包含毁丝霉属漆酶的染色组合物,其在角蛋白纤维染色中的应用和对角蛋白纤维染色的方法

本发明涉及一种包含微生物漆酶的染色组合物，该染色组合物 在进行角蛋白纤维染色，特别是头发、皮毛、兽皮和羊毛染色中的应 用，以及进行角蛋白纤维染色的方法。

用染发的方法来遮盖变灰的头发已经有很多年了。需要这样做 的原因在于灰发是青年时代已然过去的第一征兆的事实，许多人不 愿接受这种事实。

例如，在亚洲的特定地区，男人和女人都广泛使用染料来染发， 这种染料被幽默的人们称为“黑色鞋油”。

在过去的几十年中，染发在西方越来越流行。最初，“朋克”青年 和其他社会批判分子将他们的头发染成极端的颜色做为他们反对主 流社会的一部分，但是今天尤其是青年人也使用染发剂(较“朋克”柔 和的色调)做为一种“化妆品”来改变或更新他们的形象。 染发剂

总的来说，目前市场上的染发组合物主要可分为三种： ——暂时性染发剂 ——半永久性染发剂，以及 ——永久性的氧化型染发剂。

暂时性染发剂只是用于短期内改变头发的自然颜色，通常是将 染料涂于头发表面。这种染发剂用普通的洗发水就很容易除去。

应用半永久性染发剂时，经过五次或更多次的洗发水洗发仍能 保留染过的颜色。这是通过应用对头发角蛋白具有高度亲合力的染 料来达到的，它能渗透到毛干的内部。

永久性染发剂可耐受日晒、洗发水洗发和其他的头发处理，只需 在新头发长出时每月使用一次。这种染发体系的染料直接在头发里 或头发上产生。小分子的芳香族无色染料前体(例如：对苯二胺和邻 氨基苯酚)深入到头发中，在那里其被氧化剂氧化为有色的聚合化合 物。这些有色化合物比染料前体大，不能从头发中洗脱。

在染发组合物中加入被称为改性剂(或偶联剂)的化合物能获得 许多种头发色泽。这样的改性剂有例如邻苯二酚(Cathecol)和间苯 二酚(Resorcinol)。

通常用过氧化氢作氧化剂(助色剂)，它也用作漂白剂。含有过 氧化氢的染色组合物常被称为“增浅染料”，由于过氧化氢有使颜色 变浅的作用。

因为过氧化氢损伤头发，所以在染发组合物中应用过氧化氢有 一些弊病。而且，氧化型的染料通常要求高pH值(一般大约pH9- 10)，这也会在头发和皮肤上造成损伤。因此，如果应用含有过氧化 氢的染料组合物，通常不可用于染头发。

为了克服使用过氧化氢的弊端，建议用氧化酶来代替过氧化氢。

US专利号3,251,742(Revlon)描述了一种通过原位(例如，在 头发上)形成染料来染人头发的方法。应用氧化酶在一个基本上中 性的pH(7-8.5)条件下发生颜色形成反应。提到的合适的氧化酶 有漆酶、酪氨酸酶、多酚酶(polyphenolase)和邻苯二酚酶(cataco- lase)，唯一的作为范例的氧化酶是酪氨酸酶。

EP专利号504,005(Perma S.A.)提到的角蛋白纤维特别是头 发的染色组合物也不需要H2O2(过氧化氢)。该组合物包含一种能 催化聚合染料形成的酶和染料前体，例如碱和偶联剂，该组合物存在 于pH6.5-8的缓冲溶液中，而该酶在pH6.5-8的范围内有最佳活 性。

在这个专利中漆酶的范例是Rhizoctonia praticola漆酶和漆树 (Rhus vernicifera)漆酶。

美国化学协会vol.209，no.1-2，1995的文章摘要公开了从嗜 热小柱孢菌(Scytalidium thermophilum)和嗜热毁丝霉(Mycelioph- thora thermophila)克隆漆酶的过程。该摘要没有提及用所说的漆酶 进行染色。

本发明的目的是提供用于角蛋白纤维，例如头发、皮毛、兽皮和 羊毛的改进的染色组合物，该组合物包含作为氧化剂的氧化酶。

在本发明的范围内用于角蛋白纤维染色的“改进的”组合物指一 种能较快地使角蛋白纤维染上颜色的组合物或者使用较少量的氧化 酶就能获得最佳的染色效果的组合物，该效果通过与相应的现有技 术染色组合物相比较的ΔE*来确定。

此外，也可使用较少量的染料前体。因为一些特定的染料前体 是非常有害健康和致癌的，所以这一点很有好处。

出于使用者方便考虑，那些能更快地对角蛋白纤维，特别是头 发、皮毛、兽皮和羊毛进行染色的组合物是所希望。

再者，希望能在染色组合物中使用较少量的酶。这可使染色方 法更经济。而且产生空气传播蛋白气溶胶的风险也减小了。

目前令人惊奇地发现，通过使用微生物漆酶氧化染料前体可以 提供这种改进的角蛋白纤维染色组合物。

漆酶(苯二酚：氧氧化还原酶)(E.C.分类1.10.3.2，根据En- zyme Nomenclature(1992)Academic Press，Inc.)是催化酚氧化的 含铜多酶。漆酶介导的氧化反应导致从合适的酚类底物产生芳氧基 自由基中间体；所产生的这些中间体最终偶联产生二聚的、寡聚的和 聚合的反应产物的组合。特定的反应产物可以用于形成适于角蛋白 纤维，例如头发和羊毛染色的染料(见下)。

