSaMe04PCR扩增里氏木霉β- 木糖苷酶基因以构建木霉属表达载体。使用IN-FUSIONTM Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体pMJ09(WO 2005/056772)，无需选择性消化和连接。
[0605] TrBXYL-F(ID 064491)：
[0606] 5’-CGGACTGCGCACCATGGTGAATAACGCAGCTCT-3’(SEQ ID NO:87)
[0607] TrBXYL-R(ID 064492)：
[0608] 5’-TCGCCACGGAGCTTATTATGCGTCAGGTGTAGCAT-3’(SEQ ID NO:88)
[0609] 粗体字母代表编码序列。剩余序列与pMJ09的插入位点同源。
[0610] 将五十皮摩尔上述每个引物用于PCR反应，所述反应包含50ng的 pSaMe04，1μl的10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的混合物，5μl 的10X ACCUTAQTM DNA Polymerase Buffer(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO， USA)，和5单位的ACCUTAQTM DNA聚合酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，最终体积为50μl。使用 5333
以扩增PCR片段，其程序如下：1个循环，在95℃进行3分钟；和30个循环，每个在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72℃进行1分30秒。在30个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步操作。
[0611] 将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中将 1.2kb产物条带从凝胶切出，并使用 Gel Extraction Kit根据生产商的指示来纯化。
[0612] 然后将1.2kb片段使用IN-FUSIONTM Cloning Kit克隆入pMJ09。将载体用Nco I和Pac I消化，并通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳纯化。将基因片段和消化的载体连接在一起用于反应，得到表达载体pSaMe-TrBXYL，其中β- 木糖苷酶基因的转录在里氏木霉cbh1基因启动子的调控下。连接反应(50μl) 包含1X IN-FUSIONTMBuffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(稀释1:10)， 100ng用Nco I和Pac I消化的pMJ09，和100ng的里氏木霉β-木糖苷酶纯化的PCR产物。将反应在室温温育30分钟。使用一μl的反应物转化大肠杆菌 XL10Gold感受态细胞。含有pSaMe-TrBXYL的大肠杆菌转化体通过限制性酶消化
来检测，并使用 9600制备质粒DNA。对来自pSaMe-TrBXYL的里氏木霉β-木糖
苷酶基因的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略来进行。
[0613] 将质粒pSaMe-AaXYL构建为包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子和棘孢曲霉GH10木聚糖酶编码序列。
[0614] 对棘孢曲霉木聚糖酶的克隆遵循如H. 等，1994，Mol.Gen.Genet. 243：253-260中概述的总体克隆方案。
[0615] RNA从棘孢曲霉CBS 101.43菌丝体分离。多聚(A)+RNA从总RNA通过对寡聚(dT)-纤维素的层析来分离。双链cDNA如Maniatis等(Molecular cloning：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982)中所述来分离。在合成之后，将cDNA用绿豆核酸酶处理，用T4DNA聚合酶平端化，并连接于非回文的Bst XI将汇集的级分接头(Invitrogen Corp.，Carlsbad， CA，USA)。将cDNA通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，其中将600bp至4000bp范围的片段用于文库构建。将DNA在GAL1 启动子和异-1-细胞色素c终止子之间连接入Bst XI-消化的pYES 2.0 (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，并转化入大肠杆菌MC1061细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。将文库铺板于LB平板，并在37℃温育过夜。将菌落从平板刮去并重悬于补充100μg氨苄青霉素每ml的LB培养基。质粒DNA使用Plasmid Midi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离。汇集纯化的质粒DNA。
[0616] 将纯化的质粒DNA混合物转化入酿酒酵母W3124细胞(MATa；ura 3-52； leu 2-3，112；his 3-D200；pep 4-1137；prcl::HIS3；prbl:：LEU2；cir+；van den Hazel等，1992，Eur.J.Biochem.207：277-283)。培养、转化和培养基如Guthrie  等，1991，
Meth.Enzymol.Vol 194，Academic Press所述。将转化的细胞在30 ℃铺板于含有2％葡萄糖的合成完全琼脂3日。在3日之后，将菌落复制铺板至含2％半乳糖的SC琼脂平板，并在30℃温育4日。表达木聚糖酶的菌落使用在pH 4.5覆盖0.1％AZCL-桦木-木聚糖的1％琼脂糖(
2006，FEMS Microbiology Reviews 21：29-42)来鉴定。表达木聚糖酶活性的菌
落被蓝色区包围。从阳性克隆回收的质粒DNA，含有大约1.3kb的DNA插入物。对分离的基因片段的测序揭示了1218bp的开读框，其编码具有43.0kDa的理论分子量的多肽。将cDNA片段亚克隆入用Bam HI和Xho I消化的曲霉属表达载体pHD464( 和Heldt-Hansen，
1994，Mol.Gen.Genet.243，253–260)，即用Bam HI和Xho I消化所述克隆并分离1.2kb cDNA插入物(Christgau等， 1996，Biochem.J.319：705-712)以生成质粒pA2X2。
[0617] 将棘孢曲霉GH10木聚糖酶编码序列使用作为模板的质粒pA2x2和下示的引物153505和153506使用标准方法进行PCR扩增以得到大约1.2kb片段。将1.2kb片段用Bam HI和Xho I消化(导入PCR引物)并克隆入载体pCaHj527 (WO 2004/099228)。所得的质粒命名为pMT2155，其中cDNA处于来自黑曲霉的中性淀粉酶II(NA2)启动子和来自黑曲霉的AMG终止子的转录调控下。
[0618] 引物153505：
[0619] 5’-TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3’(SEQ ID NO:89)
[0620] 引物153506：
[0621] 5’-TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3’(SEQ ID NO:90)
[0622] 设计下示的两个合成寡核苷酸引物以从质粒pMT2155来PCR扩增棘孢曲霉GH10基因，并将用于插入的侧翼序列导入表达载体pMJ09(WO 2005/056772)。粗体字母代表编码序列，而剩余序列同源于pMJ09的插入位点。
