Enzyme for the dyeing of keratin fibers

【発明の詳細な説明】 ケラチン繊維を染色するための酵素発明の属する分野 本発明は、ケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための染色組成物、染色方法並びに染色のためのシタリジウム(Scytalidium)ラッカーゼの使用に関する。 発明の背景 白髪が現われるのを隠すために毛髪を染めることは長年行なわれてきた。 そうすることの必要性は、白髪が、多くの人々が受け入れ難い、青年期を過ぎてしまったことの最初の徴候であるという事実から起こる。 たとえばアジアの特定の地域では、ユーモアのある人々により「黒の靴クリーム」としばしば呼ばれる染料で毛髪を染めることが、男性、女性の両方に広く行なわれている。 ここ数10年の間に、毛染めは西洋においてますます一般的になった。 最初に、 パンクロッカーズや他の社会批判グループが、確立した社会に対する抵抗の一部として毛髪を極端な色に染めたが、今日では、特に多くの若者が「化粧品」の類として「外観」を変えたり、新たにするためにも毛染め剤（パンクロッカーズよりは地味な色合いの）を用いる。 毛染め剤 一般に今日市販されている毛染め組成物を三つの主な群、すなわち、 ・一時的毛染め剤 ・半−永久毛染め剤、及び ・永久酸化毛染め剤に分けることができる。 一時的毛染め剤は生来の毛髪の色を短期間のみ変えることを意図するもので、 通常、染料を毛髪の表面上に析出させることにより機能する。 このような毛染め剤は普通の洗髪により容易に取り除かれる。 半−永久毛染め剤を用いると染められた毛髪の色は５回以上の洗髪の間残存することができる。 これは、毛髪ケラチンに対して高親和性を有し、毛髪の軸の内部まで浸透し得る染料を用いることにより達成される。 永久毛染め剤は、日光、洗髪及び他の毛髪処理に非常に耐久性であって、新しい毛髪が成長するにつれ、１ケ月に１回新たにする必要があるだけである。 これらの染色系で、染料は直接毛髪の内及び上に創造される。 小さい芳香族の無色染料前駆体（たとえば、ｐ−フェニレン−ジアミン及びｏ−アミノフェノール）が毛髪の内に深く浸透し、そこで前記染料前駆体が酸化剤により酸化されて、着色した重合化合物となる。 これらの着色した化合物は染料前駆体よりも大きく、毛髪から洗い出すことはできない。 変性剤（またはカプラー）と呼ぶ化合物を毛染め組成物に包含させることにより、多数の毛髪着色色合を得ることができる。 カテコール及びレゾルシノールが前記変性剤の例である。 伝統的にH ₂ O ₂は酸化剤（着色ビルダー）としてのみならず、漂白剤としても用いられる。 H ₂ O ₂を含む染色組成物はこのH ₂ O ₂の色を淡くする作用により、しばしば「淡色染料（lightening dye）」と呼ばれる。 染色組成物においてH ₂ O ₂を用いることは、H ₂ O ₂が毛髪を損傷するので、いくらか欠点がある。 さらに、酸化染色はしばしば高pH（通常約pH９〜10 ）を必要とし、それが毛髪に損傷を与える。 結果として、H ₂ O ₂を含む染料組成物を用いるなら、毛髪をしばしば染めることは勧められない。 H ₂ O ₂を用いる欠点を克服するためにH ₂ O ₂に代えて酸化酵素を用いることが示唆された。 米国特許第3,251,742 号（レブロン）は染料の現場生成（すなわち、毛髪上で）により人毛を染める方法を記載している。 酸化酵素は実質上中性pH(７〜8.5) で、色生成反応に用いられる。 ラッカーゼ、チロシナーゼ、ポリフェノラーゼ及びカタコラーゼが適切な酵素として言及されている。 欧州特許第504,005(パーマSA)はH ₂ O ₂ （過酸化水素）の存在を必要としない、 毛染めのための組成物に関する。 その組成物は、前記組成物のpHが 6.5〜８で、 前記酵素が 6.5〜８のpH範囲で最適活性を有している緩衝液中で、重合体染料及びまた、染料前駆体、たとえば、塩基及びカプラーの生成を触媒できる酵素を含んでいる。 リゾクトニア・プラチコラ(Rhizoctonia praticola)ラッカーゼ及びルース・ バ−ニシフェラ（Rhus vernicifera）ラッカーゼは6.８〜８の最適pHを有し、この特許により重合体染料を生成するのに用いることができる。 アメリカン・ケミカル・ソサエティの論文の抄録vol． 209、第１〜２（1995年）はシタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）からのラッカーゼのクローン化を開示している。 この抄録は前記ラッカーゼを染色のために用いることについて言及していない。 発明の概要 本発明の目的はケラチン繊維、たとえば、毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための改良された染色組成物を提供することであって、それはたとえばH ₂ O ₂を用いる毛髪のための染色組成物よりもケラチン繊維の損傷が少ない。 