Laccase with improved dyeing aptitude

【発明の詳細な説明】 改良された染色適性を有するラッカーゼ発明の属する分野 本発明は微生物ラッカーゼを含む染色組成物、ケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛を染色するための前記組成物の使用及びケラチン繊維を染色する方法に関する。 発明の背景 白髪が現われるのを隠すために毛髪を染めることは長年行なわれてきた。 そうすることの必要性は、白髪が、多くの人々が受け入れ難い、青年期を過ぎてしまったことの最初の徴候であるという事実から起こる。 たとえばアジアの特定の地域では、ユーモアのある人々により「黒の靴クリーム」としばしば呼ばれる染料で毛髪を染めることが、男性、女性の両方に広く行なわれている。 ここ数10年の間に、毛染めは西洋においてますます一般的になった。 最初に、 パンクロッカーズや他の社会批判グループが、確立した社会に対する抵抗の一部として毛髪を極端な色に染めたが、今日では、特に多くの若者が「化粧品」の類として「外観」を変えたり、新たにするためにも毛染め剤（パンクロッカーズよりは地味な色合いの）を用いる。 毛染め剤一般に今日の市販されている毛染め組成物を三つの主な群、すなわち、 ・一時的毛染め剤 ・半−永久毛染め剤及び ・永久酸化毛染め剤に分けることができる。 一時的毛染め剤は生来の毛髪の色を短期間のみ変えることを意図するもので、 通常、染料を毛髪の表面上に析出させることにより機能する。 このような毛染め剤は普通の洗髪により容易に取り除かれる。 半−永久毛染め剤を用いると染められた毛髪の色は５回以上の洗髪の間残存することができる。 これは、毛髪ケラチンに対して高親和性を有し、毛髪の軸の内部まで浸透し得る染料を用いることにより達成される。 永久毛染め剤は、日光、洗髪及び他の毛髪処理に非常に耐久性であって、新しい毛髪が成長するにつれ、１ケ月に１回新たにする必要があるだけである。 これらの染色系で、染料は直接毛髪の内及び上に創造される。 小さい芳香族の無色染料前駆体（たとえば、ｐ−フェニレン−ジアミン及びｏ−アミノフェノール）が毛髪の内に深く浸透し、そこで前記染料前駆体が酸化剤により酸化されて、着色した重合化合物となる。 これらの着色した化合物は染料前駆体よりも大きく、毛髪から洗い出すことはできない。 変性剤（またはカプラー）と呼ぶ化合物を毛染め組成物に包含させることにより、多数の毛髪着色色合を得ることができる。 カテコール及びレゾルシノールが前記変性剤の例である。 伝統的にH ₂ O ₂は酸化剤（着色ビルダー）としてのみならず、漂白剤としても用いられる。 H ₂ O ₂を含む染色組成物はこのH ₂ O ₂の色を淡くする作用により、しばしば「淡色染料（lightening dye）」と呼ばれる。 染色組成物においてH ₂ O ₂を用いることは、H ₂ O ₂が毛髪を損傷するので、いくらか欠点がある。 さらに、酸化染色はしばしば高pH（通常約pH９〜10 ）を必要とし、それが毛髪及び皮膚に損傷を与える。 結果として、H ₂ O ₂を含む染料組成物を用いるなら、毛髪をしばしば染めることは勧められない。 H ₂ O ₂を用いる欠点を克服するために、H ₂ O ₂に代えて酸化酵素を用いることが示唆された。 米国特許第3,251,742号（レブロン）は染料の現場生成（すなわち、毛髪上で）により人毛を染める方法を記載している。 酸化酵素は実質上中性pH(７〜8.5) で、色生成反応に用いられる。 ラッカーゼ、チロシナーゼ、ポリフェノラーゼ及びカタコラーゼが適切な酵素として言及されている。 唯一の例証された酸化酵素はチロシナーゼである。 欧州特許第504,005(パーマSA)号はケラチン繊維、特に毛髪のための染色組成物に関し、それはH ₂ O ₂ （過酸化水素）の存在を必要としない。 その組成物は、前記組成物のpHが6.5〜８で、前記酵素が6.5〜８のpH範囲で最適活性を有している緩衝液中で、重合体染料及びまた、染料前駆体、たとえば、塩基及びカプラーの生成を触媒できる酵素を含んでいる。 リゾクトニア・プラチコラ(Rhizoctonia praticola)ラッカーゼ及びルース・ バーニシフェラ（Rhus vernicifera）ラッカーゼがこの特許において例証された唯一のラッカーゼである。 アメリカン・ケミカル・ソサエティの論文の抄録vol． 209、第１〜２（1995年）はシタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）及びマイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）からのラッカーゼのクローン化を開示している。 この抄録は前記ラッカーゼを染色のために用いることについて言及していない。 発明の概要 本発明の目的は酸化剤として酸化酵素を含む、ケラチン繊維、たとえば、毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛のための改良された染色組成物を提供することである。 本発明の文脈では、ケラチン繊維を染色するための「改良された」組成物は、 相当する先行技術の染色組成物と比較して、当該ケラチン繊維を速く染色することができるか、またはより少量の酸化酵素を用いることにより、ΔＥ＊として測定された最適染色効果を得ることができる組成物を意味する。 さらに、より少量の染料前駆体を用いることも可能である。 このことは、特定の染料前駆体は非常に不健康で非常に発癌性であるので、有利である。 ケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛をより速く染めることができる組成物は、このような組成物は非常に使用者に便利であるので望ましい。 さらに、染色組成物により少量の酵素を用いることができることが望ましい。 これは染色方法をより経済的にするかもしれない。 さらに、空輸されるタンパク質エアゾールを創造するためのリスクが減少する。 今や驚くべきことに、染料前駆体を酸化するために微生物ラッカーゼを用いることにより、このようなケラチン繊維のための改良された染色組成物を提供できることが発見された。 ラッカーゼ(ベンゼンジオール：酵素 オキシドレダクターゼ)(「酵素の学名命名法(Enzyme Nomenchature)」、1992年、アカデミック プレス、インコーポレイティドによると、ECクラス1.10.3.2)はフェノールの酸化を触媒する多− 銅（multi-copper）含有酵素である。 ラッカーゼ仲介酸化は、適切なフェノール基質からアリールオキシ基中間体の生産をもたらし、そのようにして生産された中間体の最終カップリングは、２量化、オリゴマー化及び重合反応生成物の組み合せをもたらす。 特定の反応生成物はケラチン繊維、たとえば毛髪及び羊毛を染めるために適切な染料を生成するのに用いることができる（下記参照）。 第１に、本発明の目的は、 ａ）１mlの染色組成物当り０より大で１mgまでの酵素タンパク質の微生物ラッカーゼ、 ｂ）１または２以上の染料前駆体、 ｃ）任意に１または２以上の変性剤を含む染色組成物を提供することである。 特にマイセリオフトラ属の菌株から由来する微生物起原のラッカーゼが特に期待される。 第２の面では、本発明は本発明の染色組成物をケラチン繊維、たとえば、毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛を染色するために用いることに関する。 本発明は、本発明の染色組成物を当該ケラチン繊維と染料前駆体の着色組成物への酸化を可能とするのに適切な条件下でかつ十分な時間接触させることを含む、ケラチン繊維を染色する方法にも関する。 本発明はケラチン繊維の永久染色のためにラッカーゼを用いることにも関し、 ここで前記ラッカーゼは、相当する染色条件下で、ルース（Rhus）由来のラッカーゼから生ずるΔＥ＊値よも高いΔＥ＊値をもたらすラッカーゼである。 これは、本発明の染色組成物を用いてケラチン繊維を染める時、測定されたΔ Ｅ＊値は、ルース由来のラッカーゼを含む染色組成物を用いて同じ条件下で染められた相当するケラチン繊維から測定されたΔＥ＊値よりも高いことを意味する。 用語「染色条件に相当する」は、たとえば、酵素濃度または酵素活性、染色インキュベーション時間、染色インキュベーション温度、pH条件、ケラチン繊維型（たとえば毛髪型）が同じ条件下で、さらに同じ染色前駆体及び変性剤が用いられることを意味する。 言い換えると、それは特定の選択された染色条件と一致する条件を定義する。 下記の例中で記載する染色条件を選択することができる。 本発明の文脈では「より高い」ΔＥ＊値は、総量的な着色変化が１ΔＥ＊単位よりも大であることを定義する。 ΔＥ＊は、たとえばミノルタCR200彩度計で、測定されたパラメ