[0623] 正向引物：5’-cggactgcgcaccatggtcggactgctttcaat-3’(SEQ ID NO:91)[0624] 反向引物：5’-tcgccacggagcttatcacagacactgcgagtaat-3’(SEQ ID NO:92)[0625] 将五十皮摩尔的上述每个引物用于PCR反应，所述反应组成为50ng的 pMT2155，1μl的10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP的混合物，5μl 的10X ACCUTAQTM DNA Polymerase Buffer，和5单位的ACCUTAQTM DNA 聚合酶，最终体积为50μl。使用5333 扩增DNA片段，其程序如下：1个循环，在95℃进行3分钟；和30
个循环，每个在94℃进行45秒，55℃进行60秒，和72℃进行1分30秒。在30个循环之后，将反应物在72℃温育10分钟，然后冷却至4℃直至进一步操作。
[0626] 将反应产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将1.2 kb产物条带从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit根据生产商的指示进行纯化。
[0627] 然后将片段使用IN-FUSIONTM Cloning Kit克隆入pMJ09。将载体用Nco I和Pac I消化并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将1.2kb基因片段和消化的载体连接在一起用于反应，得到表达质粒pSaMe-AaXYL，其中家族GH10 基因的转化处于里氏木霉cbh1启动子的调控下。连接反应物(50ul)包含1X IN-FUSIONTM Buffer，1X BSA，1μl的IN-FUSIONTM酶(稀释1:10)，100ng 用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和100ng的棘孢曲霉GH10木聚糖酶纯化的PCR产物。将反应物在室温温育30分钟。使用一μl的反应物以根据生产商的指示转化大肠杆菌XL10 Gold感受态细胞。含有 pSaMe-AaGH10的大肠杆菌转化体通过限制性酶消化来检测，并使用 9600制备质粒DNA。对来自pSaMe-AaXYL的棘孢
曲霉GH10 基因的DNA测序使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上文)和引物步移策略进行。
[0628] 将编码棘孢曲霉GH10内切葡聚糖酶的质粒pSaMe-AaXYL和编码里氏木霉β-木糖苷酶的pSaMe-TrBXYL通过PEG介导的转化(Penttila等，1987， Gene 61 155-164)共转化入里氏木霉RutC30以生成里氏木霉菌株 SaMe-BXX13。每个质粒含有构巢曲霉amdS基因以使得转化体能够以乙酰胺作为唯一氮源生长。
[0629] 里氏木霉RutC30在27℃和90rpm在25ml的补充2％(w/v)葡萄糖和 10mM尿苷的YP培养基中培养17小时。将菌丝体通过使用Vacuum Driven Disposable Filtration System(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤收集并用去离子水洗涤两次和用1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体通过将经洗涤的菌丝体悬于20ml的含有15mg每ml的GLUCANEXTM(Novozymes A/S， Bagsvaerd，Denmark)和0.36单位每ml的壳多糖酶(Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO，USA)的1.2M山梨醇并在34℃以90rpm的轻柔振荡温育15-25 分钟来产生。原生质体通过在
400x g离心7分钟并用冷的1.2M山梨醇洗涤两次来收集。原生质体使用血细胞计数器计数，并重悬于STC中至1X 108个原生质体每ml的最终浓度。将过量原生质体储藏于在-80℃的Cryo 1℃ Freezing Container(Nalgene，Rochester，NY，USA)。
[0630] 将大约4μg的质粒pSaMe-AaXYL和pSaMe-TRBXYL用Pme I消化并添加至100μl的原生质体溶液，并轻柔地混合，接着加入250μl的10mM CaCl2-10mM Tris-HCl pH 7.5-60％PEG 4000，混合，并在室温温育30分钟。然后添加STC(3ml)并混合，并将转化溶液铺板于使用构巢曲霉amdS选择的 COVE平板。将平板在28℃温育5-7日。将转化体亚克隆在COVE2平板上并在28℃生长。
[0631] 将超过40个转化体亚克隆在含有乙酰胺的新鲜平板上，并允许在28℃使孢子形成7日。
[0632] 将里氏木霉转化体在含有25ml的pH 6.0的CIM培养基的125ml带挡板的摇瓶中培养，即接种转化体的孢子并在28℃和200rpm温育7日。将里氏木霉RutC30作为对照运行。在第5日去除培养液样品。将一ml的每个培养液在微离心机中以15,700x g离心5分钟，并将上清转移至新管。
[0633] SDS-PAGE使用具有 System(Bio-Rad Laboratories，Inc.， Hercules，CA，USA)的 Tris-HCl(5％溶解)凝胶进行。将五μl 的第7日上清
(见上)悬于2X浓缩的Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)，并在5％β-巯基乙醇的存在下煮沸 3分钟。将上清样品加载于聚丙烯酰胺凝胶上，并对其进行用1X Tris/Glycine/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA， USA)的电泳。将所得的凝胶用BIO-SAFETM Coomassie Stain染色。基于蛋白凝胶显示最高的棘孢曲霉GH10木聚糖酶和里氏木霉β-木糖苷酶表达的转化体命名为里氏木霉SaMe-BXX13。
[0634] 将里氏木霉SaMe-BXX13在含有250ml的pH 6.0的CIM培养基的500ml 带挡板的烧瓶中培养，所述培养基用里氏木霉SaMe-BXX13的孢子接种。将烧瓶在28℃以200rpm温育五TM日。然后使用0.22μm EXPRESS  Plus Membrane过滤培养液。
[0635] 将经过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron， Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA， USA)浓缩和用乙酸缓冲液交换至pH 4.0。将样品加载于在50mM乙酸钠pH 4.0中平衡的SP 柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上，用0-1000mM氯化钠的梯度洗脱结合的蛋白质。将级分使用切线流浓缩器缓冲液交换至20mM磷酸钠pH 7.0并施于用1.5M(NH4)2SO4-20mM磷酸钠 pH 7.0平衡的PHENYL SUPEROSETM HR 16/10柱(GE Healthcare，Piscataway， NJ，USA)。将结合的蛋白质用在20柱体积中20mM Tris-HCl pH 7.0中从1.5 至0M(NH4)2SO4的线性梯度进行洗脱。将蛋白积分使用切线流浓缩器缓冲液交换至20mM TEA HCl pH 7.5。将样品施于在20mM TEA HCl pH 7.5中平衡的MONOQTM HR 16/10离子交换柱，结合的蛋白质用0-300mM氯化钠的梯度洗脱。最终蛋白级分的缓冲液为20mM TEA-100mM氯化钠pH 7.5。蛋白浓度使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