今や驚くべきことに、酸化酵素として糸状菌属シタリジウムの菌株由来の酵素を用いることによりこのような改良された染色組成物を提供できることが発見された。 第１の面においては、本発明はケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための永久染色組成物に関し、それは １）１または２以上のシタリジウム属の菌株由来の酸化酵素、 ２）１または２以上の染料前駆体及び 任意に３）１または２以上の変性剤を含む酸化酵素を含んでなる。 本発明の好ましい態様では、酸化酵素はシタリジウム属の菌株、特にシタリジウム・サーモフィルムの菌株由来のラッカーゼである。 第２に本発明の目的は、シタリジウム属の菌株由来ラッカーゼとケラチン性繊維及び少なくとも１の染料前駆体とを少なくとも１の変性剤の存在または不存在下に、染料前駆体の着色化合物への酸化を可能とするのに適切な時間で、かつ十分な条件下に接触させることを含む、ケラチン繊維を染色する方法を提供する。 最後に本発明は、ケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛の酸化染色のためのシタリジウム属の菌株由来の酸化酵素の使用に関する。 図面の簡単な説明 図１はシタリジウム・サーモフィルム ラッカーゼ（rStL-FXu-1 ）の染色効果を示す。 発明の詳細な説明 本発明の目的はケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための改良された永久染色組成物を提供することであり、それは、たとえばH ₂ O ₂を用いる毛染め組成物よりもケラチン繊維に対する損傷が少ない。 驚くべきことに、糸状菌属シタリジウムの菌株を用いることにより上記改良された染色組成物を提供することが可能なことが見い出された。 シタリジウム属の菌株由来の前記酸化酵素を用いると、発現した色がH ₂ O ₂を用いる、たとえば毛髪の酸化染色と同じ位洗浄安定性で、光堅牢度は化学的に染色するのと同じ位良好である。 結果として、第１の面では本発明はケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための永久染料組成物に関し、 １）１または２以上のシタリジウム属の菌株由来の酸化酵素、 ２）１または２以上の染料前駆体及び 任意に３）１または２以上の変性剤を含むものである。 本発明の態様では、酸化酵素は、シタリジウム属の菌株、たとえばシタリジウム・サーモフィルムの菌株由来のラッカーゼたとえばノボ ノルディスクからの WO 95／33837(PCT／US95／06816)号（本明細書に組み入れる）に記載された精製されたラッカーゼである。 配列番号１はシタリジウム・サーモフィルム種の菌株由来の適切なラッカーゼをコードするDNA 配列を示す。 配列番号１を含む発現ベクターpShTh15 を含有する大腸菌JM101はブダペスト条約の下に61604 イリノイ州ペオリア ユニバーシティ ストリート1815、アグリカルチュラル リサーチ サービスパテント カルチュア コレクション、ノーザン リージョナルセンターに寄託されている。 そのベクターは受託番号NRRL B-21262を付与されている。 本発明により、シタリジウム・サーモフィルム種の菌株由来の配列番号１に80 ％より多く相同性である、他の微生物由来のラッカーゼも意図するものである。 さらに、シタリジウム ラッカーゼは、Ｓ． サーモフィルム内に見い出すことができるラッカーゼ並びにストラーツマ(Straatsma)及びサムソン、「Mycol．Re s．」97，p.321〜328(1993年)に定義された定義の範囲内に入る異名である他の真菌内に見い出すことができるラッカーゼの代替型も包含する。 これらは、Ｓ． インドネシアクム（indonesiacum）、トルラ・サーモフィラ（Torula thermophi la）、フミコラ・ブレビス(Humicola brevis)変異体サーモイデア（thermoidea ）、フミコラ・ブレビスポラ（brevispora）、Ｈ． グリセア（grisea）変異体サーモイデア、フミコラ・インソレンス（insolens）及びフミコラ・ラヌギノサ（ lanuginosa）｛サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)としても公知である｝を包含する。 シタリジウム ラッカーゼは宿主細胞として糸状菌、酵母または細菌を用いて、同種的または異種的に生産することができることが理解されるべきである。 