首先，本发明的目的是提供一种染色组合物，它包括：

a)每毫升微生物漆酶的染色组合物中0以上-1毫克酶蛋白，

b)一种或多种染料前体，

c)任选的一种或多种改性剂。

特别关注的是微生物来源的漆酶，源于毁丝霉属(Mycelio ph- thora)的一个菌株。

本发明的另一方面涉及本发明的染色组合物在对角蛋白纤维， 诸如头发、皮毛、兽皮和羊毛进行染色中的应用。

本发明也涉及一种角蛋白纤维染色方法，它包括在适当的条件 下使本发明的染色组合物接触上述角蛋白纤维一段时间，这段时间 足以允许染料前体氧化成一种有色化合物。

本发明还涉及漆酶在对角蛋白纤维进行永久性染色中的应用， 这里所说的漆酶是一种在相同染色条件下能使ΔE*值比源于漆树 (Rhus)的漆酶的ΔE*值高的漆酶。

这意味着，当用本发明的一种染色组合物染角蛋白纤维时，测定 的ΔE*值比用含有源于漆树的一种漆酶的染色组合物在相同条件 下染相同的角蛋白纤维测定的ΔE*值高。

术语“相同的染色条件”指的条件是，例如酶浓度或酶活力、染色 保温时间、染色保温温度、pH情况、角蛋白纤维类型(比如头发类型) 是一样的，还有用同样的染料前体和改性剂。换句话说，它限定的条 件平行于所选择的特定染色条件。可以选择在下面的实施例中所描 述的染色条件。

在本发明的范围内，“较高的”ΔE*值规定总的定量颜色变化超 过一个ΔE*单位。  

ΔE*从测定的参数a*、b*和L*的值计算出，所述参数例如在 一个Minolta CR200 Chroma Meter上测定，使用公式 △E*＝√(ΔL*2+Δa*2+△b*2)。a*、b*和L*的意义在下面的“材料与 方法”部分进行解释。

图1显示了六种不同漆酶的染色效果。这六种漆酶是Poly- porus pinsitus漆酶(rPp-漆酶)、嗜热毁丝霉漆酶(Mt-漆酶wt.)、 嗜热毁丝霉T1变种漆酶(Mt-漆酶(var))、漆树漆酶(Rv1-FXu- 1)，嗜热小柱孢菌漆酶(rStL-FXu-1)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)漆酶(rRsL-3-FXu-1)。邻氨基苯酚被用作染料前体，而 间苯二胺被用作改性剂。

图2显示了嗜热毁丝霉T1变种漆酶(Mt-漆酶(var)和Poly- porus pinsitus漆酶(rPp-漆酶)作为氧化剂的洗涤稳定性。

图3显示了用嗜热毁丝霉T1变种漆酶(Mt-漆酶(var)和Poly- porus pinsitus漆酶(rPp-漆酶)作为氧化剂的快速程度(速度)。

图4显示了嗜热毁丝霉漆酶染色效果的剂量一响应，所用的量 从每毫升染色组合物中0.0001到0.5毫克酶蛋白。

本发明的目的是提供含有一种氧化酶的用于角蛋白纤维，诸如 头发、皮毛、兽皮和羊毛永久性染色的改进的染色组合物。

目前令人惊奇地发现，通过使用微生物漆酶氧化染料前体可以 提供这种改进的染色组合物。 染色组合物

本发明的第一个方面涉及一种染色组合物，其包括：

a)每毫升微生物漆酶的染色组合物中0以上-1毫克酶蛋白，

b)一种或多种染料前体，以及

c)任选一种或多种染料改性剂。

在本发明的一个优选的实施方案中，漆酶在染色组合物中存在 的浓度范围可以为0.0001-1mg/ml，优选0.001-0.8mg/ml，更优 选0.002-0.5，甚至更优选0.003-0.2，特别是0.004-0.1mg酶 蛋白/ml染色组合物。

当用本发明的一种组合物进行永久性染色时，所得到的ΔE*值 高于在相同染色条件下用含有源于漆树的一种漆酶的染色组合物所 得到的ΔE*值。

漆树漆酶的一个例子是来源于日本漆树Rhus vernicifera的漆 酶(Yoshida，(1883)，J.Chem.Soc，472)。在下面的实施例1中 应用了这种漆树漆酶。

根据本发明，所用的微生物漆酶是真菌或细菌来源的，特别是丝 状真菌来源的。

在本发明的一个实施方案中，微生物漆酶源于毁丝霉属的一个 菌株，诸如嗜热毁丝霉种的一个菌株，例如在Novo Nordisk的 WO95/33836(PCT/US95/06815)中描述的纯化的漆酶，该文献引 入本文作参考。下面的SEQ ID NO1显示了编码源于嗜热毁丝霉的 一种合适的漆酶的DNA序列。

含有包括SEQ ID NO1的表达载体pRaMB5的大肠杆菌 JM101已经按照布达佩斯条约保藏在The Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center， 1815 University Street，Peoria，Illinois，61604。该载体已经获取了 保藏号NRRL B-21261。

根据本发明，来源于其他微生物的、与来源于嗜热毁丝霉的 SEQ ID NO1相比有超过80％同源性的漆酶也加以了考虑。

另外，毁丝霉属漆酶也包括能在嗜热毁丝霉中找到的漆酶的其 它形式，以及能在其他真菌中找到的漆酶的其它形式，这些真菌是属 于Apinis所描述的嗜热毁丝霉的定义范围的同物异名体(Nova Hedwigia 5，57-78，1963)，被命名为嗜热侧孢(Sporotrichum ther- mophile)。后来的分类版本将其归入金孢子菌属(Chysosporium) (Von klopotek，A.Arche.，(1974)Microbiol，98，365-369)，再后来 归入毁丝霉属(Myceliophthora)(Van Oorshot，Persoonia，(1977)， 9，401-408)。许多其他命名的微生物也属于这个种。它们包括嗜 纤维侧孢(Sporotrichum cellulophilum)(US专利号4,106,989)、嗜热 梭孢壳(Thielavia thermophila)(Fergus and Sinden(1968)，Can.J. Botany，47，1635-1637)、Chrysosporium fergussi和Corynascus thermophilus(Von Klopotek，同上)。

根据本发明也考虑了漆酶变体的应用。

一个漆酶变体的例子是在PCT/US96/14087(Novo Nordisk)中 描述的嗜热毁丝霉T1变体。

T1变体(或类型I变体)是修饰过的铜蓝氧化酶，包括漆酶。T1 变体能够通过例如定点诱变来构建，与相关的野生型铜蓝氧化酶的 差别在于类型I(T1)铜位点中的至少一个氨基酸残基。这些修饰通 常导致相对于野生型酶的pH范围和/或特异活性的改变。当把这 种酶用于染色组合物时这可能是有利的。

