通过选择性解聚作用从植物生物质产生化学构建块

发明背景

由于石化石油化工资源的全球限制，从可再生资源产生生物源 (biobased)化学构建块(Chemical Building Blocks)近年来吸引 了日益增加的关注。用于产生此类生物源化学制品的优选原料来源于 可再生植物生物质(Kamm等人，2006)。

目前生物源产品的制造方法主要利用来自食物和饲料市场例如 油、糖和淀粉的底物。大部分第一代原料是明确确定的化学组合物并 具有低结构复杂性。此外，可以以相对高的纯度(只具有少量的伴随 污染物)获得此类底物。虽然它们的用途在技术上和经济上都很吸引 人，但它们的持续大规模供给并不可靠，因为第一代原料在生物源化 学工艺方法中的使用与它们在食品工业中空前增加的全球需求发生激 烈的竞争。

上述第一代原料的可替代的底物来源于低成本的森林副产品和 构成植物材料的不用作食物来源的农业废物。这些指定的第二代原料 的实例是来自农业活动的残留植物材料例如玉米秸杆和小麦秆以及各 种木材相关废料。该木质纤维素生物质(Lignocellulosic Biomass) (LCB)与第一代生物原料的区别在于其复杂的化学和结构组成。LCB的 主要成分是高度聚合的材料例如纤维素(大约35-50％w/w)、半纤维 素(大约20-35％w/w)和木质素(大约10-25％w/w)。蛋白质、脂质 和其他化合物在大多数LCB原材料中构成极小的部分(Saha，2005)， 但可以以更大的量存在于特殊农业废物例如来自油料生产的残渣中。 因为LCB由多种化学上不同的成分组成，因而其下游加工在技术方面 是很困难的，这反过来限制了目前基于LCB的生物工艺的经济可行性。

技术问题

为了通过经济上可行的基于LCB原料的生物工艺生产有价值的化 学物质和构建块，重要的是(i)回收和精炼其不同化学成分的大部分和 (ii)以足够的纯度生产它们。与不同的和高度聚合的组成LCB的实体 相比，其有利的加工产物是低分子量的。原则上，可从LCB的所有成 分产生经济上吸引人的产品：从纤维素产生的葡萄糖是用于产生高价 值化学中间产物例如山梨醇的通用起始材料。源于LCB的半纤维素级 分的戊糖例如木糖和阿拉伯糖是高价值低营养且非产热型甜味剂例如 木糖醇和阿拉伯糖醇的起始材料。可水解来自LCB的蛋白以产生对映 体纯(enantiopure)L-氨基酸。木质素可用作酚类化合物的来源，从 而替代由石油化学工艺产生的芳族物质。对于第二代原料的应用，目 前的技术限制主要与它们复杂的化学组成相关。

使用LCB的大多数现有方法集中在底物的纤维素部分。当使用其 他成分时，通常通过非选择性的处理步骤例如在单个处理步骤中使用 硫酸水解所有半纤维素的预处理来水解它们。此类非选择性加工步骤 的产物通常具有较低的商业价值并且在一些情况下具有负商业价值。

用于生物乙醇的发酵生产的近来实施的logen工艺在200-250℃ 下使用稀释的酸蒸气预处理来调动LCB的半纤维素级分，该级分包含 不同的己糖和戊糖的混合物。在分开的酶步骤中，将不溶的纤维素级 分水解成己糖(葡萄糖)。在半纤维素和纤维素级分液化后，将不溶 的木质素固体与渣(marsh)物理分离，然后燃烧，从而产生用于剩余 LCB级分的下游处理的能量。将合并的纤维素和半纤维素级分在单个 步骤中发酵以产生生物乙醇。然后通过蒸馏从发酵液中回收所得的乙 醇。因为大部分商购可得的用于发酵方法的有机体(即面包酵母 (baker′s yeast)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisise))不能 利用戊糖，所以LCB的这些成分，当以纯的形式存时虽然具有重要的 商业价值，但在该方法中仍然与剩余的废渣一起被抛弃(Lawford和 Rousseau，2003)。

最近，一直尝试使LCB的戊糖级分可用于发酵转变成生物乙醇。 在该经修正的方法设计中，在预处理步骤后，将被液化的半纤维素级 分与LCB的剩余成分分离。当如之前所述处理所有剩余的LCB级分时， 特别地在分开的发酵步骤中使用具有利用戊糖的能力的经基因工程改 造的微生物(即经基因工程改造的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Lawford和Rousseau，2003；Lynd等人，2005)来有效地 将液化的和条件化的半纤维素转变成生物乙醇。随后将所得的发酵渣 添加入常规工艺物料流以回收生物乙醇。虽然来自复杂戊糖混合物的 生物乙醇产品似乎是有商业价值的，但己糖、戊糖和木质素至高价值 产品和化学构建块的选择性加工是利用LCB成分的吸引人的可替代的 途径。

所有目前使用的预处理方法的一个固有问题是组成LCB成分的不 同化学构建块的同时和非选择性水解和释放(Saha，2005)。目前，商 业上使用的和经济上可行的预处理方法使用剧烈的化学或物理处理， 其可包括在提高的温度下进行的酸或碱处理的组合(Ramos等人， 2005)。所得的LCB水解产物包含多种通过LCB构建块的化学修饰衍生 的不希望的副产品。此类污染物的存在通常阻碍产物的下游酶促催化 过程或全细胞发酵(Saha，2005)，从而严重地降低了通过此类方法从 LCB产生的产物流的商业价值。

因此，本发明背后的技术问题是提供用于从可再生植物生物质产 生化学构建块的方法。

特别地，技术问题是提供用于从LCB产生有价值的化学构建块的 方法，该方法避免了现有技术的不利方面和缺点。

发明概述

根据第一方面，本发明提供了用于未处理的聚合物原料的酶处理 的处理方法，其包括步骤：(a)用酶系统处理未处理的聚合物原料以从 未处理的聚合物原料释放确定的单体构建块或寡聚构建块和(b)将步 骤a)中产生的确定的单体构建块或寡聚构建块与未处理的聚合物原 料的残余物分离。

根据优选方面，在溶剂(液体介质)中进行步骤a)和b)。优选， 在其中(未处理的)聚合物原料不溶于其中，即在其中其不以溶解的 形式存在的溶剂存在的情况下，处理(未处理的)聚合物原料。因此， (未处理的)聚合物原料优选是不溶的未处理的聚合物原料。溶剂优 选是水性溶剂。更优选，酶步骤a)可从未处理的聚合物原料释放可溶 的单体构建块或寡聚构建块，所述构建块在溶剂中是可溶的，从而可 溶解于其中。根据更优选方面，步骤a)中产生的可溶的(溶解的)确 定的单体构建块或寡聚构建块与不溶的(不溶解的)未处理或已处理 的聚合物原料的残余物的分离(步骤b)可通过固体-液体分离来获得。 可使用用于固体-液体分离的任何常规方法，包括过滤或离心法。

根据另一个优选方面，本发明包括由步骤a)和步骤b)或一系列 顺序处理步骤组成的单一整合处理，其中重复步骤a)和步骤b)至少一 次。在各处理步骤中，通过连续加入特定的酶系统，然后将可溶的单 体产物或寡聚产物与聚合物原料的不溶的残余物分离来从不溶未处理 或已处理的聚合物原料产生可溶的单体产物或寡聚产物。可使用用于 固体-液体分离的任何常规方法，包括过滤或离心法。

根据优选方面，在每一个处理步骤a)中从未处理或已处理的聚合 物原料释放的确定的单体构建块或寡聚构建块是一种选自下面表1的 左栏的特定“产物”。换句话说，通过使用具有相同产物的酶系统或 酶系统的组合，在每一个处理步骤a)中从未处理或已处理的聚合物原 料只释放一种特定的单体或聚合物构建块。表1中列出酶的此类组合 的实例。