² ＋Δｂ＊

² ）を用いて計算される。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊の意味は下記の「材料及び方法」の節で説明する。 図面の簡単な説明 図１は６つの異なるラッカーゼの染色効果を示す。 その６つのラッカーゼは、 ポリポラス・ピンシツス（Polyporus pinsitus）ラッカーゼ(rPp−ラッカーゼ) 、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ(Mt−ラッカーゼwt.)、マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼ(Mt−ラッカーゼ(変異体))、ルース・バーニシフェラ（Rhus vernicifera）ラッカーゼ(Rv1-FXu-1)、シタリジウム・サーモフィルム(Schytalidium thermophi lum)ラッカーゼ（rStL-FXu-1）及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani ）ラッカーゼ（rRsL-3-FXu-1）である。 ｏ−アミノフェノールを染料前駆体として用い、ｍ−フェニレンジアミンを変性剤として用いる。 図２は、酸化剤としてのマイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１ 変異体ラッカーゼ(Mt−ラッカーゼ(変異体))及びポリポラス・ピンシツス ラッカーゼ(rPp−ラッカーゼ)の洗浄安定性を示す。 図３は、酸化剤としてマイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼ(Mt−ラッカーゼ(変異体))及びポリポラス・ピンシツス ラッカーゼ(rPp−ラッカーゼ)を用いる毛染めの迅速性（速度）を示す。 図４は、１mlの染料組成物当り0.0001〜0.5mg酵素タンパク質を用いる、マイセリオフトラ・セーモフィラ ラッカーゼの投与量−応答染色効果を示す。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、酸化酵素を含む、ケラチン繊維、たとえば毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛の永久染色のための改良された染色組成物を提供することである。 いまや驚くべきことに、このような改良された染色組成物を染料前駆体を酸化するために微生物ラッカーゼを用いることによって提供できることが見い出された。