更特殊的嗜热毁丝霉T1漆酶变体可含有509VSGGL511序列 或者可被修饰以增加T1铜位点的至少一个片段的负电荷。

上述的微生物漆酶可有利地用于角蛋白纤维永久性染色组合 物。这样的组合物比包含例如实施例1所示的漆树漆酶的相应组合 物具有更好的染色效果。

嗜热毁丝霉T1变体漆酶比Polyporus pinsitus漆酶洗涤稳定性 更强，染色更快，这分别在实施例2和3中得到证明。

实施例4显示与Polyporus pinsitus漆酶相比，为得到合适的染 色效果所需的毁丝霉漆酶活力(即LACU/ml)更少。

实施例5显示对于嗜热毁丝霉漆酶，每毫升染色组合物大约0. 005毫克酶蛋白将获得最佳染色效果。

在毁丝霉漆酶用于永久性染色组合物的情况中，漆酶浓度在0 以上-1mg/ml是有利的，优选0.0001-0.1mg/ml，更优选0.0005 -0.05mg/ml，特别是0.001-0.01mg酶蛋白/ml染色组合物。

可以理解漆酶可在宿主细胞，诸如丝状真菌、酵母或细菌中同源 性地或异源性地产生。

丝状真菌宿主细胞的例子包括木霉属(Trichoderma)种的菌株， 优选Trichoderma harzianum或Trichoderma reesei的一个菌株；或者 是镰孢属(Fusarium)的一个种；或者是曲霉属(Aspergillus)的一个 种，最优选米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)；或者是酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)的一个菌株， 特别是酵酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccha- romyces kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；裂殖酵母 (Schizosaccharomyces sp.)的一个菌株，比如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)；汉逊酵母(Hansenula sp.)、毕赤酵母 (Pichia sp.)、Yarrowia sp.比如Yarrowia lipolytica或克鲁维酵 母(Kluyveromyces sp.)比如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 的一个菌株；或者细菌，例如革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属(Bacil- lus)菌株、诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、 嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alka- lophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、 巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis) 的菌株，或者是链霉菌属(streptomyces)菌株诸如浅青紫链霉菌(S. lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)的菌株；或者革兰氏阴性细菌诸 如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。

为了给角蛋白纤维染色，本发明的染色组合物中包含一种或多 种染料前体，它们可被氧化剂转变为有色化合物，根据本发明，这种 氧化剂是一种微生物漆酶。

此外，染料前体可以是但不限于芳香族化合物，属于三个主要化 学物质家族之一：二胺类、氨基苯酚(或氨基萘酚)类和苯酚类。靛红 衍生染料前体的例子可以在DE 4,314,317-A1中找到。另外，许 多吲哚或二氢吲哚衍生的染料前体在WO94/00100中公开。在这 些文件中提到的染料前体收入本文供参考。

合适的染料前体的例子包括下组化合物：对苯二胺(PPD)、对甲 代苯二胺(PTD)、氯对苯二胺、对氨基苯酚、邻氨基苯酚、3，4-二氨 基甲苯、2-甲基-1，4-二氨基苯、4-甲基-邻苯二胺、2-甲氧基 -对苯二胺、2-氯-1，4-二氨基苯，4-氨基二苯胺、1-氨基-4- β-甲氧基乙基氨基苯、1-氨基-4-双-(β-羟乙基)-氨基苯、1， 3-二氨基苯、2-甲基-1，3-二氨基苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二 氨基吡啶、1-羟基-2-氨基苯、1-羟基-3-氨基苯、1-甲基-2 -羟基-4-氨基苯、1-甲基-2-羟基-4-β-羟乙基氨基苯、1- 羟基-4-氨基苯、1-羟基-4-甲基氨基苯、1-甲氧基-2，4-二 氨基苯、1-乙氧基-2，3-二氨基苯、1-β-羟基乙氧基-2，4-二 氨基苯、吩嗪、诸如4，7-吩嗪二羧酸、2，7-吩嗪二羧酸、2-吩嗪羧 酸、2，7-二氨基吩嗪、2，8-二氨基吩嗪、2，7-二氨基-3，8-二甲 氧基吩嗪、2，7-二氨基-3-甲氧基吩嗪、2，7-二氨基-3-甲氧基 吩嗪、3-二甲基-2，8-吩嗪二胺、2，2′-[(8-氨基-7-甲基-2 -吩嗪基)亚氨基]双-乙醇、2，2′-[(8-氨基-7-甲氧基-2-吩 嗪基)亚氨基]双-乙醇、2，2′-[(8-氨基-7-氯-2-吩嗪基)亚 氨基]双-乙醇、2-[(8-氨基-7-甲基-2-吩嗪基)氨基]-乙 醇、2，2′-[(8-氨基-2-吩嗪基)亚氨基]双-乙醇、3-氨基-7- (二甲基氨基)-2，8-二甲基-5-苯基氯、9-(二乙基氨基)-苯并 [a]吩嗪-1，5-二醇、N-[8-(二乙基氨基)-2-吩嗪基]-甲烷 磺酰胺、N-(8-甲氧基-2-吩嗪基)-甲烷磺酰胺、N，N，N′，N′- 四甲基-2，7-吩嗪二胺，3，7-二甲基-2-吩嗪胺，对氨基苯甲酸 类，诸如对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸甘油酯、对氨基苯甲酸异 丁酯、对二甲基氨基苯甲酸戊酯(p-dimethylamino benzoic acid amil)、对二甲基氨基苯甲酸辛酯、对二乙氧基氨基苯甲酸戊酯、对二 丙氧基氨基苯甲酸乙酯、乙酰水杨酸，靛红衍生物，诸如2，3-二氨 基苯甲酸。

一个实施方案中，将漆酶与染料前体一起使用，直接将其氧化成 有色化合物。染料前体可以单独或与其他染料前体组合使用。

据信，当把二胺或氨基苯酚用作染料前体时，至少共聚合反应中 的一种中间体一定是邻或对二胺或氨基苯酚。这样的例子可在下文 找到，在US专利号3,251,742(Revlon)中也有描述，该专利的内容 收入本文供参考。

