콜라겐 피브릴을 함유하는 생제작된 물질을 제조하는 방법

콜라겐 피브릴을 함유하는 생제작된 물질을 제조하는 방법{METHOD FOR MAKING A BIOFABRICATED MATERIAL CONTAINING COLLAGEN FIBRILS}

본 출원은 2016년 2월 15일 제출된 미국 가출원 제62/295,435호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 참조로 포함된다. 본 출원은 2013년 3월 28일 제출된 발명의 명칭이 "가공된 레더 및 그 제조 방법"인 미국 특허 출원 제13/853,001호; 2015년 12월 11일 제출된 발명의 명칭이 "가공된 레더 및 그 제조 방법"인 미국 특허 출원 제14/967,173호; 2015년 11월 3일 제출된 발명의 명칭이 "강화된 가공된 생물질 및 그 제조 방법"인 PCT 특허 출원 번호 PCT/US2015/058794와 관련있다.

본 발명은 종래 레더 제품과 비교하여 우수한 강도, 비이방성 (non-anisotropic properties) 및 균일성을 나타내지만, 천연 가죽의 외관, 촉감 및 기타 심미적 특성을 갖는, 언번들되고 (unbundled) 또한 임의의 배향성을 갖는 (randomly-oriented) 삼량체 콜라겐 피브릴 (trimeric collagen fibrils)로 이루어진 생제작된 레더 물질에 관한 것이다. 플라스틱 수지로 이루어진 합성 레더 제품과는 달리, 본 발명의 생제작된 레더는 레더의 천연 성분인 콜라겐을 기본으로 한다.

레더 ( Leather) . 레더는 가구 덮개 (furniture upholstery), 의류, 신발, 여행 가방, 핸드백 및 액세서리, 자동차 용품을 포함하는 광범위한 응용 분야에서 사용된다. 레더에 있어서 추정된 세계 무역 가치는 연간 약 1000억 달러이고 ( Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade , United Nations Industrial Development Organization, Vienna, 2010), 레더 제품에 대한 수요가 계속 증가하고 있다. 레더를 제조하는 경제적, 환경적 및 사회적 비용을 고려할 때 이러한 요구를 충족시키는 새로운 방법이 필요하다. 기술적 및 심미적 경향에 발맞추기 위해, 레더 제품의 생산자 및 사용자는 천연 성분들을 포함하고, 우수한 강도, 균일성, 가공성 및 세련되고 매력적인 심미적 특성을 나타내는 신규한 물질을 찾고 있다.

천연 레더가 가축 사육이 필요한 동물의 피부로부터 제조된다. 그러나, 가축 사육을 위해서는 엄청난 양의 사료, 목초지, 물 및 화석 연료가 필요하다. 또한 메탄과 같은 온실 가스의 생성을 포함하는 대기 및 수로 오염을 일으킨다. 캘리포니아와 같은 미국의 일부 주에서는 가축에 의해 생성되는 메탄과 같은 오염 물질의 양에 대해 세금을 부과할 수 있다. 가축 사육 비용이 상승함에 따라서, 레더 비용이 상승하게 될 것이다.

세계적인 레더 산업은 연간 10억 마리 이상의 동물을 도살한다. 대부분의 레더가 공장형 축산 (factory farming)에 종사하거나, 동물 복지법이 없거나, 또는 이러한 법이 거의 또는 완전히 시행되지 않는 국가에서 제조된다. 비인간적인 조건에서의 도축은 사회적으로 의식있는 많은 사람들이 반대할 만하다. 결과적으로, 천연 레더 제품의 사용에 대해 윤리적, 도덕적 또는 종교적으로 반대하는 소비자들로부터 동물의 학대 또는 도살 없이 인간적으로 생산되거나 또는 도살되는 동물의 수를 최소화하는 방법으로 제조된 제품에 대한 요구가 있다.

동물 피부를 취급하고 레더로 가공하는 것은 동물의 피부를 취급할 때 탄저병과 다른 병원균 및 레더 먼지 같은 알레르겐 (allergens)에 작업자를 노출시킬 수 있기 때문에 건강에 위험을 초래한다. 동물의 공장형 축산은 인플루엔자 (예컨대, "조류 독감") 및 다른 감염성 질환의 전파에 기여하고, 이는 궁극적으로 돌연변이화하여 인간을 감염시킨다. 동물 유래 제품은 또한 바이러스와 프리온 (prions) ("광우병")으로 오염되기 쉽다. 생산자와 소비자의 안락함을 위해서, 이러한 위험을 나타내지 않는 레더 제품에 대한 요구가 존재한다.

천연 레더는 동물의 생가죽 (rawhide) 및 피부, 예컨대 소의 가죽 (cattle hides)을 처리함으로써 제조되는, 일반적으로 내구성 및 가요성 물질이다. 상기 처리는 통상적으로 3가지의 주요 파트를 포함한다: 준비 단계 (preparatory stages), 태닝 (tanning) 및 재태닝 (retanning). 레더는 또한 표면이 코팅되거나 또는 엠보싱될 수 있다.

피부 또는 가죽을 준비하고, 이를 레더로 전환시키는 수 많은 방법이 알려져 있다. 상기는 가죽 또는 피부를 보존하기 위해서 이를 염처리 (salting) 또는 냉장처리하고; 염, 먼지, 잔해 (debris), 혈액 및 과량의 지방을 제거하기 위해서, 상기 가죽을 계면활성제 또는 다른 화학제를 포함하는 수성 용액에 소킹 (soaking) 또는 재수화 (rehydrating)하고; 상기 가죽으로부터 살을 발라내거나 (defleshing) 또는 피하 물질을 제거하고; 상기 가죽으로부터 대부분의 털을 제거하기 위한 탈모 (dehairing) 또는 제모 (unhairing)하고; 파이버를 느슨하게 하고 콜라겐 번들을 열어서 화학제가 흡수되도록 상기 가죽을 라이밍(liming)하고; 상기 가죽을 둘 이상의 층들로 분할 (splitting)하고; 알칼리를 제거하고 그 pH를 더 낮추기 위해 상기 가죽을 디라이밍(deliming)하고; 상기 디라이밍 과정을 완료하고 그레인 (grain)을 평활하게 하기 위해서 상기 가죽을 탈회 (bating)하고; 과량의 지방을 제거하기 위한 탈지 (degreasing)하고; 프리징 (frizzing)하고; 표백 (bleaching)하고; pH를 변화함으로써 산세척 (pickling)하거나; 또는 탈산 (depickling)하는 단계를 포함한다.

일단 준비 단계가 완료되면, 상기 레더가 태닝된다. 레더가 태닝되면, 처리되지 않은 가죽과 비교하여 그 내구성이 증가된다. 태닝은 상기 가죽 또는 피부내 단백질을 안정한 물질로 전환시켜서 부패되지 않고 상기 레더 물질이 가요성을 유지하도록 한다. 태닝 중에, 상기 피부 구조가 상기 콜라겐의 일부를 크롬 또는 다른 태닝제의 복합체 이온과 반응시킴으로써 "개방 (open)" 형태로 안정화될 수 있다. 사용된 화합물에 따라서, 상기 레더의 색상 및 질감이 변화될 수 있다.

태닝은 레더를 제조하기 위해서 동물의 피부를 처리하는 과정인 것으로 일반적으로 이해된다. 태닝은 피부 또는 가죽을 베지터블 태닝제 (vegetable tanning agent), 크롬 화합물, 알데히드, 신탄 (syntan), 합성, 반합성 또는 천연 수지 또는 폴리머, 또는/및 태닝 천연 오일 또는 변성된 오일과 접촉시키는 것을 포함하는 여러가지 잘-이해된 방법으로 실시될 수 있다. 베지터블 탄닌 (vegetable tannins)은 피로갈롤(pyrogallol)-계 또는 피로카테킨(pyrocatechin)-계 탄닌, 예컨대, 발로니아 (valonea), 미모사 (mimosa), 텐 (ten), 타라 (tara), 오크 (oak), 파인우드 (pinewood), 수마크 (sumach), 케브라초 (quebracho) 및 체스트너트 (chestnut) 탄닌을 포함하고; 크롬 태닝제는 크롬염, 예컨대 크롬 술페이트를 포함하고; 알데히드 태닝제는 글루타르알데히드 및 옥사졸리딘 화합물을 포함하고, 신탄은 방향족 폴리머, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 말레산 무수물과 스티렌의 코폴리머, 멜라민 또는 디시안디아미드와 포름알데히드의 축합 생성물, 리그닌 및 천연 밀가루 (natural flours)를 포함한다.

크롬은 가장 일반적으로 사용되는 태닝 물질이다. 상기 피부/가죽의 pH가 조정되어서 (예컨대, pH 2.8-3.2로 낮춤), 상기 태닝제를 침투시키고; 침투 후에, 상기 pH를 올려서, 상기 태닝제를 고정시킬 수 있다 (크롬에 대해서 약간 더 높은 수준, 예컨대 pH 3.8-4.2로 "염기화 (basification)").

태닝 후에, 레더가 재태닝될 수 있다. 재태닝은 착색 (염색), 박막화 (thinning), 건조 (drying) 또는 수화 (hydrating) 등을 포함할 수 있는 태닝 후 처리를 나타낸다. 재태닝 기술의 예로는 하기를 포함한다: 태닝, 습윤 (재수화), 탈수 (sammying) (건조), 중화 (pH를 보다 덜 산성 또는 알칼리성 상태로 조정함), 염색, 가지 공정 (fat liquoring), 결합되지 않은 화학제의 고정, 경화 (setting), 컨디셔닝 (conditioning), 연화 (softening), 버핑 (buffing) 등

태닝된 레더 제품이 기계적 또는 화학적으로 피니싱 (finishing)될 수 있다. 기계적 피니싱 (mechanical finishing)은 상기 레더를 연마하여, 윤기나는 표면을 수득하고, 다림질 (iron)하고, 레더를 플레이트 (plate)하여 평평하고, 부드러운 표면을 갖게 하고, 레더를 엠보싱하여, 3차원 프린트 또는 패턴을 제공하거나, 또는 레더를 텀블링 (tumbling)하여, 더 분명한 그레인 및 매끄러운 표면을 제공한다. 화학적 피니싱 (Chemical finishing)은 필름의 도포, 천연 또는 합성 코팅, 또는 다른 레더 처리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분무 (spraying), 커튼-코팅 (curtain-coating) 또는 롤러 코팅 (roller coating)에 의해서 적용될 수 있다.

동물 가죽에서, 섬유상 콜라겐 조직의 변화가 동물의 다른 연령이나 종에서 관찰된다. 이러한 차이는 가죽의 물리적 특성 및 가죽으로부터 제조된 레더의 차이에 영향을 미친다. 콜라겐 조직의 변화는 또한 상기 가죽의 두께를 통해 발생한다. 가죽의 탑 그레인 면 (top grain side)은 콜라겐 피브릴의 미세한 네트워크로 이루어지는 반면에, 더 깊은 부분 (진피)은 더 큰 파이버 번들로 이루어진다 (도 2). 상기 그레인 층의 피브릴 조직이 더 작아지면 부드럽고 매끄러운 레더 외관을 야기하는 반면, 더 깊은 영역의 파이버 번들 조직이 더 커지면 거칠고 굵은 (course) 가죽 외관을 야기한다.

가죽 내 콜라겐의 다공성 섬유상 조직은 레더 태닝 중에 적용된 분자를 침투시키고, 안정화시키고, 윤활시킬 수 있다. 가죽에서 고유 콜라겐 조직 및 태닝을 통해서 수득되는 변형의 조합으로 레더의 바람직한 강도, 드레이프 (drape) 및 심미적 특성을 야기한다.

레더의 탑 그레인 표면은 종종 그 매끄럽고 부드러운 질감 때문에 가장 바람직하다고 여겨진다. 상기 레더 그레인은 조직된 콜라겐 피브릴의 고다공성 네트워크를 포함한다. 내인성 콜라겐 피브릴이 열공성 (lacunar) 영역과 중첩 (overlapping) 영역을 갖도록 조직된다; 도 1에 도시된 콜라겐의 계층적 조직을 참조한다. 탑 그레인 레더에서 피브릴의 강도, 마이크로스케일 다공성 (microscale porosity), 및 밀도는 태닝제 또는 가지제 (fatliquoring agents)가 이를 침투하도록 하여, 상기 콜라겐 피브릴을 안정화 및 윤활시키고, 사람들이 원하는 부드럽고, 매끄러우며, 또한 강한 레더를 제조한다.

레더 가죽은 주로 탑 그레인인 레더를 수득하기 위해서 분할될 수 있다. 상기 분할된 가죽이 추가적으로 마멸되어서, 상기 분할된 면에서 더 거칠게 그레인된 진피가 감소될 수 있지만, 그러나 항상 일부 잔류하는 진피가 있어서 거친 외관을 가질 수 있다. 양면에 매끄러운 그레인을 갖는 레더를 제조하기 위해서, 그레인의 두 조각을 진피 면과 진피 면이 마주하게 결합시키고, 매끄러운 탑 그레인 면들이 바깥쪽으로 향하도록, 이들을 함께 바느질하거나, 또는 이들을 접착제로 라미네이팅시킨다. 매끄럽고, 탑 그레인과 같은 표면을 그 양쪽 면에 갖는 레더 제품에 대한 요구가 있으며, 이는 분할하고, 또한 2개의 분할된 레더 조각을 함께 바느질하거나 또는 라미네이팅시킬 필요를 피할 수 있기 때문이다.

레더의 최종 특성의 조절은 상이한 동물 가죽들 사이에서 콜라겐 구조내 자연적 변화에 의해서 제한된다. 예를 들면, 염소 가죽에서 그레인에서 진피까지의 상대적 두께는 캥거루 가죽에서보다 상당히 더 두껍다. 또한, 캥거루 진피에서 콜라겐 파이버 번들의 직조각 (weave angle)은 상기 가죽의 표면에 훨씬 더 평행하고, 소의 진피에서 파이버 번들은 상기 가죽 표면에 대해서 평행 및 수직 방향으로 배향된다. 또한, 파이버 번들의 밀도는 그 해부학적 위치에 따라 각 가죽내에서 다양할 수 있다. 엉덩이 (butt), 배 (belly), 어깨 (shoulder) 및 목 (neck)에서 채취된 가죽은 상이한 조성 및 특성을 가질 수 있다. 동물의 연령이 또한 그 가죽의 조성에 영향을 줄 수 있으며, 예를 들어 어린 소 (juvenile bovine) 가죽은 다 자란 소 가죽에서 발견되는 더 큰 파이버 번들보다 더 작은 직경의 파이버를 포함한다.

레더의 최종 특성이 태닝 및 재태닝 중에 가죽 또는 피부로 안정화 및 윤활 분자의 혼입을 통해서 어느 정도 조절될 수 있지만, 그러나 상기 분자들의 선택은 상기 피부 또는 가죽의 조밀한 구조로 침투할 필요에 의해서 제한된다. 직경이 수 미크론 (microns) 만큼 큰 입자가 윤활을 향상시키기 위해서 레더로 혼입되어질 수 있지만; 그러나 상기 입자의 적용이 가장 큰 공극 크기를 갖는 가죽으로 제한된다. 상기 가죽 전체에 걸쳐서 상기 입자를 균일하게 분포시키는 것은 많은 도전 과제를 제공한다.

콜라겐 ( Collagen). 콜라겐은 레더의 성분이다. 피부, 또는 동물 가죽에는, 상당한 양의 콜라겐인, 섬유상 단백질이 포함된다. 콜라겐은 적어도 28개의 구별되는 콜라겐 타입의 패밀리에 대한 일반적인 용어이며; 동물 가죽은 통상적으로 타입 I 콜라겐이지만, 비록 콜라겐의 다른 타입이 타입 III 콜라겐을 포함하는 레더를 형성하는데 사용될 수 있다.

콜라겐은 반복되는 3중 아미노산, -(Gly-XY) _n -을 특징으로 하고, 콜라겐 중 상기 아미노산 잔기의 약 1/3은 글리신이다. X는 종종 프롤린이고, Y는 종종 히드록시프롤린이지만, 최대 400개의 가능한 Gly-XY 삼중체가 있을 수 있다. 다른 동물들은 상기 콜라겐의 다른 아미노산 조성을 생성할 수 있고, 이로 인해 생성되는 레더의 특성 및 차이가 달라질 수 있다.

콜라겐의 구조는 길이가 다른 3개의 얽힌 (intertwined) 펩티드 사슬로 구성될 수 있다. 콜라겐 삼중 나선 (또는 모노머)은 약 1,050개의 아미노산 길이의 α-사슬로부터 생성될 수 있으므로, 상기 삼중 나선은 길이가 약 300 nm이고, 직경이 약 1.5 nm인 막대 (rod)의 형태를 취한다.

섬유아세포 피부 세포에 의한 세포외 기질의 제조에서, 삼중 나선 모노머가 합성될 수 있고, 상기 모노머가 섬유상 형태로 자기조립 (self-assemble)될 수 있다. 상기 삼중 나선이 염 브릿징 (salt bridging), 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 힘 (dipole-dipole forces), 분극력 (polarization force), 소수성 상호작용 (hydrophobic interactions) 및/또는 공유 결합을 포함한 정전기 상호작용에 의해 함께 유지된다. 삼중 나선은 피브릴로 불리는 번들로 함께 결합될 수 있고, 피브릴은 파이버 및 파이버 번들을 형성하기 위해 더 조립될 수 있다 (도 1).

피브릴은 콜라겐 모노머의 엇갈린 중첩 (staggered overlap)에 의해 특징적으로 밴드된 (banded) 외관을 갖는다. 밴드들 사이의 거리는 타입 I 콜라겐의 경우 약 67 nm이다. 피브릴 및 파이버는 통상적으로 분지되고, 피부층을 통해서 서로 상호작용한다. 피브릴 및 파이버의 조직 또는 가교의 변형은 상기 물질에 강도를 제공할 수 있다.

파이버는 동물 가죽의 종류에 따라 다양한 직경의 범위를 가질 수 있다. 타입 I 콜라겐 이외에, 피부 (가죽)는 타입 III 콜라겐 (레티쿨린), 타입 IV 콜라겐 및 타입 VII 콜라겐을 포함하는 다른 타입의 콜라겐을 포함할 수 있다.

다양한 형태의 콜라겐이 포유류 몸 전체에 존재한다. 예를 들면, 피부 및 동물 가죽의 주요 성분인 것 외에, 타입 I 콜라겐이 또한 연골 (cartilage), 힘줄 (tendon), 혈관 합자 (vascular ligature), 기관 (organs), 근육 (muscle) 및 뼈의 유기 부분 (organic portion of bone)에도 존재한다. 동물의 피부 또는 가죽 뿐만 아니라 포유류 신체의 여러 부위로부터 콜라겐을 분리하기 위한 성공적인 노력이 이루어졌다. 수십 년 전에, 연구자들은 중성 pH에서 산-용해된 콜라겐이 네이티브 조직에서 관찰된 것과 같은 가로무늬 (cross-striated) 패턴으로 이루어진 피브릴로 자기-조립되는 것을 발견했다; Schmitt FOJ Cell. Comp Physiol. 1942;20:11). 이로 인해 조직 조작 및 다양한 생물의학 응용 분야에서 콜라겐의 사용을 이끌었다. 최근 몇 년 동안, 콜라겐이 재조합 기술을 사용하여 박테리아와 효모로부터 수득되었다.

콜라겐의 타입에도 불구하고, 이들 모두는 염 브릿징, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 힘, 분극력, 소수성 상호작용 및 효소 반응에 의해서 종종 촉매화되는 공유 결합을 포함한 정전기 상호작용을 포함하는 물리적 및 화학적 상호작용의 조합을 통해서 형성되고 안정화된다. 타입 I 콜라겐 피브릴, 파이버 및 파이버 번들에 있어서, 그 복합체 조립체가 성장하는 동안 인 비보 ( in vivo )에서 수득되고, 세포 이동 및 영양분 운반을 가능하게 하면서 상기 조직으로 기계적 서포트를 제공하는데 중요하다. 다양한 구별되는 콜라겐 타입이 척추동물 (vertebrates)에서 확인되었다. 이는 소 (bovine), 양 (ovine), 돼지 (porcine), 닭 (chicken), 및 인간 (human) 콜라겐을 포함한다.

일반적으로, 상기 콜라겐 타입은 로마 숫자로 번호가 매겨지고, 각 콜라겐 타입에서 발견된 사슬은 아라비아 숫자로 확인된다. 자연 발생되는 콜라겐의 다양한 상이한 타입의 구조 및 생물학적 기능에 대한 상세한 설명이 당분야에서 이용가능하다; 예컨대 Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E., and Nimmi (1992) "Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution" in Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, CM et al. (1993) "The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix," Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, PM and B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; and Prockop, DJ- and KI Kivirikko (1995) "Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy," Annu.Rev. Biochem., 64:403-434.) 참조.

타입 I 콜라겐은 생물체의 전체 콜라겐의 약 80-90 %를 포함하는 뼈와 피부의 주요 피브릴 콜라겐 (fibrillar collagen)이다. 타입 I 콜라겐은 다세포 생물체의 세포외 기질에 존재하는 주요 구조적 거대분자이고, 전체 단백질 질량의 약 20 %를 포함한다. 타입 I 콜라겐은 COL1A1 및 COL1A2 유전자들 각각에 의해서 인코딩 (encoding)되는, 2개의 α1(I) 사슬 및 1개의 α2(I) 사슬을 포함하는 헤테로트리머 분자 (heterotrimeric molecule)이다. 다른 콜라겐 타입은 타입 I 콜라겐보다 덜 풍부하고, 상이한 분포 패턴을 나타낸다. 예를 들어, 타입 II 콜라겐은 연골 및 유리액 (vitreous humor)에서 우세한 콜라겐이고, 타입 III 콜라겐은 혈관에서 높은 수준으로 발견되고, 피부에서는 더 적은 수준으로 발견된다.

타입 II 콜라겐은 COL2A1 유전자에 의해서 인코딩되는 3개의 동일한 al(II) 사슬을 포함하는 호모트리머 (homotrimeric) 콜라겐이다. 정제된 타입 II 콜라겐이 당분야에 알려져 있는 방법, 예를 들어 Miller and Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64에 기재된 방법에 의해서 조직으로부터 제조될 수 있다.

타입 III 콜라겐은 피부 및 혈관 조직에서 발견되는 주요 피브릴 콜라겐이다. 타입 III 콜라겐은 COL3A1 유전자에 의해서 인코딩되는 3개의 동일한 α1(III) 사슬을 포함하는 호모트리머 콜라겐이다. 조직으로부터 타입 III 콜라겐을 정제하는 방법은 예를 들어, Byers et al. (1974) Biochemistry 13:5243-5248; 및 Miller and Rhodes, supra 에서 찾을 수 있다.

타입 IV 콜라겐은 피브릴보다는 오히려 시트 (sheets)의 형태로 기저막 (basement membranes)에서 발견된다. 가장 일반적으로, 타입 IV 콜라겐은 2개의 α1(IV) 사슬 및 1개의 α2(IV) 사슬을 포함한다. 타입 IV 콜라겐을 포함하는 특정 사슬은 조직-특이적 (tissue-specific)이다. 타입 IV 콜라겐은 예를 들면, Furuto and Miller (1987) Methods in Enzymology, 144:41-61, Academic Press에 개시된 방법을 사용하여 정제될 수 있다.

타입 V 콜라겐은 우선적으로 뼈, 힘줄, 각막, 피부, 및 혈관에서 발견되는 피브릴 콜라겐이다. 타입 V 콜라겐은 호모트리머 형태 및 헤테로트리머 형태로 존재한다. 타입 V 콜라겐의 한가지 형태는 2개의 α1(V) 사슬 및 1개의 α2(V) 사슬의 헤테로트리머이다. 타입 V 콜라겐의 다른 형태는 α1(V), α2(V), 및 α3(V) 사슬의 헤테로트리머이다. 타입 V 콜라겐의 부가의 형태는 α1(V)의 호모트리머이다. 천연 공급원으로부터 타입 V 콜라겐을 분리하는 방법은 예를 들면, Elstow and Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, and Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2:493-502에서 찾을 수 있다.

타입 VI 콜라겐은 작은 3중 나선 영역 (triple helical region) 및 2개의 큰 비-콜라겐성 (non-collagenous) 나머지 부분을 갖는다. 타입 VI 콜라겐은 α1(VI), α2(VI), 및 α3(VI) 사슬을 포함하는 헤테로트리머이다. 타입 VI 콜라겐이 많은 결합 조직 (connective tissues)에서 발견된다. 천연 공급원으로부터 타입 VI 콜라겐을 정제하는 방법에 대한 서술은 예를 들면, Wu et al. (1987) Biochem. J. 248:373-381, and Kielty et al. (1991) J. Cell Sci. 99:797-807에서 찾을 수 있다.

타입 VII 콜라겐은 특정 상피 조직에서 찾을 수 있는 피브릴 콜라겐이다. 타입 VII 콜라겐은 3개의 α1(VII) 사슬의 호모트리머 분자이다. 조직으로부터 타입 VII 콜라겐을 정제하는 방법의 서술은 예를 들어, Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048, and Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3168-3172에서 찾을 수 있다. 타입 VIII 콜라겐이 각막내 데스메막 (Descemet's membrane)에서 발견될 수 있다. 타입 VIII 콜라겐은 2개의 α1(VIII) 사슬 및 1개의 α2(VIII) 사슬을 포함하는 헤테로트리머이고, 다른 사슬 조성이 보고되어 있다. 자연으로부터 타입 VIII 콜라겐의 정제를 위한 방법은 예를 들면, Benya and Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261:4160-4169, and Kapoor et al. (1986) Biochemistry 25:3930-3937에서 찾을 수 있다.