染色組成物第１面では、本発明は、 ａ）１mlの染色組成物当り、０より大で１mgまでの酵素タンパク質の微生物ラッカーゼｂ）１または２以上の染料前駆体及びｃ）任意に１または２以上の染料変性剤を含む染色組成物に関する。 本発明の好ましい態様では、ラッカーゼは染色組成物中で、0.0001〜１mg／ml 、好ましくは0.001〜0.8mg／ml、より好ましくは0.002〜0.5、さらにより好ましくは0.003〜0.2、特に0.004〜0. 1mg酵素タンパク質／ml染色組成物の範囲内の濃度で存在することができる。 本発明の永久染色のための組成物を用いて染色する時、得られたΔＥ＊は、相当する染色条件下でルース由来のラッカーゼを含む染色組成物を用いて得られたものより高い。 ルース ラッカーゼの例は、日本ウルシの木のルース・バーニシフェラ（vern icifera）（吉田、「J．Chem．Soc．」472、1883年）由来のラッカーゼである。 ルース・バーニシフェラ ラッカーゼを下記の例１で用いる。 本発明により用いられる微生物ラッカーゼは真菌または細菌起原、特に糸状菌起原のものである。 本発明の１態様では、微生物ラッカーゼは、マイセリオフトラ属の菌株、たとえばマイセリオフトラ・サーモフィラ種の菌株由来のもの、たとえばノボ ノルディスクからのWO 95／33836(PCT／US95／06815)号（参照により本明細書に組み入れる）に記載された精製ラッカーゼである。 下記の配列番号１は、マイセリオフトラ・サーモフィラ由来の適切なラッカーゼをコードするDNA配列を示す。 配列番号１を含む発現ベクターpRaMB5を含有する大腸菌JM101をブタペスト条約の下に、61604，イリノイ州ペオリア，ユニバーシティ ストリート1815のアグリカルチュラル リサーチ サービス パテントカルチャー コレクション、 ノーザン リージョナル リサーチセンターに寄託した。 そのベクターは受託番号NRRL B-21261を与えられた。 マイセリオフトラ・サーモフィラ由来の配列番号１に80％より多く相同性である他の微生物由来のラッカーゼも本発明によって意図される。 さらに、マイセリオフトラ ラッカーゼは、Ｍ． サーモフィラ内で見い出すことができるラッカーゼ、並びにアピニス（「Nova Hedwigia」５，p .57〜78、1963年）により記載されたＭ． サーモフィラの定義の範囲に入る異名であり、スポロトリシウム・サーモフィル（Sporotrichum thermophile）という名の他の真菌に見い出すことができるラッカーゼの代替型も包含する。 その後の分類学的改訂はこの生物体をキソスポリウム（Chysosporium）属(Von Klopotek 、A．Avche．「Microbiol」98，p.365〜369、1974年）に、後にマイセリオフトラ属（Van Oorshot「Persoonia」９，p.401〜408、1977年）に位置させた。 他の名称により公知の多数の生物体もこの種に属するように見える。 これらは、スポロトリシウム・セルロフィルム（cellulophilum）（米国特許第4,106,989号）、 シーラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）（Fergus及びSinden「Can ．J．Botany」47，p.1635〜1637、1968年）、クリソスポリウム・ファーグッシ（Chrysosporium fergussi）及びコリナスクス・サーモフィルス(Corynascus th ermophilus)(Von Klopotek、上記)を包含する。 ラッカーゼ変異体の使用も本発明により意図される。 ラッカーゼ変異体の例PCT／US96／14087(ノボ ノルディスク)号に記載されているマイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体である。 Ｔ１変異体（または型Ｉ変異体）はラッカーゼを包含する、変性青色銅オキシダーゼである。 Ｔ１変異体はたとえば部位特異的変異誘発によって構築することができ、相当する野生型青色銅オキシダーゼと型Ｉ（Ｔ１）銅部位において少なくとも１アミノ酸残基によって異なる。 これらの変性は一般に変更されたpHプロフィル及び／または野生型酵素に関連する特異的活性を生じる。 これは当該酵素を染色組成物に用いる時有利であることがある。 より特異的なマイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１ラッカーゼ変異体は配列509VSGGL511を含むことができるか、またはＴ１の銅部位の少なくとも１つのセグメントにおける負の荷電を増加するように変性することができる。 上記微生物ラッカーゼはケラチン繊維の永久染色組成物に有利に用いることができる。 このような組成物は、たとえば例に示されているルース・バーニシフェラ ラッカーゼを含む相当する組成物に優る染色効果を有している。 マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼは例２及び例３でそれぞれ立証されているポリポラス・ピンシツス ラッカーゼよりも洗浄安定性でさらに速く染める。 例４は、適切な染色効果を得るために、ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼに対比してより少ないマイセリオフトラ ラッカーゼ活性（すなわち、LACU／ml ）が必要とされることを示している。 例５は、マイセリオフトラ・サーモフィラ ラッカーゼについて、最適染色効果は１mlの染色組成物当り、約0.005mgの酵素タンパク質で得られることを示している。 永久染色組成物においてマイセリオフトラ ラッカーゼを用いる場合、有利には０より大で１までのmg／ml、好ましくは0.0001〜0.1mg／ml、より好ましくは0 .0005〜0.05mg／ml、特に１mlの染色組成物当り0.001〜0.01mgの酵素タンパク質の濃度で存在することができる。 前記ラッカーゼは宿主細胞、たとえば糸条菌、酵母または細菌中で、同種的にまたは異種的にのいずれかで生産できるものと解すべきである。 糸条菌宿主細胞の例は、トリコデルマの種の菌株、好ましくはトリコデルマ・ ハージアヌム(harzianum)もしくはトリコデルマ・リーセイ（reesei）の菌株またはフザリウム（Fusarium）の種またはアスペルギルス(Aspergillus)の種、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ（oryzae）もしくはアスペルギルス・ニガー(niger)または酵母細胞、たとえば、サッカロマイセス(Saccharomyces)の菌株、特にサッカロマイセス・セレビシエ（cerevisia e）、サッカロマイセス・クルイベリ（cluyveri）もしくはサッカロマイセス・ ウバルム（uvarum）、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)種の菌株、 たとえばジゾサッカロマイセス・ポンベ(pombe)、ハンセヌラ(Hansenula)種の菌株、ピチア（Pichia）種、ヤロウイア（Yarrowia）種、たとえばヤロウイア・リポリチカ（lipolytica）またはクルイベロマイセス(Kluyveromyces)種、たとえばクルイベロマイセス・ラクチス（lactis）、またはグラム陽性菌、たとえば、 バシラスの菌株、たとえば、Ｂ． ズブチリス（subtilis）、Ｂ． リケニホルミス(Licheniformis)、Ｂ． レンツス（lentus）、Ｂ． ブレビス（brevis）、Ｂ． ステアロサーモフィルス（stearothermophilus）、Ｂ． アルカロフィルス（alkalo philus）、Ｂ． アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)、Ｂ． コアギュランス(coagulans)、Ｂ． サーキュランス(circulans)、Ｂ． ラウツス（lautus）、 Ｂ． メガテリウム（megaterium）もしくはＢ． スーリンジェンシス(thuringiens is)の菌株、または、ストレプトマイセス(Streptmyces)の菌株、たとえば、Ｓ． リビダンス（lividans）もしくはＳ． ムリヌス(murinus)またはグラム陰性菌、 たとえば大腸菌（Escherichia coli）を包含する。 