根据本发明的一个优选方面，已令人惊讶地发现，(充足)量的 木质素的存在在本发明的方法是有益的。因此，从酶促处理步骤获得 的产物流的选择性和因而纯度可因木质素在聚合物原料中的存在而意 外地增加。观察到的酶促选择性的改变可归因于在木质素存在的情况 下改变的表面性质，然而，本发明不限定于该假设的理论机制。

因此，根据优选实施方案，未处理的聚合物原料包含至少1重量 ％木质素，优选至少3重量％木质素，更优选至少5重量％木质素。 如果未处理的聚合物原料包含至少10重量％木质素，优选至少20重 量％木质素，则获得特别有利的结果。原料中存在的木质素的量可通 过本领域技术人员已知的方法来测定。根据一个实施方案，可根据A. Sluiter等人，″Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass″，LAP，Technical Report NREL/TP-510-42618， January 2008中指出的方法计算木质素含量。根据另一个实施方案， 可根据Hsu等人，Journal of Animal Science，1987.65：pp.244-255 for acid detergent lignin(ADL)中指出的方法计算木质素含量。

与上述令人惊讶的发现相符，根据本发明的另外优选方面，在本 发明的方法中不进行木质素降解酶处理步骤。同样，进一步优选地在 步骤(a)和(b)或它们的重复过程中不减小计算为聚合物原料的总组 成的重量％的聚合物原料中木质素的含量。可按如上所概述的，测定 木质素含量。

根据本发明的特别有利的方面，本发明的处理方法在步骤a)之前 包括至少一个用于将可溶性成分与未处理或已处理的(不溶的)聚合 物原料分离(除去)的处理步骤(“预处理步骤”)。因此，该步骤 在未处理或已处理的聚合物原料的酶促处理之前进行。已发现，通过 此类用于从未处理或已处理的聚合物原料除去可溶性成分的预处理步 骤，可令人惊讶地增加后续的酶促处理步骤的效率。下面进一步论述 此类预处理步骤的优选条件。

根据优选实施方案，在预处理步骤中使用与用于下列酶促处理步 骤a)的相同或相似的溶剂(液体介质)。优选在与下列酶促处理步骤 a)相同的温度下和更优选在更高的温度下进行用于除去可溶性物质的 各个预处理步骤以增加提取效率。更优选地，在与下列酶促处理步骤 相比更高的温度和压力(高压锅原理)但在缩短的处理时间下进行使 用预处理步骤的可溶性提取。再次地，未处理或已处理的聚合物原料 优选不溶于所使用的溶剂，而待除去的成分溶于其中。优选通过常规 固体-液体分离法将可溶性成分与不溶的未处理或已处理的聚合物原 料分离。

根据本发明的另一个实施方案，可在至少两个预处理步骤的多步 骤循环(stepwise cycle)中重复在步骤a)之前用于从(未处理或已 处理的)聚合物原料除去可溶性成分的各个处理步骤。在优选实施方 案中，利用不同的溶剂组成、温度和时间分布进行所述循环以增加可 溶性提取的效率。

预处理步骤可包含本文中定义的一个或多个物理-化学预处理步 骤和/或一个或多个清洗步骤。

在本发明中，根据一个优选方面已发现，鉴于通过使用选择性催 化处理步骤从复杂的天然底物例如LCB产生化学纯的较高附加值的基 础化学物质和化学构建块方面，在使用酶系统进行确定的处理后经释 放的(可溶性)单体构建块或寡聚构建块从(不溶的)未处理或已处 理的聚合物原料的分离提供了显著的有利方面。此类选择性催化方法 步骤从复杂的聚合物原料释放确定的化学单体成分或寡聚成分，通过 处理步骤产生的产物中的其他污染物的量较低。在LCB的水解中提供 这样的特异性和选择性的优选技术方案是选择性酶促步骤的使用。基 础化学物质可用作常规石油化学加工中的起始材料以及新型化学和生 物化学合成途径中的起始材料的替代物，从而具有极高的商业价值。

下面更详细地描述另外的优选方面和实施方案。

定义

术语“未处理的聚合物原料”是指以不同质量比混合的通常来源 于植物材料的不同的不溶的聚合物底物例如碳水化合物、聚脂类、多 肽、多核苷酸和聚类苯丙烷(phenylpropanoid)的复杂混合物。除了这 些不溶的聚合物底物外，未处理的聚合物原料通常还包含可溶性单体 成分或寡聚成分。未处理的聚合物原料包括但不限于来自森林、农业 和食品加工业的废物以及市政废物。当主要聚合物是纤维素和木质素 时，此类未处理的聚合物原料称为“未处理的木质纤维素原料”或“木 质纤维素生物质”或“LCB”。来自农业活动的未处理的木质纤维原料 包括但不限于小麦秆、玉米秸杆、瘤胃畜粪肥(rumen animal manure)、 甘蔗渣(sugarcane bargass)、甜菜浆和草本材料如柳枝稷、Sericea Lespedeza Serala和高丹草(Sorghum sudan grass)。森林来源的 废物包括但不限于木材树皮、木屑和废木料。来源于食品工业的木质 纤维原料包括但不限于果浆、龙舌兰属植物(agave)的完整残余物、 咖啡残渣和榨油工厂废料例如菜子饼和工厂废水。来源于纸浆与造纸 工业的未处理的原料包括但不限于造纸废渣(paper sludge)和造纸 工厂废水。来源于市政废物的未处理的原料包括但不限于废纸、蔬菜 残渣和水果残渣。

本文中使用的术语“已处理的聚合物原料”表示在至少一个酶促 处理步骤(步骤a)后未处理的聚合物原料(的残余物)。

术语“清洗步骤”将表示为了从不溶的聚合物原料提取可溶性成 分而使用至少一种溶剂进行的未处理或已处理的聚合物原料的任何预 处理步骤，其不修饰或改变聚合物原料本身的结构。

术语“物理化学处理步骤”是指为了从不溶的聚合物原料提取可 溶性成分而进行的未处理或已处理的聚合物原料的任何预处理步骤， 包括修饰或改变聚合物原料本身的结构。

术语“聚合物底物”是指由以线性或部分分支的分子结构共价连 接在一起的特定的单体成分或有限种类的确定的单体成分组成的物 质。未处理的木质纤维原料的不溶的级分包含显著量的此类聚合物底 物例如纤维素、木聚糖、甘露聚糖和半乳糖体。此外，还包含聚合物 底物例如木质素、阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸木聚糖(glucoronoxylan)、 葡甘露聚糖和木葡聚糖。

术语“酶系统”是指能够将多聚或寡聚底物催化转化成更小的寡 聚或单体成分(构建块)的蛋白性质的实体。除了使用单种酶从聚合 物底物产生单体产物或寡聚产物外，术语酶系统还包括包含多种酶的 混合物，所述酶通过协同或平行作用从聚合物原料产生确定的单体产 物或寡聚产物。因此，术语“酶系统”和“酶混合物”在本文中可互 换使用并且这两者可分别包括一种或多种酶或酶活性。

术语“单体构建块或寡聚构建块”是指通过使用酶系统从未处理 的聚合物原料释放的单体产物或寡聚产物。“寡聚的”应当包括具有 两个或更多个单体单元的化合物。

术语酶的“酶促活性”是指酶在适当的条件下的催化活性，在所 述条件下，酶用作将特定聚合物底物或人工底物转变成特定寡聚产物 或单体产物的蛋白质催化剂。

术语“污染性酶促活性”描述了所使用的酶系统的酶促活性，其 导致除所期望的寡聚产物或单体产物之外的寡聚产物或单体产物，所 述所期望的产物是根据酶系统所期望的(主要的或第一)酶促活性产 生的。