타입 IX 콜라겐은 연골 및 유리액에서 발견되는 피브릴-관련 콜라겐이다. 타입 IX 콜라겐은 α1(IX), α2(IX), 및 α3 (IX) 사슬을 포함하는 헤테로트리머 분자이다. 타입 IX 콜라겐이 FACIT (Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices) 콜라겐으로 분류되고, 비-삼중 나선 영역 (non-triple helical domains)에 의해서 분리된 몇 개의 삼중 나선 영역을 포함한다. 타입 IX 콜라겐을 정제하는 방법은, 예를 들면 Duance, et al. (1984) Biochem. J. 221:885-889; Ayad et al. (1989) Biochem. J. 262:753-761; and Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, AM, ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 3-28에서 찾을 수 있다.

타입 X 콜라겐은 α1(X) 사슬의 호모트리머 화합물이다. 타입 X 콜라겐이, 예를 들면, 성장판 (growth plates)에서 발견된 비대성 연골 (hypertrophic cartilage)로부터 분리되었다; 예컨대, Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1):217-24 참조.

타입 XI 콜라겐이 타입 II 및 타입 IX 콜라겐과 관련된 연골 조직 (cartilaginous tissues) 및 신체내 다른 위치에서 발견될 수 있다. 타입 XI 콜라겐은 α1(XI), α2(XI), 및 α3(XI) 사슬을 포함하는 헤테로트리머 분자이다. 타입 XI 콜라겐을 정제하는 방법은, 예를 들면 Grant et al., supra 에서 찾을 수 있다.

타입 XII 콜라겐은 타입 I 콜라겐과 관련되어 주로 발견되는 FACIT 콜라겐이다. 타입 XII 콜라겐은 3개의 α1(XII) 사슬을 포함하는 호모트리머 분자이다. 타입 XII 콜라겐 및 그 변이체를 정제하는 방법은, 예를 들면, Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; and Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20093-20099에서 찾을 수 있다.

타입 XIII는 피부, 장기, 뼈, 연골 및 가로무늬근 (striated muscle)에서 발견되는 비-피브릴상 (non-fibrillar) 콜라겐이다. 타입 XIII 콜라겐의 상세한 설명은, 예를 들면, Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 24700-24707에서 찾을 수 있다.

타입 XIV는 α1(XIV) 사슬을 포함하는 호모트리머 분자를 특징으로 하는 FACIT 콜라겐이다. 타입 XIV 콜라겐을 분리하는 방법은, 예를 들면, Aubert-Foucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764, and Watt et al., supra 에서 찾을 수 있다.

타입 XV 콜라겐은 타입 XVIII 콜라겐과 구조적으로 상동이다. 자연 형태의 XV 콜라겐의 구조 및 분리에 대한 정보는, 예를 들면, Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14:220-224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:4773-4779; and Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264:4042-4046에서 찾을 수 있다.

타입 XVI 콜라겐은 피부, 폐 섬유아세포 (lung fibroblast), 및 각질형성세포 (keratinocytes)에서 발견되는 피브릴-관련 (fibril-associated) 콜라겐이다. 타입 XVI 콜라겐의 구조 및 타입 XVI 콜라겐을 인코딩하는 유전자에 대한 정보는, 예를 들면, Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; and Yamaguchi et al. (1992) J. Biochem. 112:856-863에서 찾을 수 있다.

타입 XVII 콜라겐은 수포성 유천포창 항원 (bullous pemphigoid antigen)으로 또한 알려져 있는 반결합 막횡단 (hemidesmosal transmembrane) 콜라겐이다. 타입 XVII 콜라겐의 구조 및 타입 XVII 콜라겐을 인코딩하는 유전자에 대한 정보는, 예를 들면, Li et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; and McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1):83-86에서 찾을 수 있다.

타입 XVIII 콜라겐은 타입 XV 콜라겐과 구조적으로 유사하고, 간으로부터 분리될 수 있다. 자연 공급원으로부터 타입 XVIII 콜라겐의 구조 및 분리에 대한 상세는, 예를 들면, Rehn and Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4234-4238; Oh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; and Oh et al. (1994) Genomics 19:494-499에서 찾을 수 있다.

타입 XIX 콜라겐은 FACIT 콜라겐 패밀리의 다른 구성원인 것으로 여겨지며, 횡문근육종 세포 (rhabdomyosarcoma cells)로부터 분리된 mRNA에서 발견되었다. 타입 XIX 콜라겐의 구조 및 분리의 상세는, 예를 들면, Inoguchi et al. (1995) J. Biochem. 117:137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13:884-886; and Myers et al., J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994)에서 찾을 수 있다.

타입 XX 콜라겐은 FACIT 콜라겐 패밀리의 신규하게 발견된 요소이며, 병아리 각막 (chick cornea)에서 동정되었다. (예컨대, Gordon et al. (1999) FASEB Journal 13:A1119; and Gordon et al. (1998), IOVS 39:S1128 참조).

본원에서 개시된 방법에 의해서 피브릴화 및 가교될 수 있는, 콜라겐, 절단 콜라겐 (truncated collagen), 비변형된 (unmodified) 또는 번역후 변형된 (post-translationally modified), 또는 아미노산 서열-변형된 콜라겐의 임의의 형태가 생제작된 물질 또는 생제작된 레더를 제조하는데 사용될 수 있다. 생제작된 레더는 실질적으로 균일한 콜라겐, 예컨대 타입 I 또는 타입 III 콜라겐을 포함할 수 있거나, 또는 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 종류의 콜라겐의 혼합물을 포함할 수 있다.

재조합 콜라겐 (Recombinant Collagen).

콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 재조합 발현이 알려져 있고, Bell, EP 1232182B1, Bovine collagen and method for producing recombinant gelatin; Olsen, et al., 미국 특허 제6,428,978호, Methods for the production of gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells ; VanHeerde, et al., 미국 특허 제8,188,230호, Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagen-like polypeptides 에 참조로 포함된다. 상기 재조합 콜라겐은 레더를 제조하기 위해서 사용되지 않았다.

원핵세포 발현 (Prokaryotic expression). 원핵세포계, 예컨대 박테리아계에서, 다수의 발현 벡터가 발현된 폴리펩티드에 대한 의도된 용도에 따라서 유익하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 다량의 동물 콜라겐 및 젤라틴이 제조되는 경우, 예컨대 항체의 발생을 위해서, 용이하게 정제된 다량의 융합 단백질 산물의 발현을 가능하게 하는 벡터가 바람직할 수 있다. 상기 벡터는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 이. 콜리 ( E. coli ) 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791)을 포함하고, 여기서 상기 코딩 서열 (coding sequence)이 lac Z 코딩 영역을 갖는 프레임내 상기 벡터로 결찰 (ligate)될 수 있어서, 하이브리드 (hybrid) AS-lacZ 단백질이 제조되고; pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 and Van Heeke et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); 등을 포함한다. pGEX 벡터가 글루타티온 S-트란스퍼라제 (glutathione S-transferase: GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하기 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드로 흡수시킨 후에, 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 용해된 (lysed) 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 상기 pGEX 벡터가 트롬빈 (thrombin) 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위 (cleavage sites)를 포함하도록 고안되어서, 관심 있는 클로닝된 (cloning) 폴리펩티드가 상기 GST 모이어티로부터 분리될 수 있다. 재조합 콜라겐은 번역후 변형되지 않은, 예컨대 글리코실화 또는 히드록실화되지 않은 콜라겐 분자를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 번역후 변형, 예를 들어 콜라겐 분자의 언번들되고 무작위로 배향된 피브릴의 피브릴화 및 형성을 촉진하는 변형을 포함할 수 있다.

재조합 콜라겐 분자는 트리머 콜라겐 피브릴을 형성할 수 있는 네이티브 콜라겐 분자, 또는 네이티브 콜라겐 아미노산 서열 (또는 그 피브릴 형성 영역 또는 [Gly-XY] _n 을 실질적으로 포함하는 세그먼트)과 적어도 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 변형된 콜라겐 분자 또는 절단된 콜라겐 분자의 아미노산 서열의 단편, 예컨대 서열번호: 1, 2, 또는 3 및 접근 번호 NP_001029211.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252, last accessed February 9, 2017), NP_776945.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257 last accessed February 9, 2017) 및 NP_001070299.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881 last accessed February 9, 2017)로 개시된 Col1A1, Col1A2, 및 Col1A3의 아미노산 서열에 의해서 개시된 소의 콜라겐의 단편을 포함할 수 있고, 상기는 참조로 포함된다. (상기 링크는 두개의 슬래시 다음에 언더라인을 포함시켜서 불활성시켰음).

이러한 재조합 또는 변형된 콜라겐 분자는 일반적으로 본원에 개시된 상기 반복된 -(Gly-XY) _n - 서열을 포함할 것이다.

BLASTN이 콜라겐 폴리펩티드를 인코딩하거나 또는 서열번호: 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 같이 참조 폴리뉴클레오티드에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 (sequence identity)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하기 위해서 사용될 수 있다. 매우 유사한 서열을 찾기 위해 최적화된 대표적인 BLASTN 세팅은 10의 예상 역치 (Expect Threshold) 및 28의 워드크기 (Wordsize), 0의 질의 범위 (query range)로 최대 매치 (max matches), 1/-2의 매치/미스매치 점수 (match/mismatch Scores) 및 선형 갭 비용 (linear gap cost)을 사용한다. 낮은 복잡성 영역 (Low complexity regions)이 필터되거나 또는 마스킹될 수 있다. 표준 뉴클레오티드 (Standard Nucleotide) BLAST의 디폴트 세팅 (default settings)이 하기를 참조로 서술되고, 포함된다: https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (last accessed January 27, 2017).

BLASTP가 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80과 같은 유사도 매트릭스 (similarity matrix)를 사용하여, 콜라겐 아미노산 서열과 같은 참조 아미노산과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 동정하기 위해서 사용될 수 있고, 여기서 BLOSUM45가 긴밀하게 관련된 서열에 대해 사용될 수 있고, BLOSUM62는 중간범위 서열(midrange sequences)에 대해서 사용될 수 있고, 또한 BLOSUM80은 더 떨어져 있는 관련된 서열에 대해서 사용될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 유사성 점수 (similarity score)는 BLOSUM62의 사용에 기반할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 퍼센트 유사도 (percent similarity)가 BLASTP 포지티브 점수에 기반되고, 퍼센트 서열 동일성 (percent sequence identity)은 상기 BLASTP 동일성 점수에 기반한다. BLASTP "동일성 (Identities)"은 동일한 높은 점수 서열 쌍에서 전체 잔기들의 수 및 분율 (fraction)을 나타내고; 또한 BLASTP "포지티브"는 상기 정렬 점수 (alignment scores)가 포지티브 값을 가지고, 또한 서로 유사한 잔기들의 수 및 분율을 나타낸다. 상기 동일성 또는 유사성 정도 또는 본원에 개시된 아미노산 서열과의 동일성 또는 유사성의 임의의 중간 정도를 갖는 아미노산 서열들이 본 명세서에 의해서 고려되고, 또한 포함된다. 대표적인 BLASTP 세팅은 10의 예상 역치, 3의 워드크기, 매트릭스로서 BLOSUM 62, 및 11 (존재) 및 1 (연장)의 갭 페널티 (Gap Penalty) 및 조건적 조성 스코어 매트릭스 조정 (conditional compositional score matrix adjustment)을 사용한다. BLASTP에 대한 다른 디폴트 세팅이 하기에서 이용가능한 문헌에 의해서 개시되고, 또한 참조로 포함된다: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (last accessed January 27, 2017).

이스트 발현 (Yeast expression). 하나의 구현예에서, 콜라겐 분자가 이스트 발현 시스템에서 생성된다. 이스트에서, 당분야에 알려져 있는 항시성 (constitutive) 또는 유도성 (inducible) 프로모터를 포함하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다; Ausubel et al., supra, Vol. 2, Chapter 13; Grant et al. (1987) Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, NY 153:516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., DC, Ch. 3; Bitter (1987) Heterologous Gene Expression in Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, NY 152:673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982).

콜라겐이 숙주 세포, 예를 들면, 이스트 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae )로부터 발현될 수 있다. 상기 특정 이스트가 다수의 발현 벡터들 중 어느 것과도 사용될 수 있다. 통상적으로 사용된 발현 벡터는 이스트에서 증식 (propagation)을 위한 복제의 2P 기원 (origin) 및 외래 유전자의 효과적인 전사를 위한 이. 콜리 를 위한 Col E1 기원을 포함하는 셔틀 벡터 (shuttle vectors)이다. 2P 플라스미드에 기반한 상기 벡터의 통상적인 예는 pWYG4이고, 이는 2P ORI-STB 요소들, GAL1-10 프로모터, 및 2P D 유전자 종결자 (gene terminator)를 갖는다. 상기 벡터에서, Ncol 클로닝 부위 (cloning site)가 발현될 상기 폴리펩티드를 위한 유전자를 삽입하고, 또한 ATG 개시 코돈 (start codon)을 제공하기 위해 사용된다. 다른 발현 벡터는 pWYG7L이고, 이는 온전한 2αORI, STB, REP1 및 REP2, 및 GAL1-10 프로모터를 가지며, FLP 종결자를 사용한다. 상기 벡터에서, 상기 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 BamHI 또는 Ncol 부위에서 그 5' 말단을 갖도록 상기 폴리링커 (polylinker)에 삽입된다. 상기 삽입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 세포벽을 제거한 후에 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)로 형질전환되어서, 칼슘 및 폴리에틸렌 글리콜에 의한 처리에서 또는 리튬 이온에 의한 온전한 세포의 처리에 의해서 DNA를 흡수하는 스페로플라스트 (spheroplasts)를 생성한다.

대안으로서, DNA가 전기천공법 (electroporation)에 의해서 도입될 수 있다. 형질전환체 (transformants)가, 예를 들면, LEU2, TRP1, URA3, HIS3, 또는 LEU2-D와 같은 선택가능한 마커 유전자 (marker genes)와 함께 루신 (leucine), 트립토판, 우라실, 또는 히스티딘에 대한 영양균주 (auxotrophic)인 숙주 이스트 세포를 사용하여 선택될 수 있다.

하나의 구현예에서, 콜라겐을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이스트 피치아 ( Pichia )로부터 숙주 세포로 도입된다. 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris )와 같은 비- 사카로마이세스 (non- Saccharomyces ) 이스트의 종은 스케일업 과정 (scaled up procedures)에서 높은 수득율의 재조합 단백질을 제조하는데 특별한 장점을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 피치아 발현 키트는 Invitrogen Corporation (San Diego, CA)로부터 이용가능하다.

피치아 파스토리스 와 같은 메틸영양체 이스트 (methylotrophic yeasts)에서 다수의 메탄올 반응성 유전자가 있으며, 각 발현이 프로모터로 불리우는, 메탄올 반응성 조절 영역에 의해서 조절된다. 이러한 메탄올 반응성 프로모터의 어느 것은 본 발명의 실시에 사용하기에 적당하다. 특정 조절 영역의 예로는 AOX1 프로모터, AOX2 프로모터, 디히드록시아세톤 신타제 (dihydroxyacetone synthase: DAS), P40 프로모터, 및 피. 파스토리스로부터 카탈라제 유전자 (catalase gene)에 대한 프로모터 등을 포함한다.

다른 구현예에서, 메틸영양체 이스트 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha )가 사용된다. 메탄올 상에서 성장은 메탄올 대사의 중요 효소, 예컨대 MOX (메탄올 옥시다제), DAS (디히드록시아세톤 신타제), 및 FMHD (포르메이트 디히드로게나제)의 유도를 초래한다. 상기 효소는 전체 세포 단백질의 30-40 % 미만으로 이루어질 수 있다. MOX, DAS, 및 FMDH 생성을 인코딩하는 유전자가 메탄올에서 성장에 의해서 유도되고, 글루코스에서 성장에 의해서 억제되는 강한 프로모터에 의해서 조절된다. 상기 3개의 프로모터 모두 또는 그 중 어느 것이 에이치. 폴리모르파 에서 이종 유전자의 고수준의 발현을 수득하기 위해서 사용될 수 있다. 그러므로, 하나의 양태에서, 동물 콜라겐 또는 그 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 유도성 에이치. 폴리모르파 프로모터의 제어하에 발현 벡터로 클로닝된다. 상기 생성물의 분비를 원한다면, 이스트에서 분비를 위한 시그날 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상기 폴리뉴클레오티드를 갖는 프레임에 융합된다. 부가의 구현예에서, 상기 발현 벡터는 바람직하게 영양요구성 마커 유전자 (auxotrophic marker gene), 예컨대 URA3 또는 LEU2를 포함하고, 이는 영양요구성 숙주의 부족을 보충하기 위해서 사용될 수 있다.

상기 발현 벡터는 그 후에 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 기술을 사용하여 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 형질전환하기 위해서 사용된다. 에이치. 폴리모르파 형질전환의 유용한 특성은, 게놈으로 상기 발현 벡터가 최대 100 카피로 자발적 통합 (spontaneous integration)된다는 점이다. 대부분의 사례에서, 상기 통합된 폴리뉴클레오티드는 헤드-투-테일 정렬 (head-to-tail arrangement)을 나타내는 멀티머 (multimers)를 형성한다. 상기 통합된 외래 폴리뉴클레오티드가 비-선택적 조건하에서 조차도 몇개의 재조합 균주에서 유사분열적으로 (mitotically) 안정한 것으로 보였다. 이러한 고 카피 통합의 현상은 상기 시스템의 고 생산성 가능성을 더 높인다.

진균 발현 (Fungal Expression). 필라멘트형 진균 (filamentous fungi)이 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해서 또한 사용될 수 있다. 필라멘트형 진균에서 재조합 단백질을 발현 및/또는 분비하는 벡터가 잘 알려져 있으며, 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 재조합 동물 콜라겐을 발현시키기 위해서 상기 벡터를 사용할 수 있다.

식물 발현 (Plant Expression). 하나의 양태에서, 동물 콜라겐이 식물 또는 식물 세포에서 제조된다. 식물 발현 벡터가 사용되는 경우에, 본 발명의 콜라겐을 인코딩하는 서열의 발현이 다수의 프로모터 중 어느 것에 의해서 구동될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 (Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514), 또는 TMV의 코트 단백질 프로모터 (Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311)가 사용될 수 있고; 대안으로서, 식물 프로모터, 에컨대 RUBISCO의 작은 서브유닛 (Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224:838-843) 또는 열 충격 프로모터 (heat shock promoters), 예컨대, 대두 (soybean) hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B (Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565)가 사용될 수 있다. 상기 구조체가 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 방법, 예컨대 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주입 (microinjection), 전기영동 (electroporation), 등의 다양한 방법에 의해서 식물 세포로 도입될 수 있다. 상기 기술의 검토를 위해서, 예를 들면, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463 (1988); Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9 (1988); Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen and Pen eds., John Wiliey & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun and Breiman eds, Imperial College Press, 1997; and Applied Plant Biotechnology, Chopra, Malik, and Bhat eds., Science Publishers, Inc., 1999 참조.

식물 세포는 안정한 콜라겐을 효과적으로 제조하기 위해서 번역후 효소의 충분한 양을 자연적으로 생성하지 못한다. 그러므로, 히드록실화를 원하는 경우, 안정한 콜라겐을 충분히 생성하기 위해서 동물 콜라겐을 발현시키기 위해서 사용된 식물 세포에 필요한 번역후 효소가 보충된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 번역후 효소는 프롤릴 4-히드록실라제이다.

식물계에서 본 동물 콜라겐을 생성하는 방법이 식물 또는 식물 세포로부터 바이오매스 (biomass)를 제공함으로써 달성될 수 있고, 상기 식물 또는 식물 세포는 상기 폴리펩티드의 발현을 초래하기 위해서 프로모토에 작동적으로 연결된 (operably linked) 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 그 후에 상기 바이오매스로부터 추출된다. 대안으로서, 상기 폴리펩티드가 추출되지 않을 수 있고, 예컨대 상기 배유 (endosperm)로 발현될 수 있다.

식물 발현 벡터 및 리포터 유전자 (reporter genes)가 일반적으로 당분야에 알려져 있다; 예컨대 Gruber et al. (1993) in Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology , CRC Press 참조. 통상적으로, 상기 발현 벡터는 예를 들어 재조합 또는 합성으로 생성된 핵산 구조체를 포함하고, 식물 세포에서 기능하는 프로모터를 포함하며, 이러한 프로모터가 동물 콜라겐 또는 그 단편 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 콜라겐의 생합성에 중요한 번역후 효소에 작동적으로 연결된다.

프로모터는 식물에서 단백질 발현의 수준을 유도한다. 식물에서 원하는 수준의 단백질 발현을 생성하기 위해서, 발현이 식물 프로모터의 지시하에 있을 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적당한 프로모터가 일반적으로 당분야에서 이용가능하다; 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 91/19806 참조. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 프로모터의 예는 비-항시성 프로모터 또는 항시성 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 이에 한정되는 것은 아니지만, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유닛에 대한 프로모터; 아그로박테리움 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens )의 종양-유도 플라스미드로부터의 프로모터, 예컨대, RUBISCO 노팔린 (nopaline) 신타제 (NOS) 및 옥토핀 (octopine) 신타제 프로모터; 박테리아성 T-DNA 프로모터, 예컨대 mas 및 ocs 프로모터; 및 바이러스 프로모터, 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus: CaMV) 19S 및 35S 프로모터 또는 피그워트 모자이크 바이러스 (figwort mosaic virus) 35S 프로모터를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열이 식물의 대부분의 조직에서 콜라겐 또는 번역후 효소의 발현을 지시하는 항시성 프로모터의 전사 조절 하에 있을 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터의 조절하에 있다. 이중가닥 콜리모바이러스 패밀리 (caulimorvirus family)가 식물에서 이식유전자 (transgene) 발현을 위한 단일한 가장 중요한 프로모터 발현, 특히 35S 프로모터의 발현을 제공한다; 예를 들어, Kay et al. (1987) Science 236:1299 참조. 상기 피그워트 모자이크 바이러스 프로모터 등과 같은 상기 패밀리로부터 부가의 프로모터가 당분야에 개시되었고, 또한 사용될 수 있다; 예를 들어, Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:433-443; Medberry et al. (1992) Plant Cell 4:195-192; and Yin and Beachy (1995) Plant J. 7:969-980 참조.

콜라겐을 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 구조체에서 사용된 프로모터가 원한다면 변형되어서 그 조절 특성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 상기 CaMV 프로모터가 빛의 부재하에 RUBISCO의 발현을 억제하는 RUBISCO 유전자의 일부에 결찰되어서 뿌리가 아니라 잎에서 활성인 프로모터를 형성한다. 수득된 키메라 (chimeric) 프로모터가 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.

당분야에 알려져 있는 일반적 발현 특성을 갖는 항시성 식물 프로모터가 본 발명의 발현 벡터와 함께 사용될 수 있다. 상기 프로모터가 대부분의 식물 조직에서 풍부하게 발현되고, 예를 들어 액틴 (actin) 프로모터 및 유비퀴틴 (ubiquitin) 프로모터를 포함한다; 예를 들면, McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171; and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 참조.

대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드가 특정 조직, 세포 타입에서, 또는 더 정확한 환경 조건 또는 성장 조절하에 발현될 수 있다. 상기 예에서 발현을 지시하는 프로모터가 유도성 프로모터로 알려져 있다. 조직-특이적 프로모터가 사용된 경우에, 단백질 발현은 상기 단백질의 추출이 소망되는 조직에서 특히 높다. 원하는 조직에 따라서, 배유, 호분층 (aleurone layer), 배아 (embryo) (또는 배반 (scutellum) 및 자엽 (cotyledons)으로서 그 일부), 과피 (pericarp), 줄기 (stem), 잎 덩이줄기 (leaves tubers), 뿌리 (roots) 등이 발현의 표적이 될 수 있다. 공지된 조직-특이적 프로모터의 예로는 덩이줄기-유도 클래스 I 파타틴 프로모터 (tuber-directed class I patatin promoter), 감자 괴경 ADPGPP 유전자와 관련된 프로모터, 씨-유도 전사를 구동하는 β-콘글리시닌 (7S 단백질)의 대두 프로모터, 및 옥수수 배유의 zein 유전자로부터의 씨-유도 프로모터를 포함한다; 예를 들어, Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4625-38; Muller et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224:136-46; Bray (1987) Planta 172: 364-370; and Pedersen et al. (1982) Cell 29:1015-26 참조.

콜라겐 폴리펩티드가 예를 들어 카놀라, 옥수수, 대두, 쌀, 및 보리 씨를 사용하여 씨-기반 제조 기술에 의해서 씨에서 생성될 수 있다. 상기 과정에서, 예를 들어, 상기 생성물이 종자 발아 (seed germination) 중에 회수된다; 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 9940210; WO 9916890; WO 9907206; 미국 특허 제5,866,121호; 미국 특허 제5,792,933호; 및 여기 인용된 모든 문헌 참조. 상기 폴리펩티드의 발현 유도를 위해서 사용될 수 있는 프로모터는 이종 또는 비-이종일 수 있다. 상기 프로모터가 또한 원하는 조직에서 본 동물 콜라겐의 농도 및 조성을 감소, 증가 또는 변화시키기 위한 안티센스 (antisense) 핵산의 발현을 구동하기 위해서 사용될 수 있다.