[0636] 实施例11：磷酸溶胀的纤维素的制备
[0637] 磷酸溶胀的纤维素(PASC)从 PH101(FMC，Philadelphia，PA， USA)使用Zhang等，2006，Biomacromolecules 7:644-648描述的实验方案来制备。
[0638] 实施例12：磷酸溶胀的纤维素(PASC)的水解测定
[0639] 将如实施例11中所述制备的PASC的1.0％浆料通过振荡充分重悬，并迅速转移至100ml烧杯，并用磁性搅拌棒迅速搅拌。将1.0％PASC浆料的五百μl等分试样使用具有宽开口的尖的1000μl微移液管(尖末端从基部约2mm 处切去)移液入2.0ml 96深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)的孔中。然后将一百μl的10mM MnSO4-500mM乙酸钠pH 5添加至每个孔。将二百μl 的去离子水或1.0％连苯三酚(w/w)(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，Mo， USA)溶液添加至每个孔中。制备酶混合物，然后将其以200μl的体积同时添加至所有孔中，使每个反应总体积为1ml。然后使用ALPS 300TM平板密封器(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封平板，充分混合，并在50℃或65℃温育大约3日。所有报道的实验一式三份进行。
[0640] 对于水解反应的初步分析使用配置有AMINEXTM  HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)的具有 软件(Agilent 
Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)的 1100HPLC(Agilent 
Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)来进行。在大约4日之后，将深孔板从培养箱移除，并冷却过夜至4℃。然后将平板通过倒置混合均匀，并在 RT7离心机中以
52x g短暂地离心10秒。然后将样品通过移液混合，并将来自每个孔的200μl转移至HV(Millipore， Bedford，MA，USA)离心过滤板装置。将离心过滤板装
置在 RT7 离心机中以2000rpm离心20分钟。将滤过物转移至96孔自动取样器
平板，并用5mM H2SO4 1:1稀释，用硅密封垫密封，并插入HPLC插入器模块(设为4℃)以供将
20μl注入连接于4.6x 250mm HPX-87H柱的 CATION HTM保护柱上，接着用5mM 
H2SO4中的0.05％w/w苯甲酸洗脱。糖通过折射率检测来检测，其中通过与纯化的糖标样相比的积分来定量。
[0641] 所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft， Richland，WA，USA)进行。将测得的葡萄糖浓度就合适的稀释系数进行调整。在此测定中，仅测量葡萄糖，因为β-葡糖苷酶以高水平存在于所有除对照外的样品中。百分比相对转化使用下述方程计算：
[0642] ％转化＝[样品葡萄糖浓度]/[限制消化的葡萄糖浓度]x 100
[0643] 为了计算％转化，基于100mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素  (CELLUCLAST PLUSTM，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)的纤维素酶对照来设定100％转化点，并将所有值除以该数值并乘以100。将一式三份数据点取平均值，并计算标准偏差。
[0644] 实施例13：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的添加对烟曲霉β-葡糖苷酶在50℃和65℃在连苯三酚存在下转化磷酸溶胀的纤维素的作用
[0645] 对烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体L90V I75V+F77L+ F179I+I181L+I183V评估其在连苯三酚存在下增强烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶水解磷酸溶胀的纤维素的能力。磷酸溶胀的纤维素水解测定如实施例12中所述进行。
[0646] 连苯三酚(0.2％w/w)和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(5mg蛋白每g纤维素) 的组合；(0.2％w/w)连苯三酚，烟曲霉GH61B野生型多肽(10mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(5mg蛋白每g纤维素)的组合；以及连苯三酚(0.2％w/w)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V (10mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(5mg蛋白每g纤维素) 的组合对磷酸溶胀的纤维素(0.5％w/w)的转化根据实施例12中所述的测定来确定。在50℃或65℃温育72小时之后，如实施例12中所述收集并分析数据。数据示于图1。
[0647] 连苯三酚(0.2％w/w)和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(5mg蛋白每g纤维素) 的组合导致磷酸溶胀的纤维素的转化在50℃和65℃分别为2.1±0.3％和2.2± 1.0％。将烟曲霉GH61B野生型多肽(10mg蛋白每g纤维素)添加至连苯三酚 (0.2％w/w)和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(5mg蛋白每g纤维素)的组合导致磷酸溶胀的纤维素的转化在50℃和65℃分别为23.8±0.6％和16.8±0.4％。将烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(10mg蛋白每g纤维素)添加至连苯三酚(0.2％w/w)和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(5mg蛋白每g 纤维素)的组合导致磷酸溶胀的纤维素的转化在50℃和65℃分别为29.0± 1.0％和21.1±
0.3％。
[0648] 实施例14：经预处理的玉米秸秆水解测定
[0649] 玉米秸秆在U.S.Department of  Energy National Renewable Energy Laboratory(NREL)使用1.4wt％硫酸在165℃和107psi处理8分钟。在经预处理的玉米秸秆中的水不溶性固体含有大约59％纤维素，5％半纤维素和28％木质素。纤维素和半纤维素通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL Standard Analytical Procedure#002的高效液相色谱分析糖来确定。木质素在用硫酸使用NREL Standard Analytical Procedure#003水解纤维素和半纤维素级分之后通过重量分析法来确定。