本发明染色组合物(特别是染发组合物)也任选地包括一种改性 剂(偶联剂)，通过它可获得各种色泽。

通常改性剂用于染发组合物中，因为没有改性剂的染发组合物 得到的头发颜色常常不被大多数人所接受。

改性剂通常是间二胺、间氨基苯酚、或多酚。一旦任选添加改性 剂(偶联剂)，它就在例如漆酶的存在下与染料前体反应，将染料前体 转变为有色化合物。

改性剂(偶联剂)的例子包括间苯二胺、2，4-二氨基苯甲醚、1- 羟基萘(α-萘酚)、1，4-二羟基苯(氢醌)、1，5-二羟基萘，1，2-二 羟基苯(邻苯二酚)、1，3-二羟基苯(间苯二酚)，1，3-二羟基-2- 甲基苯，1，3-二羟基-4-氯苯(4-氯间苯二酚)、1，2，3-三羟基 苯、1，2，4-三羟基苯、1，2，4-三羟基-5-甲基苯、1，2，4-三羟基 甲苯。

当使用本发明的染色组合物时需要用较少量的酶(例如毫克酶 蛋白/毫升染色组合物)就可获得最大染色效果(见图1和图4)，与 现有技术染色组合物如含有源于漆树的漆酶的染色组合物相比，其 被确定为最佳ΔE*值。

用于本发明组合物的染料前体和其他成份的量与通常的商业用 量一致。

根据本发明，含有染色组合物的产品可以是一区室产品或二区 室产品。在一区室产品中漆酶、染料前体和其他成分放在一起，在一 种稳定的溶液中或保存在稳定的条件下(例如，染料前体不被漆酶氧 化)。在二区室产品中漆酶、染料前体和其他成分保存在两个分开的 容器中。容器中的内含物在临用前混和。 应用

本发明的第二方面涉及本发明的染色组合物应用于角蛋白纤 维，特别是头发、皮毛、兽皮和羊毛的永久性染色。

用本发明的染色组合物得到的ΔE*值高于在相同条件下使用 含有源于漆树属的漆酶的染色组合物(见图1)所得到的值。 方法

本发明的第三方面涉及角蛋白纤维永久性染色的方法，包括将 本发明的染色组合物与上述角蛋白纤维在合适的条件下接触一段时 间，这一段时间足以使染料前体氧化为有色化合物。

染色过程可以在室温下进行，最好在酶的最适温度附近，通常为 10-60℃；pH范围为3-10，最好是5-9，特别是6-8；时间为10- 60分钟，最好是15-50分钟，特别是20-40分钟。

当使用本发明的方法时，获得的ΔE*值高于在同样染色条件下 使用源于漆树属的品系的漆酶的相应方法得到的ΔE*值，具有或缺 乏至少一种改性剂，至少一种染料前体，一定的时间，以及条件足够 允许用于氧化染料的染料前体氧化。

该方法能用一种或多种染料前体，单独或与一种或多种改性剂 组合实施。 材料与方法 材料： 头发： 6″De Meo Virgin Natural White Hair(De Meo Brothers Inc.USA) 酶： WO 95/33836(PCT/US95/06815)中描述的嗜热毁丝霉漆酶，来自 Novo Nordisk Biotech，Inc. US专利申请60/003,142中描述的嗜热毁丝霉T1变体漆酶，来自 Novo Nordisk Biotech，Inc. WO 96/00290(PCT/US95/07536)中描述的Polyporus pinsitus漆 酶，来自Novo Nordisk Biotech，Inc. 漆树漆酶(Yoshida，J.Chem.Soc.，472(1883) WO 95/07988中描述的立枯丝核菌漆酶，来自Novo Nordisk Biotech，Inc. WO 95/33837(PCT/US95/06816)中描述的嗜热小柱孢菌漆酶，来 自Novo Nordisk Biotech，Inc. 生物材料的保藏

下列生物材料已经于1994年5月25日按布达佩斯条约的条款 保藏在the Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern Regional Research Center，1815 University Street，Peoria， Illinois，61604并获取如下保藏号。 保藏物                         保藏号 含pRaMB5的大肠杆菌JM101        NRRL B-21261 染料前体： 0.1％w/w对苯二胺于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0(pPD) 0.1％w/w对甲代苯二胺于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w氯对苯二胺于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w对氨基苯酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w邻氨基苯酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w3，4-二氨基甲苯于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 改性剂： 0.1％w/w间苯二胺于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w2，4-二氨基苯甲醚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/wα-萘酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w氢醌于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w邻苯二酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w间苯二酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0 0.1％w/w4-氯间苯二酚于0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0

染料前体与上述改性剂之一组合起来，在染色溶液中的终浓度 就前体而言是0.1％w/w，就改性剂而言是0.1％w/w。 其他溶液： 商品洗发水 装置： Minolta CR200 Chroma Meter 漆酶活性(LACU)的确定

漆酶活性是在有氧条件下从丁香醛连氮氧化而确定的。产生的 紫色于530nm下光测量。分析条件是19mM的丁香醛连氮，23. 2mM的乙酸盐缓冲液，pH5.5，30℃，1分钟反应时间。

1个漆酶单位(LACU)指在这些条件下每分钟催化1.0微摩尔 丁香醛连氮转化的酶量。 头发颜色的评价

发束的颜色在Minolta CR200 Chroma Meter上通过应用参数 L*(“0”＝黑色和“100”＝白色)、a*(“-”＝绿色和“+”＝红色)与 b*(“-”＝蓝色和“+”＝黄色)定量。

ΔL*、Δa*和Δb*分别是与未处理头发的L*、a*和b*相比的 L*、a*和b*的Δ值(例：/L*＝L样品*-L未处理头发*)

ΔE*根据   ΔE*＝√(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)计算出，表示颜色 变化的总量。

实施例

实施例1 染色效果

不同漆酶的染色效果在相同的条件下用0.1％w/w邻氨基苯 酚(染料前体)和0.1％w/w间苯二胺(改性剂)检测并进行比较。

被检测的漆酶是 一种Polyporus pinsitus  漆酶 一种嗜热毁丝霉漆酶 一种嗜热毁丝霉T1漆酶变体 一种漆树漆酶 一种立枯丝核菌漆酶 一种嗜热小柱孢菌漆酶 染发