식물 또는 식물 세포에서 본 폴리펩티드의 전사를 증가 및/또는 최대화하기 위해서 제조될 수 있는 다른 변형이 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 기준으로 알려져 있다. 예를 들면, 프로모터에 작동적으로 연결된, 재조합 동물 콜라겐, 또는 그 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 콜라겐의 전사율 또는 관련된 번역후 효소를 변형하는 적어도 하나의 인자를 더 포함할 수 있고, 상기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 펩티드 방출 신호 서열, 코돈 사용, 인트론, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 식물에서 발현 수준을 증가시키기 위해 구조체를 변형하는 방법이 일반적으로 당분야에 알려져 있다; 예를 들어, Rogers et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3731; and Cornejo et al. (1993) Plant Mol Biol 23:567-58 참조. 본 콜라겐의 전사율 및 관련된 번역후 효소에 영향을 주는 식물계를 조작하는데 있어서, 포지티브 또는 네가티브 작용 서열, 인헨서 (enhancers) 및 사일런서 (silencers)와 같은 조절 서열, 뿐만 아니라 크로마틴 구조 (chromatin structure)를 포함하는 당분야에 알려져 있는 다양한 인자가 식물에서 전사율에 영향을 줄 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 전술한 콜라겐 타입을 포함하는 재조합 동물 콜라겐을 발현할 때 상기 인자들 중 적어도 하나가 사용될 수 있다.

본 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 통상적으로 식물 세포에서 선택가능한 표현형을 부여하는 마커 유전자를 포함할 것이다. 보통, 상기 선택가능한 마커 유전자는 항생제 내성을 인코딩할 것이고, 적당한 유전자는 항생제 스펙티노마이신 (spectinomycin)에 대한 내성을 코딩하는 유전자, 스트렙토마이신 내성에 대해 코딩하는 스트렙토마이신 포포트란스퍼라제 (streptomycin phophotransferase: SPT) 유전자, 카나마이신 (kanamycin) 또는 게네티신 (geneticin) 내성을 인코딩하는 네오마이신 포포트란스퍼라제 (neomycin phophotransferase: NPTH) 유전자, 아세토락테이트 신타제 (acetolactate synthase: ALS)의 작용을 억제하는 작용을 하는 제초제에 대한 내성에 대해 코딩하는 히그로마이신 내성 (hygromycin resistance) 유전자, 특히, 술포닐우레아-타입 제초제; 예컨대, 특히 S4 및/또는 Hra 돌연변이화에서 내성을 유도하는 아세토락테이트 신타제 (acetolactate synthase: ALS) 유전자를 포함하는 돌연변이, 글루타민 신타제의 작용을 억제하는 작용을 하는 제초제에 대한 내성에 대해 코딩하는 유전자, 예컨대 포피노트리신 (phophinothricin) 또는 바스타 (basta); 예컨대, bar 유전자, 또는 당분야에 알려져 있는 다른 유사한 유전자의 적어도 하나의 세트를 포함한다. 상기 bar 유전자는 제초제 basta에 내성을 인코딩하고, 상기 nptII 유전자는 항생제 카나마이신 및 게네티신에 내성을 인코딩하고, 상기 ALS 유전자는 제초제 클로르술푸론 (chlorsulfuron)에 내성을 인코딩한다.

식물에서 외래 유전자의 발현에 유용한 통상적인 벡터가 당분야에 잘 알려져 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 (Ti) 플라스미드로부터 유래된 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 형질전환시에 상기 숙주 식물의 게놈으로 DNA의 일부를 통합시키는 식물 통합 벡터이다; 예를 들어, Rogers et al. (1987) Meth In Enzymol. 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; and Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8402-8406 참조.

본 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터 및 그 번역후 효소 또는 그 서브유닛을 포함하는 벡터가 상기 원하는 식물로 동시 도입될 수 있다. 식물 세포를 형질전환하는 과정은 당분야에서, 예를 들어, 직접 유전자 전달 (direct gene transfer), 인 비트로 ( in vitro ) 프로토플라스트 형질전환 (protoplast transformation), 식물 바이러스-매개 (plant virus-mediated) 형질전환, 리포좀-매개 (liposome-mediated) 형질전환, 미세주입, 전기영동, 아그로박테리움-매개 형질전환 및 입자 봄바드먼트 (particle bombardment)에서 이용가능하다; 예를 들어, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; 미국 특허 제4,684,611호; 유럽 출원 제0 67 553호; 미국 특허 제4,407,956호; 미국 특허 제4,536,475호; Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:5602-5606; Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-921; 및 미국 특허 제4,945,050호 참조. 예를 들어, 쌀, 밀, 옥수수, 수수, 및 보리의 형질전환에 대한 표준 방법이 당분야에 개시되었다: 예를 들어, Christou et al. (1992) Trends in Biotechnology 10: 239 and Lee et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:6389 참조. 옥수수 또는 쌀을 형질전환하기 위해서 사용된 것과 유사한 기술에 의해서 밀이 형질전환될 수 있다. 또한, Casas et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11212에서는 수수의 형질전환에 대한 방법을 개시하고, 한편 Wan et al. (1994) Plant Physiol. 104: 37에서는 보리를 형질전환하기 위한 방법을 교시한다. 옥수수 형질전환을 위한 적당한 방법이 Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833 및 Gordon-Kamm et al., supra 에 의해서 제공된다.

본 발명의 동물 콜라겐을 생성하는 식물을 제조하는데 사용될 수 있는 부가의 방법이 당분야에 수립되었다: 예를 들어, 미국 특허 제5,959,091호; 미국 특허 제5,859,347호; 미국 특허 제5,763,241호; 미국 특허 제5,659,122호; 미국 특허 제5,593,874호; 미국 특허 제5,495,071호; 미국 특허 제5,424,412호; 미국 특허 제5,362,865호; 미국 특허 제5,229,112호; 미국 특허 제5,981,841호; 미국 특허 제5,959,179호; 미국 특허 제5,932,439호; 미국 특허 제5,869,720호; 미국 특허 제5,804,425호; 미국 특허 제5,763,245호; 미국 특허 제5,716,837호; 미국 특허 제5,689,052호; 미국 특허 제5,633,435호; 미국 특허 제5,631,152호; 미국 특허 제5,627,061호; 미국 특허 제5,602,321호; 미국 특허 제5,589,612호; 미국 특허 제5,510,253호; 미국 특허 제5,503,999호; 미국 특허 제5,378,619호; 미국 특허 제5,349,124호; 미국 특허 제5,304,730호; 미국 특허 제5,185,253호; 미국 특허 제4,970,168호; 유럽 공개 번호 EPA 00709462; 유럽 공개 번호 EPA 00578627; 유럽 공개 번호 EPA 00531273; 유럽 공개 번호 EPA 00426641; PCT 공개 번호 WO 99/31248; PCT 공개 번호 WO 98/58069; PCT 공개 번호 WO 98/45457; PCT 공개 번호 WO 98/31812; PCT 공개 번호 WO 98/08962; PCT 공개 번호 WO 97/48814; PCT 공개 번호 WO 97/30582; 및 PCT 공개 번호 WO 9717459를 참조한다.

곤충 발현 (Insect Expression). 콜라겐에 대한 다른 대안의 발현 시스템은 곤충계이다. 바쿨로바이러스 (Baculoviruses)는 곤충 세포에서 다양한 재조합 단백질의 대규모 생성을 위한 매우 효과적인 발현 벡터이다. 상기 방법이 Luckow et al. (1989) Virology 170:31-39 and Gruenwald, S. and Heitz, J. (1993) Baculovirus Expression Vector System에 개시되고: Procedures & Methods Manual, Pharmingen, San Diego, CA가 본 발명의 콜라겐에 대한 콜라겐 코딩 서열 및 적당한 전사/번역 조절 시그날을 포함하는 발현 벡터를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 재조합 생성이, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 바쿨로바이러스 벡터의 감염에 의해서 곤충 세포에서 수득될 수 있다. 안정한 3중 나선을 갖는 재조합 콜라겐, 콜라겐-유사 또는 콜라겐성 폴리펩티드의 제조는 발현될 동물 콜라겐을 인코딩하는 것 및 프롤릴 4-히드록실라제의 α 서브유닛 및 β 서브유닛을 각각 인코딩하는 3개의 바쿨로바이러스로 곤충 세포를 동시-감염시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 곤충 세포계는 다량의 재조합 단백질을 생성시킨다. 하나의 이러한 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 핵 폴리히드로시스 바이러스 ( Autographa californica nuclear polyhidrosis virus: AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 상기 바이러스가 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) 세포에서 성장한다. 콜라겐 또는 콜라겐-유사 폴리펩티드 대한 코딩 서열이 상기 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리히드론 (polyhedron) 유전자)으로 클로닝되고, 또한 AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리히드론 프로모터)의 조절하에 놓일 수 있다. 코딩 서열의 성공적인 삽입으로 폴리히드론 유전자의 불활성화 및 비-흡장된 (non-occluded) 재조합 바이러스; 예컨대, 상기 폴리히드론 유전자에 의해서 코딩된 단백질성 코트가 결핍된 바이러스를 생성시킬 것이다. 상기 재조합 바이러스가 그 후에 상기 삽입된 유전자가 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) 세포를 감염시키기 위해서 사용된다; 예를 들어, Smith et al. (1983) J. Virol. 46:584; 및 미국 특허 제4,215,051호 참조. 상기 발현 시스템의 부가의 예가 예를 들어 상기 Ausubel et al.에서 찾을 수 있다.

동물 발현 (Animal Expression). 동물 숙주 세포에서, 다수의 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 (adenovirus)가 발현 벡터로 사용되는 경우에, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대 후기 프로모터 (late promoter) 및 삼부 리더 서열 (tripartite leader sequence)에 결찰될 수 있다. 상기 키메라 유전자가 그 후에 인 비트로 또는 인 비보 재조합에 의해서 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 상기 바이러스 게놈의 비-필수 영역에서 삽입 (예컨대, 영역 E1 또는 E3)으로 감염된 숙주에서 상기 인코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존가능한 재조합 바이러스를 제조할 것이다; 예를 들어, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984) 참조. 대안으로서, 상기 백시니아 (vaccinia) 7.5 K 프로모터가 사용될 수 있다; 예를 들어, Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al. (1982) J. Virol. 49:857-864; and Panicali et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 참조.

포유류 숙주 세포에서 바람직한 발현 시스템은 셈리키 삼림열 바이러스 (Semliki Forest virus)이다. 포유류 숙주 세포, 예를 들면 베이비 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포의 감염으로 매우 높은 재조합 발현 수준을 수득할 수 있다. 셈리키 삼림열 바이러스는 상기 바이러스가 광범위한 숙주 범위를 갖기 때문에 바람직한 발현 시스템이고, 포유류 세포주의 감염이 가능할 것이다. 특히, 상기 시스템이 크로모좀 통합에 기반하지 않으므로, 구조적 기능 관계를 동정하고, 다양한 하이브리드 분자의 효과를 시험하는데 목적이 있는 연구에서 상기 재조합 동물 콜라겐의 변형을 수득하는 용이한 방법을 제공하기 때문에 셈리키 삼림열 바이러스가 광범위한 숙주 범위에서 사용될 수 있다. 포유류 숙주 세포에서 외인성 단백질의 발현을 위한 셈리키 삼림열 바이러스 벡터를 제조하는 방법이 예를 들면 Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol 43:43-53에 기재되었다.

비인간 유전자이식 동물 (non-human transgenic animals)이 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 시스템이 유선 (mammary glands)에서 발현을 초래할 수 있는 필수 또는 선택적 조절 서열과 함께, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 작동적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 마찬가지로, 필요적 또는 선택적 번역후 효소가 적당한 발현 시스템을 사용하는 표적 세포에서 동시에 생성될 수 있다. 단백질을 재조합으로 생성하기 위한 비-인간 유전자이식 동물을 사용하는 방법이 당분야에 알려져 있다; 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호; 미국 특허 제5,824,838호; 미국 특허 제5,487,992호; 및 미국 특허 제5,614,396호 참조.

재조합 콜라겐의 생산을 개시하는 상기 섹션에서 인용된 참조문이 참조로 각각 포함된다.

복합체 콜라겐 파이버 시트 (Composite collagen fiber sheets). 도 1에서 도시된 바와 같이, 3중 나선 콜라겐 분자가 동물 피부에서 더 큰 피브릴 번들 또는 콜라겐 파이버로 조립되는 피브릴로 결합된다. 콜라겐 시트를 제조하는 이전의 방법은 분쇄된 동물 피부 또는 레더 스크랩의 혼합물을 사용하고, 콜라겐을 용해 또는 현탁시켰다. 상기 콜라겐 파이버-함유 생성물이 미국 특허 제2,934,446호; 제3,073,714호; 제3,122,599호; 및 제3,136,682호에 의해서 개시되었다. Highberger, et al.의 미국 특허 제2,934,446호에서는 송아지피부 가죽 또는 진피의 슬러리를 제조하기 위해서 고기 분쇄기를 사용하는 방법이 개시되었고, 상기 슬러리를 시트로 성형시키고, 5 ℃의 산성 수용액에서 동물 피부를 분쇄 및 분산시킴으로써 교차된 (interlocked) 콜라겐 파이버 물질을 형성하기 위해서 태닝시키고, 그 후에 상기 pH 및 온도를 상승시켜서 콜라겐 섬유를 침전시키고, 겔을 형성하고 그 후에 건조시키는 단계를 포함한다. 콜라겐 파이버 물질의 시트는 레더 스크랩을 사용하여, 레더와 유사한 시트를 형성한다. Highberger는 상기 레더 시트가 상업적 용도로 적당하다는 것을 보여주지 않았다. Tu, et al.의 미국 특허 제3,073,714호는 베지터블 태닝 용액으로 태닝되고, 글리세린 및 올레산으로 처리된 25% 고형물을 포함하는 송아지피부 슬러리로부터 시트를 제조하는 방법을 개시하였다. 상기 콜라겐 파이버 시트가 천연 피부 및 가죽에서 콜라겐 파이버의 내부 정렬을 재현하는 것으로 개시되었다. Tu는 상기 레더 시트가 소비자 제품에 사용하기에 조성적 또는 심미적으로 적당하다는 것을 보여주지 않았다. Tu, et al.의 미국 특허 제3,122,599호는 콜라겐 파이버 및 가용성 콜라겐 뿐만 아니라 동물 피부로부터 유래된 다른 성분들을 포함하는 분쇄된 동물 피부 또는 레더로부터 만들어진 레더-유사 시트를 개시한다. Tu는 상기 혼합물을 크롬으로 처리하고, 이를 아세톤으로 탈수시켜서, 올레산으로 처리하여, 콜라겐 파이버 물질을 함유하는 레더-유사 생성물을 제조하는 것을 개시하였다. Tu는 상기 시트가 소비자 제품에서 사용하기에 조성적, 물리적 또는 심미적으로 적당하다는 것을 보여주지 않았다. Tu, et al.의 미국 특허 제3,136,682호는 콜라겐 파이버들의 혼합물 및 동물 피부로부터 유래된 수용성 단백질성 물질의 결합제를 포함하는 레더-유사 물질을 제조하는 방법을 개시하였다. 또한, 크롬 태닝제의 사용 및 올레산으로 처리를 개시하였다. Tu는 우수한 외관 및 촉감의 시트를 개시하였지만, 그러나 소비자 제품으로 도입하기에 적당한지를 보여주지 않았다. 상기 생성물은 거칠고, 분쇄되거나, 또는 분해된 콜라겐 파이버를 포함한다.

배양된 레더 제품 (Cultured leather products). 상기 제품은 일반적으로 인 비트로에서 세포 배양에 의해서 제조된 콜라겐 함유 복수의 층을 포함하고, 이는 Forgacs, et al., US 2016/0097109 A1 및 Greene의 미국 특허 제9,428,817 B2호에 개시되었다. 상기 제품이 세포 이식편 또는 배양된 콜라겐-생성 세포의 배양에 의해서 인 비트로에서 생성된다. 상기 세포는 콜라겐 피브릴의 4차 번들로 콜라겐을 생성 및 처리하고, 본 발명의 상기 콜라겐 피브릴의 무작위적 비-이방성 (non-antistrophic) 구조를 갖지 않는다. Forgacs는 성형되어서 레더 제품을 제조할 수 있는 가공된 동물 피부를 개시하였다. Green은 다양한 제품, 예컨대, 인 비트로에서 배양된 레더를 포함할 수 있는 풋웨어, 의류 및 여행가방을 개시하였다. US 2013/0255003에서는 배양물 중 소의 피부 세포를 성장시킴으로써 레더-유사 제품을 위한 콜라겐을 제조하는 것을 개시하였다. 의료용 이식을 위해 콜라겐을 제조하거나 또는 젤라틴을 제조하기 위해 숙주 세포의 다른 타입이 이용되었다. 예를 들면, 미국 특허 출원 US 2004/0018592에서는 숙주 세포, 예컨대 이스트에서 소의 콜라겐을 재조합으로 발현시킴으로써 젤라틴을 제조하는 방법이 개시되었다.

의료용 제품 (Medical products). 콜라겐의 네트워크가 생물의학적 적용을 위한 물질로서 인 비트로에서 제조되었다. 상기 적용에서, 콜라겐 3중 나선의 모노머가 동물 조직, 예컨대 소 진피로부터, 산 처리 또는 펩신 (pepsin)과 같은 단백질 분해 효소에 의한 처리에 의해서 추출되어서, 상기 조직으로부터 콜라겐을 용해시켰다. 일단 정제되면, 상기 가용화된 콜라겐 (종종 상기 콜라겐 3중 나선의 모노머, 다이머 및 트리머의 혼합물)이 수성 완충액에서 pH 이동을 통해서 피브릴로 피브릴화될 수 있다. 올바른 조건하에서, 상기 콜라겐 모노머가 피브릴로 자기-조립되고, 그 공급원 및 분리되는 방법에 따라서, 상기 피브릴이 물리적으로 가교되어 고형 히드로겔이 형성될 수 있다. 또한, 재조합 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질이 pH 및 염 농도에서 유사한 조정을 통해서 인 비트로에서 피브릴화되는 것이 개시되었다. 의료 용도를 위한 상기 제품의 예로는 미국 특허 제9,539,363호의 거시적 콜라겐 파이버로 자기-조립되는 콜라겐 슬러리로부터 제조된 생분해성 콜라겐 매트릭스, 및 미국 특허 제9,518,106호의 외부 가이던스 구조 또는 내부 주형 및 텐션 적용의 사용에 의해서 제조되는 콜라겐 피브릴의 조직화된 어레이를 포함한다. 의약, 예컨대 조직 공학 또는 이식에 사용되는 콜라겐 제품은 가공될 또는 복구될 특정 조직에서와 유사한 형태로 콜라겐을 제공하는데 목적이 있다. 가용성 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 피브릴화가 생물의학적 용도를 위한 콜라겐 히드로겔을 제조하기 위해서 연구되었으나, 상기 기술이 천연 레더의 강도 및 심미적 특성을 갖는 물질의 제조에 성공적으로 적용되지 못했다.

합성 플라스틱-기반 레더 (Synthetic plastic-based leathers). 합성 레더를 제조하기 위한 시도는 기능적 및 심미적 특성을 갖는 레더의 독특한 세트를 재현하는데 부족함이 있었다. 합성 레더 물질의 예로는 다른 것들 중에서도 클라리노 (Clarino), Naugahyde®, 코르팜 (Corfam), 및 알칸타라 (Alcantara)를 포함한다. 상기는 폴리비닐 클로리드, 폴리우레탄, 니트로셀룰로스 코팅된 면포, 폴리에스테르, 또는 합성 폴리머로 코팅된 기타 천연 천 또는 파이버 물질을 포함하는 다양한 화학적 및 폴리머 성분으로 이루어진다. 상기 물질들이, 부직포 및 고급 방사 공정을 포함하는, 화학적 및 직물 제조 접근법으로부터 유래되는, 다양한 기술을 사용하여 조립된다. 많은 상기 물질들이 풋웨어, 덮개, 및 의류 용도로서 사용되었으나, 상기는 고급품 용도에는 충분하지 않은 바, 이는 레더를 더 독특하고 사랑받게 만드는 통기성 (breathability), 성능 (performance), 촉감 (hand feel), 또는 심미적 특성에 부합될 수 없기 때문이다. 최근까지 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질의 균일한 네트워크로부터 대안의 상업적 레더-유사 물질이 만들어지지 못했다. 합성 플라스틱 물질은 허용가능한 레더 외관을 생성하는 콜라겐 네트워크의 화학적 조성 및 구조가 결여되어 있다. 합성과 달리, 콜라겐 폴리펩티드 사슬을 따라서 아미노산 측기의 화학적 조성과, 그 조직을 다공성으로 만드는 섬유상 구조는 가교화 과정을 통해서 피브릴 네트워크를 안정화 및 기능화시켜서, 레더의 원하는 강도, 연화도 (softness) 및 미감을 가능케한다.

가용성 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 피브릴화가 분쇄 또는 세분된 레더 스크랩을 함께 결합시키거나, 또는 생물의학적 용도를 위한 콜라겐 히드로겔의 제조를 위해서 연구되었으나, 상업적으로 허용가능한 레더-유사 물질을 제조하기 위해서 이러한 현상을 활용하는 것은 달성되지 않았다.

종래 기술의 천연 레더, 및 복합체, 배양 및 합성, 플라스틱-기반 레더 제품의 문제점을 고려하여, 본 발명자들은, 레더에서 발견된 천연 성분들을 포함하는 우수한 강도 및 균일성 및 비-이방성 특성을 갖는 생제작된 레더를 제공하는 방법을 열심히 추구했다.

본원에서 가교, 탈수 및 윤활에 의해서 부여된 레더-유사 특성을 갖는, 인 비트로에서 피브릴화된 콜라겐 피브릴로 이루어진 물질이 개시되었다. 태닝되고, 가지화된 (fatliquored) 동물 가죽과 비교하여, 상기 생제작된 물질은 구조적, 조성적 및 기능적으로 균일함을 가질 수 있고, 예를 들어 유익하게 실질적으로 비-이방성 강도 및 기타 기계적 특성 뿐만 아니라 그 상부면과 바닥면 모두에서 탑 그레인과 같은 미관을 가질 수 있다.

그 다른 구현예들 중에서, 본 발명은 가교 및 윤활된 콜라겐 피브릴의 네트워크로 이루어진 생제작된 물질에 관한 것이다. 상기는 동물 공급원으로부터 분리된 콜라겐 또는 재조합 콜라겐으로부터 제조될 수 있다. 실질적으로 잔기를 포함하지 않는 콜라겐으로부터 제조될 수 있다. 바람직하게, 콜라겐 파이버의 다량의 번들, 또는 레더의 다른 비-히드록시리신 또는 비-3-히드록시프롤린 콜라겐 성분, 예컨대 엘라스틴이 실질적으로 존재하지 않는다. 상기 물질은 또한 천연 레더의 주요 성분인 콜라겐으로 이루어지고, 피브릴로의 콜라겐 분자의 피브릴화, 상기 피브릴의 가교 및 상기 가교된 피브릴의 윤활의 공정에 의해서 제조된다.

천연 레더와 달리, 상기 생제작된 물질은 비-이방성 (방향 의존성이 없음) 물리적 특성을 나타내며, 예를 들면, 생제작된 물질의 시트는 다른 방향에서 측정될 때 실질적으로 동일한 탄성 또는 인장 강도를 가질 수 있다. 천연 레더와는 달리, 상기는 염료 및 코팅재의 균일한 흡수를 촉진하는 균일한 질감을 갖는다. 심미적으로, 상기는 제조가능성이 용이하게 균일하고 일관된 그레인을 제조한다. 상기는, 그레인이 한쪽 면 (예컨대, 원말단의 표면)에서 다른쪽 면(근접 내부 층)으로 증가되는 천연 레더와는 달리, 양쪽 면에서 실질적으로 동일한 그레인, 질감 및 기타 심미적 특성을 가질 수 있다.

도 1은 콜라겐의 조성을 계층적 형태로 보여주는 도면이다. 참조 문자 (1)은 각 삼중 나선 콜라겐 모노머 및 이들이 이웃하는 콜라겐 모노머와 관련하여 어떻게 조립되는지를 나타내고; (2)는 밴딩된 (banded) 콜라겐 피브릴로 만들어진 조립된 콜라겐을 나타내며; (3)은 더 큰 축적으로 상기 콜라겐 피브릴을 나타내고; (4)는 파이버로 정렬된 콜라겐 피브릴을 나타내며; 또한 (5)는 콜라겐 파이버의 번들을 나타낸다.
도 2a는 버팔로 가죽의 조성을 나타내는 사진이다. 탑 그레인 층 및 그 아래의 진피 층이 도시되고, 콜라겐 피브릴에서 콜라겐 파이버 번들로의 더 높은 차수의 조직의 상대 정도가 표시된다. 상기 탑 그레인 층은 대부분 미세한 콜라겐 피브릴로 이루어지고, 상기 진피 층은 대부분 더 거친 콜라겐 파이버 및 파이버 번들로 이루어진다.
도 2b 및 도 2c는 한쪽이 미세한 그레인이고, 다른 쪽이 더 거친 진피를 나타내는 레더의 외부면 및 내부면의 질감 및 그레인을 비교하였다.
도 3a는 미세한 콜라겐 피브릴의 네트워크를 보여주는 피브릴화된 콜라겐 히드로겔의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 3b는 더 거친 파이버 번들을 나타내는 소의 진피의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 4는 피브릴 밴딩을 나타내는 피브릴화된 콜라겐 네트워크 또는 히드로겔의 투과 전자 현미경 사진이다.