[0650] PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)以1.0ml的总反应体积来进行。水解用含有1mM硫酸锰和多种蛋白加载的纤维素酶组合物 (表示为mg蛋白每克纤维素)的50mg PCS每ml 50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液来进行。制备酶混合物，并以100μl的体积同时添加至所有孔，在每个反应中得到1ml的终体积。然后将平板使用ALPS-300TM平板热密封器来密封，充分混合，并在50℃，55℃，60℃和/或65℃温育72小时。所有实验进行一式三次。
[0651] 在水解之后，将样品使用0.45μm 96孔过滤板(Millipore， Bedford，MA，USA)来过滤，并如上所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将经过滤的糖等分试样冷冻在-20℃。稀释于0.005M H2SO4中的样品的糖浓度使用4.6x  250mmHPX-87H柱来测量，即在65℃以0.6ml 每分钟的流速用0.05％w/w苯甲酸-
0.005M H2SO4洗脱，并通过积分来自折射率检测(
1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)的葡萄糖和纤维二糖信号(通过醇糖样品校正)来进行定量。使用所得的当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。
[0652] 所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCELTM软件进行。就合适的稀释因子调整测得的糖浓度。分别测量葡萄糖和纤维二糖。然而，为了计算总转化率，将葡萄糖和纤维二糖值合并。将纤维二糖浓度乘以1.053以转化为葡萄糖当量，并添加至葡萄糖浓度。纤维素转化的程度使用下述方程来计算：
[0653] ％转化＝[样品葡萄糖浓度]/[限制消化中的葡萄糖浓度]x 100
[0654] 为了计算％转化，基于100mg纤维素酶转化为每克纤维素 (CELLUCLAST PLUSTM，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)的纤维素酶对照来设定100％转化点，并将所有值除以该值，后乘以100。对一式三份的数据点取平均值，并计算标准偏差。
[0655] 实施例15：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的添加对在50℃和55℃里氏木霉纤维素酶转化为和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶转化PCS的作用
[0656] 根据如下所述的发酵实验方案来制备来自里氏木霉菌株981-O-8(D4)的纤维素酶组合物。里氏木霉菌株981-O-8(D4)是里氏木霉RutC30(ATCC 56765；Montenecourt和Eveleigh，1979，Adv.Chem.Ser.181：289-301)的诱变株。纤维素酶组合物类似于CELLUCLAST(Novozymes A/S，Bagsvaerd， Denmark)。向纤维素酶组合物补充烟曲霉β-葡糖苷酶。在实施例中，补充烟曲霉β-葡糖苷酶的纤维素酶组合物命名为“里氏木霉纤维素酶组合物”。
[0657] 烧瓶培养基包含20g的右旋糖，10g的玉米液冻干粉，1.45g的 (NH4)2SO4，2.08g的KH2PO4，0.36g的CaCl2，0.42g的MgSO4·7H2O，0.42 ml的痕量金属溶液，和去离子水加至1升。痕量金属溶液包含216g的 FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O，27g的MnSO4·H2O，10g的CuSO4·5H2O， 2.4g的H3BO3，336g的柠檬酸，和去离子水加至1升。
[0658] 将一百ml的烧瓶培养基添加至500ml烧瓶。用两个来自固体平板培养的栓来接种烧瓶，并在28℃在定轨振荡器上以200rpm温育48小时。使用五十ml的烧瓶培养液来接种2升发酵容器。
[0659] 发酵批次培养基包含30g的纤维素，4g的右旋糖，10g的玉米液冻干粉，3.8g的(NH4)2SO4，2.8g的KH2PO4，2.64g的CaCl2，1.63g的MgSO4.7H2O， 1.8ml的消泡剂，0.66ml的痕量金属溶液，和去离子水加至1升。痕量金属溶液包含216g的FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O，27g的MnSO4·H2O， 10g的CuSO4·5H2O，2.4g的H3BO3，336g的柠檬酸，和去离子水加至1升。发酵补料培养基包含右旋糖。
[0660] 将总共1.8升的发酵批次培养基添加至Applikon Biotechnology三升玻璃夹套发酵罐。发酵补料培养基以0至4g/l/hr的速率给料185小时的时间。将发酵容器维持在28℃的温度，并将pH使用Applikon 1030控制系统控制在4.5+/-0.1 的设定点。将空气以1vvm的速率添加至容器，并将培养液通过在1100至1300 rpm旋转的Rushton叶轮进行搅拌。在发酵终止时，从容器收获全培养液，并以3000x g离心以去除生物质。将上清灭菌过滤并储藏在5至10℃。
[0661] 对烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I +I181L+I183V评估其增强里氏木霉纤维素酶组合物和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合在50℃或55℃水解PCS的能力。PCS水解测定法如实施例14 中所述进行。
[0662] 里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.3mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.45mg蛋白每 g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽 (0.6mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；木霉属纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B 野生型多肽(0.75mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg 蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.3mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L +F179I+I181L+I183V(0.45mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合；里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.6 mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素) 的组合；和里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B 变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.75mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合对PCS的转化根据实施例15确定。在50℃或55℃温育72小时之后，如实施例15中所述收集并分析数据。对于50℃和55℃的结果分别示于图2A和2B。
[0663] 里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致53.5±0.2％和 52.2±0.3％的PCS转化。