使用了一克白色De Meo发束。

4毫升染料前体溶液(含有改性剂)与1毫升漆酶在一个 Whirley混合器上混匀，涂于该发束上，在30℃保温60分钟。

然后用流水冲洗发束，用洗发水洗，用水冲洗、梳、并空气干燥。

a*、b*和L*在Chroma Meter上确定，然后计算出ΔE*。

未用酶处理的发束样品作为参照。

实验结果显示于图1。

实施例2 洗涤稳定性

用白色De Meo发束(1克)检验用嗜热毁丝霉T变体漆酶和 Polyporus pinsitus漆酶染色的头发的洗涤稳定性。

根据实施例1进行氧化型染发，所不同的是对苯二胺(pPD)用 作染料前体而未用改性剂。 洗发

把染过的发束弄湿，用50ml商品洗发水洗15秒，用水冲洗1分 钟，空气干燥。该发束被洗了多达18次。

然后在Chroma Meter上测定a*、b*和L*，再计算出ΔE*值。

未用酶处理的发束样品用作参照。

实验结果显示于图2。

实施例3 染发速度

用白色De Meo发束(1克)检测应用嗜热毁丝霉T1变体漆酶和 Polyporus pinsitus漆酶染发的速度。

对苯二胺用作染料前体而未使用改性剂。

4毫升染料前体溶液与1毫升漆酶在Whirley混合器上混合，涂 到发束上，在30℃分别保温10、20、30、40、50和60分钟。

然后用流水冲洗发束，用洗发水洗，用流水冲洗，梳，并空气干 燥。

在Chroma Meter上测定每个保温时间的a*、b*和L*，然后计 算出ΔE*值。

不加酶处理60分钟的发束样品作为参照。

实验结果显示于图3。

实施例4 嗜热毁丝霉T1变体漆酶的染色效果

分别用下列物质作为染料前体，将嗜热毁丝霉T1变体漆酶的 染色效果与Polyporus pinsitus漆酶作比较：0.1％w/w对苯二胺、0. 1％w/w对甲代苯二胺、0.1％w/w氯对苯二胺、0.1％w/w对氨基 苯酚、0.1％邻氨基苯酚和0.1％w/w3，4-二氨基甲苯。

Polyporus pinsitus漆酶的使用浓度为10 LACU/ml，而嗜热毁丝 霉T1变体漆酶的使用浓度仅1 LACU/ml。

使用了1克白色De Meo发束。

4毫升染料前体溶液与1毫升漆酶在Whirley混合器上混合，涂 到发束上，在30℃保温60分钟。

然后用流水冲洗发束，用洗发水洗，用流水冲洗，梳，并空气干 燥。

在Chroma Meter上测定a*、b*和L*，然后计算出ΔE*值。

不加酶处理的发束样品作为参照。

实验结果列于表1 表1     样品 Polyporus pinsitus   漆酶ΔE*     嗜热毁丝霉   T1变体漆酶ΔE*     对苯二胺参照     9.7     10.9     对苯二胺+漆酶     52.7     52.9     对甲代苯二胺参照     16.1     18.6     对甲代苯二胺+漆酶     39.1     38.2     氯对苯二胺参照     2.6     4.0     氯对苯二胺+漆酶     40.5     39.2     对氨基苯酚参照     6.2     7.0     对氨基苯酚+漆酶     32.4     28.1     邻氨基苯酚参照     5.6     6.4     邻氨基苯酚+漆酶     22.9     22.0     3，4-二氨基甲苯参照     3.4     2.6     3，4-二氨基甲苯+漆酶     36.5     42.2

从表1可以看出，尽管Polyporus pinsitus漆酶的浓度高出十倍， 含有嗜热毁丝霉T1漆酶变体的组合物染发的效果与Polyporus pin- situs漆酶一样好。

实施例5 嗜热毁丝霉漆酶染色效果的剂量响应

嗜热毁丝霉漆酶的染色效果在0.0001-0.5毫克酶蛋白/毫升 漆酶染色组合物的浓度范围内进行了检测。0.1％w/w对甲代苯二 胺(PTD)用作染料前体。

应用了实施例1中所描述的同样的染色方法。

实验结果显示于图4。

               序列表 (1)一般信息： (i)申请人：   (A)名称：Novo Nordisk A/S   (B)街道：Novo Alle   (C)城市：Bagsvaerd   (D)国家：Denmark   (E)邮政编码(ZIP)：DK-2880   (F)电话：+45 4444 8888   (G)传真：+45 4449 3256 (ii)发明名称：具有改进的染色性能的漆酶 (iii)序列数目：2 (v)计算机可读形式：   (A)介质类型：软盘   (B)计算机：IBM PC相容机   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30 (2)SEQ ID NO：1的信息：   (1)序列特征：

(A)长度：3192碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性   (ii)分子类型：DNA(基因组的)   (ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位点：连接(586..831，917..994，1079..1090，1193..1264，

   1337..2308，2456..2524，2618..3028)   (xi)序列描述：SEQ ID NO：1： TCTAGCTTCT TTGGTCACCG TCGTTTTCGC CCGCCCCCTC CCTCCTTCAA CCCCCTGAGT        60 AGTCGGCTAA GCGATCCTCA ATCTGGTCTT GTGAGGTCAC GTCCTCCAGC AGATGACAGT       120 TCATCGAGCG AGTGATCTCC ACCACCCAGA AGGGAGGGGG GATGCGCGCA TGCTCCAACA       180 TCCCTGGTGT CGCTAGAGAC GTCGCGGCAT CAGCCTTTTC ATCACACCGA GCACGTCCAC       240 GGACCGGCTC CTTTCACCCC CGCGTCCTCC GGAGGATTGA GTCACGATAT TTCGGGATGT       300 GGGAAGGGGG AGAGAAAGGA GGGGGGAGGG GCGGAAACAT GTTGGATACG AGCTGCGCCC       360 CTTTTTCAAC ATCGAGAACA GGAAGTCGTT GGTGTCGGCC GTAATGTCTA TAAAACGAGG       420 CTCCTTCTCG TCGTCGACTT GTCTCAGGTT CTCTCTCTCG TCCACACCAA GCCAGTCTTG       480 CCTGAGCCAC CTGAGCCACC TTCAACTCAT CATCTTCAGT CAAGTCGTTC ATTGACATTG       540 TGTCTCTCTT TCTATCGAGT CGGCTTCCCG GCCCTTCACC ACAAC ATG AAG TCC           594