ケラチン繊維の染色を達成するために、本発明の染色組成物は、本発明では微生物ラッカーゼである酸化剤によって着色化合物に変換される１または２以上の染料前駆体を含む。 限定するものではないが、その染料前駆体は３つの主要な化学のファミリーである、ジアミン、アミノフェノール（またはアミノナフトール）及びフェノールの１つに属する芳香族化合物であることができる。 イサチン誘導体染料前駆体の例は、独国特許出願公開4,314,317(Ａ１)号に見い出される。 さらに、多数のインドールまたはインドリン誘導体染料前駆体はWO 94／00100号により開示されている。 これらの文献に言及された前記染料前駆体は参照により本明細書に組み込まれる。 適切な染料前駆体の例は、ｐ−フェニレンジアミン(PPD)、ｐ−トルイレンジアミン(PTD)、クロル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アミノフェノール、ｏ− アミノフェノール、３，４−ジアミノトルエン、２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン、４−メチル−ｏ−フェニレンジアミン、２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、２−クロル−１，４−ジアミノベンゼン、４−アミノジフェニルアミン、１−アミノ−４−β−メトキシエチルアミノベンゼン、１−アミノ−４− ビス−（β−ヒドロキシエチル）アミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、 ２−メチル−１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６− ジアミノピリジン、１−ヒドロキシ−２−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−３ −アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−β−ヒドロキシエチルアミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−メチルアミノベンゼン、１− メトキシ−２，４−ジアミノベンゼン、１−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン、１−β−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン、フェナジン類、たとえば４，７−フェナジンジカルボン酸、２，７−フェナジンジカルボン酸、２−フェナジンカルボン酸、２，７−ジアミノフェナジン、２，８−ジアミノフェナジン、２，７−ジアミノ−３，８−ジメトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、３−ジメチル−２，８−フェナジンジアミン、２， ２′−〔（８−アミノ−７−メチル−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−７−メトキシ−２−フェナジニル）イミノ〕 ビス−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−７−クロル−２−フェナジニル）イミノ〕 ビス−エタノール、２−〔（８−アミノ−７−メチル−２−フェナジニル）アミノ〕−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、３−アミノ−７−（ジメチルアミノ）−２，８− ジメチル−５−フェニルクロリド、９−（ジエチルアミノ）−ベンゾ〔ａ〕フェナジン−１，５−ジオール、Ｎ−〔８−（ジエチルアミノ）−２−フェナジニル〕−メタンスルホンアミド、Ｎ−（８−メトキシ−２−フェナジニル）−メタンスルホンアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−２，７−フェナジンジアミン、３，７−ジメチル−２−フェナジンアミン、ｐ−アミノ安息香酸類、たとえば、ｐ−アミノ安息香酸エチル、ｐ−アミノ安息香酸グリセリド、ｐ−アミノ安息香酸イソブチル、ｐ−ジエチルアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸オクチル、ｐ−ジエトキシアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジプロポキシアミノ安息香酸エチル、アセチルサリチル酸、イサチン誘導体類、たとえば、２， ３−ジアミノ安息香酸を含む群からの化合物を包含する。 １態様では、ラッカーゼは染料前駆体を直接に着色化合物に酸化するのに用いられる。 染料前駆体は単独または他の染料前駆体といっしょに用いてもよい。 ジアミンまたはアミノフェノールを染料前駆体として用いる時、共重合における少なくとも１つの中間体はオルトもしくはパラジアミンまたはアミノフェノールでなければならないと信じる。 上記の例は、下記に見い出され、米国特許第3,251,742号（レブロン）にも記載されている（その内容を参照により本明細書に組み入れる）。 任意に本発明の染料組成物（特に毛染め組成物）は、それにより多数の色合いを得ることができる変性剤（カプラー）も含む。 変性剤なしの毛髪染色組成物から生じる毛髪の色は通常ほとんどの人に受け入れ難いので、一般に毛髪のための染色組成物に変性剤が用いられる。 変性剤は典型的にはｍ−ジアミン、ｍ−アミノフェノールまたはポリフェノールである。 変性剤（カプラー）の任意の添加により、たとえばラッカーゼの存在でそれは染料前駆体と反応して、染料前駆体を着色化合物に変換する。 変性剤（カプラー）の例はｍ−フェニレンジアミン、２，４−ジアミノアニソール、１−ヒドロキシナフタレン（α−ナフトール）、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，２−ジヒドロキシベンゼン（ピロカテコール）、１，３−ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、１，３−ジヒドロキシ−２−メチルベンゼン、１，３−ジヒドロキシ− ４−クロルベンゼン（４−クロルレゾルシノール）、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシ−５−メチルベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシトルエンを包含する。 本発明の染色組成物を用いる時、先行技術の染色組成物、たとえば、ルース由来のラッカーゼを含む染色組成物に比較して、最適ΔＥ＊値として決定された、 最大限の染色効果（図１及び図４参照）を得るために、減少した量の酵素（すなわち、１mlの染色組成物当りの酵素タンパク質のmg）が必要である。 本発明の組成物に用いられる染料前駆体及び他の成分の量は通常の業務用の量に従う。 本発明によると、染料組成物を含む製品は１または２の区画の製品であってもよい。 １区画の製品では、ラッカーゼ、染料前駆体及び他の成分を安定化溶液中にいっしょに保管するか、または安全条件下に保管する（すなわち、染料前駆体はラッカーゼにより酸化されない）。 ２区画の製品では、ラッカーゼ及び他の成分を別々に保たれた２つの容器中に保管する。 前記容器の内容物を使用直前に混合する。