본원에서 사용되는 " 생제작된 물질 ( biofabricated material)" 또는 " 생제작된 레더 ( biofabricated leather)" 는 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질로부터 제조된 물질이다. 상기는 비-인간 콜라겐, 예컨대, 소, 버팔로, 황소, 사슴, 양, 염소 또는 돼지 콜라겐으로부터 제조될 수 있고, 상기는 동물 가죽과 같은 자연 공급원으로부터 포유류 또는 동물 세포의 인 비트로 배양에 의해서 분리되고, 재조합으로 생성되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 상기는 동물 피부로부터 제조된 종래의 물질 또는 레더가 아니다. 상기 생제작된 물질 또는 생제작된 레더를 제조하는 방법이 본원에 개시되었고, 일반적으로 콜라겐 피브릴을 제조하기 위해서 콜라겐 분자의 분리 또는 정제된 용액 또는 현탁액을 피브릴화하고, 상기 피브릴을 가교하고, 상기 피브릴을 탈수하고, 또한 상기 피브릴을 윤활시키는 것을 포함한다.

이종성 내부 콜라겐 구조를 나타내는 천연 레더와 대조적으로, 생제작된 물질 또는 생제작된 레더는 그 부피 전체를 통해서 언번들되고, 또한 무작위로-배향된 콜라겐 피브릴을 특징으로 하는 실질적으로 균일한 내부 구조를 나타낼 수 있다.

상기 수득된 생제작된 물질이 천연 레더가 사용되는 임의의 방법으로 사용될 수 있고, 또한 실제 레더와 거의 유사한 외관 및 촉감을 나타낼 수 있지만, 통상의 레더와 구별되는 조성적, 기능적 또는 심미적 특성을 갖는다. 예를 들어, 천연 레더와 달리, 생제작된 레더는 천연 레더에서 발견되는 가능한 알레르겐성 비-콜라겐 단백질 또는 성분을 포함하지 않으며, 생제작된 레더는 그 콜라겐 피브릴의 실질적인 비-정렬에 의해 모든 방향(비-이등성)으로 유사한 가요성 및 강도를 나타낼 수 있고, 심미적으로 양쪽 면에서 매끄러운 그레인 질감을 가질 수 있다. 생제작된 레더는 균일한 두께 및 항시성, 윤활제, 가교제, 염료의 균일한 분포, 균일한 비-이방성 강도, 연신율, 가요성 및 파이핑 (piping)에 대한 저항성 (또는 시트의 평면에 평행하게 분리 또는 분할되는 천연 레더에 대한 경향)을 포함하는 특성들의 균일함을 나타낼 수 있다. 콜라겐의 함량 및 처리 조건을 선택함으로써, 생제작된 레더가 특정 두께, 항시성, 가요성, 연화도, 드레이프 (drape), 표면 질감 또는 다른 기능성으로 "조절 (tuned)"될 수 있다. 라미네이팅, 적층 또는 복합체 제품은 생제작된 레더를 포함할 수 있다.

용어 "콜라겐 (collagen)" 은 콜라겐 타입 I 내지 XX, 뿐만 아니라 임의의 다른 콜라겐을 포함하는 공지된 콜라겐 타입 중 어느 하나를 나타내고, 이는 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합을 포함한다. 상기는 본원에 개시된 콜라겐, 변형된 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 모두를 포함한다. 상기 용어는 또한 프로콜라겐 (procollagens) 및 콜라겐-유사 단백질 또는 모티프 (Gly-XY)n를 포함하는 콜라겐성 단백질 (collagenous proteins)을 포함하고, 여기서 n은 정수이다. 상기는 콜라겐 및 콜라겐-유사 단백질의 분자, 콜라겐 분자의 트리머, 콜라겐의 피브릴, 및 콜라겐 피브릴의 파이버를 포함한다. 상기는 또한 피브릴화될 수 있는 화학적, 효소적 또는 재조합으로-변형된 콜라겐 또는 콜라겐-유사 분자 뿐만 아니라 나노섬유로 조립될 수 있는 콜라겐, 콜라겐-유사 분자 및 콜라겐성 분자의 단편을 의미한다.

일부 구현예에서, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질내 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및 프롤린은 상응하는 천연 또는 비변형된 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질보다 히드록실화가 결여되거나, 또는 더 적거나 또는 더 많은 히드록실화 정도를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질에서 아미노산 잔기는 상응하는 천연 또는 비변형된 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질보다 글리코실화가 결여되거나, 또는 더 적거나 또는 더 많은 글리코실화 정도를 가질 수 있다.

콜라겐 조성물 중 콜라겐은 콜라겐 분자의 단일한 타입, 예컨대 100% 소의 타입 I 콜라겐 또는 100% 타입 III 소의 콜라겐을 균일하게 포함할 수 있거나, 또는 콜라겐 분자 또는 콜라겐-유사 분자의 상이한 종류의 혼합물, 예컨대 소의 타입 I 및 타입 III 분자들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 혼합물은 상기 개별의 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질 성분들의 > 0%, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 < 100%를 포함할 수 있다. 상기 범위는 모든 중간 값을 포함한다. 예를 들어, 콜라겐 조성물은 30%의 타입 I 콜라겐 및 70%의 타입 III 콜라겐을 포함할 수 있거나, 또는 33.3%의 타입 I 콜라겐, 33.3%의 타입 II 콜라겐, 및 33.3%의 타입 III 콜라겐을 포함할 수 있고, 상기 콜라겐의 퍼센트는 조성물 중 콜라겐의 전체 질량 또는 콜라겐 분자의 분자 퍼센트에 기반한다.

"콜라겐 피브릴 (Collagen fibrils)" 은 트로포콜라겐 (tropocollagen) (콜라겐 분자의 3중 나선)으로 이루어진 나노섬유이다. 트로포콜라겐은 또한 3중 나선 구조를 나타내는 트로포콜라겐-유사 구조를 포함한다. 본 발명의 콜라겐 피브릴은 1 nm 내지 1 μm 범위의 직경을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 콜라겐 피브릴은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 nm (1 μm) 범위의 평균 또는 개별 피브릴 직경을 가질 수 있다. 상기 범위는 모든 중간값 및 하위범위 (subranges)를 포함한다. 본 발명의 구현예들의 일부에서, 콜라겐 피브릴은 예를 들어 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이 네트워크를 형성할 것이다. 콜라겐 피브릴은 도 1에 도시된 밴드된 패턴을 나타내는 피브릴로 결합할 수 있고, 또한 상기 피브릴은 피브릴의 더 큰 응집체로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 피브릴은 소 또는 다른 종래의 레더의 탑 그레인 또는 표면 층에서와 유사한 직경 및 배향을 가질 것이다. 다른 구현예에서, 상기 콜라겐 피브릴은 종래 레더의 탑 그레인 및 진피 층을 포함하는 직경을 가질 수 있다.

"콜라겐 파이버 (collagen fiber)" 는 단단하게 패킹되고, 도 1에 개시된 바와 같은 파이버의 방향으로 높은 정렬 정도를 나타내는 콜라겐 피브릴로 이루어진다. 상기는 1 μm 내지 10 μm 초과, 예를 들어, > 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 μm 또는 그 이상의 직경에서 다양할 수 있다. 본 발명의 콜라겐 피브릴의 네트워크의 일부 구현예들은 5 μm 초과의 직경을 갖는 콜라겐 파이버의 실질적 함량을 포함하지 않는다. 도 2에 도시된 바와 같이, 레더의 그레인 표면의 조성은 그 더욱 내부 부분, 예컨대, 더 거친 파이버 번들을 포함하는 진피와는 다를 수 있다.

" 피브릴화 (Fibrillation)" 는 콜라겐 피브릴을 생성하는 방법을 나타낸다. 상기는 콜라겐 용액 또는 현탁액의 pH를 올리거나 또는 염 농도를 조정함으로써 실시될 수 있다. 상기 피브릴화된 콜라겐의 형성에서, 상기 콜라겐이 1분 내지 24시간 및 모든 중간값을 포함하는 임의의 적당한 기간동안 상기 피브릴을 형성하기 위해서 인큐베이션될 수 있다.

본원에 개시된 피브릴화 콜라겐이 일반적으로, 평면 시트, 곡선 형태/시트, 원통형, 실 및 복합 형태를 포함하는 임의의 적당한 형태 및/또는 두께로 형성될 수 있다. 상기 시트 및 기타 형태는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 mm 초과; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000 cm 또는 초과의 두께, 너비 또는 높이를 포함하는 거의 임의의 선형 치수를 가질 수 있다.

생제작된 레더에서 피브릴화된 콜라겐은 임의의 또는 임의의 실질적 양의 더 고차원 구조가 결여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 생제작된 레더 중 콜라겐 피브릴은 언번들될 것이고, 동물 피부에서 발견되는 다량의 콜라겐 파이버를 형성하지 않으며, 상기 생제작된 레더에 강하고 균일한 비-이방성 구조를 제공한다.

다른 구현예에서, 일부 콜라겐 피브릴이 고차 구조로 번들되거나 또는 정렬될 수 있다. 생제작된 레더에서 콜라겐 피브릴은 0, >0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, <1.0, 또는 1.0 범위의 지향성 지수 (orientation index)를 나타내고, 0의 지향성 지수는 콜라겐 피브릴이 다른 피브릴과의 정렬이 결여된 것을 나타내고, 1.0의 지향성 지수는 콜라겐 피브릴이 완전하게 정렬된 것을 나타낸다. 상기 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 지향성 지수와 친숙하며, Sizeland, et al., J. Agric. Food Chem. 61: 887-892 (2013) or Basil-Jones, et al., J. Agric. Food Chem. 59: 9972-9979 (2011)는 참조로 포함된다.

본원에 개시된 방법은 콜라겐의 동일한 타입을 발현하는 동물에 의해서 생성된 것과 직경에서 차이가 있는 콜라겐 피브릴을 포함하는 생제작된 레더를 제조할 수 있다. 천연 콜라겐의 특성, 예컨대 피브릴 직경 및 피브릴들 사이의 가교 정도는 예컨대 동물의 종 또는 품종과 같은 유전적 및 환경적 요인 및 상기 동물의 상태, 예를 들어, 지방의 양, 사료의 형태 (예컨대, 곡류, 풀) 및 운동 수준에 의해서 영향을 받는다.

생제작된 레더가 동물의 특정 종 또는 품종 또는 특정 조건하에 사육된 동물에 의해서 생성된 콜라겐 피브릴의 특성과 유사하거나 또는 이를 모방하는 콜라겐 피브릴을 포함하도록 피브릴화되고 처리될 수 있다.

대안으로서, 피브릴화 및 처리 조건이 예를 들면 천연 레더 중 피브릴과 비교하여 피브릴 직경, 정렬 정도, 또는 가교 정도를 감소 또는 증가시킴으로써, 자연에서 발견되는 것과 구별되는 콜라겐 피브릴을 제공하기 위해 선택될 수 있다.

때때로 히드로겔로 불리는 콜라겐의 가교된 네트워크가 상기 콜라겐이 피브릴화될 때 형성될 수 있거나, 또는 피브릴화 후에 네트워크를 형성할 수 있고; 일부 변형에서, 상기 콜라겐을 피브릴화하는 방법은 또한 겔-유사 네트워크를 형성한다. 형성되었을 때, 상기 피브릴화 콜라겐 네트워크가, 크롬, 아민, 카르복실산, 술페이트, 술파이트, 술포네이트, 알데히드, 히드라지드, 술프히드릴, 디아자린, 아릴-, 아지드, 아크릴레이트, 에폭시드 또는 페놀을 포함하는 디-, 트리- 또는 다관능성 반응성기를 갖는 분자들을 도입시킴으로써 더 안정화될 수 있다.

상기 피브릴화 콜라겐 네트워크가 또한 다른 제제 (예컨대, 중합할 수 있는 폴리머 또는 다른 적당한 파이버)와 중합될 수 있고, 이는 상기 매트릭스를 더 안정화시키고, 원하는 최종 구조를 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 아크릴아미드, 아크릴산 및 그 염에 기반한 히드로겔이 역상 현탁 중합 (inverse suspension polymerization)을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 개시된 히드로겔이 극성 모노머로부터 제조될 수 있다. 사용된 히드로겔은 천연 폴리머 히드로겔, 합성 폴리머 히드로겔, 또는 그 둘의 조합일 수 있다. 사용된 히드로겔이 그래프트 중합, 가교 중합, 수용성 폴리머로 형성된 네트워크, 방사선 가교 (radiation crosslinking) 등을 사용하여 수득될 수 있다. 소량의 가교제가 중합을 증강시키기 위해서 상기 히드로겔 조성물로 첨가될 수 있다.

평균 또는 개별 콜라겐 피브릴 길이는 생제작된 레더의 전체 두께에 대해서 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 (1 μm); 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 μm (1 mm)의 범위일 수 있다. 상기 범위는 모든 중간값 및 하위 범위를 포함한다.

피브릴은 그 길이의 50, 100, 200, 300, 400, 500 μm 또는 그 이상에 걸쳐서 다른 피브릴과 정렬될 수 있거나, 또는 거의 또는 전혀 정렬을 나타내지 않을 수 있다. 다른 구현예에서, 일부 콜라겐 피브릴이 번들되거나 또는 고차 구조로 정렬될 수 있다.

생제작된 레더에서 콜라겐 피브릴은 0, >0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, <1.0, 또는 1.0 범위의 지향성 지수를 나타낼 수 있으며, 0의 지향성 지수는 다른 피브릴과 정렬이 결여된 콜라겐 피브릴을 나타내고, 1.0의 지향성 지수는 완전하게 정렬된 콜라겐 피브릴을 나타낸다. 상기 범위는 모든 중간값 및 하위범위를 포함한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 지향성 지수와 친숙하고, Sizeland, et al., J. Agric. Food Chem. 61: 887-892 (2013) or Basil-Jones, et al., J. Agric. Food Chem. 59: 9972-9979 (2011)에 대해 참조로 또한 포함된다.

생제작된 레더의 콜라겐 피브릴 밀도는 약 1 내지 1,000 mg/cc, 바람직하게 5 내지 500 mg/cc의 범위일 수 있고, 모든 중간값, 예컨대 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 및 1,000 mg/cc를 포함한다.

생제작된 레더에서 콜라겐 피브릴은 단봉형 (unimodal), 이봉형 (bimodal), 삼봉형 (trimiodal), 또는 다중형태 (multimodal) 분포를 나타낼 수 있고, 예를 들어, 생제작된 레더가 2개의 상이한 피브릴 조제로 이루어질 수 있고, 각각은 2개의 상이한 모드 중 하나 주위에 정렬된 피브릴 직경의 상이한 범위를 가질 수 있다. 상기 혼합물이 상이한 직경을 갖는 피브릴에 의해서 부여되는 생제작된 레더에 대한 물리적 특성들의 첨가적, 상승적 또는 균형을 나타내도록 선택될 수 있다.

천연 레더 제품은 상기 레더 제품의 중량에 기반하여 150-300 mg/cc 콜라겐을 포함할 수 있다. 생제작된 레더는 상기 생제작된 레더의 중량에 기반하여 종래 레더와 유사한 함량의 콜라겐 또는 콜라겐 피브릴, 예컨대 100, 150, 200, 250, 300 또는 350 mg/cc의 콜라겐 농도를 포함할 수 있다.

때때로 히드로겔로 불리는 상기 피브릴화된 콜라겐은 그 최종 용도에 기반하여 선택된 두께를 가질 수 있다. 상기 피브릴화된 콜라겐의 조제의 두께가 더 두꺼워지거나 또는 농도가 더 높아지면, 일반적으로 더 두꺼운 생제작된 레더를 생성한다. 생제작된 레더의 최종 두께는 가교, 탈수 및 윤활에 의한 수축 이전에 상기 피브릴 조제의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 일 수 있다.

"가교 ( Crosslinking )" 는 콜라겐 분자들 사이 내에 화학결합의 형성 (또는 재형성 (reformation))을 나타낸다. 가교 반응은 상기 콜라겐 구조를 안정화시키고, 일부 사례에서, 콜라겐 분자들 사이에 네트워크를 형성한다. 당분야에 알려져 있는 임의의 적당한 가교제가 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 미네랄 염, 예컨대 크롬, 포름알데히드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 폴리에폭시 화합물, 감마 방사선 및 리보플라빈에 의한 자외선 조사에 기반한 것을 포함한다. 상기 가교가 임의의 알려져 있는 방법에 의해서 실시될 수 있다: 예를 들어, Bailey et al., Radiat. Res. 22:606-621 (1964); Housley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 67:824-830 (1975); Siegel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:4826-4830 (1974); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 45:644-653 (1971); Mechanic et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 41:1597-1604 (1970); and Shoshan et al., Biochim. Biophys. Acta 154:261-263 (1968)을 참조하고, 각각은 참조로 포함된다.

가교제는 이소시아네이트, 카르보디이미드, 폴리(알데히드), 폴리(아지리딘), 미네랄염, 폴리(에폭시), 효소, 티이란, 페놀성화물, 노볼락, 레졸 (resole) 뿐만 아니라 리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 히드록실프롤린 또는 히드록시리신과 같은 아미노산 곁사슬과 반응하는 화학 특성을 갖는 기타 화합물을 포함한다.

콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질이 상기 콜라겐 피브릴들 사이에 화학적 및/또는 물리적 가교를 촉진하기 위해서 화학적으로 변형될 수 있다. 상기 콜라겐 분자 상에 반응성기 예컨대 리신, 글루탐산 및 히드록실기가 콜라겐의 막대형 피브릴 구조로부터 돌출되기 때문에 화학적 가교가 가능할 수 있다. 상기 기들을 포함하는 가교는 상기 콜라겐 분자가 스트레스 하에 서로 슬라이딩되는 것을 방지하여서, 상기 콜라겐 파이버의 기계적 강도를 증가시킨다. 화학적 가교 반응의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 리신의 ε-아미노기와 반응, 또는 상기 콜라겐 분자의 카르복실기와 반응을 포함한다. 트란스글루타미나제와 같은 효소가, 글루탐산과 리신 사이의 가교를 생성하여, 안정한 γ-글루타밀-리신 가교를 형성하는데 또한 사용될 수 있다. 이웃하는 콜라겐 분자의 관능기들 사이의 가교를 유도하는 것이 당분야에 알려져 있다. 가교는 상기 피브릴화된 콜라겐 히드로겔-유도된 물질로부터 수득된 물리적 특성을 조정하기 위해서 여기서 실시될 수 있는 또 다른 단계이다.

피브릴화 또는 피브릴화된 콜라겐이 가교 또는 윤활될 수 있다. 콜라겐 피브릴이, 네트워크 형성 이전, 네트워크 형성 중, 또는 네트워크 겔 형성에서 크롬 또는 적어도 하나의 알데히드기를 포함하는 화합물, 또는 베지터블 탄닌으로 처리될 수 있다. 가교는 상기 피브릴화된 콜라겐 레더를 더 안정화한다. 예를 들면, 아크릴 폴리머로 사전-처리되고, 베지터블 탄닌, 예컨대 아카시아 몰리스시마 ( Acacia Mollissima )로 처리된 콜라겐 피브릴은 증가된 수열 안정성 (hydrothermal stability)을 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 글리세르알데히드가 가교제로 사용되어, 상기 피브릴화된 콜라겐의 열안정성, 단백질분해 저항성 (proteolytic resistance) 및 기계적 특성, 예컨대 영의 모듈러스 (Young's modulus) 및 인장 응력 (tensile stress)을 증가시킬 수 있다.

콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 생제작된 물질은 종래의 레더에 사용되는 태닝제를 포함하는 가교제의 0, >0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 상기 가교제가 생제작된 물질의 상기 콜라겐 피브릴 또는 다른 성분들에 공유적으로 결합되거나, 또는 이들과 비-공유적으로 결합될 수 있다. 바람직하게, 생제작된 레더는 가교제를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 이하로 포함할 것이다.

"윤활 (Lubricating)" 은 콜라겐을 포함하는 생제작된 제품 또는 레더로 탈수하는 중에 윤활제, 예컨대 지방 또는 다른 소수성 화합물, 또는 피브릴-피브릴 결합을 조절 또는 제어하는 임의의 물질을 적용하는 과정을 나타낸다. 상기 레더 외관의 원하는 특성은 상기 물질의 강성 (stiffness) 또는 핸드 (hand)이다. 상기 특성을 수득하기 위해서, 피브릴 및/또는 파이버 사이의 수-매개 수소 결합이 윤활제의 사용을 통해서 레더에서 제한된다. 윤활제의 예로는 지방, 생물학적, 미네랄 또는 합성 오일, 대구간유 (cod oil), 술폰화 오일, 폴리머, 유기관능성 실록산, 및 기타 소수성 화합물 또는 종래 레더를 가지화하기 위해 사용된 제제 뿐만 아니라 그 혼합물을 포함한다. 윤활은 일부 측면에서는 천연 레더를 가지화하는 것과 유사하지만, 생제작된 제품이, 그 제조 방법, 더 균질한 조성 및 덜 복잡한 조성으로 인해서 윤활제로 더 균일하게 처리될 수 있다.

다른 윤활제는 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양이온성 폴리머 계면활성제, 음이온성 폴리머 계면활성제, 양쪽성 폴리머, 지방산, 개질된 지방산, 비이온성 친수성 폴리머, 비이온성 소수성 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리 메타크릴, 아크릴, 천연 고무, 합성 고무, 수지, 양쪽성 음이온성 폴리머 및 코폴리머, 양쪽성 양이온성 폴리머 및 코폴리머 및 그 혼합물, 뿐만 아니라 물, 알콜, 케톤 및 기타 용매 중 그 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다.

윤활제가 콜라겐 피브릴을 포함하는 생제작된 물질로 첨가될 수 있다. 윤활제가 피브릴 이동을 촉진하거나 또는 레더-유사 특성, 예컨대 가요성, 취성 (brittleness) 감소, 내구성, 또는 내수성 (water resistance)을 부여하는 임의의 양으로 포함될 수 있다. 윤활제 함량은 상기 생제작된 레더의 약 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60 중량%의 범위일 수 있다.

"배수 (Dehydrating)" 또는 "탈수 ( dewatering )" 는 피브릴화 콜라겐을 함유하는 수성 용액, 현탁액, 겔 또는 히드로겔과 같이, 콜라겐 피브릴 및 물을 함유하는 혼합물로부터 물을 제거하는 과정을 나타낸다. 물이 여과, 증발, 동결-건조, 용매 교환, 진공-건조, 대류-건조, 가열, 조사 (irradiating), 또는 마이크로파 조사 (microwaving) 또는 물을 제거하기 위한 다른 알려진 방법에 의해서 제거될 수 있다. 또한, 콜라겐의 화학적 가교가, 리신, 아르기닌, 및 히드록시리신과 같은 친수성 아미노산 잔기를 소비시킴으로써, 콜라겐으로부터 결합된 물을 제거하는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 아세톤이 콜라겐 피브릴을 빠르게 탈수시키고, 수화된 콜라겐 분자에 결합된 물을 또한 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 탈수 후에 생제작된 물질 또는 레더의 수분 함량은 바람직하게 상기 생제작된 레더의 60 중량% 이하, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 50 또는 60 중량% 이하이다. 상기 범위는 모든 중간값을 포함한다. 수분 함량이 25 ℃ 및 1 atm에서 65%의 상대 습도에서 평형화 (equilibration)로 측정된다.

" 그레인 질감 (Grain texture)" 은 풀 그레인 (full grain) 레더, 탑 그레인 (top grain) 레더, 콜렉티드 그레인 (corrected grain) 레더 (여기서, 인조 그레인이 적용되어짐)의 질감, 또는 더 거친 스플릿 그레인 (split grain) 레더 질감과 심미적으로 또는 질감적으로 유사한 레터-유사 질감을 나타낸다. 유익하게, 본 발명의 생제작된 물질이, 도 2a, 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이, 레더의 표면 그레인과 닮은 미세한 그레인을 제공하기 위해서 조절될 수 있다.