糸状菌宿主細胞の例は、トリコデルマの種の菌株、好ましくはトリコデルマ・ ハージアヌム(harzianum)もしくはトリコデルマ・リーセイ（reesei）の菌株またはアスペルギルス(Aspergillus)の種、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ（oryzae）もしくはアスペルギルス・ニガー(niger)または酵母細胞、たとえば、サッカロマイセス(Saccharomyces)の菌株、特にサッカロマイセス・セレビシエ（cerev isiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（cluyveri）もしくはサッカロマイセス・ウバルム（uvarum）、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)種の菌株、たとえばジゾサッカロマイセス・ポンベ(pombe)、ハンセヌラ(Hansenula)種の菌株、ピチア（Pichia）種、ヤロウイア（Yarrowia）種、たとえばヤロウイア・リポリチカ（lipolytica）またはクルイベロマイセス(Kluyveromyces)種、たとえばクルイベロマイセス・ラクチス(lactis)、またはグラム陽性菌、たとえば、バシラスの菌株、たとえば、Ｂ． ズブチリス（subtilis）、Ｂ． リケニホルミス(Licheniformis)、Ｂ． レンツス（lentus）、Ｂ． ブレビス（brevis）、Ｂ． ステアロサーモフィルス（stearothermophilus）、Ｂ． アルカロフィルス（alka lophilus）、Ｂ． アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)、Ｂ． コアギュランス(coagulans)、Ｂ． サーキュランス(circulans)、Ｂ． ラウツス（lautus） 、Ｂ． メガテリウム（megaterium）もしくはＢ． スーリンジェンシス(thuringie nsis)の菌株、または、ストレプトマイセス(Streptmyces)の菌株、たとえば、Ｓ ． リビダンス（lividans）もしくはＳ． ムリヌス(murinus)またはグラム陰性菌、たとえば大腸菌（Escherichia coli）を包含する。 ラッカーゼ(ベンゼンジオール：酵素オキシドレダクターゼ)(「Enzyme Nomenc lature」1992年、Academic Press， Inc．によると、EC類１．10．３．２．) はフェノールの酸化を触媒する多−銅含有酵素である。 ラッカーゼ仲介酸化は適切なフェノール性基質からアリールオキシ基中間体の生産をもたらし、そのようにして生産された中間体の最終的なカップリングは、２量化、オリゴマー化及び重合反応生成物の組み合せをもたらす。 特定の反応生成物は毛髪を染めるために適切な染料を生成するのに用いることができる（下記参照）。 本発明の態様では、シタリジウム ラッカーゼは中性である。 本発明のラッカーゼの文脈においては、これは最適pHは 6.0〜8.0 の範囲にあることを意味する。 ケラチン繊維、たとえば、毛髪の染色を達成するために、本発明の染色組成物は、本発明ではシタリジウム種の菌株、たとえば、シタリジウム・サーモフィルムの菌株由来の酸化酵素である酸化剤によって着色化合物（すなわち、染料）に変換される染料前駆体も含む。 限定するものではないが、その染料前駆体は３つの主要な化学のファミリーである、ジアミン、アミノフェノール（またはアミノナフトール）及びフェノールの１つに属する芳香族化合物であることができる。 イサチン誘導体染料前駆体の例は、独国特許出願公開4,314,317（Ａ１）に見い出される。 さらに、多数のインドールまたはインドリン誘導体染料前駆体は WO 94／00100号に開示されている。 これらの文献に言及された前記染料前駆体は参照により本明細書に組み込まれる。 適切な染料前駆体の例は、ｐ−フェニレンジアミン(pPD)、ｐ−トルイレンジアミン、クロル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール及び３，４−ジアミノトルエン、２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン、４−メチル−ｏ−フェニレンジアミン、２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、２−クロル−１，４−ジアミノベンゼン、４−アミノジフェニルアミン、１−アミノ−４−β−メトキシエチルアミノベンゼン、１−アミノ−４−ビス−（β−ヒドロキシエチル）アミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、２− メチル−１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノピリジン、１−ヒドロキシ−２−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−３−アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−β −ヒドロキシエチルアミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１ −ヒドロキシ−４−メチルアミノベンゼン、１−メトキシ−２，４−ジアミノベンゼン、１−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン、１−β−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン、フェナジン類、たとえば４，７−フェナジンジカルボン酸、２，７−フェナジンジカルボン酸、２−フェナジンカルボン酸、２，７−ジアミノフェナジン、２，８−ジアミノフェナジン、２，７−ジアミノ−３，８−ジメトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、３−ジメチル−２，８−フェナジンジアミン、２，２′−〔（８−アミノ−７−メチル−２−フェナジニル） イミノ〕ビス−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−７−メトキシ−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−７−クロル−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２−〔（８−アミノ−７− メチル−２−フェナジニル）アミノ〕−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、３−アミノ−７−（ジメチルアミノ）−２，８−ジメチル−５−フェニルクロリド、９−（ジエチルアミノ） −ベンゾ〔ａ〕フェナジン−１，５−ジオール、Ｎ−〔８−（ジエチルアミノ） −２−フェナジニル〕−メタンスルホンアミド、Ｎ−（８−メトキシ−２−フェナジニル）−メタンスルホンアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−２， ７−フェナジンジアミン、３，７−ジメチル−２−フェナジンアミン、ｐ−アミノ安息香酸類、たとえば、ｐ−アミノ安息香酸エチル、ｐ−アミノ安息香酸グリセリド、ｐ−アミノ安息香酸イソブチル、ｐ−ジエチルアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸オクチル、 ｐ−ジエトキシアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジプロポキシアミノ安息香酸エチル、アセチルサリチル酸、イサチン誘導体類、たとえば、２，３−ジアミノ安息香酸を含む群からの化合物を包含する。 １態様では、ラッカーゼは染料前駆体を直接に着色化合物に酸化するのに用いられる。 染料前駆体は単独または他の染料前駆体といっしょに用いてもよい。 しかしながら、ジアミンまたはアミノフェノールを染料前駆体として用いる時、共重合における少なくとも１つの中間体はオルソもしくはパラジアミンまたはアミノフェノールでなければならないと考える。 上記の例は米国特許第3,251,74 2 号（レブロン）に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み入れる。 任意に本発明の染色組成物（特に毛染め組成物）は、それにより多数の色合いを得ることができる変性剤（カプラー）も含む。 変性剤を用いない毛染め組成物から生じる色はほとんどの人により通常受け入れられないので、一般に変性剤が毛染め組成物に用いられる。 変性剤は典型的にはｍ−ジアミン、ｍ−アミノフェノールまたはポリフェノールである。 変性剤（カプラー）は酸化酵素の存在で染色前駆体と反応して、それを着色化合物に変換する。 変性剤（カプラー）の例はｍ−フェニレンジアミン、２，４−ジアミノアニソール、１−ヒドロキシナフタレン（α−ナフトール）、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，２−ジヒドロキシベンゼン（ピロカテコール）、１，３−ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、１，３−ジヒドロキシ−２−メチルベンゼン、１，３−ジヒドロキシ− ４−クロルベンゼン（４−クロルレゾルシノール）、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシ−５−メチルベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシトルエンを包含する。 第２の面では本発明はケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛を染色する方法に関し、シタリジウム属の菌株由来のラッカーゼとケラチン繊維及び少なくとも１の染料前駆体とを、少なくとも１の変性剤の存在または不存在下に、その染料前駆体の着色した化合物（すなわち、染料）への酸化を可能とするのに十分な時間及び条件下接触させることを含む。 染色方法は１または２以上の染料前駆体を単独または１または２以上の変性剤といっしょに用いることにより行うことができる。 本発明の組成物に用いられる染料前駆体及び他の成分の量は通常の業務用の量に一致する。 