[0664] 里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.3mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每 g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致62.6±0.1％和61.5±0.4％的PCS的转化。里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.45mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致64.3±0.1％和63.4±0.1％的 PCS的转化。
[0665] 里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.6mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每 g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致65.0±0.5％和64.5±0.6％的PCS的转化。里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B野生型多肽(0.75mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致66.4±0.2％和66.1±0.4％的 PCS的转化。
[0666] 里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体 I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.3mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉 CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致 63.3±0.3％和62.3±0.4％的PCS的转化。里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg 蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V (0.45mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致65.0±0.2％和64.5±0.2％的PCS的转化。里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V +F77L+F179I+I181L+I183V(0.6mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ- 葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致65.7±0.2％和65.7±0.5％的PCS的转化。里氏木霉纤维素酶组合物(2.7mg蛋白每克纤维素)，烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.75mg蛋白每g纤维素)，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(0.3mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃和55℃分别导致67.0±0.2％和66.9±0.3％的PCS的转化。
[0667] 实施例16：烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的添加对在50℃，55℃，60℃，和65℃高温纤维素酶组合物转化PCS的作用
[0668] 称为“高温纤维素酶组合物”的纤维素酶的混合物通过以下述比例(对于总蛋白)混合制备的酶成分来制备：43.5％烟曲霉纤维二糖水解酶I，29.4％烟曲霉纤维二糖水解酶II，5.9％烟曲霉β-葡糖苷酶，5.9％烟曲霉GH10木聚糖酶3，3.5％里氏木霉β-木糖苷酶，和11.8％里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶 II。在测定中以3mg总蛋白每克纤维素加载量的组合物具有下述酶加载量每克纤维素：1.31mg烟曲霉纤维二糖水解酶I每克纤维素，0.88mg烟曲霉纤维二糖水解酶II每克纤维素，0.18mg烟曲霉β-葡糖苷酶每克纤维素，0.18mg 烟曲霉GH10木聚糖酶3每克纤维素，0.11mg里氏木霉β-木糖苷酶每克纤维素，和0.35mg里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II每克纤维素。
[0669] 对烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+ I181L+I183V评估其在50℃，55℃，60℃，和65℃增强高温纤维素酶组合物水解PCS的能力。经预处理的玉米秸秆水解测定法如实施例14中所述进行。
[0670] 高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)；高温纤维素酶组合物(3mg 蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.45mg蛋白每g纤维素)的组合；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.75mg蛋白每g纤维素)的组合；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.45mg蛋白每g纤维素)的组合；和高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V(0.75mg蛋白每g纤维素)的组合对经预处理的玉米秸秆的转化如实施例14中所述测定。在50℃， 55℃，60℃，和65℃温育72小时之后如实施例14中所述收集并分析数据。对于添加0.45mg GH61多肽每克纤维素和添加0.75mg GH61多肽每克纤维素的结果分别示于图3A和3B。
[0671] 高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)在50℃，55℃，60℃，和 65℃分别导致48.5±0.3％，52.0±0.1％，43.7±0.2％，和36.4±0.1％的经预处理的玉米秸秆的转化。
[0672] 高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.45mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃，55℃，60℃，或65℃分别导致 60.4±0.2％，65.8±0.1％，55.8±0.1％，和45.2±0.2％的PCS的转化。高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.75mg 蛋白每g纤维素)的组合在50℃，55℃，60℃，和65℃分别导致61.9±0.1％， 67.6±0.2％，57.8±0.3％，和45.5±0.7％的PCS的转化。
[0673] 高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B变体I75V +F77L+F179I+I181L+I183V(0.45mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃，55 ℃，60℃，和65℃分别导致51.4±0.7％，66.9±0.5％，56.8±0.4％，和46.2± 0.1％的PCS的转化。