" 생제작된 레더 제품 ( biofabricated leather product)" 은 생제작된 레더의 적어도 하나의 성분을 포함하는 제품, 예컨대 풋 웨어, 의류, 장갑, 가구 또는 차량 덮개, 및 기타 레더 상품 및 제품을 포함한다. 상기는 이에 한정되는 것은 아니지만, 의류, 예컨대 오버코트, 코트, 자켓, 셔츠, 바지, 팬츠, 반바지, 수영복, 속옷, 유니폼, 엠블렘 또는 레터스, 코스튬, 타이, 스커트, 드레스, 블라우스, 레깅스, 글로브, 벙어리장갑, 풋웨어, 신발, 신발 구성성분, 예컨대, 밑창 (sole), 쿼터 (quarter), 혀 (tongue), 커프 (cuff), 대다리 (welt), 및 카운터 (counter), 드레스 슈즈 (dress shoes), 운동화, 런닝화, 캐주얼화, 운동, 런닝 또는 캐주얼 신발 구성 성분, 예컨대 토 캡(toe cap), 토 박스 (toe box), 구두창 (outsole), 중창 (midsole), 어퍼 (upper), 레이스 (laces), 아이릿 (eyelets), 칼라 (collar), 안감 (lining), 아킬레� � 노치 (Achilles notch), 힐 (heel), 및 카운터, 패션 또는 여성화 및 그 신발 구성 성분, 예컨대, 어퍼, 구두창, 토 스프링 (toe spring), 토 박스, 장식, 뱀프 (vamp), 안감, 양말, 인솔 (insole), 플랫폼 (platform), 카운터 및 힐, 또는 하이힐, 부츠 (boots), 샌달 (sandals), 버튼 (buttons), 샌달, 모자, 마스크, 헤드 기어 (headgear), 헤드밴드 (headbands), 헤드 랩 (head wraps) 및 벨트; 보석류 (jewelry), 예컨대 팔찌 (bracelets), 시계 밴드 (watch bands), 및 목걸이; 장갑 (gloves), 우산, 지팡이 (walking sticks), 지갑 (wallets), 이동전화 (mobile phone) 또는 웨어러블 컴퓨터 커버링 (wearable computer coverings), 지갑 (purses), 백팩 (backpacks), 슈트케이스 (suitcases), 핸드백 (handbags), 폴리오 (folios), 폴더 (folders), 박스 (boxes) 및 기타 개인 물건; 운동, 스포츠, 사냥, 또는 레크레이션 기어 (recreational gear), 예컨대, 마구 (harnesses), 굴레 (bridles), 고삐 (reins), 재갈 (bits), 가죽끈 (leashes), 미트 (mitts), 테니스 라켓 (tennis rackets), 골프 크럽 (golf clubs), 폴로 (polo), 하키 (hockey), 또는 라크로스 기어 (lacrosse gear), 체스보드 (chessboards) 및 게임 보드 (game boards), 메디신 볼 (medicine balls), 킥볼 (kick balls), 베이스볼 (baseballs), 및 다른 종류의 공, 및 장남감 (toys); 제본 (book bindings), 북커버 (book covers), 사진 프레임 (picture frames) 또는 아트웍 (artwork); 의자, 소파, 문, 시트 (seats), 오토만 (ottomans), 칸막이 가구 (room dividers), 컵받침 (coasters), 마우스 패드, 데스크 블로터 (desk blotters), 또는 기타 패드, 테이블, 침대, 바닥 (floor), 벽 또는 천장 커버, 바닥재를 포함하는 가구 및 홈, 오피스, 또는 다른 내장 또는 외장 퍼니싱 (furnishings); 시트, 머리받침대 (headrests), 덮개 (upholstery), 패널 (paneling), 핸들, 조이스틱 (joystick) 또는 컨트롤 커버링 (control coverings) 및 기타 랩 (wraps) 또는 커버링 (coverings)을 포함하는 자동차, 보트, 항공기 및 기타 차량 제품을 포함한다.

레더 제품의 많은 용도는, 상기 레더가 함께 스티치될 때 조차도 찢어지거나 또는 뜯어지지 않는 견고한 제품이 요구된다. 스티치된 레더를 포함하고, 내구성 레더를 필요로 하는 통상적인 제품은 자동차 핸들 커버, 자동차 시트, 가구, 스포츠 용품, 스포츠 신발, 스니커즈, 시계끈 등을 포함한다. 상기 제품에서 성능을 향상시키기 위해서 생제작된 레더의 내구성을 증가시키는 것이 필요하다. 본 발명에 따른 생제작된 레더가 상기 제품들 중 임의의 것을 제조하는데 사용될 수 있다.

콜라겐 피브릴의 생제작된 네트워크 또는 생제작된 레더의 물리적 특성 (Physical Properties) 이 콜라겐의 타입, 피브릴화된 콜라겐의 농도의 양, 피브릴화 정도, 가교, 탈수 및 윤활을 선택함으로써 조절되거나 또는 선택될 수 있다.

많은 유익한 특성이 상기 콜라겐 피브릴의 네트워크 구조와 관련이 있고, 이는 수득된 생제작된 물질 또는 레더에 강하고, 가요성 및 실질적으로 균일한 특성을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 생제작된 레더의 바람직한 물리적 특성은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 MPa 범위의 인장 강도 (tensile strength), 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30% 또는 그 이상 범위의 파단에서 연신율 (elongation at break)에 의해서 측정된 가요성 (flexibility), 4, 5, 6, 7, 8 mm 또는 그 이상의 ISO 17235에 의해서 측정된 연화도 (softness), 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3. 1,4, 1,5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0 mm 또는 그 이상 범위의 두께 (thickness); 및 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 mg/cc 또는 그 이상, 바람직하게 100-500 mg/cc의 콜라겐 밀도 (콜라겐 피브릴 밀도)를 포함한다. 상기 범위는 모든 하위범위 및 중간값을 포함한다.

두께 ( Thickness). 그 최종 용도에 따라서, 생제작된 물질 또는 레더는 임의의 두께를 가질 수 있다. 그 두께는 바람직하게 약 0.05 mm 내지 20 mm 뿐만 아니라 상기 범위 중의 임의의 중간값, 예컨대 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 mm 또는 그 이상의 범위이다. 생제작된 레더의 두께는 콜라겐 함량을 조정함으로써 조절될 수 있다.

탄성 모듈러스 (Elastic modulus). 탄성 모듈러스 (또한, 영의 모듈러스 (Young's modulus)라고 알려짐)는, 대상 또는 물질에 힘이 가해졌을 때 그 탄성적 변형의 저항성 (즉, 비-영구적임)을 측정하는 수치이다. 대상의 탄성 모듈러스가 상기 탄성 변형 영역에서 그 응력-변형 곡선 (stress-strain curve)의 기울기로서 정의된다. 물질이 더 강성이면 탄성 모듈러스가 더 높아질 것이다. 상기 탄성 모듈러스가 질감 분석기 (texture analyzer)를 사용하여 측정될 수 있다.

생제작된 레더는 적어도 100 kPA의 탄성 모듈러스를 가질 수 있다. 상기는 100 kPa 내지 1,000 MPa, 뿐만 아니라 상기 범위 중 임의의 중간값, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 MPA의 범위일 수 있다. 생제작된 레더는 그 이완된 상태의 길이로부터 300% 까지, 예를 들어 그 이완된 상태의 길이의 >0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300 %까지 연신될 수 있다.

인장 강도 (Tensile strength) (또한, 최종 인장 강도 (ultimate tensile strength)로 알려짐)는 크기를 감소시키려는 로드에 견디는 압축 강도와는 반대로, 연신시키려는 로드를 견디는 물질 또는 구조의 능력이다. 인장 강도는 장력 또는 잡아당기는 힘에 저항하는 반면에, 압축 강도는 압축 또는 함께 밀리는 것에 저항한다.

생제작된 물질의 시료가 인스트론 장치 (Instron machine)를 사용하여 인장 강도에 대해 시험될 수 있다. 클램프 (clamps)가 상기 시료의 말단부에 부착되고, 상기 시료가 파괴될 때까지 반대 방향으로 잡아 당긴다. 상기 시료가 적어도 1 MPa의 인장 강도를 가질 때 양호한 강도가 입증된다. 생제작된 레더는 적어도 1 kPA의 인장 강도를 가질 수 있다. 상기는 1 kPa 내지 100 MPa, 뿐만 아니라 상기 범위내의 임의의 중간값, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500 kPA; 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 MPa의 범위일 수 있다.

인열 강도 (Tear strength) (또한 인열 저항성 (tear resistance)으로 알려져 있음)는 물질이 찢어지는 효과에 얼마나 잘 견딜 수 있는지에 대한 척도이다. 그러나, 특히, 물질 (통상적으로 고무)이 장력 하에 있을 때 임의의 절단의 성장을 얼마나 잘 견디는지이며, 보통 kN/m로 측정된다. 인열 저항성이 ASTM D 412 방법 (인장 강도, 모듈러스 및 연신율을 측정하기 위해서 사용됨)에 의해서 측정될 수 있다. ASTM D 624가 인열의 형성 (인열 개시)에 대한 저항성 및 인열의 팽창 (인열 진행)에 대한 저항성을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 둘 중 어느 것이 측정되는지에 관계없이, 상기 시료가 2개의 홀더 사이에 고정되고, 균일한 견인력이 상기한 변형이 발생될 때까지 가해진다. 인열 저항성이 그 후에 상기 물질의 두께로 적용된 힘을 나눔으로써 산출된다. 생제작된 레더는, 동일한 가교제(들) 또는 윤활제들을 사용하여 처리되고 동일한 타입의 콜라겐, 예컨대 소의 타입 I 또는 타입 III 콜라겐을 포함하는 동일한 두께의 종래의 탑 그레인 또는 다른 레더보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150 또는 200% 더 큰 인열 저항성을 나타낼 수 있다. 생제작된 물질은 약 1 내지 500 N의 범위의 인열 강도, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500 뿐만 아니라 상기 범위 내의 임의의 중간값의 인열 강도를 가질 수 있다.

연화도 ( Softness). ISO 17235:2015는 레더의 연화도를 측정하기 위한 비-파괴 방법 (non-destructive method)을 서술한다. 상기는 모든 비-강성 레더, 예컨대, 신발 어퍼 레더 (upper leather), 덮개 레더, 레더 상품 레더, 및 의류 레더에 적용가능하다. 생제작된 레더는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 mm 또는 그 이상의 ISO 17235에 의해서 측정된 연화도를 가질 수 있다.

그레인 ( Grain). 레더의 탑 그레인 표면은 그 부드러운 질감 및 매끄러운 표면으로 인해서 가장 바람직한 것으로 간주된다. 상기 탑 그레인은 콜라겐 피브릴의 고다공성 네트워크이다. 상기 그레인의 강도 및 인열 저항성은 상기 탑 그레인의 실제 단독 적용에 대한 한계이며, 종래의 레더 제품은 종종 더 거친 그레인을 갖는 진피로 배킹(backing)되었다. 도 2a, 도 2b 및 도 2c는 탑 그레인과 진피 레더 표면들을 비교한다. 강하고 균일한 물리적 특성 또는 증가된 두께를 갖도록 제조될 수 있는 본원에 개시된 생제작된 물질이 진피 배킹(backing)에 대한 요건 없이 탑 그레인 유사 제품을 제공하는데 사용될 수 있다.

다른 성분들의 함량. 일부 구현예에서, 상기 콜라겐에는 엘라스틴 또는 비-구조적 동물 단백질과 같은 다른 레더 성분들이 존재하지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, 생제작된 레더내 액틴 (actin), 케라틴 (keratin), 엘라스틴 (elastin), 피브린 (fibrin), 알부민 (albumin), 글로불린 (globulin), 뮤신 (mucin), 무시노이드 (mucinoids), 비콜라겐 구조적 단백질 (noncollagen structural proteins), 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질 (noncollagen nonstructural proteins)의 함량은 상기 생제작된 레더의 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 내지 10 중량%의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 액틴, 케라틴, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 글로불린, 뮤신, 무시노이드, 비콜라겐 구조적 단백질 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질의 함량이, 생제작된 레더의 >0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 중량% 또는 그 이상의 범위의 양으로 생제작된 레더로 포함될 수 있다. 상기 성분들이 피브릴화, 가교, 탈수 또는 윤활 중에 또는 그 후에 도입될 수 있다.

" 레더 염료 (leather dye)" 는 레더 또는 생제작된 레더를 착색시키는데 사용될 수 있는 염료를 나타낸다. 상기는 산성 염료, 직접 염료 (direct dyes), 레이크 (lakes), 황 염료, 염기성 염료 및 반응성 염료를 포함한다. 염료 및 색소가 또한 상기 생제작된 레더의 제조 중에 콜라겐 피브릴을 포함하는 현탁액 또는 네트워크 겔과 같이, 생제작된 레더의 전구체로 혼입될 수 있다.

"충전제 ( Fillers)". 일부 구현예에서, 생제작된 레더는 레더의 성분 이외에 충전제, 가령 미크로스피어 (microspheres)를 포함할 수 있다. 상기 탈수된 피브릴 네트워크의 조직을 조절하는 한가지 방법은 탈수하는 동안 상기 피브릴이 서로 떨어져서 간격을 둘 수 있도록 충전 물질 (filling materials)을 포함하는 것이다. 상기 충전제 물질은 나노입자, 마이크로 입자, 또는 다양한 폴리머, 예컨대 태닝 산업에서 널리 사용되는 신탄을 포함한다. 상기 충전 물질은 최종 탈수된 레더 물질의 일부일 수 있거나, 또는 상기 충전 물질이 희생 (sacrificial)될 수 있으며, 즉 상기는 분해되거나 또는 용해되어서, 더 다공성인 피브릴 네트워크를 위한 개방 공간이 생긴다. 상기 충전제의 형태 및 치수가 상기 탈수된 피브릴 네트워크의 배향을 조절하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 충전제는 중합성 미크로스피어(들), 비드(들), 파이버(들), 와이어(들), 또는 유기 염(들)을 포함할 수 있다. 다른 물질이 본 발명에 따른 생제작된 레더 또는 콜라켄 피브릴의 네트워크로 매립되거나 또는 혼입될 수 있다. 상기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 직포 및 부직포 섬유를 포함하는 하나의 파이버, 뿐만 아니라 면, 울, 캐시미어, 앙고라, 리넨, 대나무 (bamboo), 인피 (bast), 대마 (hemp), 콩 (soya), 시셀 (seacell), 우유 또는 우유 단백질로부터 제조된 파이버, 실크, 스파이더 실크 (spider silk), 재조합으로 제조된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 기타 펩티드 또는 폴리펩티드, 키토산, 균사체 (mycelium), 박테리아 셀룰로스를 포함하는 셀룰로스, 우드 파이버를 포함하는 우드 (wood), 레이온, 라이어셀 (lyocell), 비코스 (vicose), 항미생물 얀 (antimicrobial yarn: AMY), 소브텍 (Sorbtek), 나일론, 폴리에스테르, 엘라스토머, 예컨대 lycra®, 스판덱스 또는 엘라스탄 및 기타 폴리에스테르-폴리우레탄 코폴리머, 아라미드, 탄소 섬유 및 풀러렌을 포함하는 탄소, 유리섬유 및 부직포를 포함하� �� 유리, 실리콘 및 실리콘-함유 화합물, 미네랄 입자 및 미네랄 파이버를 포함하는 미네랄, 및 철, 스틸, 납, 금, 은, 백금, 구리, 아연 및 티타늄을 포함하는 금속 또는 금속 합금을 포함하며, 상기는 생제작된 레더로 혼입하기에 적당한 입자, 파이버, 와이어의 형태, 또는 다른 형태일 수 있다. 상기 충전제는 전기전도성 물질, 자기 물질, 형광 물질, 생물발광 물질, 인광 (phosphorescent) 물질 또는 다른 광발광성 물질, 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 성분들의 혼합물 또는 블렌드가 예를 들어 본원에 개시된 화학적 및 물리적 특성을 변경하기 위해서 생제작된 레더로 매립 또는 혼입될 수 있다.

제조 방법. 콜라겐으로부터 생제작된 레더를 형성하는 방법은 피브릴화, 가교, 배수/탈수 및 윤활 단계를 임의의 순서로 포함한다. 예를 들면, 콜라겐 용액이 피브릴화될 수 있고, 상기 피브릴이 글루타르알데히드와 같은 제제로 가교될 수 있고, 그 후에 술파이트 오일과 같은 윤활제로 코팅되고, 그 후에 여과를 통해서 탈수되어서 피브릴화 콜라겐 레더를 형성할 수 있다. 그러나, 상기 제조 방법은 단계들의 상기 특정 순서에 제한되지 않는다.

대안으로서, 피브릴 가교 후에, 상기 피브릴이 아세톤과 용매 교환을 통해서 탈수된 후에, 용매를 증발시키기 전에 술파이트 오일로 가지화되어서, 피브릴화 콜라겐 레더가 형성될 수 있다. 또한, 피브릴들 사이에 화학적 또는 물리적 가교의 혼입 (물질에 강도를 부여하기 위하여)이 상기 공정의 임의의 시점에서 달성될 수 있다. 예를 들면, 때때로 히드로겔로 불리는 고형 피브릴화 콜라겐이 형성될 수 있고, 그 후에, 상기 피브릴 네트워크가 아세톤과 용매 교환을 통해서 탈수될 수 있고, 그 후에 술파이트 오일로 가지화될 수 있다. 또한, 수지 조제에 통상적으로 사용되는 다른 폴리머의 혼입을 통해서 상기 콜라겐 피브릴이 네트워크로 가교될 수 있다.

윤활제, 습윤제 (humectants), 염료, 및 다른 처리제와 같은 물질이 상기 생제작 공정 중에 생제작된 레더 제품을 통해서 균일하게 분포될 수 있다. 상기는 그 구조적 이종성 (structural heterogeneity)이 균일한 처리가 불가능한 종래 레더 태닝 및 가지화와 비교하여 장점을 갖는다. 또한, 화학제가 네트워크 형성 전에 혼입될 수 있어서, 상기 처리 화학제를 포함하는 플로트 (float)로부터 콜라겐 네트워크로 침투시키지 않음으로써 화학적 손실이 감소되기 때문에 처리 화학제의 더 적은 양이 필요할 수 있다. 천연 레더를 처리하기 위해 종종 고온이 사용되는 것과 달리, 피브릴화 콜라겐 레더를 형성하기 위해서 상기 용매를 증발시키기 전의 공정 중에 실내 온도 또는 37 ℃ 이하의 온도로 생제작된 제품이 가열될 수 있다. 대안으로서, 탈수 중에 피브릴들 사이에서 네트워크를 형성하기 전에 또는 현탁액 또는 탈수된 물질로 결합제의 첨가를 통해서, 콜라겐 피브릴이 현탁액 중에 가교 및 윤활될 수 있다.

생제작된 레더 물질을 형성하는 방법은 용액에서 콜라겐의 피브릴화를 유도하는 단계; 히드로겔의 형태로 나타낼 수 있고, 피브릴화 콜라겐 시트 또는 다른 제품을 수득하기 위하여 상기 피브릴화 콜라겐을 가교 (예컨대, 태닝) 및 탈수하는 단계, 및 가요성 생제작된 레더를 수득하기 위하여 적어도 하나의 보습제 또는 윤활제, 예컨대 지방 또는 오일을 상기 피브릴화된 콜라겐 시트 또는 제품으로 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다.

피브릴로부터 레더를 생제작하는 방법은 피브릴화 콜라겐 히드로겔을 수득하기 위해서 용액 중에서 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질의 피브릴화를 유도하는 단계; 피브릴화 콜라겐 히드로겔 레더를 수득하기 위해서 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔을 가교하는 단계; 및 적어도 하나의 윤활 오일을 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔 레더로 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다.

생제작된 레더를 제조하기 위해 본원에 개시된 방법에서, 생제작된 레더를 형성하는 단계들의 순서가 가변될 수 있거나, 또는 둘 이상의 단계들이 동시에 실시될 수 있다. 예를 들면, 피브릴화 및 가교 단계가 함께 실시될 수 있거나, 또는 하나 이상의 제제, 또는 가교제 및 윤활제의 첨가에 의해서 상기 콜라겐 등을 피브릴화시키기 전에 상기 용액에 혼입될 수 있다.

상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질이 동물 공급원으로부터 콜라겐의 추출, 이에 한정되는 것은 아니지만, 소의 가죽 또는 힘줄 콜라겐 추출을 통해서 수득될 수 있다. 대안으로서, 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질이 비-동물 공급원, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 세포 배양 기술, 또는 화학적 펩티드 합성으로부터 수득될 수 있다.

상기 방법들 중 어느 것은, 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질 사이에 가교를 촉진하기 위해서, 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질을 피브릴화 및/또는 화학적으로 변형시키기 이전에, 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질을 이량체, 삼량체, 및 고급 올리고머로 중합시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법들 중 어느 것은 크롬, 아민, 카르복실산, 술페이트, 술파이트, 술포네이트, 알데히드, 히드라지드, 설프히드릴, 디아지린 (diazirine), 아릴, 아지드, 아크릴레이트, 에폭시드 또는 페놀기 중 하나 또는 그 조합으로 상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질을 관능화시키는 단계를 포함할 수 있다.

피브릴화를 유도하는 단계는 염 또는 염들의 조합을 첨가하는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들어, 염 또는 염들의 조합은 하기를 포함할 수 있다: Na ₃ PO ₄ , K ₃ PO ₄ , KCl, 및 NaCl, 각 염의 농도는 10 mM 내지 5M 등일 수 있다.

일반적으로, 피브릴화를 유도하는 단계는 상기 pH를 산 또는 염기로 조정하는 단계, 핵제 (nucleating agent), 예컨대 분지쇄형 콜라겐 미크로겔을 첨가하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 핵제는 1 mM 내지 100 mM의 농도를 갖는다.

상기 피브릴화 콜라겐이 크롬 화합물, 알데히드 화합물 또는 베지터블 탄닌, 또는 임의의 다른 가교제로 안정화될 수 있다. 예를 들면, 상기 피브릴화 콜라겐이 크롬 화합물, 알데히드 화합물, 또는 베지터블 탄닌으로 안정화될 수 있고, 상기 크롬, 알데히드, 또는 베지터블 타닌 화합물은 1 mM 내지 100 mM의 농도를 갖는다.

상기 방법들 중 어느 것은 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔 레더를 수득하기 위해서 상기 피브릴화 콜라겐의 수분 함량을 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 중량% 미만으로 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 피브릴화 콜라겐 물질이 탈수될 수 있다. 상기 방법들 중 어느 것은 상기 피브릴화 콜라겐 레더로 표면 피니시 (finish)을 염색 및/또는 도포하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 상기 가공된 레더 물질을 생제작하기 위한 콜라겐 개시 물질의 선택이 조절될 수 있고, 상기 수득된 제품이, 개별의 최종 용도, 예컨대 풋웨어에 유용한 특성 및 의류에 유용한 상이한 특성과 같이, 물리적 및 심미적 특성으로 상이하게 형성될 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 생제작된 피브릴화 콜라겐 히드로겔-유래된 레더가, 콜라겐 피브릴로 자기-조립되도록 유도되는 콜라겐의 용액으로부터 형성된다.

내인성 콜라겐 피브릴과 달리, 콜라겐 피브릴이 임의의 고차 구조 (예컨대, 파이버의 번들)로 조립되지 않지만, 그러나 다소 무질서하고, 특히 언번들된 피브릴을 유지한다. 인 비보에서 조립되는 경우, 콜라겐 피브릴이 통상적으로 측면으로 정렬되어서, 예를 들어 피부에서, 발견되는 고차의 구조를 갖는 번들을 형성하고, 거칠고, 미크론-크기의 콜라겐 파이버를 형성한다. 네이티브 콜라겐 피브릴의 특징적인 특성은 그 밴드된 구조 (banded structure)이다. 상기 네이티브 피브릴의 직경은 상기 길이를 따라서 약간 변화되고, 약 67 nm의 높은 재현가능한 D-밴드 반복을 갖는다. 본원에 개시된 방법의 일부에서, 콜라겐 피브릴이 언밴드 (unbanded) 및 언번들될 수 있거나, 또는 밴드 및 언번들될 수 있거나, 또는 1 내지 100 nm의 상이한 간격 및 상기 범위의 모든 중간값을 갖는 D-밴드를 가질 수 있다. 상기 콜라겐 피브릴이 무작위로 배향될 수 있다 (예컨대, 임의의 특정 방향 또는 축으로 무배향이거나 또는 배향되지 않음).

본원에 개시된 상기 생제작된 레더 물질을 형성하기 위해 사용된 개시 물질은, 피브릴화될 수 있는 임의의 적당한 비-인간 콜라겐 공급원 또는 변형된 또는 가공된 콜라겐을 포함할 수 있다.

다양한 콜라겐 형태가 상기 동물계를 통해서 발견된다. 본원에 사용된 콜라겐이, 척추동물 및 무척추동물을 포함하는 동물 공급원, 또는 합성 공급원으로부터 수득될 수 있다. 콜라겐이 또한 기존의 동물 처리의 부산물로부터 공급될 수 있다. 동물 공급원으로부터 수득된 콜라겐이, 예를 들면 Silva et. Al., Marine Origin Collagens and its Potential Applications, Mar. Drugs, 2014 Dec., 12(12); 5881-5901)과 같이, 당분야에 알려져 있는 표준 실험실 기술을 사용하여 분리될 수 있다.

상기 생제작된 레더 물질 및 본원에 개시된 이를 제조하는 방법의 하나의 주요 장점은 콜라겐이 동물의 도축을 필요로 하지 않는 공급원으로부터 수득될 수 있다는 것이다.

본원에 개시된 콜라겐이 생물반응기 (bioreactor)에서 성장된 세포를 포함하는 세포 배양 기술에 의해서 수득될 수 있다.

콜라겐이 또한 재조합 DNA 기술을 통해서 수득될 수 있다. 비-인간 콜라겐을 인코딩하는 구조체가 숙주 생물체로 도입되어서 비-인간 콜라겐을 생성할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐이 또한 숙주로서 이스트, 예컨대 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha ), 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae ), 피치아 파스토리스 등에서 제조될 수 있다. 또한, 최근에, 3중 나선 콜라겐을 특징으로 하는 시그니쳐 (signature) (Gly-Xaa-Yaa)n 반복하는 아미노산 서열을 제공하는 박테리아 게놈이 동정되었다. 예를 들면, 그람 양성 박테리아 스트렙토코쿠스 피오게네스 ( Streptococcus pyogenes )는 2개의 콜라겐-유사 단백질, Scl1 및 Scl2를 포함하고, 이는 잘 특성화 구조 및 기능적 특성들을 갖는다. 그러므로, 대규모 제조 방법을 수립하기 위한 Scl1 또는 Scl2의 다양한 서열 변형을 갖는 재조합 이 . 콜리 시스템에서 구조체를 수득할 수 있다. 콜라겐이 또한 표준 펩티드 합성 기술을 통해서 수득될 수 있다. 전술한 기술들의 어느 것으로부터 수득된 콜라겐이 더 중합될 수 있다. 콜라겐 다이머 및 트리머가 용액 중 콜라겐 모노머의 자기-결합으로부터 형성된다.