シタリジウム ラッカーゼ、たとえば上記シタリジウム・サーモフィルム ラッカーゼを用いる時、本発明のケラチン繊維の染色方法は、室温、好ましくは酵素の最適温度付近で、3.0〜9.0、好ましくは 4.0〜8.0 の範囲のpH、特にpH 6.0 〜8.0 で行うことができる。 適切な染料前駆体及び任意の変性剤は上記されている。 このシタリジウム ラッカーゼの使用は、H ₂ O ₂の使用がケラチン繊維、たとえば毛髪を損傷することがあるので、より伝統的なH ₂ O ₂の使用に対して改良である。 さらに通常先行技術の方法は高pHを必要とし、それもケラチン繊維を損傷する。 これに反して、ラッカーゼとの反応は酸性または中性pHで行うことができ、酸化に必要な酸素は苛酷な化学的酸化によるよりも、空気から来る。 シタリジウム ラッカーゼの使用によりもたらされた結果は発色のみならず洗浄及び光堅牢度において、H ₂ O ₂の使用により達成されたものに匹敵する。 さらなる商業的な利点は、前記ラッカーゼと前記前駆体の両方を含有して酸素のない雰囲気で、単一の容器で作ることができ、その配置はH ₂ O ₂を用いてはなし得ない。 材料及び方法 材料毛髪約15.2cm（６インチ）デ メオ バージン天然白色毛髪（De MeoBrothers Inc .米国） 酵素ノボ ノルディスクからの WO 95／33837(PCT／US95／06816)号に記載のシタリジウム・サーモフィルムからのラッカーゼ生物学的材料の寄託次の生物学的材料は、1994年５月25日にブダペスト条約の下に61604 イリノイ州ペオリア ユニバーシティ ストリート1815、アグリカルチュラル リサーチ サービス パテント カルチュア コレクション、ノザン リージョナル リサーチ センターに寄託され、次の受託番号を付与された。 寄託 受託番号 pShTh15を含有する大腸菌JM101 NRRL B-21262 染料前駆体 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1 ｗ／ｗ％のｐ−フェニレンジアミン(pPD) 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1 ｗ／ｗ％のｐ−トルイレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1 ｗ／ｗ％のクロル−ｐ−フェニレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のｐ−アミノフェノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のｏ−アミノフェノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％の３，４−ジアミノトルエン変性剤 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のｍ−フェニレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％の２，４−ジアミノアニソール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のα−ナフトール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のヒドロキノン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のピロカテコール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％のレゾルシノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0 中の0.1 ｗ／ｗ％の４−クロルレゾルシノール 染料前駆体を染色溶液中の最終濃度が前駆体に関して0.1 ｗ／ｗ％及び変性剤に関して0.1 ｗ／ｗ％となるように上記表示された変性剤の１つと組み合わせる。 他の溶液 ３％ H ₂ O ₂ （最終的な染料溶液中） 市販のシャンプー装置 ミノルタCR200 彩度計 昼光電球：1000ルックス（Ｄ65） ラッカーゼ活性の測定（LACU）ラッカーゼ活性を好気性条件下シリンガアルダジン(syringaldazin)の酸化により測定した。 生じた紫色は530nm で測光する。 分析条件は19mMのシリンガアルダジン、23.2mM酢酸塩緩衝液pH5.5、30℃、反応時間１分間である。 １ラッカーゼ単位（LACU）は、これらの条件で１分当り1.0 マイクロモルのシリンガアルダジンの変換を触媒する酵素の量である。 毛髪の色の評価毛髪の房の量的な色をミノルタCR200 彩度計で、パラメータＬ＊（「０」＝黒で「100」＝白）、ａ＊（「−」＝緑で「＋」＝赤）及びｂ＊（「−」＝青で「 ＋」＝黄色）を用いて測定する。 ＤＬ＊、Ｄａ＊及びＤｂ＊は未処理の毛髪のＬ＊、ａ＊及びｂ＊にそれぞれ対比したＬ＊、ａ＊及びｂ＊のデルタ値である（たとえばＤＬ＊＝Ｌ＊ _試料 −Ｌ ＊ _{未処理の毛髪} ）である。