术语“人工底物”是指在将人工底物与酶系统接触后，在人工底 物的物理化学性质上产生可测量的变化的通常低分子量的物质，所述 变化与选择的酶系统的活性相关。所述物理化学性质和在将它们与酶 系统接触后产生物理化学性质的此类变化的人工底物对于本领域技术 人员来说是已知的，其包括但不限于可用分光光度计测量的吸收或荧 光发射性质的变化、通过液相或气相色谱仪测定的色谱迁移度的变化 以及通过质谱分析测定的分子量的变化。

用于酶、酶系统以及可测量的反应产物的适当的人工底物列于下 面的表2中。

术语“释放”是指通过物理、化学或催化方法例如水解、氧化或 还原解聚作用进行的不溶的聚合物底物至可溶性单体产物或寡聚产物 的转化。

发明详述

概述

本发明根据第一方面包括用于从未处理的聚合物原料产生基础 化学物质或化学构建块的单一的整合处理过程或一系列顺序处理步 骤。在各处理步骤中，通过将未处理或已处理的聚合物原料与特定的 酶系统接触，从不溶的未处理或已处理的聚合物原料产生可溶性单体 产物或寡聚产物，所述酶系统优选基本不含产生除了期望的反应产物 (单体或聚合构建块)外的物质的酶促活性，然后将可溶的单体构建 块或寡聚构建块与不溶的未处理或已处理的聚合物原料分离。

根据优选实施方案，所述方法包括在单一整合处理之前或与其结 合时或在前述段落中定义的一系列顺序(酶促)处理步骤的一个或多 个步骤之前和当与其结合时，将可溶性成分与(不溶的)聚合物原料 例如LCB分离。

根据本发明的另一个优选实施方案，在酶促处理步骤之前的可溶 成分与(不溶的)未处理的聚合物原料的初次分离包括至少一个物理 化学预处理步骤，然后进行固体-液体分离。所述物理化学处理步骤可 包括但不限于将未处理的聚合物原料与溶剂在升温和/或加压下一起 温育和/或将未处理的聚合物原料与化学物质接触。此类化学物质包括 但不限于所述稀或浓的酸或碱。优选，在1-13的pH，更优选2-5或 8-11的pH下进行所述物理化学预处理。根据进一步优选的实施方案， 将物理化学预处理与一个或多个清洗步骤结合，优选，目的为进一步 减少未处理的聚合物原料中的可溶性成分。

根据优选的实施方案，本文中定义的预处理步骤在范围为20至 210℃，优选在50-175℃的温度下进行。各个单独的预处理步骤的压 力范围可在1至300巴的范围内，优选在1至100巴的范围内。预处 理步骤的优选持续时间取决于未处理或已处理的聚合物原料的组成并 且可在数秒至1周的范围内。最优选，各个单独预处理步骤的处理时 间可以不超过1小时。

酶促处理步骤之前的所述清洗步骤包括使用至少一种溶剂，优选 至少一种水性溶剂进行的至少一个清洗步骤。最优选但非限定性地是 水或含水缓冲液。优选地，在进行清洗步骤之后接着进行固体-液体分 离。根据一个实施方案，清洗步骤在酶或催化剂不存在的情况下进行。

在本发明的优选实施方案中，用于各个预处理步骤特别是清洗步 骤的液体介质包含不同浓度的无机盐和/或其他化学成分，其可影响介 质的离子强度、pH和/或疏水性以增加优选在各酶促处理步骤之前和 之后可溶材料的可提取性。优选地，用于单个预处理步骤的液体介质 的特征为pH 1-13。优选，用于单个预处理步骤的液体介质包含无机 酸、碱和盐例如氯化氢、硫酸、铵、氯化钠、氢氧化钠、硫酸铵、磷 酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、硫酸钠和/或有机缓冲剂成分例 如甘氨酸、甘油和/或用于疏水改性的Triton-X 100。优选，用于单 个预处理步骤的液体介质的离子强度在相当于0.1-10M的硫酸钠(离 子强度1～1.7-170)的范围内。在另一个优选实施方案中，液体介质 不含不与水混溶的任何有机溶剂和/或化合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，各个清洗步骤使用不同时 间、温度和压力分布，用不同的溶剂组成对未处理或已处理的聚合物 原料重复施用，以使特定的可溶成分的提取最大化。

在本发明的优选实施方案中，设计至少一个在未处理的聚合物原 料的酶促处理之前的物理化学预处理步骤用于(主要)从未处理的聚 合物原料除去木质素、树脂和/或蛋白质成分。优选，使用具有大于1 的离子强度(I)的液体介质，而在另一个优选实施方案中，所有随后 的预处理步骤，特别是清洗步骤都使用具有比起始物理化学预处理步 骤中更低的离子强度的液体介质进行。

用于分离可溶和不溶成分的方法对于本领域内技术人员来说是 已知的，其包括处理步骤例如沉淀、倾析、过滤、微滤、超滤、离心、 挥发性产物的蒸发，和使用有机或无机溶剂进行的提取。根据优选实 施方案，预处理步骤包括使用水性溶剂、有机溶剂或这些溶剂的任何 组合或混合物，优选使用乙醇或甘油进行的处理。

根据本发明的优选实施方案，酶促处理在水性介质中进行，从未 处理或已处理的聚合物原料释放的确定的单体构建块或寡聚构建块在 水性介质中是可溶的，根据上面步骤b)的分离通过在水性介质中可溶 性构建块与不溶的未处理或已处理的聚合物原料的固体-液体的分离 来进行。

构成聚合物原料的主要成分的聚合物底物、它们的单体或寡聚降 解产物(构建块)以及用于从包含在未处理或已处理的聚合物原料中 的各聚合物底物产生基本上纯的产物的酶系统的相关实例列于下面的 表1中。

在本发明的处理步骤中，聚合物底物的化学构建块如半纤维素、 纤维素、木质素、葡聚糖、蛋白质和脂质通过将聚合物原料与特定的 酶系统接触来释放。各个原料成分生成基本上纯的可溶产物的酶促分 解基于底物特异性酶制剂的应用，所述酶制剂，根据优选实施方案， 在各个处理步骤中基本上不含释放除了期望的产物外的其他成分的活 性。

未处理的聚合物原料的组成的确定

用于本文中描述的方法的未处理的原料的分子组成可通过对于 本领域技术人员来说是已知的方法来确定。例如，木质纤维素材料的 组成可使用热分解、气相色谱和质谱法的组合来确定。描述用于确定 LCB  成分的可能的分析方法的方法库列于： http://www1.eere.energy.gov/biomass/analvtical procedures.html#samples。

根据一个实施方案，包括几个物理和酶促反应步骤的标准方法可 用于基于获得的反应产物对聚合物原料的组成进行经验性地定量化。

关于常用的原料，列举最常用的原料种类的质量比的数据库可见 于：http://www1.eere.energy.gov/biomass/feedstock databases.html。

在分析原料成分的举例说明中，首先必须在可进行进一步分析之 前将未处理的聚合物原料部分水解。

在原料水解之前，应当将未处理的原料样品(1g)置于坩埚中并且 在50℃下进行干燥直至获得恒重。将干重记录至小数点后3位，从而 获得样品的烘干重(ODW)。

关于水解方法，将1g磨细的原料(2μm)置于压力管(pressure tube)中，加入3ml 72％v/v硫酸。将压力管置于30℃的水浴中并 且温育1小时。使用搅拌棒，必须在不将样品移出水浴的情况下，每 隔5至10分钟搅拌一次样品。搅拌对于确保酸在颗粒上的均匀分布是 必需的。通过使用滴定管添加84ml重蒸(d.d.)水将酸稀释至4％，样 品通过试管的数次翻转以消除相分离进行混合。