본원에 개시된 상기 콜라겐 물질의 형성에서 개시 단계로서, 상기 개시하는 콜라겐 물질을 용액 중에 넣고, 피브릴화될 수 있다. 콜라겐 피브릴화가 상기 콜라겐 용액으로 염의 도입을 통해서 유도될 수 있다. 염 또는 염들의 조합, 예컨대 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 포타슘 클로리드, 및 소듐 클로리드를 상기 콜라겐 용액으로 첨가함으로써 상기 콜라겐 용액의 이온 강도를 변화시킬 수 있다. 콜라겐 피브릴화는, 더 큰 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 및 공유 결합을 통해서 정전기 상호작용을 증가시킨 결과로서 발생할 수 있다. 적당한 염 농도는 예를 들어, 약 10 mM, 50 mM, 100 mM, 500 mM, 1M, 2M, 3M, 4M 내지 5M 뿐만 아니라 상기 범위내의 임의의 중간값의 범위일 수 있다.

콜라겐 피브릴화가 또한 염 이외의 핵제에 의해 유도 또는 증강될 수 있다. 핵제는 콜라겐 모노머가 서로 긴밀하게 접촉하여 피브릴화를 개시할 수 있거나 또는 핵제를 통해서 다수의 피브릴이 연결될 수 있는 분지쇄점 (branch point)으로 작용할 수 있는 표면을 제공한다. 적당한 핵제의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐을 포함하는 미크로겔, 콜라겐 미크로 또는 나노입자, 금속성 입자, 또는 천연 또는 합성 유래된 파이버를 포함한다. 적당한 핵제 농도는 대략 1 mM 내지 100 mM의 범위일 수 있다.

콜라겐 네트워크는 또한 pH에 매우 민감할 수 있다. 상기 피브릴화 단계 중에, 상기 pH가 직경 및 길이와 같은 피브릴 치수를 조절하기 위해 조정될 수 있다. 상기 콜라겐 피브릴의 전체 치수 및 조직은 수득된 피브릴화 콜라겐 유래된 물질의 인성 (toughness), 신축성 (stretch-ability), 및 통기성 (breathability)에 영향을 줄 것이다. 상기는 상이한 인성, 가요성 및 통기성을 필요로 할 수 있는 다양한 용도를 위해 피브릴화 콜라겐 유래 레더를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 염 농도의 변경의 여부와 관계없이 pH의 조정이 피브릴화를 위해서 사용될 수 있다.

상기 탈수된 피브릴 네트워크의 조직을 조절하는 하나의 방법은 건조하는 동안 상기 피브릴을 간격을 두고 떨어져 있도록 충전 물질을 포함하는 것이다. 상기 충전제 물질은 나노입자, 미크로입자, 또는 태닝 산업에서 통상적으로 사용된 신탄과 같은 다양한 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 충전 물질은 상기 최종 탈수된 레더 물질의 일부일 수 있거나, 또는 상기 충전 물질이 희생될 수 있고, 즉 이들이 분해되거나 또는 용해되어서 더 다공성인 피브릴 네트워크에 개방된 공간을 남긴다.

상기 콜라겐 또는 콜라겐-유사 단백질이 상기 콜라겐 피브릴들 사이에 화학적 및 물리적 가교를 촉진하기 위해서 화학적으로 변형될 수 있다. 상기 콜라겐 분자 상에 리신, 글루탐산, 및 히드록실기와 같은 반응성기가 콜라겐의 막대형 피브릴 구조로부터 돌출되기 때문에 화학적 가교가 가능할 수 있다. 상기 기들을 포함하는 가교는 상기 콜라겐 분자들이 응력 하에 서로 슬라이딩되는 것을 방지하여서, 상기 콜라겐 파이버의 기계적 강도를 증가시켰다. 화학적 가교 반응의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 리신의 ε-아미노기와의 반응, 또는 상기 콜라겐 분자의 카르복실기와의 반응을 포함한다. 트란스글루타미나제 (transglutaminase)와 같은 효소가 글루탐산과 리신 사이에 가교를 형성하는데 사용되어서 안정한 γ-글루타밀-리신 가교를 형성할 수 있다. 이웃하는 콜라겐 분자의 관능기들 사이에 가교를 유도하는 것이 당분야에 알려져 있다. 가교는 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔-유래된 물질로부터 수득된 물리적 특성을 조정하기 위해서 본원에서 실시될 수 있는 또 다른 단계이다.

일단 형성되면, 상기 피브릴화 콜라겐 네트워크가, 크롬, 아민, 카르복실산, 술페이트, 술파이트, 술포네이트, 알데히드, 히드라지드, 술프히드릴, 디아자린, 아릴-, 아지드, 아크릴레이트, 에폭시드, 또는 페놀을 포함하는 디-, 트리- 또는 다관능성 반응성 기를 갖는 분자들을 혼입시킴으로써 더 안정화될 수 있다.

상기 피브릴화 콜라겐 네트워크가, 히드로겔을 형성하거나, 또는 섬유상 품질을 갖는 다른 제제 (예컨대, 중합할 수 있는 폴리머 또는 다른 적당한 파이버)와 중합될 수 있어서, 상기 매트릭스를 더 안정화시키고, 원하는 최종 구조를 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 아크릴아미드, 아크릴산, 및 그 염에 기초한 히드로겔이 역상 현탁 중합을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 개시된 히드로겔이 극성 모노머로부터 제조될 수 있다. 사용된 히드로겔은 천연 폴리머 히드로겔, 합성 폴리머 히드로겔, 또는 그 둘의 조합일 수 있다. 사용된 히드로겔이 그래프트 중합, 가교 중합, 수용성 폴리머로 형성된 네트워크, 방사선 가교 등을 사용하여 수득될 수 있다. 소량의 가교제가 상기 히드로겔 조성물로 첨가되어서 중합을 증강시킬 수 있다.

상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔의 적당한 두께가 본원에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 상기 최종 두께는 상기 히드로겔 두께보다 훨씬 더 적을 것이기 때문에 (예컨대, 10-90% 더 얇음), 상기 초기 히드로겔 두께는 원하는 최종 생성물의 두께에 의존할 수 있고, 본원에 개시된 바와 같이 가교, 탈수 및/또는 하나 이상의 오일 또는 다른 윤활제의 첨가 중에 수축을 포함하는 두께 (또는 전체 부피)의 변화를 추정할 수 있다.

히드로겔 두께는 0.1 mm 내지 50 cm 또는 상기 범위내의 임의의 중간값일 수 있다. 상기 피브릴화 히드로겔을 형성하는데 있어서, 상기 히드로겔이 1분 내지 24 시간 사이를 포함하는 임의의 적당한 시간 길이 동안 상기 두께를 형성하기 위해서 인큐베이션될 수 있다.

본원에 개시된 피브릴화 콜라겐 히드로겔이 일반적으로, 평면 시트, 곡선 형태/시트, 원통형, 실 및 복합 형태를 포함하는 임의의 적당한 형태 및/또는 두께로 형성될 수 있다. 또한, 실제 상기 형태는 임의의 선형 크기를 갖는다. 예를 들면, 상기 히드로겔의 어느 것이 개시된 바와 같은 두께 및 10 mm 초과의 길이 (예컨대, cm로, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1500 등 초과) 및 10 mm 초과의 너비, 예컨대 cm로, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1500 등 초과를 갖는 시트로 형성될 수 있다.

히드로겔을 특징으로 하는 상기 콜라겐 피브릴이 형성되거나 또는 형성되는 중에 이들이 가교될 수 있다. 예를 들면, 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔이 크롬, 또는 적어도 하나의 알데히드기, 또는 베지터블 탄닌을 포함하는 화합물로, 겔 형성 이전, 겔 형성 중에, 또는 겔 형성 후에, 처리되어서 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔을 더 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 피브릴이 아크릴 폴리머로 사전-처리되어서, 이후에 베지터블 탄닌 (예컨대, 아카시아 몰리스시마)으로 처리되어서 증가된 수열 안정성을 나타낼 수 있다. 다른 실시예에서, 글리세르알데히드가 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔의 열 안정성, 단백질 분해 저항성, 및 기계적 특성 (예컨대, 영의 모듈러스, 인장 응력)을 증가시킬 수 있는 가교제로서 사용될 수 있다.

본원에 개시되는 콜라겐의 용액의 피브릴화 (예컨대, 번들과 같이 고차 조직이 결여된 콜라겐 피브릴의 형성)가 가시적으로 추적될 수 있다. 예를 들면, 피브릴화가 유도될 때, 400 nm에서 거의 흡광도를 갖지 않는 맑은 콜라겐 용액이 불투명해지고, 400 nm에서 약 0.5의 흡광도를 갖는다. 개시 물질의 온도 및 부피에 따라서, 상기 피브릴화 및 히드로겔 형성이 유도 후에 다소 빠르게 발생할 수 있고, 1시간 반 후에 대부분 완료될 수 있으며, 흡광도 값에 의해 개시되는 바와 같이 70분이 흐른 후에 변동이 없을 수 있다. 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔에 있어서 약 1 Pa (콜라겐의 용액에 있어서)에서 대략 400 Pa로, 유도 후에 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔의 저장 모듈러스 (storage modulus) (또는 상기 물질의 점탄성 품질 (viscoelastic qualities))의 증가가 발생될 수 있다.

전술되고, 또한 도 1 및 도 2에서 개시된 바와 같이, 동물 피부는 고차 구조로 배열된 피브릴을 통상적으로 포함하고, 이는 밴드 (규칙적인 열공 영역을 가짐)의 존재 및 정렬된 파이버로 다수의 피브릴의 형성을 포함하고, 이들은 그 후에 콜라겐 번들로 번들될 수 있다. 반대로, 상기 콜라겐 히드로겔 및 그러므로 본원에 개시된 상기 생제작된 레더는 상기 물질의 전체 두께 (일부 사례에서, 전체 부피)를 통해서 1차 무질서한 콜라겐 피브릴 구조를 가질 수 있다. 특히, 콜라겐 히드로겔로부터 형성된 생제작된 레더의 콜라겐 구조는 임의의 특정 축을 따라서 주로 언번들되고, 또한 무배향일 수 있다. 일부 변형예에서, 상기 콜라겐 피브릴이 언밴드일 수 있다 (예컨대, 부피 전체를 통해서 10% 초과 언밴드됨, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 등 초과의 언밴드됨). 또한, 상기 부피 내에서 (또는 상기 부피 전체를 통해서) 상기 콜라겐 피브릴의 배향은 무배향이거나 또는 무작위로 배향될 수 있고, 상기 배향의 결여는 천연 가죽에서 부피 두께를 통해 변경되는 것보다는 오히려 상기 부피 전체를 통해서 동일할 수 있으며, 이는 수직적으로 배향된 콜라겐 피브릴의 번들로부터 상기 두께에 수평적으로 배향된 번들로 변경될 수 있다. 상기 히드로겔 및 수득된 레더 물질의 임의의 두께 수준에서 동일한 특성들의 어느 것은 본원에서 두께 전체를 통해서 "균일한 (uniformly)" 으로 나타낼 수 있다.

또한, 본원에 개시된 상기 생제작된 레더의 어느 것은 상기 겔 및 수득된 레더 물질의 두께 전체를 통해서 피브릴의 균일한 분포를 가질 수 있다. 상기는 천연 레더, 예컨대 도 2에서 개시된 물질과 대조적이며, 상기 물질의 두께를 통해서 파이버 번들의 수가 증가되는 것을 보여준다.

상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔 및 이로부터 형성된 레더 물질의 고수준 조직의 결여가 도 3a 및 도 3b에서 명백하다. 도 3a는 본원에 개시된 바와 같이 형성된 피브릴화 콜라겐 히드로겔의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸다. 유사하게, 도 4는 피브릴화 콜라겐 히드로겔을 통한 투과 전자 현미경 사진을 나타낸다. 상기 투과 전자 현미경 사진 및 상기 주사 전자 현미경 사진 모두는 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔은 콜라겐 피브릴이 무질서하게 얽혀 있는 것을 보여준다. 전술한 바와 같이, 밀도 및 어느 정도까지의 콜라겐 피브릴 형성의 패턴이, 탈수하는 동안 피브릴의 농도와 함께 피브릴화 유도 중에 상기 콜라겐 용액의 pH를 조정함으로써 조절될 수 있다. 도 3은 또한 소의 진피의 주사 전자 현미경 사진을 보여준다. 천연 소의 진피와 비교하여 (도 3b), 상기 피브릴화 콜라겐 네트워크는 훨씬 더 무작위적이고, 명백한 줄무늬가 부족하다. 상기 피브릴의 전체 크기가 유사할 수 있음에도 불구하고, 상기 피브릴의 배열이 꽤 상이하다. 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔 및 천연 조직, 예컨대 소의 진피 (및 그로부터 수득된 레더) 내에서 콜라겐 피브릴들 사이에 이러한 울트라구조적 (ultrastructural) 차이는 최종 생제작된 레더 제품에서 문제를 일으키지 않을 수 있고, 천연 레더보다 연질이거나 또는 더 연질이고, 더 유연할 수 있고, 또한 유사한 외관을 가질 수 있다.

때로 히드로겔이라 불리는 상기 피브릴화 콜라겐이 그 후에 탈수되어서, 그 수분 함량의 대부분이 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔에서 제거될 수 있다. 상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔로부터 상기 수분을 제거하는 것은 수화된 겔로부터 유연한 시트로 그 물리적 품질을 변화시킬 수 있다. 상기 물질이 파열/인열을 방지하기 위해서 처리될 수 있다. 예를 들면, 상기 피브릴화 콜라겐으로부터 너무 많은 수분이 제거되지 않도록 주의를 기울여야 한다. 일부 예에서, 상기 피브릴화 콜라겐은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 % 미만의 수분 함량을 갖도록 탈수시키는 것이 바람직할 수 있다. 수분 함량이 65 %의 상대 습도에서 1 atm의 압력에서 25 ℃에서 평형에 의해서 결정된다.

탈수는 공기 건조 (air drying), 진공 및 가압 여과 (pressure filtration), 용매 교환 (solvent exchange) 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 피브릴화 콜라겐 히드로겔은 또한 그 수분 함량을 유기 용매로 대체함으로써 탈수를 실시할 수 있다. 적당한 유기 용매는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아세톤, 에탄올, 디에틸 에테르 등을 포함할 수 있다. 그 후에, 상기 유기 용매가 증발될 수 있다 (예컨대, 공기 건조, 진공 건조 등). 또한, 상기 최종 제품에서 탈수 수준을 미세하게 조절하기 위해서 하나 또는 그 이상의 유기 용매를 사용하여 탈수의 연속적 단계들을 실시할 수 있다.

탈수 이후 또는 중에, 상기 피브릴화 콜라겐 물질이 윤활제 및/또는 오일로 처리되어서 상기 피브릴화 콜라겐 물질로 더 큰 가요성 및 유연성을 부여할 수 있다. 오일과 용매의 조합을 사용함으로써, 오일 자체 만을 사용하는 것과 비교하여, 상기 오일이 상기 피브릴화 콜라겐 네트워크로 침투하는 것을 더 좋게 할 수 있다. 오일 자체는 상기 노출된 표면에 침투하도록 하지만, 합리적 시간 내에 상기 피브릴화 콜라겐 물질의 전체 두께로 용이하게 스며들지 않을 수 있다. 상기 오일/용매 조성물이 상기 물질의 전체 두께로 침투되면, 상기 용매가 그 후에 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 수득된 피브릴화 콜라겐 물질은 윤활제 및/또는 오일 처리 이전에 상기 탈수되고 피브릴화된 콜라겐 물질과 비교하여 더 레더와 같은 외관을 나타낸다. 적당한 오일 및 윤활제는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 캐스터 오일, 파인 오일, 라놀린, 밍크오일, 우각유 (neatsfoot oil), 피쉬 오일 (fish oil), 셰어 버터 (shea butter), 알로에 등을 포함할 수 있다.

레더 물질을 형성하기 위해서 탈수되고 가교된 피브릴화 콜라겐 네트워크 또는 히드로겔을 윤활시킴으로써, 천연 레더의 특성과 유사하거나 또는 더 양호한 특성을 갖는 물질을 수득할 수 있다. 오일 및 유기 용매의 조합을 포함하는 용액은 상기 탈수된 피브릴화 콜라겐 물질의 질량 및 연화도 (상기 응력-변형 곡선의 기울기에 반비례함)를 증가시킨다. 상기는 오일과 유기 용매의 조합을 상기 탈수된 피브릴화 콜라겐 물질로 침투시키고, 일단 침투되면, 상기 오일이 상기 물질 전체에 분포되고, 상기 유기 용매가 증발될 수 있다. 도시되지는 않았지만, 오일을 단독으로 사용하는 경우, 상기 탈수된 피브릴화 콜라겐 물질을 통해서 전체적으로 침투되는데 효과적이지 않을 수 있다.

상기 수득된 피브릴화 콜라겐 물질이 동물 가죽 또는 피부로부터 유래된 천연 레더와 유사하게 처리될 수 있고, 재태닝되고, 염색되고 및/또는 피니쉬될 수 있다. 부가의 처리 단계는 가교, 재태닝 및 표면 코팅을 포함할 수 있다. 가교 및 재태닝은 하위-공정, 예컨대 재습윤 (wetting back) (반-처리된 레더를 재-수화시킴), 탈수 (sammying) (45-55%의 수분이 상기 레더로부터 짜내어짐), 분할 (splitting) (레더가 하나 이상의 층으로 분할됨), 쉐이빙 (shaving) (레더가 얇아짐), 중화 (neutralization) (레더의 pH가 4.5 내지 6.5로 조정됨), 염색 (dyeing) (레더가 착색됨), 가지화 (fat liquoring) (지방, 오일, 왁스가 상기 레더 파이버로 고정됨), 충전 (filling) (레더를 더 경질이고 더 무껍게 만들기 위한 조밀/중질 화학제), 스터핑 (stuffing) (지방, 오일, 왁스가 레더 파이버들 사이에 첨가됨), 고정 (fixation) (결합되지 않은 화학제가 결합/트랩되고, 또한 제거됨), 세팅 (setting) (그레인 평편도가 부여되고, 또한 과량의 물이 제거됨), 건조 (drying) (레더가 원하는 수분 수준, 10-25%로 건조됨), 컨디션화 (conditioning) (수분이 레 더로 18-28% 수준으로 첨가됨), 연화 (softening) (상기 파이버를 분리함으로써 레더의 물리적 연화), 또는 버핑 (buffing) (냅 (nap) 및 그레인 결함을 감소시키기 위해서 레더의 표면을 마모시킴)을 포함할 수 있다. 표면 코팅은 하기 단계들의 임의의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다: 오일링 (oiling) (원유 또는 오일들로 코팅된 레더), 버핑, 분무 (spraying), 롤러 코팅 (roller coating), 커튼 코팅, 폴리싱 (polishing), 플레이팅 (plating), 엠보싱 (embossing), 아이로닝 (ironing), 또는 그레이징 (glazing).

가죽이 트리밍되어서 원하는 두께 또는 치수를 수득해야 하는 동물 가죽과는 달리, 가공된 레더 물질이 특정 최종 제품에 따른 광범위한 두께 뿐만 아니라 원하는 치수로 제작될 수 있다.

상기 가공된 레더 물질의 제조는 상기 레더 제조 공정에서 천연 동물 가죽을 처리하기 위해서 필요한 과량의 단백질, 지방, 및 털을 제거하는 단계를 우회함으로써 폐기물을 덜 발생시킬 수 있어서, 개시된 방법 및 상기 방법으로부터 유래된 제품에서 환경적 문제를 덜 일으킨다.

발명의 구현예

본 발명은 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기에 개시된 특성을 갖는 생제작된 물질을 포함한다.

제1 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 콜라겐 파이버의 네트워크를 포함하는 물질, 예컨대 생제작된 물질 또는 생제작된 레더에 관한 것이다:

(i) 비-인간 콜라겐 피브릴의 네트워크,

상기 물질 중 상기 콜라겐 피브릴의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 중량% 미만은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μm 이상의 직경을 갖는 콜라겐 파이버의 형태 및/또는 그 길이의 100 μm 이상에 대해 정렬된 피브릴의 형태이고; 상기 물질은 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60 중량% 이하의 물을 포함하고; 상기 물질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40 중량%의 윤활제를 포함하고; 또한 선택적으로, 상기 물질은 상부면 및 바닥면 또는 내부면 및 외부면을 포함하고; 또는

(ii) 재조합 비-인간 콜라겐 피브릴의 네트워크, 상기 콜라겐은 3-히드록시프롤린을 실질적으로 포함하지 않고, 또한 선택적으로 히드록시리신을 실질적으로 포함하지 않으며; 상기 물질은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 중량% 이하의 물을 포함하고; 상기 물질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40%의 윤활제를 포함하고; 또한, 선택적으로 상기 물질은 상부면 및 바닥면 또는 내부면 및 외부면을 포함한다. 상기 물질 중 수분 함량은 바람직하게 25 내지 40% 미만이다. 윤활제에 대한 상기 생제작된 물질의 흡수 용량을 매치시키거나 또는 초과하지 않도록 윤활제 함량이 선택될 수 있다. 상기 물질은 포유류 콜라겐, 예컨대 소의 타입 I 또는 타입 III 콜라겐을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기는 동물이 포함하는 콜라겐 분자를 자연적으로 발생시키는 동물의 털 (hair), 모낭(들), 또는 지방(들)을 포함하지 않을 것이다. 예를 들면, 상기는 종래 레더에서 발견되는 액틴, 케라틴, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 글로불린, 뮤신, 무시노이드, 비콜라겐 구조적 단백질, 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중량% 미만으로 포함할 수 있다. 상기는 종래의 레더, 예컨대 생제작된 물질 중 상기 콜라겐 분자를 자연적으로 발생시키는 동물에서 발견된 다른 콜라겐성 단백질, 탄수화물, 핵산, 또는 지질, 또는 면역원, 항원 또는 알레르겐이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 대안의 구현예는 종래의 레더에서 발견된 액틴, 케라틴, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 글로불린, 뮤신, 무시노이드, 비콜라겐 구조적 단백질 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질의 하나 이상을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%로 포함할 수 있다.

상기 물질 중 상기 피브릴을 제조하는데 사용된 콜라겐이 천연 공급원, 바람직하게 정제된 형태로 분리될 수 있거나, 또는 상기는 재조합으로 제조되거나 또는 화학 합성으로 제조될 수 있다. 콜라겐은 일반적으로 4-히드록시프롤린을 포함한다. 예를 들면 더 낮은 함량으로 포함하거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 히드록시리신 또는 3-히드록시프롤린, 글리코실화 또는 가교된 아미노산 잔기, 또는 콜라겐 아미노산 서열의 다른 번역후 변형을 포함하는 경우, 천연 공급원으로부터 수득된 콜라겐과 화학 구조가 상이할 수 있다. 대안으로서, 상기는 더 높은 함량의 히드록실화 아미노산 잔기, 글리코실화 잔기, 가교 또는 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다.

전술한 물질은 일반적으로 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 및 1,000 mg/cc, 바람직하게 100 내지 500 mg/cc의 피브릴 밀도를 나타낼 수 있는 콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함한다. 상기 피브릴 또는 피브릴의 네트워크는 생제작된 물질 또는 생제작된 레더에, 그레인 질감, 예컨대 탑 그레인 질감, 촉감, 또는 외관을 부여할 수 있다. 그러나, 생제작된 물질은, 생제작된 생성물내 조성, 피브릴 크기, 가교 및 윤활을 조절하거나 또는 이의 제어에 의해서 조정될 수 있어서 상응하는 종래 레더보다 더 균일한 다공성 및 다른 물리적 특성을 나타낼 수 있다.

많은 구현예에서, 전술한 생제작된 물질은 상부면 및 바닥면, 또는 내부면 및 외부면을 가질 것이고, 콜라겐 피브릴을 포함한다. 상기 표면의 하나 이상이 외부에 노출될 수 있다. 생제작된 물질의 단일 층은, 콜라겐 피브릴 또는 파이버 직경이 가죽의 더 내부층에 대해 증가하는 종래 레더 제품과는 달리, 그 양면에서 실질적으로 동일한 그레인 및 외관을 나타낼 수 있다.

다른 구현예에서, 생제작된 물질이, 그 표면(들)에 대해 실질적으로 균일한 특성을 나타낼 수 있는 특정 형태로, 주조, 성형 또는 형성될 수 있다.

생제작된 물질에서 상기 콜라겐 피브릴이 특정 직경을 갖도록 조절될 수 있다. 피브릴 직경의 분포는 실질적으로 단일형태의 분포, 이형태 분포, 삼형태 분포 또는 기타 다형태 분포를 나타낼 수 있다. 다형태 분포는 상이한 피브릴화 조건을 사용하여 제조된 피브릴의 둘 이상의 상이한 조제로 이루어질 수 있다. 실질적으로 단일형태 분포에서, 상기 피브릴의 직경의 > 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99%가 단일 형태 주위에 분포한다. 이형태 분포에서, 상기 피브릴의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%가 하나의 형태 주위에 분포할 것이다. 삼형태 및 다른 다형태 분포에서, 일반적으로 상기 피브릴 직경의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30% 또는 그 이상 (형태의 수에 의존함)이 형태 주위에 분포할 것이다.

생제작된 물질은 피브릴을 포함할 수 있고, 상기 콜라겐 피브릴의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%는 1 nm 내지 1 μm의 직경을 갖는다. 현미경사진 또는 전자 현미경사진, 예컨대 주사 또는 투과 전자 현미경사진의 육안 검사에 의한 것을 포함하는 당분야에 알려져 있는 방법에 의해서 피브릴 직경이 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 콜라겐 피브릴은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 nm (1 μm) 범위의 집합적 평균 또는 개별 피브릴 직경을 가질 수 있다.