                                              Met Lys Ser

                                                1 TTC ATC AGC GCC GCG ACG CTT TTG GTG GGC ATT CTC ACC CCT AGC GTT         642 Phe Ile Ser Ala Ala Thr Leu Leu Val Gly Ile Leu Thr Pro Ser Val

  5                  10                  15 GCT GCT GCC CCT CCA TCC ACC CCT GAG CAG CGC GAC CTG CTC GTC CCG         690 Ala Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Glu Gln Arg Asp Leu Leu Val Pro  20                  25                  30                  35 ATC ACG GAG AGG GAG GAG GCA GCC GTG AAG GCT CGC CAG CAG AGC TGC         738 Ile Thr Glu Arg Glu Glu Ala Ala Val Lys Ala Arg Gln Gln Ser Cys

             40                  45                  50 AAC ACC CCC AGC AAC CGG GCG TGC TGG ACT GAC GGA TAC GAC ATC AAC         786 Asn Thr Pro Ser Asn Arg Ala Cys Trp Thr Asp Gly Tyr Asp Ile Asn

         55                  60                  65 ACC GAC TAC GAA GTG GAC AGC CCG GAC ACG GGT GTT GTT CGG CCG             831 Thr Asp Tyr Glu Val Asp Ser Pro Asp Thr Gly Val Val Arg Pro

     70                  75                  80 GTGAGTGCTC TCGTTAATTA CGCTTCGGCG AGTTGCGCAG ATATATTAAA TACTGCAAAC       891 CTAAGCAGGA GCTGACATGC GACAG TAC ACT CTG ACT CTC ACC GAA GTC GAC         943

                        Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Glu Val Asp

                                 85                  90 AAC TGG ACC GGA CCT GAT GGC GTC GTC AAG GAG AAG GTC ATG CTG GTT         991 Asn Trp Thr Gly Pro Asp Gly Val Val Lys Glu Lys Val Met Leu Val

         95                 100                 105 AAC GTACGGCACC CCTTTTCTTG TCCTAGGATC TGGGTGATGT GCGTCGTTGC             1044 Asn CCCTGAGAGA GACTGACCGA GCCTTTGGCT GCAG AAT AGT ATA ATC GTAATTAATT       1100

                                  Asn Ser Ile Ile

                                      110 ATACCGCCCT GCCTCCAGCA GCCCCAGCAG CTCGAGAAGG GTATCTGAAG TTAGTCAGGC      1160 CTGCTGACCT GACCGGGGCC AACCCACCAT AG GGA CCA ACA ATC TTT GCG GAC        1213

                                Gly Pro Thr Ile Phe Ala Asp

                                        115 TGG GGC GAC ACG ATC CAG GTA ACG GTC ATC AAC AAC CTC GAG ACC AAC        1261 Trp Gly Asp Thr Ile Gln Val Thr Val Ile Asn Asn Leu Glu Thr Asn 120                 125                 130                 135 GGC GTATGTCTGC TGCTTGCTCT CTTGCTCTCC TCGTCCGCGA CTAATAATAA            1314 Gly TATCAACTCG TGTGGAAAAC AG ACG TCG ATC CAC TGG CAC GGA CTG CAC CAG      1366

                     Thr Ser Ile His Trp His Gly Leu His Gln

                                 140                 145 AAG GGC ACC AAC CTG CAC GAC GGC GCC AAC GGT ATC ACC GAG TGC CCG       1414 Lys Gly Thr Asn Leu His Asp Gly Ala Asn Gly Ile Thr Glu Cys Pro

        150                 155                 160 ATC CCG CCC AAG GGA GGG AGG AAG GTG TAC CGG TTC AAG GCT CAG CAG       1462 Ile Pro Pro Lys Gly Gly Arg Lys Val Tyr Arg Phe Lys Ala Gln Gln

    165                 170                 175 TAC GGG ACG AGC TGG TAC CAC TCG CAC TTC TCG GCC CAG TAC GGC AAC       1510 Tyr Gly Thr Ser Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gln Tyr Gly Asn

180                 185                 190 GGC GTG GTC GGG GCC ATT CAG ATC AAC GGG CCG GCC TCG CTG CCG TAC       1558 Gly Val Val Gly Ala Ile Gln Ile Asn Gly Pro Ala Ser Leu Pro Tyr 195                 200                 205                 210 GAC ACC GAC CTG GGC GTG TTC CCC ATC AGC GAC TAC TAC TAC AGC TCG       1606 Asp Thr Asp Leu Gly Val Phe Pro Ile Ser Asp Tyr Tyr Tyr Ser Ser

            215                 220                 225 GCC GAC GAG CTG GTG GAA CTC ACC AAG AAC TCG GGC GCG CCC TTC AGC       1654 Ala Asp Glu Leu Val Glu Leu Thr Lys Asn Ser Gly Ala Pro Phe Ser

        230                 235                 240 GAC AAC GTC CTG TTC AAC GGC ACG GCC AAG CAC CCG GAG ACG GGC GAG       1702 Asp Asn Val Leu Phe Asn Gly Thr Ala Lys His Pro Glu Thr Gly Glu

    245                 250                 255 GGC GAG TAC GCC AAC GTG ACG CTC ACC CCG GGC CGG CGG CAC CGC CTG       1750 Gly Glu Tyr Ala Asn Val Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg His Arg Leu        

260                 265                 270 CGC CTG ATC AAC ACG TCG GTC GAG AAC CAC TTC CAG GTC TCG CTC GTC       1798 Arg Leu Ile Asn Thr Ser Val Glu Asn His Phe Gln Val Ser Leu Val 275                 280                 285                 290 AAC CAC ACC ATG ACC ATC ATC GCC GCC GAC ATG GTG CCC GTC AAC GCC       1846 Asn His Thr Met Thr Ile Ile Ala Ala Asp Met Val Pro Val Asn Ala

            295                 300                 305 ATG ACG GTC GAC AGC CTC TTC CTC GGC GTC GGC CAG CGC TAC GAT GTC       1894 Met Thr Val Asp Ser Leu Phe Leu Gly Val Gly Gln Arg Tyr Asp Val