使用第２の面では、本発明は、ケラチン繊維、特に毛髪、毛皮、獣皮及び羊毛の永久染色のための本発明の染色組成物の使用に関する。 本発明の染色組成物を用いる時、得られたΔＥ＊値は、相当する染色条件下でルース属由来のラッカーゼを含む染色組成物のものよりも高い（図１参照）。

方法第３の面では、本発明は、本発明の染色組成物と当該ケラチン繊維とを染料前駆体の着色化合物への酸化させるのに適切な条件下で、かつ、十分な時間接触させることを含む、ケチラン繊維の永久染色方法に関する。 染色手順は、室温、好ましくは酵素の最適温度付近で、典型的には10〜60℃で、３〜10、好ましくは５〜９、特に６〜８の範囲のpHで、10〜60分、好ましくは15〜50分、特に20〜40分の時間行なうことができる。 本発明の方法を用いる時、得られたΔＥ＊値は、同じ染色条件下で、少なくとも１つの変性剤の存在または不在下に、少なくとも１ つの染料前駆体を用い、用いられた染料前駆体を染料に酸化させるのに十分な時間、かつ条件下にルース属由来のラッカーゼを用いた相当する方法のものよりも高い。 この方法は１または２以上の染料前駆体を用い、単独または１もしくは２以上の変性剤といっしょに行なうことができる。 材料及び方法 材料