[0674] 高温纤维素酶组合物(3mg蛋白每g纤维素)和烟曲霉GH61B变体I75V +F77L+F179I+I181L+I183V(0.75mg蛋白每g纤维素)的组合在50℃，55 ℃，60℃，和65℃分别导致62.3±0.2％，68.3±0.2％，58.8±0.4％，和46.2 ±1.1％的PCS的转化。
[0675] 实施例17：通过差示扫描量热法确定烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V的Td(变性温度)
[0676] 烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+ I181L+I183V GH61多肽的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)使用带自动取样器的VP-Capillary Differential Scanning Calorimeter(MicroCal Inc.，GE Health Care，Piscataway，NJ，USA)来确定。热变性温度Td(℃)取为热分析图(Cp对T)中变性峰(主要的吸热峰)顶部，所述热分析图在将酶在添加100 ppm X100的50mM乙酸钠pH 5.0的溶液中以恒定编程的加热速率加热之后获得。将大约0.4ml的样品和参照溶液储藏在10℃，然后将样品加载于量热计。将样品和参照(参照：不含酶的缓冲液)溶液自动加载于DSC 并在20℃热预平衡
20分钟，然后以200K/hr的扫描速率从20℃至90℃进行 DSC扫描。变性温度以大约+/-1℃的准确性确定。结果示于图4A和4B。
[0677] 通过差示扫描量热法，烟曲霉野生型GH61B多肽在pH 5具有大约68℃的Td(图4A)，而烟曲霉GH61B变体I75V+F77L+F179I+I181L+I183V GH61多肽在pH 5具有大约74℃的Td(图4B)。
[0678] 本发明进一步通过下述编号的段落描述：
[0679] [1]一种变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77，179， 181，和183的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
[0680] [2]段1的变体，其为具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的变体，选自下组：(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下与以下杂交： (i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)或(i)或(ii) 的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1 的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％序列同一性；和(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其具有纤维素分解增强活性。
[0681] [3]段2的变体，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少 86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少
90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少 99％，或100％序列同一性。
[0682] [4]段2的变体，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在低严格条件，中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
[0683] [5]段2的变体，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少 82％，至少83％，至少84％，至少
85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。
[0684] [6]段2的变体，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。
[0685] [7]段2的变体，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其中所述片段具有纤维素分解增强活性。
[0686] [8]段2的变体，其与具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少
84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少 88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少
92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于
100％序列同一性。
[0687] [9]段1-8任一项的变体，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少 96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于100％序列同一性。
[0688] [10]段1-9任一项的变体，其中所述变体组成为200至220个氨基酸，例如205至220，210至220，和215至220个氨基酸。
[0689] [11]段1-10任一项的变体，其中取代的数量为1-5，如1，2，3，4或5 个取代。
[0690] [12]段1-11任一项的变体，其在对应于位置75的位置包含取代。
[0691] [13]段12的变体，其中所述取代为Val。
[0692] [14]段1-13任一项的变体，其在对应于位置77的位置包含取代。
[0693] [15]段14的变体，其中所述取代为Ser。
[0694] [16]段1-15任一项的变体，其在对应于位置179的位置包含取代。
[0695] [17]段16的变体，其中所述取代为Leu。
[0696] [18]段1-17任一项的变体，其在对应于位置181的位置包含取代。
[0697] [19]段18的变体，其中所述取代为Trp。
[0698] [20]段1-17任一项的变体，其在对应于位置183的位置包含取代。
[0699] [21]段20的变体，其中所述取代为Val。
[0700] [22]段1-21任一项的变体，其在对应于任何位置75，77，179，181，和183的两个位置包含取代。
[0701] [23]段1-21任一项的变体，其在对应于任何位置75，77，179，181，和183的三个位置包含取代。
[0702] [24]段1-21任一项的变体，其在对应于任何位置75，77，179，181，和183的四个位置包含取代。
[0703] [25]段1-21任一项的变体，其在对应于任何位置75，77，179，181，和183的每个位置包含取代。
[0704] [26]段1-25任一项的变体，其包含或组成为一个或多个选自下组的取代：I75V，F77L，F179I，I181L，和I183V。
[0705] [27]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L。
[0706] [28]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F179I。
[0707] [29]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+I181L。