전술한 상기 생제작된 물질에서 콜라겐 피브릴이, 콜라겐 피브릴들 사이에 가교를 형성하는 적어도 하나의 제제와 접촉함으로써 보통 가교된다. 상기 가교제가 아민, 카르복실산, 술페이트, 술파이트, 술포네이트, 알데히드, 히드라지드, 술프히드릴, 디아지린, 아릴, 아지드, 아크릴레이트, 에폭시드, 페놀, 크롬 화합물, 베지터블 탄닌 및 신탄의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

가교가 1, 5, 10, 25, 50, 75 내지 100 mM 범위의 가교제 농도로 실시될 수 있고, 또한 상기 가교제에 콜라겐 피브릴을 균일하게 노출하는 조건하에 실시될 수 있어서 형성된 가교의 평균 수는 균일하고, 또한 상기 물질의 동일한 단위 부피에서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

생제작된 물질은 상기 물질의 중량에 근거하거나 또는 상기 물질 중 상기 콜라겐 또는 콜라겐 피브릴의 중량에 근거하여, 가교제의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%를 포함할 수 있다. 상기 가교제가 공유 결합 또는 비공유 결합 형태로 존재할 수 있고, 예를 들면 상기 콜라겐 피브릴로 공유 결합될 수 있다. 가교제가 상기 생제작된 물질 중에 균일하게 존재할 수 있고, 그 농도는 중량 (또는 몰)으로 상기 물질의 동일한 단위 부피에서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

전술한 생제작된 물질 또는 생제작된 레더는 윤활제를 포함한다. 콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 윤활되지 않은 물질, 예컨대 이후 윤활을 위한 전구체 기재가 제조될 수 있지만, 그러나 윤활된 생성물의 가요성 및 기타 유용한 특성이 결여될 수 있다. 피브릴 이동을 촉진하거나 또는 레더와 같은 특성, 예컨대 가요성, 취성 감소, 내구성, 강도, 파열 또는 인열에 대한 증가된 저항성, 또는 내수성을 부여하는 임의의 양으로 윤활제가 포함될 수 있다. 윤활제 함량은 상기 생제작된 레더의 약 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60 중량%의 범위일 수 있다.

본 발명의 구현예에서 사용된 윤활제는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 지방, 생물학적, 미네랄 또는 합성 오일, 코드 오일, 술폰화 오일, 폴리머, 수지, 유기관능성 실록산, 및 종래 레더를 가지화하기 위해 사용된 기타 제제; 그 혼합물을 포함한다. 다른 윤활제는 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양이온성 폴리머 계면활성제, 음이온성 폴리머 계면활성제, 양쪽성 폴리머, 지방산, 변형된 지방산, 비이온성 친수성 폴리머, 비이온성 소수성 폴리머, 폴리 아크릴산, 폴리 메타크릴산, 아크릴, 천연 고무, 합성 고무, 수지, 양쪽성 음이온성 폴리머 및 코폴리머, 양쪽성 양이온성 폴리머 및 코폴리머, 및 그 혼합물 뿐만 아니라 물, 알콜, 케톤 및 기타 용매 중 이들의 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다.

윤활제를 포함하는 용액 또는 에멀젼이 윤활제로서 사용될 수 있고, 예를 들면, 수지 및 기타 소수성 윤활제가 이들을 용해시키기에 적당한 에멀젼 또는 용매 중에 사용될 수 있다. 생제작된 레더로 적용 또는 혼입하기에 적당한 윤활제의 임의의 양을 상기 용액은 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기는 윤활제의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%, 또는 예컨대 적어도 하나의 수성 용매, 예컨대 물, 알콜, 예컨대 C ₁ -C ₆ 알콜, 예컨대 에탄올, 케톤, 예컨대 C ₁ -C ₆ 케톤, 알데히드, 예컨대 C ₁ -C ₆ 알데히드, 왁스, 계면활성제, 분산제 또는 다른 제제의 부피에 대한 상응하는 양을 포함할 수 있다. 윤활제는 다양한 형태, 예컨대 O/W 또는 W/O 에멀젼, 수성 또는 소수성 용액, 분무가능한 형태, 또는 생제작된 물질로 혼입 또는 적용하기에 적당한 다른 형태일 수 있다.

윤활제가 생제작된 물질 전체에 균일하게 분포될 수 있어서, 상기 물질의 동일 단위 부피에서 상기 윤활제의 농도는 5, 10, 15, 20, 35, 30, 40, 또는 50% 이하로 가변하고, 생제작된 물질로 또는 그 안으로 균일하게 적용하기에 적당한 형태로 배합 또는 혼합될 수 있다.

생제작된 제품의 일부 구현예들은 레더와 유사한 많은 유익한 특성 또는 종래 레더와 비교하여 신규하거나 또는 우수한 특성을 나타낸다.

다른 구현예에서, 생제작된 레더는 적어도 100 kPA의 탄성 모듈러스를 가질 수 있다. 상기는 100 kPa 내지 1,000 MPa 뿐만 아니라 상기 범위 중 임의의 중간값, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 MPA의 범위일 수 있다.

일부 구현예는 균일한 탄성을 나타낼 수 있고, 상기 탄성 모듈러스는, 상기 물질의 동일한 길이 또는 너비 (또는 부피 또는 고정된 단면적)에 걸쳐 30, 60, 또는 90도 (또는 다른 각도에서)로 상이한 각에서 측정될 때, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

일부 구현예는 신축가능할 수 있고, 이완된 상태에서 그 길이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 내지 300%까지 연신될 수 있다. 상기 범위는 모든 중간값을 포함한다.

일부 구현예에서, 생제작된 레더는 적어도 1 kPA의 인장 강도를 가질 수 있다. 상기는 1 kPa 내지 100 MPa의 범위 뿐만 아니라 상기 범위 중 임의의 중간값, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500kPA; 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 MPa일 수 있다. 일부 구현예들은 균일한 인장 강도를 나타낼 것이고, 상기 인장 강도는, 상기 물질의 동일한 길이 또는 너비 (또는 부피 또는 고정된 단면적)에 걸쳐 30, 60, 또는 90도 (또는 다른 각도에서)로 상이한 각에서 측정할 때, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

일부 생제작된 레더는, 동일한 가교제(들) 또는 윤활제를 사용하여 처리된 콜라겐의 동일한 타입, 예컨대 소의 타입 I 또는 타입 III 콜라겐을 포함하는 동일한 두께의 종래의 탑 그레인 또는 기타 레더보다, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150 또는 200% 더 인열 강도 또는 저항성을 나타낸다. 일부 구현예들은 균일한 인열 저항성을 나타낼 것이며, 이는 상기 물질의 동일한 길이 또는 너비 (또는 부피 또는 고정된 단면적)에 걸쳐 30, 60, 또는 90도 (또는 다른 각도에서)로 상이한 각에서 측정될 때, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다. 생제작된 물질은 약 1 내지 500 N의 범위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500의 인열 강도 뿐만 아니라 상기 범위내의 임의의 중간값의 인열 강도를 가질 수 있다.

생제작된 레더는 ISO 17235로 측정하여, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 mm 또는 그 이상의 연화도를 가질 수 있다. 일부 구현예는 균일한 연화도를 나타낼 것이고, 이는 상기 생제작된 물질의 동일한 단위 면적 또는 부피로 측정하여, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100% 이하로 가변한다.

다른 구현예에서, 생제작된 물질은 진피 배킹을 위한 요건 없이 탑 그레인과 같은 제품을 제공하기 위한 맞춤형 두께 (customized thickness)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 물질은, 동일하거나 또는 실질적으로 같은 그레인, 그레인 질감, 촉감 및 외관을 갖는 상부면 및 바닥면 또는 내부면 및 외부면을 가질 것이다. 다른 구현예들은 패턴 (pattern)으로 엠보싱 (embossed), 디스트레스 (distressed), 프린트 (printed), 염색 (stained) 또는 페인트 (painted)된다. 다른 구현예들은 표면 코팅 또는 표면 피니쉬를 가지며, 이는 상기 물질 상에 또는 전체에 균일하게 분포될 수 있고, 상기 물질의 동일한 단위 부피 또는 단위 면적에 대해 그 농도는 중량으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다. 일부 구현예들은 염료, 염색, 수지, 폴리머, 안료 또는 페인트를 포함할 수 있고, 선택적으로 상기 염료, 염색, 수지, 폴리머, 안료 또는 페인트가 상기 물질 전체에 균일하게 분포되고, 상기 물질의 동일한 단위 부피 또는 단위 면적에서 그 농도가 중량으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

전술한 생제작된 물질의 특정 구현예들은 충전제 뿐만 아니라 콜라겐 피브릴의 네트워크로 혼입되는 다른 물질 또는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예들은 충전제, 예컨대 폴리머 미크로스피어(들), 비드(들), 파이버(들), 와이어(들), 또는 유기 염(들)의 적어도 하나를 포함할 것이다. 상기는 건조하는 동안 상기 피브릴들이 서로 간격을 두고 떨어져 있음으로써 탈수된 콜라겐 피브릴 네트워크의 조직을 조절하도록 선택될 수 있다. 상기 충전제는 일부 조건하에서 가용성일 수 있거나 또는 건조 또는 다른 처리 후에 생제작된 물질로부터 제거될 수 있는 형태일 수 있다.

다른 구현예들은 콜라겐 피브릴의 네트워크로 혼입되는 적어도 하나의 직포 또는 부직포 물질 또는 상기 부직포 또는 직포 물질로 혼입되는 콜라겐 파이버의 네트워크를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 생제작된 물질은 다른 제품, 예컨대, 풋웨어, 의류, 스포츠웨어, 유니폼, 지갑, 시계끈, 팔찌, 여행가방, 덮개 또는 가구로 혼입될 것이다.

제조 방법의 구현예

본 발명에 따른 방법은 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기의 구현예들을 포함한다.

하기를 제조하는 방법:

(i) 비-인간 콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 물질, 여기서 상기 물질 중 상기 콜라겐 피브릴의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 중량% 미만은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μm 또는 그 이상의 직경을 갖는 콜라겐 파이버의 형태 및/또는 그 길이의 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400 μm 또는 그 이상에 대해 정렬된 피브릴의 형태이고; 상기 물질은 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 중량% 이하의 물을 포함하고; 상기 물질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40%의 윤활제를 포함하고, 비-인간 콜라겐 분자의 수성 용액 또는 현탁액을 콜라겐 피브릴로 피브릴화하는 단계, 상기 콜라겐 피브릴을 적어도 하나의 가교제와 접촉시킴으로써 상기 콜라겐 피브릴을 가교하는 단계, 40 중량% 이하의 물을 포함하도록 상기 가교된 콜라겐 피브릴을 탈수시키는 단계, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40 중량%의 적어도 하나의 윤활제를 상기 물질로 혼입하는 단계, 및 선택적으로 상부면 및 바닥면 또는 내부면 및 외부면을 포함하는 상기 물질을 주조, 성형, 또는 형성하는 단계를 임의의 순서로 포함하고; 또는

(ii) 재조합 비-인간 콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 물질, 여기서 상기 콜라겐은 3-히드록시프롤린을 실질적으로 포함하지 않고, 또한 선택적으로 히드록시리신을 실질적으로 포함하지 않으며; 상기 물질은 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 중량% 이하의 물을 포함하고; 상기 물질은 적어도 1%의 윤활제를 포함하고, 비-인간 콜라겐 분자의 수성 용액 또는 현탁액을 콜라겐 피브릴로 피브릴화하는 단계, 상기 콜라겐 피브릴을 적어도 하나의 가교제와 접촉시킴으로써 상기 콜라겐 피브릴을 가교하는 단계, 5, 10, 15, 20 또는 25 중량% 이하의 물을 포함하도록 상기 가교된 콜라겐 피브릴을 탈수시키는 단계, 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50 중량%의 적어도 하나의 윤활제를 상기 물질로 혼입하는 단계, 및 선택적으로 상부면 및 바닥면 또는 내부면 및 외부면을 포함하는 상기 물질을 주조, 성형, 또는 형성하는 단계를 임의의 순서로 포함한다.

상기 방법에 사용하기 위한 콜라겐 또는 콜라겐성 물질은 포유류 콜라겐, 예컨대 소의 타입 I, 타입 III 콜라겐 또는 다른 타입 및 전술한 콜라겐 또는 콜라겐성 단백질의 공급원을 포함할 수 있다. 상기는 포유류 또는 다른 동물로부터 수득될 수 있거나, 또는 일부 구현예에서, 에스케리치아 콜리 , 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis ), 또는 다른 박테리움 (bacterium); 피치아 ( Pichia ), 사카로마이세스 ( Saccharomyces ), 또는 다른 이스트 또는 진균; 식물 세포; 곤충 세포 또는 포유류 세포에 의해서 재조합으로 발현될 수 있다.

전술한 방법에 사용하기 위한 콜라겐이 또한 세포, 예컨대 인 비트로에서 배양된 전술된 것, 예컨대 배양된 포유류 또는 동물 세포로부터 분리될 수 있다. 대안으로서, 콜라겐 또는 콜라겐성 단백질이 다른 수단, 예컨대 화학 합성에 의해서 수득될 수 있다. 예를 들면 더 낮은 함량으로 포함하거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 히드록시리신 또는 3-히드록시프롤린, 글리코실화 또는 가교된 아미노산 잔기, 또는 콜라겐 아미노산 서열의 다른 번역후 변형을 포함할 수 있다면, 천연 공급원으로부터 수득된 콜라겐과 화학 구조가 상이할 수 있다. 대안으로서, 상기는 더 높은 함량의 히드록실화 아미노산 잔기, 글리코실화 잔기, 가교 또는 다른 화학 변형을 포함할 수 있다.

바람직하게, 콜라겐은 동물이 포함하는 콜라겐 분자를 자연적으로 발생하는 동물의 털, 모공(들), 또는 지방(들)을 포함하지 않을 것이며, 이는 그 균일성, 강도 및 심미적 특성을 손상시킬 수 있기 때문이다. 예를 들면, 상기는 종래 레더에서 발견되는 액틴, 케라틴, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 글로불린, 뮤신, 무시노이드, 비콜라겐 구조적 단백질 및/또는 비콜라겐 비구조적 단백질을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중량% 미만으로 포함할 수 있다. 상기는 생제작된 물질내 상기 콜라겐 분자를 자연적으로 발생시키는 동물에서와 같이, 종래 레더에서 발견되는 다른 콜라겐성 단백질, 탄수화물, 핵산, 또는 지질, 또는 면역원, 항원, 또는 알레르겐을 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 콜라겐 또는 콜라겐-유사 물질이 실질적인 균일성으로 정제될 수 있거나, 또는 피브릴을 형성하기 위한 그 능력과 일치하는 순도를 가질 수 있고, 예를 들어, 상기는 그 전체 단백질 함량에 기반하거나 또는 그 전체 중량에 기반하여 콜라겐을 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99 중량%로 포함할 수 있다. 상이한 생물학적 공급원으로부터 콜라겐 또는 콜라겐들의 상이한 타입들의 혼합물이, 콜라겐 피브릴의 화학적 및 물리적 특성들을 균형을 맞추거나 또는 상보적인 특성들을 갖는 피브릴들의 혼합물을 제조하기 위해서, 특정 구현예에서 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 1, 5, 10, 25, 50, 75, 95, 또는 99 중량%의 제1 콜라겐 및 99, 95, 90, 75, 50, 25, 10 또는 1 중량%의 제2, 제3 또는 후속 콜라겐 성분을 포함할 수 있다. 상기 범위는 콜라겐들의 모든 중간값 및 비율을 포함하고, 모든 콜라겐 성분들의 전체 콜라겐 함량은 중량부로 100%이다.

본원에 개시된 방법은 실질적으로 균일하게 분포된 피브릴, 가교된 피브릴, 탈수된 피브릴 및/또는 윤활된 피브릴을 갖는 생제작된 제품을 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 피브릴이 상기 물질 전체에 분포될 수 있고, 상기 물질 중 동일한 단위 부피에서 상기 콜라겐 피브릴의 농도는 중량으로 (또는 수 또는 수 평균으로) 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

일부 구현예에서, 상기 생제작된 물질이 가교, 탈수 및/또는 윤활 후에 상기 물질을 스테이킹 (staking)될 것이다.

본원에 개시된 구현예에서, 콜라겐 용액 또는 현탁액이, 예를 들면, 상기 용액 또는 현탁액의 염 농도를 조정하고, 그 pH를 조정, 예를 들어 콜라겐의 산성 용액의 pH를 올리거나, 또는 그 둘 다를 조정함으로써 피브릴화된다. 일부 구현예에서, 피브릴화가 핵제를 포함함으로써 촉진될 수 있다. 피브릴화를 위해 사용된 염은 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스페이트 염 및 클로리드 염, 예컨대 Na ₃ PO ₄ , K ₃ PO ₄ , KCl, 및 NaCl을 포함한다. 피브릴화 중에 염 농도가 10 mM 내지 2M의 범위로 조정될 수 있거나, 또는 pH가 산, 염기, 또는 완충액에 의해서 pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0 또는 그 이상으로 조정될 수 있다. 염 농도 및 pH가 피브릴화를 유도 또는 촉진하기 위해서 동시에 조정될 수 있다. 본원에 개시된 방법의 특정 구현예에서, pH 6.0 미만의 pH를 갖는 콜라겐 분자의 수성 용액 또는 현탁액이 상기 pH를 pH 6.0 내지 8.0으로 조정함으로써 피브릴화될 수 있다.

본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 상기 콜라겐 피브릴이 그 형성 과정 중에 또는 피브릴화의 완료 후에 가교될 것이다.

일부 구현예에서, 콜라겐 피브릴이 이를 적어도 하나의 아민, 카르복실산, 술페이트, 술파이트, 술포네이트, 알데히드, 히드라지드, 술프히드릴, 디아지린, 아릴, 아지드, 아크릴레이트, 에폭시드, 페놀, 크롬 화합물, 베지터블 탄닌, 및 신탄과 접촉시킴으로써 가교된다.

하나 이상의 가교제가 1 mM 내지 100 mM 범위의 농도로, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 6, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mM의 농도로 첨가될 수 있다.

가교의 시간, 온도 및 기타 화학적 및 물리적 조건이 상기 콜라겐 피브릴 중에 가교의 특정 정도를 제공하도록 선택되어서, 결과의 가교된 피브릴은 하나 이상의 상이한 가교의 특정 정도를 포함할 수 있다. 결과의 가교된 피브릴 조제는, 상기 가교제의 중량 및 상기 콜라겐의 중량에 기반하거나 또는 콜라겐 피브릴의 가교된 네트워크, 예컨대 히드로겔의 중량에 기반하여, 가교제의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 상기 가교제가 상기 콜라겐 피브릴로 공유 결합 또는 비공유-결합될 수 있다. 가교 후에 상기 물질의 동일한 단위 부피로 콜라겐 분자, 트로포콜라겐 (tropocollagen), 또는 피브릴들 사이 또는 이들 중 가교의 수, 또는 콜라겐 분자들, 트로포콜라겐 또는 콜라겐 피브릴들 사이의 가교의 평균 수는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 미만으로 가변할 수 있다.

본원에 개시된 방법은, 피브릴화 또는 가교 중에, 또는 이들 둘의 실시 중에, 또는 피브릴화 및 가교가 실질적으로 완료한 후에 실시할 수 있는 탈수 또는 배수 단계를 필요로 한다.

일부 구현예에서, 탈수 단계는 콜라겐 피브릴의 네트워크를, 아세톤, 신탄, 또는 콜라겐으로부터 결합된 물을 제거하는 다른 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 피브릴 조제 또는 가교된 피브릴 조제로부터, 여과 또는 증발에 의해서 일부의 물이 제거될 수 있고, 그 후에 콜라겐 피브릴의 네트워크와 결합하여 남아 있는 물이, 아세톤 또는 물을 제거하는 기타 화학제와 같은 용매를 사용하여 제거된다.

본원에 개시된 방법은 일반적으로 제조된 콜라겐 피브릴의 네트워크의 윤활을 필요로 한다. 윤활 단계는 피브릴화, 가교, 탈수 중 또는 상기 단계들 중 어느 단계 중, 또는 상기 단계들 중 하나 이상의 단계가 실질적으로 완료된 후에 실시될 수 있다.

일부 구현예에서, 윤활 단계는 가교된 콜라겐 피브릴의 네트워크를, 하나 이상의 윤활제, 예컨대 지방, 생물학적, 미네랄 또는 합성 오일, 코드 오일, 술폰화 오일, 폴리머, 유기관능성 실록산, 및 종래 레더를 가지화하기 위해 사용된 기타 제제; 또는 그 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함할 것이다.

다른 구현예에서, 윤활제(들)이 콜라겐 피브릴의 탈수 가교된 네트워크의 균일한 윤활을 촉진하는 방법을 사용하여 적용되어서, 상기 물질의 동일한 단위 부피에서 상기 윤활제의 농도는 중량으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다. 상기 적용은 딥-코팅 (dip-coating), 분무-코팅 (spray-coating), 증착 (vapor deposition), 방사-코팅 (spin-coating), 닥터 블레이드 코팅 (Doctor Blade coating), 블러쉬 코팅 (brush coating) 뿐만 아니라 다른 공지된 코팅 또는 도포 방법에 의해서 실시할 수 있다.

본원에 개시된 방법의 부가의 구현예에서, 표면 코팅 또는 표면 피니쉬가 생제작된 물질로 적용된다. 생제작된 물질의 제조의 다양한 단계들 중에 콜라겐 피브릴의 네트워크를 포함하는 물질의 표면에 상기가 적용될 수 있고, 이들은 일반적으로 가교, 탈수 및 윤활된 제품에 적용될 것이다. 본원에 개시된 방법에 의해서 제조된 균일한 윤활 단계는 상기 코팅 또는 피니쉬의 균일한 적용 및 부착을 성공적으로 촉진한다.

다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 그 제조의 다양한 단계들 중 또는 이에 한정되는 것은 아니지만 염료, 염색, 안료, 수지, 폴리머 또는 페인트를 포함하는 다른 관능성 성분들로 가교, 탈수 및 윤활되어진 후에, 생제작된 물질을 혼입 또는 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 부가의 구현예에서, 상기 관능성 성분들이 상기 물질 상에 또는 전체에 상기 제제를 균일하게 분포시키는 조건하에 적용 또는 혼입될 수 있어서, 상기 물질의 동일한 단위 부피에서 이들 농도는 중량으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 이하로 가변한다.

다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은, 그 제조의 다양한 단계들 중 또는 이들이 가교, 탈수 및 윤활되어진 후에, 충전제를 생제작된 물질로 혼입하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 충전제가 탈수 이전, 예를 들면 피브릴화 또는 가교 중에 혼입된다. 상기 충전제는 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리머 미크로스피어, 비드, 파이버, 와이어, 또는 유기 염을 포함한다.

전술한 방법의 일부 구현예들은, 그 제조 중 또는 이후에, 생제작된 물질로 또는 그 위에 적어도 하나의 직포 또는 부직포 물질을 혼입하는 단계를 포함할 것이다. 예를 들면, 직포 또는 부직포 종이 또는 직물 물질을 사용하여 가교된 피브릴을 여과한다. 다른 구현예들은, 그 제조 중 또는 그 후에, 적어도 하나의 직포 또는 부직포 물질로 생제작된 물질을 혼입하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 상업적 구현예들은, 풋웨어, 의류, 스포츠웨어, 유니폼, 지갑, 시계끈, 팔찌, 여행가방, 덮개, 가구 또는 다른 산업적, 상업적 또는 소비 제품과 같은 제품으로 생제작된 물질을 혼입하는 단계를 포함한다.

하기 비-제한되는 실시예는 본 발명을 서술한다. 본 발명의 범위는 하기 실시예에 상세하게 서술된 것에 제한되지 않는다.

실시예 1

생제작된 레더의 두께의 조절

추출된 소의 타입 I 콜라겐의 히드로겔이, 상이한 두께를 갖는 건조된 콜라겐 물질을 제조하기 위해서, 상이한 콜라겐 농도 및 부피로 형성되었다. 콜라겐이 0.01N HCl 중 5 g/L 또는 9 g/L로 용해되고, 그 후에 1 부의 10x PBS가 9 부의 용해된 콜라겐으로 첨가되어서, 콜라겐 피브릴화 및 겔 형성을 유도하였다.

상기 피브릴화 콜라겐의 0.8 L 또는 1.6 L의 용액들이 그 후에 몰드로 주조되고, 25 ℃에서 인큐베이션되어서 히드로겔을 형성시켰다. 0.8L의 용액이 1.5 cm의 두께를 갖는 겔을 제조하고, 1.7L의 용액이 3.0 cm의 두께를 갖는 겔이 생성되었다. 상기 겔이 아세톤에서 탈수 및 윤활되고, 그 후에 건조되고, 레더와 같은 물질로 기계적으로 스테이크 (stake)되었다. 상기 최종 건조된 물질의 두께는 상기 개시 히드로겔에서 콜라겐의 전체 양과 상관관계가 있다.

생제작된 레더의 두께가 그 전체 콜라겐 함량을 가변시킴으로써 조절되었다. 시료들 A, B 및 C가 525 cm ² 의 부피 (수화된 겔 면적)로, 각각 4, 7.2 또는 14.4 gr의 콜라겐을 사용하여 제조되었다. 생제작된 레더가 가교, 윤활 및 탈수에 의해서 각 시료들로부터 제조되었다. 하기 표 1에 개시된 바와 같이, 상기 겔 중 콜라겐의 함량을 증가시키면 결과의 생제작된 레더의 두께를 증가시켰다.