毛髪約15.2cm（６インチ）のデ メオ． バージン天然白髪（De Meo Brothers Inc. 米国）

酵素ノボ ノルディスク バイオテク インコーポレイティドからのWO 95／33836 (PCT／US95／06815)号に記載されたマイセリオフトラ・サーモフィラ ラッカーゼ ノボ ノルディスク バイオテク インコーポレイティドからの米国特許出願60／003,142号に記載されたマイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼ ノボ ノルディスク バイオテク インコーポレイティドからのWO 96／00290 (PCT／US95／07536)号に記載されたポリポラス・ピンシツス ラッカーゼ ルース・バーニシフェラ ラッカーゼ（吉田「J．Chem．Soc．」、472、1983 年） ノボ ノルディスク バイオテク インコーポレイティドからのWO 95／07988 号に記載されたリゾクトニア・ソラニ ノボ ノルディスク バイオテク インコーポレイティドからのWO 95／33837 (PCT／US95／06816)号に記載されたシタリジウム・サーモフィラ ラッカーゼ

生物学的材料の寄託 次の生物学的材料は1994年５月25日にブダペスト条約の下に61604，イリノイ州ペオリア，ユニバーシディ ストリート1815のアグカルチュラル リサーチ サービス パテント カルチャー コレクション、ノーザン リージョナル リサーチ センターに寄託され、次の受託番号を与えられた。

寄託

受託番号 pRaMB5を含有する大腸菌JM101 NRRL B-21261

染料前駆体 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のｐ−フェニレンジアミン(pPD) 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のｐ−トルイレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のクロル−ｐ−フェニレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のｐ−アミノフェノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のｏ−アミノフェノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％の３，４−ジアミノトルエン

変性剤 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のｍ−フェニレンジアミン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％の２，４−ジアミノアニソール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のα−ナフトール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のヒドロキノン 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のピロカテコール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％のレゾルシノール 0.1Ｍ Ｋ−リン酸塩緩衝液pH7.0中の0.1ｗ／ｗ％の４−クロルレゾルシノール 染料前駆体を染色溶液中の最終濃度が前駆体に関して0.1ｗ／ｗ％及び変性剤に関して0.1ｗ／ｗ％となるように上記表示された変性剤の１つと組み合わせる。

他の溶液市販のシャンプー

装置ミノルタCR200彩度計

ラッカーゼ活性の測定（LACU）ラッカーゼ活性を好気性条件下シリンガアルダジン(syringaldazin)の酸化により測定した。 生じた紫色は530nmで測光する。 分析条件は19mMのシリンガアルダジン、23.2mM酢酸塩緩衝液pH5.5、30℃、反応時間１分間である。 １ラッカーゼ単位（LACU）は、これらの条件で１分当り1.0マイクロモルのシリンガアルダジンの変換を触媒する酵素の量である。

毛髪の色の評価毛髪の房の定量的色をミノルタCR200彩度計で、パラメータＬ＊（「０」＝黒で「100」＝白）、ａ＊（「−」＝緑で「＋」＝赤）及びｂ＊（「−」＝青で「 ＋」＝黄色）を用いて測定する。 ΔＬ＊、Δａ＊及びΔｂ＊は未処理の毛髪のＬ＊、ａ＊及びｂ＊にそれぞれ対比したＬ＊、ａ＊及びｂ＊のデルタ値である（たとえばΔＬ＊＝Ｌ＊試料−Ｌ＊ 未処理の毛髪）である。 算し、そして総量的着色変化に対する表現である。 例 例１

染色効果異なるラッカーゼの染色効果を0.1ｗ／ｗ％のｏ−アミノフェノール（染料前駆体）及び0.1ｗ／ｗ％のｍ−フェニレンジアミン（変性剤）を用いて試験し、 同じ条件で対比した。 試験したラッカーゼは、 ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼ マイセリオフトラ・サーモフィラ ラッカーゼ マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１ラッカーゼ変異体 ルース・バーニシフェラ ラッカーゼ リゾクトニア・ソラニ ラッカーゼ シタリジウム・サーモフィラ ラッカーゼであった。