[0708] [30]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+I183V。
[0709] [31]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+F179I。
[0710] [32]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+I181L。
[0711] [33]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+I183V。
[0712] [34]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F179I+I181L。
[0713] [35]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F179I+I183V。
[0714] [36]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I181L+I183V。
[0715] [37]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+F179I。
[0716] [38]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+I181L。
[0717] [39]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+I183V。
[0718] [40]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F179I+I181L。
[0719] [41]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F179I+I183V。
[0720] [42]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+I181L+I183V。
[0721] [43]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+F179I+I181L。
[0722] [44]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+F179I+I183V。
[0723] [45]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F179I+I181L+I183V。
[0724] [46]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+I181L+I183V。
[0725] [47]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+F179I+I181L。
[0726] [48]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F179I+I181L+I183V。
[0727] [49]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+I181L+I183V。
[0728] [50]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+F179I+I183V。
[0729] [51]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F77L+F179I+I181L+I183V。
[0730] [52]段1-25任一项的变体，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+F77L+F179I+I181L+I183V。
[0731] [53]一种分离的多核苷酸，其编码段1-52任一项的变体。
[0732] [54]一种核酸构建体，其包含段53的多核苷酸。
[0733] [55]一种表达载体，其包含段53的多核苷酸。
[0734] [56]一种宿主细胞，其包含段53的多核苷酸。
[0735] [57]一种产生变体的方法，其包括：(a)在适于表达所述变体的条件下培养段56的宿主细胞；和(b)回收所述变体。
[0736] [58]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用段53的多核苷酸转化。
[0737] [59]一种产生段1-52任一项的变体的方法，其包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。
[0738] [60]一种用于获得变体的方法，其包括：在亲本多肽的对应于SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置75，77，179，181，和183的一个或多个位置处导入取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性；和回收所述变体。
[0739] [61]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括在段1-52任一项的变体的存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。
[0740] [62]段61的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[0741] [63]段61或62的方法，其进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[0742] [64]段61-63任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0743] [65]段64的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[0744] [66]段64的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[0745] [67]段61-66任一项的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[0746] [68]段64的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[0747] [69]一种用于产生发酵产物的方法，其包括(a)在段1-52任一项的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
[0748] [70]段69的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[0749] [71]段69或70的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0750] [72]段71的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[0751] [73]段71的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[0752] [74]段69-73任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。