为了测定原料中不溶于酸的木质素级分，将经高压灭菌的水解溶 液通过之前称重的滤埚进行真空过滤。

将滤液收集在吸滤瓶中，然后将50ml的等份转移入样品储存瓶。 该样品将用于随后测定木质素和碳水化合物含量的步骤中。可溶于酸 的木质素的测定必须在6小时的水解之内进行。

为了测定不溶于酸的木质素，添加重蒸水以定量地将所有剩余的 不溶物从压力管转移入滤埚。不溶的物质必须用最小量50ml重蒸水冲 洗，然后必须将坩埚和不溶于酸的残渣在105℃下干燥4小时或直至 获得恒重。在温育后，从烘箱中取出样品，然后在干燥器中冷却。在 将坩埚和残渣于575℃下的烘炉中放置24小时之前，必须记录坩埚和 干燥残渣的重量“w2”，直至最接近0.1mg。

从炉中小心取出坩埚并且将其直接转移入干燥器，冷却至与坩埚 的初始冷却时间相等的特定时间段。称取坩埚和灰分的重量(重量 “w3”)，然后将其重置于炉内直至获得恒重。就剩余的灰分(“w3”) 修正的重量“w2”等于未处理的原料中包含的不溶于酸的木质素的重 量。

与获得不溶于酸的木质素的量所需的复杂测量相比，可溶于酸的 木质素的量可容易地通过分光光度计测量来测定。首先在选择的分光 光度计上用4％v/v硫酸水溶液进行背景测量。使用初始水解液，测 量320nm处和通常在198nm左右的滤液水解产物的最大吸光率处的吸 光率。必要时必须稀释样品以产生范围为0.7-1.0A单位的吸光率。 按照下列算式，使用保留至小数点后3位的样品的吸光率来计算存在 于样品中的可溶于酸的木质素(ASL)的量：

％ASL＝(UVabs*体积滤液*稀释因子)/(e*ODW样品)*100

ODW＝未处理的原料样品的烘干重

UVabs＝样品在320nm的平均UV-可见吸光率

体积滤液＝水解滤液的体积

E＝在样品的最大吸光率下的生物质水解液的消光系数(大量未 处理的聚合物原料的消光系数的数值可见于 http://www1.eere.energy.gov/biomass/analytical procedures.html#samples)。

通过使用基于HPLC的方法，样品水解液还可用于测定原料的半 纤维素级分中包含的结构性碳水化合物。

该测定首先需要针对各D-纤维二糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿 拉伯糖和甘露糖的校准混合物。制备的各糖标准品的浓度应当在0.1 至4mg/ml范围内。对于各组校准用标准，应当制备落在校准曲线的验 证范围的中间段(即2.5mg/ml)的独立的校准确认标准(CVS)。应当 在各校准设定之后和在整个分析顺序，包括样品组中，每隔一定的时 间通过HPLC分析CVS。CVS用于验证各次测定的校准曲线的质量和稳 定性。

将在初始步骤中样品水解后获得的20ml水解液转移入50ml锥形 瓶。加入碳酸钙，将样品中和至pH 5-6，在溶液沉降后，倾析出上清 液。在沉降后，溶液将具有大致中性的pH。

糖校准用标准CVS和样品即可用于使用配备有适当的保护柱的 Shodexsugar SP0810(Phenomenex)或AminexHPX-87P(BioRad) 柱进行的HPLC分析。

取决于浓度和检测器的检测限，样品注射体积应当在10和50μl 之间。以0.6ml/分钟的流速和80℃的柱温用重蒸水洗脱样品。样品洗 脱可使用折光率检测法最好地监控。

在分析之前应当对色谱图进行积分，以及应当参照各糖成分的适 当的标准曲线来测定每种糖的含量。

酶系统

在本文描述的实施方案中，定制施用的酶混合物的特异性以获得 来源于不同聚合物底物种类的纯单体产物流(确定的单体或聚合构建 块)。

在本发明的优选实施方案中，施用于具体的未处理或已处理的聚 合物原料的酶系统可包含不超过50％的其他酶促活性，所述其他酶促 活性可从指定的聚合物原料产生除优选产物以外的产物。

在本发明更优选的实施方案中，施用于未处理或已处理的聚合物 原料的酶系统混合物可包含不超过(或少于)20％，优选不超过(或 少于)10％，更优选不超过(或少于)5％，更优选不超过(或少于)2 ％，最优选不超过(或少于)1％的其他酶促活性，所述其他酶促活性 可从指定的聚合物原料产生除了优选产物外的产物。

其他酶促活性的百分比可使用用于测定各种酶活性的标准方法 常规测定。因此，存在于酶系统中的导致从未处理或已处理的聚合物 原料释放期望的确定的单体或聚合构建块的“主要”酶活性应当达到 至少50％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，更 优选至少98％，更优选至少99％，基于存在于酶系统中的所有酶活性 计。

酶活性可根据本领域技术人员已知的和本文中描述的标准方法 进行测定。

根据一个优选实施方案，上述百分比可通过根据上述步骤a)用酶 系统处理未处理的聚合物原料，并分析在根据步骤b)从不溶的未处理 的聚合物原料固体-液体分离后释放的可溶的单体构建块或寡聚构建 块，来简单地测定。因此，如果释放的单体构建块或寡聚构建块包含 超过50mol-％的特定的期望的构建块(基于总固体含量)时，存在于酶 系统中的其他酶活性被认为低于50％。类似地，如果释放的单体构建 块或寡聚构建块包含超过80、90、95、98或99mol-％的特定的所期 望的构建块时，存在于酶系统中的其他酶活性被认为分别低于20、10、 5、2或1mol-％。相应地，存在于酶系统中并且导致从未处理的聚合 物原料释放期望的确定的单体构建块或寡聚构建块的“主要”酶活性 在该情况下被认为达到至少50％，优选至少80％，更优选至少90％， 更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％，基于存在于 酶系统中的所有酶活性计。根据进一步的实施方案，在酶活性的百分 比的上述测定中，用“重量％”替代“mol-％”。

根据一个实施方案，酶活性可通过测量经选择的如以上定义的聚 合物底物的转化率来测定。在可替代的实施方案中，存在于酶系统中 的酶活性可通过使用人工底物来测定。取决于使用的检测方法的方便 性和可靠性，可测量底物本身的转化或者可替代地测量由于酶促催化 反应而引起的特定产物的形成。在特殊情况下，酶本身(例如，氧化 还原酶)的催化中间体可通过分光光度计测量来检测。

经配制的酶混合物的酶促活性试验对于本领域技术人员来说是 已知的。用于特定性酶活性的适当试验库列于： http://www.sigmaaldrich.com/Area of Interest/Biochemicals/Enzyme Explorer/ Key Resources/Assay Library/Assays by Enzyme Name.html。

用于测定特定酶种类的酶活性的特定试验的实例列于下面。

在具体情况下，可在0.5ml的含有10mM CaCl2、4mM对-硝基苯 基-β-D-纤维二糖糖苷和200μl稀释的酶溶液的50mM MES(pH 6)反 应缓冲液中测量内切-和外切-纤维素活性(exo-cellulose activity)。然后应当将反应在50℃下温育30分钟。加入甘氨酸缓 冲液(100mM，pH 4)来终止反应。然后可以通过用分光光度计在430nm 处测量所释放的对-硝基苯基的量来测定酶促活性。使用硝基酚的微摩 尔数与吸光率相关的标准图将对硝基苯酚的吸光率值转变成硝基酚的 微摩尔数。一个单位的纤维素酶活性是在测定的条件下每分钟释放1 μmol的对-硝基苯酚所需的酶的量(Wood，T.M.和Bhat，K.，1988)。