毛染め １ｇの白色デ メオ毛髪の房を用いた。 ４mlの染料前駆体溶液（変性剤を包含する）と１mlのラッカーゼとをワーレイ(Whirley)混合機で混合し、毛髪の房に塗布し、30℃で60分間インキュベートした。 次にその毛髪の房を流水ですすぎ、シャンプーで洗い、水ですすぎ、くしでとかし、空気乾燥させた。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊を彩度計で測定し、次にΔＥ＊を計算した。 酵素なしで処理した毛髪房試料をブラインドとして用いた。 試験結果を図１に示す。 例２

洗浄安定性マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ−変異体及びポリポラス・ピンシツス ラッカーゼを用いて染めた毛髪の洗浄安定性を試験するために白色のデ メオ毛髪（１ｇ）の房を用いた。 酸化的毛染めを、ｐ−フェニレンジアミン(pPD)を染料前駆体として用い、変性剤を用いなかった以外は例１に記載したように行なった。

洗髪染められた毛髪の房を湿らせ、50mlの市販のシャンプーで15秒間洗い、１分間水ですすぎ、空気乾燥させた。 毛髪の房を18回まで洗った。 次いで彩度計でａ＊，ｂ＊及びＬ＊を彩度計で測定し、ΔＥ＊を次いで計算した。 酵素なしで処理した毛髪の房の試料をブラインドとして用いた。 試験の結果を図２に示す。 例３

毛染めの迅速性マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼ及びポリポラス・ピンシツス ラッカーゼを用いる毛染めの迅速性（速度）を試験するために白色のデ メオ毛髪の房（１ｇ）を用いた。 ｐ−フェニレンジアミン(pPD)を染料前駆体として用い、変性剤を用いなかった。 ４mlの染料前駆体溶液と１mlのラッカーゼをワーレイ混合機で混合し、毛髪の房に塗布し、30℃でそれぞれ10分、20分、30分、40分、50分及び60 分インキュベートした。 次いで毛髪の房を流水ですすぎ、シャンプーで洗い、流水ですすぎ、くしでとかし、空気乾燥した。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊を各インキュベーション時間ごとに彩度計で測定し、次にΔＥ＊値を計算した。 酵素を用いずに60分間処理した毛髪の房試料をブラインドとして用いた。 試験の結果を図３に示す。 例４

マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼの染色

効果マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼの染色効果を、ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼと0.1ｗ／ｗ％のｐ−フェニレンジアミン、0.1 ｗ／ｗ％のｐ−トルイレンジアミン、0.1ｗ／ｗ％のクロル−ｐ−フェニレンジアミン、0.1ｗ／ｗ％のｐ−アミノフェノール、0.1ｗ／ｗ％のｏ−アミノフェノール及び0.1ｗ／ｗ％の３，４−ジアミノトルエンをそれぞれ染料前駆体として用いて比較した。 ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼは10LACU／mlの濃度で塗布し、一方マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体ラッカーゼはほんの１LACU／mlの濃度で塗布した。 １ｇの白色のデ メオ毛髪の房を用いた。 ４mlの染料前駆体溶液と１mlのラッカーゼをワーレイ混合機で混合し、毛髪の房に塗布し、30℃で60分間インキュベートした。 次いで毛髪の房を流水ですすぎ、シャンプーで洗い、流水ですすぎ、くしでとかし、空気乾燥した。 ａ＊，ｂ＊及びＬ＊を彩度計で測定し、次にΔＥ＊値を計算した。 酵素を用いない毛髪の房試料をブラインドとして用いた。 試験の結果を表１に示す。 表１から分かるように、マイセリオフトラ・サーモフィラ Ｔ１変異体を含む組成物は、ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼの濃度が10倍も高いのにもかかわらず、ポリポラス・ピンシツス ラッカーゼと同じ位良好に毛髪を染める。 例５