て総量的着色変化に対する表現である。 例 例１

染色効果シタリジウム・サーモフィルム ラッカーゼの染色効果を染料前駆体ｏ−アミノフェノール及び変性剤ｍ−フェニレンジアミンを用いて試験した。

毛染め １ｇのデ メオ白色毛髪の房を用いた。 ４mlの染料前駆体溶液（変性剤を包含する）と１mlのラッカーゼとをワーレイ(Whirley)混合機で混合し、毛髪の房に塗布し、30℃で60分間インキュベートした。 次いでその毛髪の房を流水ですすぎ、シャンプーで洗い、水ですすぎ、くしでとかし、空気乾燥させた。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊を彩度計で測定し、次にDE＊を計算した。 酵素なしで処理した毛髪房試料をブラインドとして用いた。 毛髪染色試験の結果を図１に示す。 例２

洗浄安定性白色のデ メオ毛髪の房（１ｇ）を、H

₂ O

₂を用いて染めた毛髪と比較して、シタリジウム・サーモフィルム ラッカーゼ及び染料前駆体としてｐ−フェニレンジアミン(pPD)を用いて染めた毛髪の洗浄安定性を試験するために用いた。 さらに市販の酸化染料と洗浄安定性を比較する。 酸化毛染めを例１に記載されているように行う。

洗髪染められた毛髪の房を湿らせ、50mlの市販のシャンプーで15秒間洗い、１分間水ですすぎ、空気乾燥させた。 毛髪の房を18回まで洗う。 次いで彩度計でａ＊，ｂ＊及びＬ＊を測定し、ΔＥ＊値を次いで計算する。 例３

光堅牢度ブロンドのヨーロッパ人の毛髪の房を、H

₂ O

₂を用いて染めた毛髪に比較して、 シタリジウム・サーモフィルムを用いて染めた毛髪の光堅牢度を試験するために用いる。 ｐ−フェニレンジアミンを染料前駆体として用いた。 毛髪の染色は例１に記載されているように行なった。 １方の毛髪の房は暗所に、他方は昼光（すなわち昼光電球（Ｄ65）で、約1000 ルックス）に275時間まで保持した。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊パラメータは毛染め直後に、そしてさらに昼光にさらしている間に測定する。 次いで測定されたａ＊，ｂ＊及びＬ＊値からDE＊を計算した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ロルバエク，カレン デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