在另一个具体情况下，可在1ml含有4-100μM的4-硝基苯基- α-L-呋喃阿拉伯糖苷(pNP-Araf)和稀释的酶溶液(4nM-8μM)的50mM 磷酸钠(pH 7)中测定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。可在37℃下温育反应， 在400nm处测量所释放的4-硝基苯酚的量。可使用4-硝基苯酚在 400nm处的消光系数10500M-1cm-1计算酶活性(Taylor等人，2006)。

在另一个具体情况下，可使用邻-硝基酚取代的-β-D-木吡喃糖 苷(ONP-β-D-木吡喃糖苷)作为底物来测定木糖苷酶活性(Chen等人， 1986)。在100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5)中制备底物原液(10mM)。在重 蒸水中制备待测的稀释的酶溶液。包含等摩尔量的底物和酶溶液的反 应于25℃和pH 9.8下在200mM硼酸盐缓冲剂中进行。为了测定酶活 性，通过分光光度计在410nm的波长处测量记录邻-硝基酚的释放。酶 的以单位/mg表示的酶活性与邻-硝基酚的释放量成比例并且可如对 于纤维素酶的活性所描述的那样进行计算。

在另一个具体的情况下，使用愈创木酚氧化测定法测定漆酶活 性。在50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.3，40℃)中新鲜配制10mM愈创木 酚的原液。反应在使用10μl稀释的酶原液(1-3nM)和不同量的底物 (5-20μl)在2ml 50mM柠檬酸盐缓冲液中进行。然后通过分光光度计 在465nm处测量愈创木酚的氧化速度。可使用愈创木酚氧化产物的消 光系数5200M-1cm-1测定愈创木酚氧化速度(Smirnov等人2001)。

在另一个具体的情况下，可通过向含有0.5μM/ml MnP和5-200 μM Mn2+的反应混合物中加入100μM H2O2来在50mM酒石酸盐缓冲液(pH 3，25℃)中测量锰过氧化物酶(MnP)活性。通过分度光度计在238nm 处测量以监测Mn3+的形成(Kmaitisuji等人，2005)。

为了确定用于产生期望的产物的特定酶系统(如表1中所列的) 是否包含来自从相同或不同聚合物底物产生不同的不希望的产物的任 何其他酶系统(如表1中所列的)的不希望的活性，人们可通过使用 上述任何方法，如上所述，使用特定的聚合物底物或人工底物测试该 活性。

例如，如果怀疑表1中所列的包含纤维素酶的特定酶系统包含不 希望的木糖苷酶活性(如表1中所列的)，则可首先使用人工纤维素 底物测定在加入确定量的酶系统后在单位时间内释放的葡萄糖的量来 测试主要的纤维素酶活性。一旦测定了制剂的纤维素酶活性后，就可 通过将酶系统与人工木聚糖底物接触，随即测量在单位时间内由确定 量的酶释放的木糖的量来就木糖苷酶活性检测相同的酶制剂。通过测 量使用确定的酶量，利用纤维素酶和木糖苷酶底物，在确定的时期内 的相对转化率，可计算对于各底物种类的特异活性。

用于测定表1中所列的任何酶促活性的底物列于表2中。

在可替代的实施方案中，测定酶系统是否包含任何独立的污染性 酶活性的方法是通过方法例如电泳或色谱分离所述制剂的成分。可使 用特定的方法例如比色染色法(colorimetric staining)或通过吸光 率进行的成分检测或本领域技术人员已知的其他方法来检测制剂的单 个成分。蛋白质成分的相对百分比分布可使用定量方法例如光密度测 定法或本领域技术人员已知的任何其他等效方法，结合适当的数学计 算来测定。

顺序的确定

在从未处理或已处理的聚合物原料释放确定的单体产物或寡聚 产物(构建块)所需的系列酶促处理步骤之前，优选通过一个或多个 预处理步骤分离未处理的聚合物原料的可溶成分。

在本发明的优选实施方案中，在酶促处理之前分离未处理或已处 理的聚合物原料的可溶成分的预处理步骤是至少一个物理化学预处理 步骤和一个或多个清洗步骤的组合。根据本发明的另一个优选实施方 案，在酶促处理之前从未处理或已处理的聚合物原料分离可溶性成分 的清洗步骤优选使用亲水溶剂，优选水性溶剂例如水来进行。如上面 所提及的，已发现清洗步骤和物理化学预处理步骤提高后续酶促处理 步骤的效率。

根据进一步优选的实施方案，只在未处理的聚合物原料的第一酶 促处理步骤(步骤a)之前使用物理化学预处理步骤。可在未处理的 聚合物原料的第一酶促处理步骤(步骤a)之前将此类物理化学预处 理步骤与至少一种清洗步骤结合。更优选，已处理的聚合物原料的预 处理步骤只包含至少一个清洗步骤但无进一步的物理化学预处理步 骤。

用于聚合物原料的物理化学预处理步骤可包括但不限于热水提 取、低温蒸汽爆破法、酸蒸汽爆破法、氨蒸汽爆破法和超声处理。它 们可用于物理改性未处理的聚合物底物以增加植物纤维的表面可及度 并且减少纤维素级分的结晶度(Puls等人，1985；Ramos等人，2005； Kinley等人，2005)。优选，上面提及的预处理步骤以使底物更易于 进行后续的酶促步骤的方式改变未处理的聚合物底物结构的物理性 质，但释放有限量的或不释放其化学构建块。此外，在将未处理的聚 合物原料与酶系统接触之前，它们可用于进一步除去未处理的聚合物 原料中包含的可溶性物质以防止该酶步骤的产物被原料中包含的可溶 性物质污染。

当顺序使用两个或更多个处理步骤时，这些处理步骤的顺序和从 而添加表1中所述的酶混合物的顺序取决于所使用的未处理的聚合物 原料的特定组成。以使酶催化剂的剂量和成本以及导致期望的产物释 放的原料接触时间最少的方式选择处理步骤和酶系统的顺序。此外， 经选择的顺序步骤应当使从聚合物底物释放的单体或寡聚反应产物的 纯度以及收益率最优化。因而处理步骤的顺序是原料和产物依赖性的。

根据本发明的一个优选实施方案，用于第一酶促步骤a)的酶或酶 系统选自根据表1的释放葡萄糖的酶或酶系统，确定的可溶的单体构 建块或寡聚构建块是葡萄糖，用于第二酶促步骤a)的酶或酶系统选自 根据表1的释放木糖的酶或酶系统，并且各确定的可溶的单体构建块 或寡聚构建块是木糖。

根据本发明的另一个优选实施方案，用于第一酶促步骤a)的酶或 酶系统选自根据表1的释放木糖的酶或酶系统，并且确定的可溶的单 体构建块或寡聚构建块是木糖，用于第二酶促步骤a)的酶或酶系统选 自根据表1的释放葡萄糖的酶或酶系统，并且各确定的可溶的单体构 建块或寡聚构建块是葡萄糖。

根据一个优选实施方案，将特定原料分解成其单元成分所必需的 酶处理的特定顺序可凭经验来确定，即使原料组成是未知的。因此， 可能在分开的处理步骤中用多种酶的混合物将未处理的聚合物原料降 解成表1中所列的不同产物。对于每一个处理步骤，所得的产物流的 纯度和组成通过使用本领域技术人员已知的分析方法来测量，所述分 析方法包括但不限于之前描述的用于分析原料组成和用于测定酶促活 性的光谱和色谱法。

使用这些测量的结果，则可能选择产生最纯的产物流的动力学上 有利的酶混合物作为第一原料处理步骤。在重复清洗由该特定酶处理 引起的不溶的残余物后，再用另外的多种酶的混合物(除了选择用于 初次处理的酶混合物以外)处理残余物。对于所有此类酶处理，通过 之前描述的方法来测定所得的产物组成。选择导致最纯的产物流的酶 混合物作为特定原料的第二处理步骤。再一次充分清洗来源于第二处 理的剩余的不溶的材料，然后再次用上述所有剩下的酶系统进行试验。 分析性地测定和选择由表1中的每一个剩余的酶混合物产生的最纯的 产物流的该方法优选重复进行，直至原料被完全分解或至在重复的酶 处理后剩余的不溶的原料残渣不能为操作者提供较大的经济增益(与 进一步处理的选择的成本相比较)后为止。