        310                 315                 320 GTC ATC GAA GCC AGC CGA ACG CCC GGG AAC TAC TGG TTT AAC GTC ACA       1942 Val Ile Glu Ala Ser Arg Thr Pro Gly Asn Tyr Trp Phe Asn Val Thr

    325                 330                 335 TTT GGC GGC GGC CTG CTC TGC GGC GGC TCC AGG AAT CCC TAC CCG GCC       1990 Phe Gly Gly Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Arg Asn Pro Tyr Pro Ala

340                 345                 350 GCC ATC TTC CAC TAC GCC GGC GCC CCC GGC GGC CCG CCC ACG GAC GAG       2038 Ala Ile Phe His Tyr Ala Gly Ala Pro Gly Gly Pro Pro Thr Asp Glu 355                 360                 365                 370 GGC AAG GCC CCG GTC GAC CAC AAC TGC CTG GAC CTC CCC AAC CTC AAG       2086 Gly Lys Ala Pro Val Asp His Asn Cys Leu Asp Leu Pro Asn Leu Lys

            375                 380                 385 CCC GTC GTG GCC CGC GAC GTG CCC CTG AGC GGC TTC GCC AAG CGG CCC       2134 Pro Val Val Ala Arg Asp Val Pro Leu Ser Gly Phe Ala Lys Arg Pro

        390                 395                 400 GAC AAC ACG CTC GAC GTC ACC CTC GAC ACC ACG GGC ACG CCC CTG TTC       2182 Asp Asn Thr Leu Asp Val Thr Leu Asp Thr Thr Gly Thr Pro Leu Phe

    405                 410                 415 GTC TGG AAG GTC AAC GGC AGC GCC ATC AAC ATC GAC TGG GGC AGG CCC       2230 Val Trp Lys Val Asn Gly Ser Ala Ile Asn Ile Asp Trp Gly Arg Pro

420                 425                 430 GTC GTC GAC TAC GTC CTC ACG CAG AAC ACC AGC TTC CCA CCC GGG TAC       2278 Val Val Asp Tyr Val Leu Thr Gln Asn Thr Ser Phe Pro Pro Gly Tyr 435                 440                 445                 450 AAC ATT GTC GAG GTG AAC GGA GCT GAT CAG GTAAGAAAAA GGGGACCGCA         2328 Asn Ile Val Glu Val Asn Gly Ala Asp Gln

            455                 460 GGGGTGCTGC TGCAAGTACA CCTTGCTCGC CCTCCTGTTC TTCCTTAATA ACTACCTCCC     2388 AACCCTCCCC CCTAATTAAT TCACTTTAAA GGCCGATCAA GACTGACCGA GCCCCCTCTC     2448 TTTGCAG TGG TCG TAC TGG TTG ATC GAG AAC GAT CCC GGC GCA CCT TTC       2497

    Trp Ser Tyr Trp Leu Ile Glu Asn Asp Pro Gly Ala Pro Phe

                    465                 470 ACC CTA CCG CAT CCG ATG CAC CTG CAC GTAAGTTGGA TACATATATA             2544 Thr Leu Pro His Pro Met His Leu His 475                 480 TATATATATA TACATTGCTT TCCTGGCTCG CTCCCTTAAA TAAATTAAA TAACCAAAAA      2604 TAACAAAAAA AAG GGC CAC GAC TTT TAC GTG CTG GGC CGC TCG CCC GAC        2653

           Gly His Asp Phe Tyr Val Leu Gly Arg Ser Pro Asp

               485                 490                 495 GAG TCG CCG GCA TCC AAC GAG CGG CAC GTG TTC GAT CCG GCG CGG GAC       2701 Glu Ser Pro Ala Ser Asn Glu Arg His Val Phe Asp Pro Ala Arg Asp

            500                 505                 510 GCG GGC CTG CTG AGC GGG GCC AAC CCT GTG CGG CGG GAC GTG ACG ATG       2749 Ala Gly Leu Leu Ser Gly Ala Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Thr Met

        515                 520                 525 CTG CCG GCG TTC GGG TGG GTG GTG CTG GCC TTC CGG GCC GAC AAC CCG       2797 Leu Pro Ala Phe Gly Trp Val Val Leu Ala Phe Arg Ala Asp Asn Pro

    530                 535                 540 GGC GCC TGG CTG TTC CAC TGC CAC ATC GCC TGG CAC GTC TCG GGC GGC       2845 Gly Ala Trp Leu Phe His Cys His Ile Ala Trp His Val Ser Gly Gly

545                 550                 555 CTG GGC GTC GTC TAC CTC GAG CGC GCC GAC GAC CTG CGC GGG GCC GTC       2893 Leu Gly Val Val Tyr Leu Glu Arg Ala Asp Asp Leu Arg Gly Ala Val 560                 565                 570                 575 TCG GAC GCC GAC GCC GAC GAC CTC GAC CGC CTC TGC GCC GAC TGG CGC       2941 Ser Asp Ala Asp Ala Asp Asp Leu Asp Arg Leu Cys Ala Asp Trp Arg

            580                 585                 590 CGC TAC TGG CCT ACC AAC CCC TAC CCC AAG TCC GAC TCG GGC CTC AAG       2989 Arg Tyr Trp Pro Thr Asn Pro Tyr Pro Lys Ser Asp Ser Gly Leu Lys

        595                 600                 605 CAC CGC TGG GTC GAG GAG GGC GAG TGG CTG GTC AAG GCG TGAGCGAAGG        3038 His Arg Trp Val Glu Glu Gly Glu Trp Leu Val Lys Ala

    610                 615                 620 AGGAAAAAGG AAACAAAGAG GGGGGGGGGG GCTAGTTCCT ATTTTTGCTT TTTTTTTTTG     3098 TTCTTGTCCT TGTGCTGGCG GTTACCCTGG TAAAGGAGAA GGGGGCCCCA AGTTCGAGTG     3158 GGTGTGTGAT CGGGTAAATA TTATCAAGAG ATCT                                 3192 (2)SEQ ID NO：2的信息： (i)序列性质：   (A)长度：620个氨基酸   (B)类型：氨基酸   (C)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质   (xi)序列描述：SEQ ID NO：2 Met Lys Ser Phe Ile Ser Ala Ala Thr Leu Leu Val Gly Ile Leu Thr   1               5                      10              15 Pro Ser Val Ala Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Glu Gln Arg Asp Leu