Ｍ．

サーモフィラ ラッカーゼの投与量−応答染色効果 Ｍ． サーモフィラ ラッカーゼの染色効果を染色組成物１ｍ当り0.0001〜0.5mgの酵素タンパク質の濃度のラッカーゼを用いて試験した。 染料前駆体として0.1ｗ／ｗ％のｐ−トルイレンジアミン(PTD)を用いた。 例１に記載されたのと同じ染色手順を用いた。 試験結果を図４に示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月１５日（１９９８．１．１５） 【補正内容】 請求の範囲 １． 染色組成物であって、 ａ）染色組成物１ml当り、０より大で１mgまでの酵素タンパク質のマイセリオフトラ属の菌株由来の微生物ラッカーゼ、 ｂ）１または２以上の染料前駆体及び ｃ）任意に１または２以上の染料変性剤を含む前記組成物。 ２． 請求項１に記載の染色組成物であって、前記ラッカーゼが0.0001〜１mg／ ml、好ましくは0.001〜0.8mg／ml、より好ましくは0.002〜0.5mg／ml、さらにより好ましくは0.003〜0.2mg／ml、特に0.004〜0.1mg酵素タンパク質／ml染色組成物の濃度で存在する前記組成物。 ３． 前記微生物ラッカーゼが糸状菌起原のものである請求項１または２に記載の染色組成物。 ４． 請求項１または２に記載の染色組成物であって、前記マイセリオフトラ ラッカーゼがマイセリオフトラ・サーモフィラ種の菌株、たとえばマイセリオフトラ・サーモフィラ NRRL B 21261またはその変異体、たとえばＴ１変異体由来のものである前記組成物。 ５． 前記ラッカーゼが配列番号１に示された配列によりコードされている請求項４に記載の染色組成物。 ６． 請求項４または５に記載の染色組成物であって、前記ラッカーゼが０より大で１mg／mlまで、好ましくは0.0001〜0.1mg／ml、より好ましくは0.0005〜0.0 5mg／ml、特に0.001〜0.01mg酵素タンパク質／ml染色組成物の濃度で存在する前記組成物。 ７． 請求項１〜６のいずれか１項に記載の染色組成物であって、ｐ−フェニレンジアミン(pPD)、ｐ−トルイレンジアミン(pTD)、クロル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノール、３，４−ジアミノトルエン、２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン、４−メチル−ｏ−フェニレンジアミン、２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、２−クロル−１，４−ジアミノベンゼン、４−アミノジフェニルアミン、１−アミノ−４−β−メトキシエチルアミノベンゼン、１−アミノ−４−ビス−（β−ヒドロキシエチル）−アミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、 ２−メチル−１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６− ジアミノピリジン、１−ヒドロキシ−２−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−３ −アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−β−ヒドロキシエチルアミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−メチルアミノベンゼン、１− メトキシ−２，４−ジアミノベンゼン、１−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン、１−β−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン、フェナジン類、たとえば４，７−フェナジンジカルボン酸、２，７−フェナジンジカルボン酸、２−フェナジンカルボン酸、２，７−ジアミノフェナジン、２，８−ジアミノフェナジン、２，７−ジアミノ−３，８−ジメトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、３−ジメチル−２，８−フェナジンジアミン、２，２′−〔（８−アミノ−７ −メチル−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２，２′−〔（８− アミノ−７−メトキシ−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２，２ ′−〔（８−アミノ−７−クロル−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、２−〔（８−アミノ−７−メチル−２−フェナジニル）アミノ〕−エタノール、２，２′−〔（８−アミノ−２−フェナジニル）イミノ〕ビス−エタノール、３−アミノ−７−（ジメチルアミノ） −２，８−ジメチル−５−フェニルクロリド、９−（ジエチルアミノ）−ベンゾ〔ａ〕フェナジン−１，５−ジオール、Ｎ−〔８−（ジエチルアミノ）−２−フェナジニル〕−メタンスルホンアミド、Ｎ−（８−メトキシ−２−フェナジニル）−メタンスルホンアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−２，７−フェナジンジアミン、３，７−ジメチル−２−フェナジンアミド、ｐ−アミノ安息香酸類、たとえば、ｐ−アミノ安息香酸エチル、ｐ−アミノ安息香酸グリセリド、 ｐ−アミノ安息香酸イソブチル、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸オクチル、ｐ−ジエトキシアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジプロポキシアミノ安息香酸エチル、アセチルサリチル酸、イサチン誘導体類、たとえば２，３−ジアミノ安息香酸を含む群から選択された染料前駆体を含む前記組成物。 ８． 請求項１〜７のいずれか１項に記載の染色組成物であって、ｍ−フェニレンジアミン、２，４−ジアミノアニソール、１−ヒドロキシナフタレン（α−ナフトール）、１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，２−ジヒドロキシベンゼン（ピロカテコール）、１，３ −ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、１，３−ジヒドロキシ−２−メチルベンゼン、１，３−ジヒドロキシ−４−クロルベンゼン（４−クロルレゾルシノール）、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシ−５−メチルベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシトルエンを含む群から選択された染料変性剤を含む前記組成物。 ９． ケラチン繊維、たとえば毛髪、毛皮、獣皮または羊毛の永久染色のための請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物の使用。 10． 請求項１〜８に記載の染色組成物とケラチン繊維とを染料前駆体の着色化合物への酸化させるのに適切な条件下で、かつ、十分な時間接触させることを含むケラチン繊維の染色方法。 11． 前記染色手順を３〜10、好ましくは５〜９、特に６〜８の範囲のpHで行なう請求項10に記載の方法。 12． 前記手順を10〜60分、好ましくは15〜50分、特に20〜40分の時間行なう請求項10または11に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 レルバエク，カレン デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