根据本发明的一个优选方面，选择这样的酶系统进行根据步骤a) 的第一酶促处理步骤，所述酶系统在用酶系统处理未处理的聚合物原 料和将确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块与未处理的聚合物原料 的残余物(已处理的聚合物原料)分离后产生最高纯度的确定的可溶 的单体构建块或寡聚构建块。

根据本发明的进一步的优选方面，选择用于根据步骤a)的第二酶 促处理步骤的第二酶系统是这样的酶系统，该酶系统在用该酶系统处 理已处理的聚合物原料(作为残余物从之前的酶促处理步骤获得的) 并且将确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块与未处理的聚合物原料 分离后产生最高纯度的确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块。

根据本发明的还进一步的优选方面，以不断减小在用相应的酶系 统处理已处理的聚合物原料(从之前的酶处理步骤获得的)，然后从 已处理的聚合物原料分离确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块后获 得的确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块的纯度的顺序进行任何后 续的酶处理步骤。

在另一个选择中，在酶促处理选择的顺序选择之前，原料的组成 通过前述分析方法来确定。因此，根据本发明的优选实施方案，通过 首先分析未处理的聚合物原料来确定待使用的酶系统和它们的使用顺 序。

本发明的一个这样的优选实施方案涉及方法，特别是确定待使用 的酶系统和它们的使用顺序的方法，其中，优选在将可溶性组分与上 述未处理的聚合物底物分离之后，将不溶的未处理的聚合物原料

(a)首先在分开的酶促处理中用多种酶系统(混合物)例如表1 中所列的每一个(优选选自从聚合物原料释放可溶的单体糖构建块或 寡聚糖构建块的酶系统)进行处理；

(b)对于每一个酶促处理，优选在将(可溶性)确定的单体构建 块或寡聚构建块与(不溶的)未处理的聚合物原料进行固体-液体分离 后，对从未处理的聚合物原料释放的确定的单体构建块或寡聚构建块 进行确定的单体构建块或寡聚构建块的纯度分析；

(c)选择产生最高纯度的酶系统进行根据权利要求1的步骤a)的 第一酶促处理步骤；

(d)任选地，对未处理或已处理的聚合物原料的残余物重复进行 步骤a)至c)的顺序以确定用于后续的酶促处理步骤的酶系统。

在可替代的实施方案中，在将可溶性成分与上述未处理或已处理 的聚合物原料分离后，将表1中所列的选择性酶混合物用于靶向为原 料组成提供最大质量比的原料成分。在酶促处理后，必须如之前对于 原料成分的分析测定所描述的那样测定所得的产物流的纯度。根据优 选实施方案，期望的纯度是使超过总固体含量的75重量％，优选超过 90重量％，更优选超过95重量％，更优选超过99重量％(优选，可 溶性级分)由确定的单体构建块或寡聚构建块组成的纯度。

如果最大质量的原料成分的酶促分解导致纯产物流(如上定义 的)，则该处理可用作原料处理的第一步骤。清洗所得的不溶的渣和 随后颗粒与上清液的固体-液体分离以备用于下一处理步骤。用特定的 酶系统，例如表1中所列的酶系统处理来源于初次原料处理的剩余的 不溶的物质，所述酶系统靶向构成原料组成的次级的大质量比的原料 成分。再一次，所得的产物流必须通过所述分析方法分析以在经选择 的酶促处理可被确认为用于原料处理的第二处理选择之前确定产物的 纯度。然后如之前所述清洗和处理第二酶促处理所得的不溶的残渣。 通过用表1中所列的特定酶系统(所述酶系统总是靶向构成由之前的 酶促处理循环产生的剩余的不溶的原料残渣中的最大质量比的成分的 聚合物底物)进行反复的处理，可顺序地将原料分解成其单元成分。

本发明的进一步的优选方面涉及方法，特别是确定待使用的酶系 统和它们的使用顺序的方法，其中，优选在如上所述将可溶性成分与 未处理的聚合物原料分离后，将不溶的未处理的聚合物原料

(a)首先在分开的酶促处理中用多种酶系统(混合物)例如表1 中所列的每一个(优选选自从聚合物原料释放可溶的单体糖构建块或 寡聚糖构建块的酶系统的)进行处理以确定在未处理的聚合物原料中 提供最大质量比的单体构建块或寡聚构建块；

(b)优选在与未处理的聚合物原料分离后，对在未处理的聚合物 原料中提供最大质量比的确定的单体构建块或寡聚构建块进行纯度分 析；

(c)如果所测定的纯度是使超过总固体含量的75重量％，优选超 过90重量％，更优选超过95重量％，更优选超过99重量％由确定的 单体构建块或寡聚构建块组成的纯度，则选择各酶系统来进行根据权 利要求1的步骤a)的第一酶促处理步骤；

(d)如果根据步骤b)确定的纯度低于根据步骤c)所需的纯度，则 相应地，优选在与(不溶的)未处理的聚合物原料固体-液体分离后， 对在未处理的聚合物原料中提供次级的大质量比的单体构建块或寡聚 构建块进行纯度分析，直至纯度满足根据步骤c)的要求，并且选择各 酶系统进行根据权利要求1的步骤a)的第一酶促处理步骤；

(e)任选地，对未处理或已处理的聚合物原料的残余物重复进行 步骤a)至d)的顺序以确定用于后续酶促处理步骤的酶系统。

本发明的进一步的优选的方面涉及方法，特别是确定待使用的酶 系统和它们的使用顺序的方法，其中对未处理的聚合物原料：

a)首先在分开的酶促处理中用多种酶系统(混合物)例如表1中 所列的每一个(优选选自从聚合物原料释放可溶的单体糖构建块或寡 聚糖构建块的酶系统的)进行处理以确定导致未处理的聚合物原料中 包含的单体构建块或寡聚构建块的最高产量的酶促处理；

(b)选择产生具有超过总固体的75重量％，更优选超过90重量 ％，更优选超过95重量％，更优选超过99重量％(优选在与不溶的 未处理或已处理的聚合物原料分离后)的纯度的确定的单体产物或寡 聚产物的这些酶促处理；

(c)在剩下的酶促处理当中，确定具有最高的单体产物或寡聚产 物的产量的处理；

(d)任选地对未处理或已处理的聚合物原料的残余物重复进行步 骤a)至c)的顺序，以确定用于后续的酶促处理步骤的酶系统。

根据本发明的另外的优选方面，以与可根据上述确定待使用的酶 系统的方法获得的顺序一致的顺序使用用于酶促处理步骤的酶系统。

根据本发明的另一个优选方面，关于已在上面论述了其应用的有 利顺序的确定的酶系统包括或由从(未处理的)聚合物原料释放可溶 的单体糖构建块或寡聚糖构建块的酶组成。根据本发明的进一步优选 的实施方案，各酶和酶系统是具有涉及寡聚糖或多糖的降解的(主) 活性和/或从未处理或已处理的聚合物原料释放可溶的单体糖构建块 或寡聚糖构建块的酶和酶系统。

根据一个实施方案，为了确定在酶温育后，在确定的可溶的单体 构建块或寡聚构建块与(剩余的不溶的)未处理或已处理的聚合物原 料分离后，在具体的酶处理中获得的确定的可溶的单体构建块或寡聚 构建块(产物)的产量或纯度，以10.000g离心水解悬浮液(具有酶 和聚合物原料)15分钟。如下文中的实施例中所述处理上清液(其包 含确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块)，并且将其经历HPAE-PAD 分析(Dionex，Ca.，USA，6)以确定其糖和糖醛酸组成。