         20                  25                  30 Leu Val Pro Ile Thr Glu Arg Glu Glu Ala Ala Val Lys Ala Arg Gln

     35                  40                  45 Gln Ser Cys Asn Thr Pro Ser Asn Arg Ala Cys Trp Thr Asp Gly Tyr

 50                  55                  60 Asp Ile Asn Thr Asp Tyr Glu Val Asp Ser Pro Asp Thr Gly Val Val  65                  70                  75                  80 Arg Pro Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Glu Val Asp Asn Trp Thr Gly Pro

             85                  90                  95 Asp Gly Val Val Lys Glu Lys Val Met Leu Val Asn Asn Ser Ile Ile

        100                 105                 110 Gly Pro Thr Ile Phe Ala Asp Trp Gly Asp Thr Ile Gln Val Thr Val

    115                 120                 125 Ile Asn Asn Leu Glu Thr Asn Gly Thr Ser Ile His Trp His Gly Leu

130                 135                 140 His Gln Lys Gly Thr Asn Leu His Asp Gly Ala Asn Gly Ile Thr Glu 145                 150                 155                 160 Cys Pro Ile Pro Pro Lys Gly Gly Arg Lys Val Tyr Arg Phe Lys Ala

            165                 170                 175 Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gln Tyr

        180                 185                 190 Gly Asn Gly Val Val Gly Ala Ile Gln Ile Asn Gly Pro Ala Ser Leu

    195                 200                 205 Pro Tyr Asp Thr Asp Leu Gly Val Phe Pro Ile Ser Asp Tyr Tyr Tyr

210                 215                 220 Ser Ser Ala Asp Glu Leu Val Glu Leu Thr Lys Asn Ser Gly Ala Pro 225                 230                 235                 240 Phe Ser Asp Asn Val Leu Phe Asn Gly Thr Ala Lys His Pro Glu Thr

            245                 250                 255 Gly Glu Gly Glu Tyr Ala Asn Val Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg His

        260                 265                 270 Arg Leu Arg Leu Ile Asn Thr Ser Val Glu Asn His Phe Gln Val Ser

    275                 280                 285 Leu Val Asn His Thr Met Thr Ile Ile Ala Ala Asp Met Val Pro Val

290                 295                 300 Asn Ala Met Thr Val Asp Ser Leu Phe Leu Gly Val Gly Gln Arg Tyr 305                 310                 315                 320 Asp Val Val Ile Glu Ala Ser Arg Thr Pro Gly Asn Tyr Trp Phe Asn

            325                 330                 335 Val Thr Phe Gly Gly Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Arg Asn Pro Tyr

        340                 345                 350 Pro Ala Ala Ile Phe His Tyr Ala Gly Ala Pro Gly Gly Pro Pro Thr

    355                 360                 365 Asp Glu Gly Lys Ala Pro Val Asp His Asn Cys Leu Asp Leu Pro Asn

370                 375                 380 Leu Lys Pro Val Val Ala Arg Asp Val Pro Leu Ser Gly Phe Ala Lys 385                 390                 395                 400 Arg Pro Asp Asn Thr Leu Asp Val Thr Leu Asp Thr Thr Gly Thr Pro

            405                 410                 415 Leu Phe Val Trp Lys Val Asn Gly Ser Ala Ile Asn Ile Asp Trp Gly

        420                 425                 430 Arg Pro Val Val Asp Tyr Val Leu Thr Gln Asn Thr Ser Phe Pro Pro

    435                 440                 445 Gly Tyr Asn Ile Val Glu Val Asn Gly Ala Asp Gln Trp Ser Tyr Trp

450                 455                 460 Leu Ile Glu Asn Asp Pro Gly Ala Pro Phe Thr Leu Pro His Pro Met 465                 470                 475                 480 His Leu His Gly His Asp Phe Tyr Val Leu Gly Arg Ser Pro Asp Glu

            485                 490                 495 Ser Pro Ala Ser Asn Glu Arg His Val Phe Asp Pro Ala Arg Asp Ala

        500                 505                 510 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Thr Met Leu

    515                 520                 525 Pro Ala Phe Gly Trp Val Val Leu Ala Phe Arg Ala Asp Asn Pro Gly

530                 535                 540 Ala Trp Leu Phe His Cys His Ile Ala Trp His Val Ser Gly Gly Leu 545                 550                 555                 560 Gly Val Val Tyr Leu Glu Arg Ala Asp Asp Leu Arg Gly Ala Val Ser

            565                 570                 575 Asp Ala Asp Ala Asp Asp Leu Asp Arg Leu Cys Ala Asp Trp Arg Arg

        580                 585                 590 Tyr Trp Pro Thr Asn Pro Tyr Pro Lys Ser Asp Ser Gly Leu Lys His

    595                 600                 605 Arg Trp Val Glu Glu Gly Glu Trp Leu Val Lys Ala

610                 615                 620 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

               (PCT Rule 13 bis) A.The indications made below relate to the microorganisrn referred to in the description   on page       13                            .line         4-13： B.IDENTIFICATION OF                                                Further depcsists are identified on an additional sheet□ Name of depository institution     Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL) Address of depository institution(including postal code and country)     Northern Regional Research Center     1815 University Street     Peoria，IL 61604，US Date of deposit  25 May 1994 Accession Number    NRRL B-21261 C.ADDITIONAL INDICATIONS(leave blank if not applicble) This information is continued on an additional sheet  □     In respect of those designations in which a European and/or Australia Patent is sought，     during the pendency of the patent application，a sample of the deposited microorganism is     only to be provided to an independent expert nominated by the person requesting the sample     (Rule 28(4)EPC/Regulation 3.25 of Australia Statutory Rule 1991 No.71). D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if the indicctions are not for all designated States) E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS(leave blank if not applicable) The indication listed below will be submitted to the International Bureau Later(specify the gerercl nature of the indications e.g. ″Accession Number of Deposit″) For receiving Office use only For International Bureau use only □This sheet was received with the International Bureau on： Authorized officer Form PCT/RO/134(July 1992)