[0753] [75]段69-74任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[0754] [76]一种发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在段1-52任一项的变体存在下用酶组合物糖化的。
[0755] [77]段76的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[0756] [78]段76或77的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0757] [79]段78的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[0758] [80]段78的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[0759] [81]段76-80任一项的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[0760] [82]段81的方法，其进一步包括从发酵回收发酵产物。
[0761] [83]段81或82任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
[0762] [84]一种去污剂组合物，其包含段1-52任一项的变体和表面活性剂。
[0763] [85]一种全培养液配制物或细胞培养组合物，其包含段1-52任一项的多肽。
[0764] 本发明还涉及如下内容：
[0765] 1.一种变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75，77，179， 181，和183的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。
[0766] 2.项1的变体，其为具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的变体，选自下组：
[0767] (a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少 84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性；
[0768] (b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少低严格条件下，例如中等严格条件下，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i) 或(ii)的全长互补链；
[0769] (c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少 75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少
98％，至少99％，或100％序列同一性；和
[0770] (d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其具有纤维素分解增强活性。
[0771] 3.项2的变体，其与具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少
84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少 88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少
92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于
100％序列同一性。
[0772] 4.项1-3任一项的变体，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少 96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但少于100％序列同一性。
[0773] 5.项1-4任一项的变体，其包含一个或多个选自下组的取代或由其组成： I75V，F77L，F191I，I181L，和I183V。
[0774] 6.项1-4任一项的变体，其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I75V+ F77L+F179I+I181L+I183V或由其组成。
[0775] 7.一种分离的多核苷酸，其编码项1-6任一项的变体。
[0776] 8.一种宿主细胞，其包含项7的多核苷酸。
[0777] 9.一种产生变体的方法，其包括：
[0778] (a)在适于表达所述变体的条件下培养项8的宿主细胞；和
[0779] (b)回收所述变体。
[0780] 10.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用项7的多核苷酸转化。
[0781] 11.一种产生项1-6任一项的变体的方法，其包括：
[0782] (a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和
[0783] (b)回收所述变体。
[0784] 12.一种用于获得变体的方法，其包括：在亲本多肽的对应于SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置75，77，179，181，和183的一个或多个位置处导入取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性；和回收所述变体。
[0785] 13.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括在项1-6任一项的变体的存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。
[0786] 14.项13的方法，其进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[0787] 15.项13或14的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0788] 16.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
[0789] (a)在项1-6任一项的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；
[0790] (b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和[0791] (c)从发酵回收所述发酵产物。
[0792] 17.项16的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0793] 18.一种发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在项1-6任一项的变体存在下用酶组合物糖化的。
[0794] 19.项18的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[0795] 20.项18或19的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[0796] 21.项20的方法，其进一步包括从发酵回收发酵产物。
[0797] 22.一种去污剂组合物，其包含项1-6任一项的变体和表面活性剂。
[0798] 23.一种全培养液配制物或细胞培养组合物，其包含项1-6任一项的变体。
[0799] 本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900