如上所提及的，根据本发明的优选方面，使用的酶系统应当含有 很低的或基本上不含有其他或污染性酶活性，所述其他或污染性酶活 性从未处理或已处理的聚合物原料释放除期望的单体构建块或寡聚构 建块外的单体构建块或寡聚构建块。

因此，根据优选实施方案，用于具体酶促处理步骤的酶系统包含 不超过50％，优选不超过20％，更优选不超过10％，更优选不超过5 ％，更优选不超过2％，更优选不超过1％的污染性(其他)酶促活性， 所述酶促活性未曾用于之前的使用不同酶系统的酶促步骤中或可引起 未曾在之前的酶促处理步骤中释放的其他确定的单体构建块或寡聚构 建块的释放，或根据一个进一步的实施方案，只可引起从起初基本上 不存在于聚合物原料中的聚合物底物中释放产物。可如上所示计算其 他或污染性酶活性在酶系统中的百分比。“基本上不存在”，根据优 选实施方案，是指少于总聚合物原料的20重量％，优选少于10重量 ％，优选少于5重量％，优选少于2重量％，优选少于1重量％。

然而，根据本发明的有利的和优选实施方案，用于具体酶促处理 步骤的酶系统包含一种或多种这样的酶促活性作为污染性酶促活性， 所述这样的酶促活性已用于之前的使用不同酶系统的酶促处理步骤， 或者，根据进一步的实施方案，只可引起从起初基本上不存在于未处 理或已处理的聚合物原料中的聚合物底物的其他单体构建块或寡聚构 建块的释放。换句话说，已发现，当特定的单体构建块或寡聚构建块 之前已在之前的酶促处理步骤中从未处理或已处理的聚合物原料释放 (或从一开始就不存在于未处理的聚合物原料)时，用于后续步骤的 酶系统不必基本上不含在之前的任何酶促处理步骤中用作主活性的相 应的酶活性。该实施方案的一个有利方面是不太纯、从而成本不太高 的酶系统可用于第二和后续的酶促处理步骤。

在这样的处理的特定情况下，在于之前的处理步骤中酶促处理纤 维素，随后除去产物葡萄糖后，在一个处理步骤中进行木聚糖至木糖 的酶促转化。因此，表1中指定用于将木聚糖处理为木糖的酶混合物 还可包含任何污染性酶促活性，该酶促活性对于纤维素的处理是特异 性的。

此外，根据本发明的进一步的优选实施方案，用于具体的未处理 或已处理的聚合物原料的成分的处理的酶系统可包含污染性(其他) 酶活性，如果它们作用于由之前的酶促反应产生的特定反应中间体以 及如果最终的终产物相同的话。换句话说，本发明的进一步的优选实 施方案涉及其中用于具体酶促处理步骤的酶系统具有主酶促活性(如 上所述的)并且包含至少一种额外的酶促活性的方法，所述额外的酶 促活性导致从未处理或已处理的聚合物原料，特别是从存在于未处理 或已处理的聚合物原料中的不同聚合物底物产生与酶系统的主酶促活 性产生的相同的确定的单体构建块或寡聚构建块。

在特定的情况下，未处理的聚合物底物包含纤维素和淀粉(直链 淀粉)，并且各处理步骤中的目的产物是葡萄糖。此时，可允许表1 中指定的用于纤维素的转化(纤维素活性)的酶混合物被伴有表1中 指定的用于淀粉的转化(淀粉酶活性)的副活性污染。因此，除了淀 粉酶活性外，酶系统不得包含高于某一比例的其他酶活性。此处，用 于不同酶促反应的离析物可以不同但在各情况下产物都是葡萄糖。

根据一个优选实施方案，原料是富含纤维素-木聚糖的原料，用 于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放葡萄糖的酶 或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是葡萄糖，以 及用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放木糖的 酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是木糖。在 该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系统选自：来自黑 曲霉(A.niger)或来自里氏木霉(T.reesei)的β-葡糖苷酶；来自里氏 木霉的纤维二糖水解酶I-II；来自里氏木霉的β-1-4-D-葡聚糖内切 酶，并且用于第二步骤a)的酶或酶系统选自：来自黑曲霉或里氏木霉 或热纤梭菌(C.thermocellum)的木聚糖内切酶；来自黑曲霉或里氏 木霉的木糖苷酶。

根据另一个优选实施方案，原料是富含纤维素-木聚糖的原料， 用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放木糖的酶 或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是木糖，以及 用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放葡萄糖的 酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是葡萄糖。 在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系统选自：来自 黑曲霉或来自里氏木霉或热纤梭菌的木聚糖内切酶；来自黑曲霉或里 氏木霉的木糖苷酶；以及用于第二步骤a)的酶或酶系统选自：来自黑 曲霉或里氏木霉的β-葡糖苷酶；来自里氏木霉的纤维二糖水解酶 I-II；来自里氏木霉的β-1-4-D-葡聚糖内切酶I-V。

根据另一个优选实施方案，原料是富含阿拉伯聚糖-果胶的原料， 用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放阿拉伯糖 的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是阿拉伯 糖，以及用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放 糖醛酸的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是 糖醛酸。在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系统选 自：来自黑曲霉的阿拉伯糖内切酶；来自黑曲霉的阿拉伯岩藻糖苷酶 (arabinofucosidase)，以及用于第二步骤a)的酶或酶系统选自： 来自针尾曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉或日本纤维弧菌(C.japonicus) 的果胶酶(果胶酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶)。

根据另一个优选实施方案，原料是富含阿拉伯聚糖-果胶-纤维素 的原料，用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放 阿拉伯糖的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块 是阿拉伯糖，用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的 释放葡萄糖的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建 块是葡萄糖，以及用于第三酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表 1的释放糖醛酸的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚 构建块是糖醛酸。在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或 酶系统选自：来自黑曲霉的阿拉伯糖内切酶；来自黑曲霉的阿拉伯岩 藻糖苷酶，用于第二步骤a)的酶或酶系统选自：来自黑曲霉或来自里 氏木霉的β-葡糖苷酶；来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I-II；来自 里氏木霉的β-1-4-D-葡聚糖内切酶I-V，以及用于第三步骤a)的酶或 酶系统选自：来自针尾曲霉、黑曲霉或日本纤维弧菌的果胶酶(果胶酸 裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶)。

根据另一个优选实施方案，原料是富含半乳聚糖-果胶的原料， 其中用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放半乳 糖的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是半乳 糖，以及其中用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的 释放糖醛酸的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建 块是糖醛酸。在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系 统选自：来自黑曲霉或来自热纤梭菌的半乳糖内切酶；来自黑曲霉或 脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)的β-半乳糖苷酶，以及用于第二步骤 a)的酶或酶系统选自：来自针尾曲霉、黑曲霉或日本纤维弧菌的果胶 酶(果胶酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶)。

根据另一个优选实施方案，原料是富含甘露聚糖-木聚糖的原料， 用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放甘露糖的 酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是甘露糖， 以及用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放木糖 的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是木糖。 在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系统选自：来自 黑曲霉或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、海栖热袍菌(T.maritima) 或来自里氏木霉的甘露聚糖内切酶；来自粪肥纤维单胞菌的外切甘露 糖苷酶；以及用于第二步骤a)的酶或酶系统选自：来自黑曲霉或里氏 木霉或热纤梭菌的木聚糖内切酶；来自黑曲霉或里氏木霉的木糖苷酶。