실시예 2

타입 I 콜라겐으로부터 생제작된 레더의 제조

타입 I 콜라겐이 Wuxi Biot Bio-technology Company, ltd. (Medical Collagen Sponge)로부터 구입되었다. 상기 콜라겐이 산 처리 후에, 펩신 분해 (pepsin digestion)에 의해서 소의 힘줄로부터 분리되었고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 동결 및 동결 건조 (lyophilized)되었다.

상기 동결 건조된 단백질 (4.1 g)이 733 ml의 0.01 N HCL에서 오버헤드 믹서 (overhead mixer)를 사용하여 용해되었다. 상기 용액 중 고형 콜라겐 스폰지의 결여에 의해서 입증되는 바와 같이, 상기 콜라겐이 충분히 용해된 후에 (1600 rpm에서 적어도 1시간 혼합), 82㎕의 상기 태닝제 Relugan GTW가 상기 용액으로 첨가되고, 상기 용액의 pH를 7.2로 올리기 위해서 81 mL의 10x PBS, pH 11.2가 첨가되었다.

상기 용액이 그 후에 3분 동안 혼합되고, 그 후 상기 용액을 실리콘 몰드로 붓는다. 상기 콜라겐 용액이 실리콘 몰드에서 2시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션되어서, 상기 콜라겐을 점탄성 히드로겔로 피브릴화시켰다.

용액의 불투명함 (425 nm 광의 흡광도로 측정)과 함께 유동 특성의 안정기는, 피브릴화가 이 시점에서 완료되었고, 상기 콜라겐 피브릴의 존재가 주사 전자 현미경 (도 3) 및 투과 전자 현미경 (도 4)에 의해 확인되었음을 나타낸다.

상기 피브릴화 콜라겐 히드로겔이 상기 몰드로부터 제거되고, 플라스틱 자 (plastic jar)내의 700 mL의 아세톤 중에 넣고, 25 ℃, 40 rpm으로 오비탈 쉐이커 (orbital shaker)에서 진탕시켰다. 상기 히드로겔이 밤새 인큐베이션 후에 상기 아세톤을 리프레쉬 (refreshing)함으로써 탈수되고, 그 후 5x 1시간 세척되고, 한번 더 밤새 인큐베이션되었다. 각 세척 후에 아세톤으로 리프레쉬되어서, 상기 겔로부터 물이 제거되었다.

아세톤 탈수 이후에, 상기 콜라겐 겔이, 각각 80% 아세톤 또는 에탄올 중 대구간유 또는 캐스터 오일의 20 % (v/v)를 포함하는 가지제 (fat liquor) 용액에서 밤새 인큐베이션되고, 40 rpm으로 진탕되었다.

상기 가지제 용액 중에서 인큐베이션한 이후에, 상기 콜라겐 겔이 37 ℃에서 건조되었다. 건조 후에, 상기 물질이 부드러워지고, 레더와 같아지거나 또는 생제작된 레더가 되었다. 상기 물질의 레더-유사 외관을 향상시키기 위해서 과량의 오일이 제거될 수 있다.

상기 생제작된 레더는 상부면 및 바닥면 모두에서 그레인 질감을 가졌고, 상기 상부면 및 바닥면 모두에서 염료가 일관되게 흡수되었다.

실시예 3

타입 III 콜라겐으로부터 생제작된 레더의 제조

0.01 N HCl 중 2.5 mg/ml로 재조합 콜라겐 타입 III의 용액 (FibroGen, Inc.)이, pH 11.2의 소듐 포스페이트 용액의 200 mM의 1부 (22mL)를 상기 콜라겐 용액의 9부 (200mL)로 첨가하여 상기 pH를 7로 증가시킴으로써 피브릴화되고, 실온에서 2시간 동안 교반되었다.

피브릴화가 경시적으로 상기 용액의 400 nm 흡광도를 측정함으로써 확인되었다.

피브릴화 후에, Relugan GTW (상기 콜라겐 상에 2% w/w 제공)를 상기 피브릴 현탁액으로 첨가하고, 30분 동안 혼합함으로써 상기 피브릴이 태닝되었다.

상기 태닝된 콜라겐 피브릴이 그 후에 3,500 RPM에서 30분 동안 원심분리되어서 상기 피브릴을 10 mg/ml의 농도로 농축시켰다. 상기 10 mg/ml의 피브릴 펠렛 (fibril pellet)이 21,000 RPM에서 30 분 동안 초원심분리기 (ultra-centrifuge)를 사용하여 더 원심분리되어서 ~40-50 mg/ml의 농도를 갖는 피브릴 겔이 수득되었다.

상기 피브릴 겔의 물리적 특성이 레오미터 (rheometer)에 의해서 평가되었다.

상기 저장 모듈러스 (storage modulus) 및 복합체 점도로 대부분이 탄성 물질임이 입증되었다.

상기 피브릴 겔이 그 후에 37 ℃로 설정된 식품 탈수기 (food dehydrator)에서 18시간 동안 건조되었다.

건조 후에, 상기 물질이, 로웨펠산 블랙 염료(Lowepel acid black dye) (상기 콜라겐 상에 2% w/w 제공) 및 루브리탄 (Lubritan) WP (상기 콜라겐 상에 20% w/w 제공)의 용액에서 인큐베이션함으로써 염색 및 재태닝되었다.

상기 물질이 상기 용액에 주입 (drumming)되고, 스퀴즈 (squeeze)되어서, 염료 및 신탄을 상기 물질로 침투시켰다. 그 후에 상기 물질이 마지막으로 건조되고, 스테이크되어서, 레더-유사 물질이 제조되었다.

실시예 4

타입 III 콜라겐으로부터 생제작된 레더의 제조

재조합 콜라겐 타입 III이 Fibrogen, Inc.로부터 구입되었다. 상기 콜라겐이 0.01N HCl에서 2.5 mg/mL의 농도로 공급되었다.

콜라겐 피브릴의 조립을 개시하기 위해서, 1부의 200mM Na ₂ HPO ₄ , pH 11.2 (100 mL)가 실온에서 9부의 원료 콜라겐 타입 III 용액으로 첨가되어서, 상기 용액을 pH 7.2로 하였다. 상기 용액이 오버헤드 믹서를 사용하여 1시간 동안 1600 rpm으로 혼합되었다.

1시간 교반 후에, 상기 콜라겐의 질량에 대해 2% (w/w) 제공으로 상기 용액에 첨가되는 Relugan GTW와 상기 콜라겐 피브릴이 반응되었다. 상기 용액이 오버헤드 믹서를 사용하여 1시간 동안 1600 rpm으로 혼합되었다.

Lipoderm A1 및 Tanigan FT가 그 후에 상기 콜라겐의 질량에 대해 80% (w/w)의 제공으로 상기 용액으로 첨가되었다. 상기 용액이 오버헤드 믹서를 사용하여 30분 동안 1600 rpm에서 혼합되었다. 상기 용액의 pH가 그 후에 10% (v/v) 포름산 용액을 사용하여 4로 낮추었다. 상기 용액이 오버헤드 믹서를 사용하여 30분 동안 1600 rpm으로 혼합되었다.

그 후에 부흐너 깔대기 (Buchner funnel)의 상부에 진공 펌프 (Hg에서 -27의 압력) 및 루버 댐 (rubber dam)이 부착된 부흐너 깔대기를 사용하여 144 mL의 상기 용액이 47 mm Whatman no. 1 멤브레인을 통해서 여과되었다. 진공이 18시간 동안 흡인되었다.

상기 농축된 피브릴 조직이 그 후에 주위 조건하에 건조되고, 상기 물질을 롤링 (rolling), 벤딩 (bending) 및 풀링 (pulling)에 의해서 30분 동안 핸드 스테이크 (hand stake)되어서, 레더-유사 물질이 제조되었다.

실시예 5

엑스판셀 (Expancell)

산 처리 이후에 펩신 분해에 의해서 소의 힘줄로부터 분리되고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 동결되고, 또한 동결건조된, 타입 I 소의 콜라겐이 Wuxi Biot Bio-technology co., Ltd. (Medical Collagen Sponge)로부터 구입되었다.

오버헤드 믹서를 사용하여, 10 gr의 상기 동결건조된 콜라겐 단백질이, 고형 콜라겐 스폰지가 존재하지 않을 때까지, 적어도 1시간 동안 0.01N HCl, pH 2의 1 L 중에 1,600 rpm으로 혼합함으로써 용해되었다.

111.1 ml의 200 mM의 소듐 포스페이트 (pH가 소듐 히드록시드로 11.2로 조정됨)가 그 후에 상기 콜라겐 용액의 pH를 7.2로 올리기 위해서 첨가되었다.

상기 pH 7.2의 콜라겐 용액이 그 후에 10분 동안 교반되고, 콜라겐의 중량으로 2%인, 가교제로서 0.1 ml의 20% Relugan GTW (BASF)가 가교된 콜라겐 피브릴을 제조하기 위해서 첨가되었다.

상기 가교된 콜라겐 피브릴이 그 후에 5 ml의 20% Tanigan FT (Lanxess)와 혼합되고, 1시간 동안 교반되었다.

그 후에, 1 gr의 엑스판셀 미크로스피어 (Expancel Microspheres) 461 WE 20 d36 (AkzoNobel) (상기 콜라겐의 중량의 10%임) 및 40 ml의 트루포솔 벤 (Truposol Ben) (Trumpler) (상기 콜라겐의 중량의 80%임)이 첨가되고, 오버헤드 교반기를 사용하여 부가의 1시간 동안 교반되었다.

상기 용액의 pH가 10%의 포름산의 첨가에 의해서 pH 4.0으로 감소되고, 1시간 동안 교반되었다.

pH에서 감소 후에, 150 ml의 상기 용액이, -27 mmHg의 압력으로 진공 펌프에 부착된 부흐너 깔대기를 사용하여 90 mm Whatman No.1 멤브레인을 통해서 여과되었다.

상기 농축된 피브릴 조직이 그 후에 주위 조건하에 건조되었고, 상기 물질을 롤링, 벤딩 및 풀링에 의해서 30분 동안 핸드 스테이크되어서, 레더-유사 물질이 제조되었다.

실시예 6

티타늄 디옥시드 (백색 안료)

타입 I 소의 콜라겐이 Wuxi Biot Bio-technology co., Ltd. (Medical Collagen Sponge)로부터 구입되었다. 상기 콜라겐 공급원은, 산 처리 이후에 펩신 분해에 의해서 소의 힘줄로부터 분리되고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 동결되고, 또한 동결건조된 타입 I 콜라겐이다. 상기 동결건조된 단백질 (10 g)이 오버헤드 믹서를 사용하여 0.01N HCl, pH 2의 1 L 중에 용해되었다. 상기 용액 중 고형 콜라겐 스폰지의 결여에 의해서 입증되는 바와 같이, 상기 콜라겐이 충분히 용해된 후에 (1600 rpm에서 적어도 1시간 혼합), 상기 용액의 pH를 7.2로 올리기 위해서 111.1 mL의 200 millimolar의 소듐 포스페이트 (pH가 소듐 히드록시드에 의해서 11.2로 조정됨)가 첨가되었다. 수득된 콜라겐 용액이 10분 동안 교반되고, 콜라겐의 중량으로 2%인, 0.1 ml의 20% Relugan GTW (BASF) 가교제 용액이 첨가되었다.

상기 가교된 콜라겐 피브릴 용액으로, 5 ml의 20% Tanigan FT (Lanxess)가 첨가되고, 그 후에 1시간 동안 교반되었다.

Tanigan-FT 첨가 이후에, 1 gr의 엑스판셀 미크로스피어 (상기 콜라겐의 중량의 10%임) 461 WE 20 d36 (AkzoNobel), 40 ml (상기 콜라겐의 중량의 80%임)의 트루포솔 벤 (Trumpler) 및 2 ml (상기 콜라겐의 중량의 10%임)의 PPE 화이트 HS a pa (Stahl)가 첨가되고, 오버헤드 교반기를 사용하여 부가의 1시간 동안 교반되었다.

상기 용액의 pH가 10%의 포름산을 사용하여 pH 4.0으로 감소되고, 1시간 동안 교반되었다.

pH 변화 후에, 150 ml의 상기 용액이, -27 mmHg의 압력으로 진공 펌프에 부착된 부흐너 깔대기를 사용하여 90 mM Whatman No.1 멤브레인을 통해서 여과되었다.

상기 농축된 피브릴 조직이 그 후에 주위 조건하에 건조되고, 상기 물질을 롤링, 벤딩 및 풀링에 의해서 30분 동안 핸드 스테이크되어서, 레더-유사 물질이 제조되었다.

실시예 7

하이카 레진 (Hycar Resin) (26552)

소의 콜라겐이 Wuxi Biot Bio-technology co., Ltd. (Medical Collagen Sponge)로부터 구입되었다. 상기 콜라겐의 공급원은, 산 처리 이후에 펩신 분해에 의해서 소의 힘줄로부터 분리되고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 동결되고, 또한 동결건조된 타입 I 콜라겐이다.

상기 동결건조된 단백질 (10 g)이 오버헤드 믹서를 사용하여 0.01N HCl, pH 2의 1 L 중에 용해되었다. 상기 용액 중 고형 콜라겐 스폰지의 결여에 의해서 입증되는 바와 같이, 상기 콜라겐이 충분히 용해된 후에 (1600 rpm에서 적어도 1시간 혼합), 상기 용액의 pH를 7.2로 올리기 위해서 111.1 mL의 200 mM의 소듐 포스페이트 (pH가 소듐 히드록시드에 의해서 11.2로 조정됨)가 첨가되었다.

수득된 콜라겐 용액이 10분 동안 교반되고, 상기 콜라겐의 중량으로 2%인, 0.1 ml의 20% Relugan GTW (BASF) 가교제 용액, 태닝제 용액이 첨가되었다.

상기 가교된 콜라겐 피브릴 용액으로, 5 ml의 20% Tanigan FT (Lanxess)가 첨가되고, 1시간 동안 교반되었다. Tanigan-FT 첨가 이후에, 1 g의 엑스판셀 미크로스피어 (콜라겐의 중량의 10%임) 461 WE 20 d36 (AkzoNobel), 40 ml (콜라겐의 중량의 80%임)의 트루포솔 벤 (Trumpler) 및 2 ml (콜라겐의 중량의 10%임)의 PPE 화이트 HS a pa (Stahl)가 첨가되고, 오버헤드 교반기를 사용하여 부가의 시간 동안 교반되었다.

상기 용액의 pH가 10%의 포름산을 사용하여 4.0으로 감소되고, 하이카 레진 (Hycar Resin) 26552 (Lubrizol)의 다양한 제공이 첨가되고, 부가의 1시간 동안 교반되었다. pH 변화 및 레진 첨가 이후에, 150 ml의 상기 용액이, -27 mmHg의 압력으로 진공 펌프에 부착된 부흐너 깔대기를 사용하여 90 mm Whatman No.1 멤브레인을 통해서 여과되었다. 활성화를 촉진하기 위해서, 상기 하이카 레진 26552가 상기 피브릴 용액과 혼합되고, 50 ℃에서 2시간 동안 가열되었다.

상기 농축된 피브릴 조직이 그 후에 주위 조건하에 건조되고, 상기 물질을 롤링, 벤딩 및 풀링에 의해서 30분 동안 핸드 스테이크되어서, 레더-유사 물질이 제조되었다. 상기 레진의 첨가로 하기 도 1에 도시된 바와 같이 기계적 특성을 향상시켰다.

Relugan은 폴리머, 레진 또는 알데히드에 기반한 재태닝제이다. Tanigan은 술폰계 신탄이다. Truposol Ben은 크롬 프리 레더 (chrome-free leather)용 가지제이다. Lipoderm Liquor A1은, 수중 하이카 레진 26552에서 장쇄 알콜, 파라핀, 음이온성 계면활성제에 기반한 가지제: 포름알데히드 프리 아크릴계 에멀젼이다.

설명의 해석

본원에서 사용된 용어는 특정 구현예들을 서술하기 위한 목적이고, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 예를 들어, 본원에서 사용되는, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 상기 문맥에서 달리 명시되지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 "포함한다 (comprises)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"이라는 용어는 명시된 특성들, 단계들, 작업들, 요소들 및/또는 성분들의 존재를 나타내지만, 그 하나 이상의 다른 특성들, 단계들, 작업들, 요소들, 성분들 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다는 것을 더 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는 (and/or)"은 관련된 열거된 항목들의 어느 것 및 그 하나 이상의 모든 조합을 포함하고, "/"로 약칭될 수 있다.

공간적으로 관련된 용어, 예컨대 "아래 (under)", "밑 (below)", "더 낮은 (lower)", "위 (over)", "더 높은 (upper)" 등이, 상기 도면에서 개시된 바와 같이 다른 요소(들) 또는 특성(들)에 대한 하나의 요소 또는 특성의 상관관계를 서술하기 위한 설명의 용이함을 위해 본원에 사용될 수 있다. 상기 공간적으로 관련된 용어가 도면에 도시된 배향 뿐만 아니라 사용 또는 작업에서 장치의 상이한 배향을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 도면에서 장치가 반전된 경우, 다른 요소 또는 특성 "아래" 또는 "밑"으로 기재된 요소들이 그 후에 다른 요소 또는 특성"위"에 배향될 수 있다. 그러므로, 상기 예시되는 용어 "아래 (under)"는 위와 아래의 배향을 모두 포함할 수 있다. 상기 장치는 달리 배향될 수 있고 (90도 회전 또는 다른 배향으로), 본원에 사용된 상기 공간적으로 관련된 서술어가 그에 따라 해석될 수 있다. 유사하게, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "상향 (upwardly)", "하향 (downwardly)", "수직 (vertical)", "수평 (horizontal)" 등이 설명의 목적을 위해 본원에서 사용된다.

용어 "제1 (first)" 및 "제2 (second)"는 다양한 특성/요소 (단계들을 포함)를 설명하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 특성/요소는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 상기 용어들에 의해 제한되어서는 안된다. 이들 용어는 하나의 특성/요소를 다른 특성/요소와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하기에 토의되는 제1 특성/요소는 제2 특성/요소로 지칭될 수 있고, 유사하게, 하기에 토의된 제2 특성/요소는 본 발명의 교시를 벗어나지 않고 제1 특성/요소로 지칭될 수 있다.

본 명세서 및 하기 청구 범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다 (comprise)" 및 변형, 예컨대 "포함된다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"은, 다양한 성분들이 방법 및 물품 (예컨대, 조성물 및 장치를 포함하는 기구 및 방법)에 함께-결합하여 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어 "포함하는 (comprising)"은 임의의 명시된 요소들 또는 단계들을 포함하지만, 임의의 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않는다는 것이 이해될 것이다.

실시예에서 사용된 것을 포함하여, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 달리 명시적으로 특정되지 않는 한, 모든 숫자는 단어가 "실질적으로 (substantially)", "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"으로 시작하는 것처럼, 상기 용어가 명확하게 나타나지 않았더라도 판독될 수 있다. 용어 "실질적으로 (substantially)", "실질적으로 없는 (substantially no)", "실질적으로 존재하지 않는 (substantially free)", "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"이, 개시된 상기 값 및/또는 위치가 값들 및/또는 위치들의 합리적인 기대 범위내에 있는 것을 나타내기 위해서, 크기 및/또는 위치를 서술할 때 사용될 수 있다. 예를 들면, 수치는 상기 명시된 값 (또는 수치들의 범위)의 +/- 0.1 %, 상기 명시된 값 (또는 값들의 범위)의 +/- 1 %, 상기 명시된 값 (또는 값들의 범위)의 +/- 2 %, 상기 명시된 값 (또는 값들의 범위)의 +/- 5 %, 상기 명시된 값 (또는 값들의 범위)의 +/- 10 % 등인 값을 가질 수 있다. 본원에 인용된 임의의 수치 범위는 여기에 포함된 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다.

특성 또는 요소가 본원에서 다른 특성 또는 요소의 "상에 (on)" 있다고 언급될 때, 다른 특성 또는 요소 상에 직접 있을 수 있거나, 또는 개재된 특성 및/또는 요소가 또한 존재할 수 있다. 대조적으로, 특성 또는 요소가 다른 특성 또는 요소 "상에 직접적으로 (directly on)"있다고 언급될 때, 개재된 특성 또는 요소가 존재하지 않는다. 또한, 특성 또는 요소가 다른 특성 또는 요소에 "연결된 (connected)", "부착된 (attached)" 또는 "결합된 (coupled)" 것으로 언급될 때, 다른 특성 또는 요소에 직접 연결, 부착 또는 결합될 수 있거나, 또는 개재된 특성 또는 요소가 존재할 수 있다. 그에 반해서, 특성 또는 요소가 다른 특성 또는 요소에 "직접 연결된 (directly connected)", "직접 부착된 (directly attached)" 또는 "직접 결합된 (directly coupled)" 것으로 언급될 때, 개재된 특성 또는 요소가 존재하지 않는다. 하나의 구현예와 관련하여 서술 또는 개시되었지만, 그렇게 서술 또는 개시된 특성 및 요소는 다른 구현예들에 적용될 수 있다. 또한, 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 다른 특성에 "인접하여 (adjacent)" 배치된 구조 또는 특성에 대한 참조가 상기 인접하는 특성에 중첩되거나 또는 하위에 있는 부분을 가질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

다양한 서술되는 구현예들이 전술되었지만, 청구범위에 개시된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 구현예에 대해서 다수의 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 다양한 개시된 방법 단계들이 수행되는 순서는 대안의 구현예에서 종종 변경될 수 있고, 다른 대안의 구현예에서, 하나 이상의 방법 단계가 모두 스킵될 수 있다. 다양한 장치 및 시스템 구현예의 선택적 특성이 일부 구현예들에 포함될 수 있고, 다른 구현예에는 포함되지 않을 수 있다. 그러므로, 전술한 설명은 주로 예시되는 목적으로 제공되며, 청구범위에 개시된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 포함된 실시예 및 설명은 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예를 개시하고 설명하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 전술한 바와 같이, 본 명세서의 범위를 벗어나지 않고 구조적 및 논리적 대체 및 변경이 이루어질 수 있도록 다른 구현예가 이로부터 이용되고 유도될 수 있다. 본 발명의 주제의 이러한 구현예는 임의의 단일 발명 또는 사실상 하나 이상이 기재되었다면, 발명의 개념으로 본 출원의 범위를 자발적으로 제한하고자 하는 의도 없이 편의상 단지 "발명"이라는 용어로 개별적으로 또는 집합적으로 언급될 수 있다. 그러므로, 특정 구현예가 본원에 개시되고 서술되었음에도 불구하고, 동일한 목적을 달성하도록 계산된 임의의 배열이 개시된 특정 구현예에 대해서 대체될 수 있다. 본 명세서는 다양한 구현예의 임의 및 모든 개조 또는 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 구현예들의 조합 및 본원에 구체적으로 개시되지 않은 기타 구현예들은 상기 명세서를 검토하면 당업자에게 명백할 것이다.

참조에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은, 각 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로 본원에 포함되고, 특히 참조에 의한 포함이 나타나는 명세서의 동일한 문장, 문단, 페이지 또는 절에서 나타나는 서술이 참조될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Modern Meadow, Inc. <120> METHOD FOR MAKING A BIOFABRICATED MATERIAL CONTAINING COLLAGEN FIBRILS <130> 500564WO <150> US 62/295,435 <151> 2016-02-15 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1463 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1463) <223> collagen alpha-1(I) chain precursor <400> 1 Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu Glu Gly Gln Glu 20 25 30 Glu Asp Ile Pro Pro Val Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His 35 40 45 Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Val Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp 50 55 60 Asn Gly Asn Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Cys Pro Asn Ala Lys Val Pro Thr Asp Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro 85 90 95 Glu Gly Gln Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly 100 105 110 Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala 145 150 155 160 Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Ile Ser Val 165 170 175 Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly 195 200 205 Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro 210 215 220 Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro 225 230 235 240 Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly 245 250 255 Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu 260 265 270 Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro 275 280 285 Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly 290 295 300 Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala 305 310 315 320 Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr 325 330 335 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly 340 345 350 Glu Gly Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val 355 360 365 Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala 370 375 380 Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro 405 410 415 Ser Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser 420 425 430 Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly 435 440 445 Glu Pro Gly Pro Thr Gly Ile Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu 450 455 460 Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly 485 490 495 Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala 500 505 510 Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro 515 520 525 Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly 530 535 540 Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln 545 550 555 560 Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala 565 570 575 Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly 580 585 590 Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro 595 600 605 Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala 610 615 620 Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly 625 630 635 640 Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys 645 650 655 Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser 660 665 670 Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly 675 680 685 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn 690 695 700 Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln 705 710 715 720 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly 725 730 735 Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala 740 745 750 Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile 755 760 765 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 770 775 780 Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp 785 790 795 800 Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro 805 810 815 Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly 820 825 830 Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro 835 840 845 Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Ala Arg 850 855 860 Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly 865 870 875 880 Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro 885 890 895 Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Ser Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr 900 905 910 Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 915 920 925 Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ala Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala 930 935 940 Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val 945 950 955 960 Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly 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Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1175 1180 1185 Gly Pro Pro Ser Gly Gly Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Pro Gln Pro 1190 1195 1200 Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp 1205 1210 1215 Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr 1220 1225 1230 Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu 1235 1240 1245 Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met 1250 1255 1260 Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn 1265 1270 1275 Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu 1280 1285 1290 Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln 1295 1300 1305 Lys Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Glu Lys Arg His Val 1310 1315 1320 Trp Tyr Gly Glu Ser Met Thr Gly Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly 1325 1330 1335 Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe 1340 1345 1350 Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His 1355 1360 1365 Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met 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