根据另一个优选实施方案，原料是富含甘露聚糖-纤维素的原料， 用于第一酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放甘露糖的 酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是甘露糖， 以及用于第二酶促处理步骤a)的酶或酶系统选自根据表1的释放葡萄 糖的酶或酶系统，并且确定的可溶的单体构建块或寡聚构建块是葡萄 糖。在该实施方案中，更优选，用于第一步骤a)的酶或酶系统选自： 来自黑曲霉或枯草芽孢杆菌、海栖热袍菌或来自里氏木霉的甘露聚糖 内切酶；来自粪肥纤维单胞菌的外切甘露糖苷酶；以及用于第二步骤 a)的酶或酶系统选自：来自黑曲霉或来自里氏木霉的β-葡糖苷酶；来 自里氏木霉的纤维二糖水解酶I-II；来自里氏木霉的β-1-4-D-葡聚 糖内切酶I-V。

下列是本发明的另外的优选实施方案，所述实施方案指出了取决 于所使用的未处理的聚合物原料的性质或组成的酶促处理步骤的顺 序。

1.对于富含木聚糖/纤维素的原料(例如麦秆)，即具有＞10重 量％木聚糖、＞10重量％纤维素和＜15重量％阿拉伯聚糖的原料，优选 使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)木聚糖解聚/降解

2.)纤维素解聚/降解

2.对于富含阿拉伯聚糖/果胶的原料(例如甜菜)，即具有＞15 重量％阿拉伯聚糖、＞10重量％果胶、＜10重量％纤维素和＜10重量％ 木聚糖的原料，优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)阿拉伯聚糖解聚/降解

2.)果胶解聚/降解

3.对于富含阿拉伯聚糖/果胶/纤维素的原料，即具有＞15重量％ 阿拉伯聚糖、＞10重量％果胶、＞10重量％纤维素和＜10重量％木聚糖 的原料，优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)阿拉伯聚糖解聚/降解

2.)纤维素解聚/降解

3.)果胶解聚/降解

4.对于富含阿拉伯聚糖/木聚糖/果胶/纤维素的原料，即具有 ＞15重量％阿拉伯聚糖、＞10重量％木聚糖、＞10重量％果胶和＞10重 量％纤维素的原料，优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)阿拉伯聚糖解聚/降解

2.)木聚糖解聚/降解

3.)纤维素解聚/降解

4.)果胶解聚/降解

5.对于富含半乳聚糖/果胶的原料(例如马铃薯果胶半乳聚糖)， 即具有＞10重量％半乳聚糖、＞10重量％果胶、＜15重量％阿拉伯聚糖 和＜10重量％木聚糖的原料，优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)半乳聚糖解聚/降解

2.)果胶解聚/降解

6.对于富含甘露聚糖/木聚糖的原料，即具有＞15重量％甘露聚 糖、＞10重量％木聚糖、＜15重量％阿拉伯聚糖和＜10％纤维素的原料， 优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)木聚糖解聚/降解

2.)甘露聚糖解聚/降解

7.对于富含甘露聚糖/木聚糖/阿拉伯聚糖的原料(例如咖啡豆 外壳)，即具有＞15重量％甘露聚糖、＞10重量％木聚糖、＞15重量％ 阿拉伯聚糖和＜10重量％纤维素的原料，优选使用下列顺序的酶促处 理步骤：

1.)阿拉伯聚糖

2.)木聚糖解聚/降解

3.)甘露聚糖解聚/降解

8.对于富含半乳聚糖的原料(例如落叶松木材阿拉伯半乳聚糖； 瓜尔豆半乳甘露聚糖)，即具有＞10重量％半乳聚糖、＜10重量％果胶 和＜10重量％木聚糖的原料，优选使用下列顺序的酶促处理步骤：

1.)半乳聚糖解聚/降解

2.)木聚糖或阿拉伯聚糖，取决于原料的组成

3.)甘露聚糖解聚/降解

9.对于富含甘露聚糖/纤维素的原料(例如魔芋葡甘聚糖)，即 具有＞15重量％甘露聚糖、＞10重量％纤维素、＜10重量％木聚糖、＜10 重量％半乳聚糖和＜15重量％阿拉伯聚糖的原料，优选使用下列顺序 的酶促处理步骤：

1.)甘露聚糖解聚/降解

2.)纤维素解聚/降解

在优选情况下，使用的所述酶混合物必须基本上不含可导致所得 的产物流污染的特定酶促活性。

在其中葡萄糖是目的产物并且未处理的聚合物原料包含纤维素 作为聚合物底物(例如小麦秆)的另一个特定情况下，使用纤维素酶 的酶混合物。表1中指定了有用的酶混合物。可将此类纤维素酶混合 物与表1中所列的β-糖苷酶、葡糖水解酶(glucohydrolases)和α- 或β-淀粉酶结合使用以将未处理的聚合物原料的纤维素级分转化成 单体葡萄糖单元。为了获得葡萄糖的纯产物流，用于纤维素级分的酶 混合物必须不含任何半纤维素活性，其包括但不限于阿拉伯呋喃糖苷 酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶 和木糖苷酶的酶活性。在该酶促处理中，聚合纤维素将被转化成可溶 性葡萄糖单元，可如上所述将其与不溶的原料分离。可进一步处理剩 余的不溶的材料，从而由半纤维素级分产生不同的戊糖。

在其中阿拉伯糖和木糖是目的产物并且未处理的聚合物原料包 含聚合物底物(其含有异质半纤维素聚合物例如阿拉伯木聚糖)的另 一个特定情况下，首先使用表1中指定的用于分支阿拉伯糖单元的转 化和调动的酶混合物。然后，在将表1中指定的第二酶混合物用于调 动木聚糖聚合物中包含的木糖单元之前，将可溶性阿拉伯糖单元与剩 余的不溶的原料分离。然后还将可溶性木糖单元与剩余的不溶的原料 分离。

可将酶促处理步骤与一个或多个预处理步骤结合。此类预处理步 骤对于提取低商业价值的组分(否则该组分将会污染处理产生的高价 值产物流)可以是非选择性的。因此，根据一个实施方案，一个或多 个预处理步骤用于提取或另一方面除去确定的成分。可替代地，可使 用在溶解未处理的聚合物底物的单个化学成分中为酶促处理步骤提供 相当的选择性的一个或多个选择性预处理步骤。因此，根据一个实施 方案，施用一个或多个预处理步骤以增加后续的酶促处理步骤的选择 性。此类处理步骤的实例是通过有机溶剂例如乙醇或甘油溶解LCB的 木质素级分(Itoh等人，2003；Demirbas，A.，1998)。此类单个的预 处理步骤和条件对于本领域技术人员来说是已知的。在另外的可替代 方案中，所述非选择性的预处理步骤用于不溶的残余物，其通过进行 之前的选择性处理步骤，已不含污染物。这样的处理步骤的实例是在 通过上述选择性处理步骤选择性溶解LCB的半纤维素、纤维素和木质 素级分后，通过酸处理进行的蛋白质级分的完全水解。

图1中给出了本发明的实施方案的另一个特定实例。因此，图1 显示了用于LCB的顺序酶促处理的工艺流程。

在富含纤维素、半纤维素和木质素并且具有少量蛋白质和脂质的 底物如小麦秆、玉米秸杆或软木材的处理的该举例说明(参见图1) 中，通过使用分别特异性释放木糖、阿拉伯糖和甘露糖的木聚糖酶、 阿拉伯糖酶和甘露聚糖酶进行顺序处理来实现半纤维素级分中包含的 不同戊糖成分的溶解。适当的酶和用于提供酶的最佳处理条件的处理 条件对于本领域技术人员来说是已知的。在每一个处理步骤后除去可 溶性级分，并将不溶的物质与后续的酶接触。在处理戊糖级分后，补 充相似的处理步骤，以通过使用纤维素外切酶和纤维素内切酶的混合 物将纤维素转化成葡萄糖，任选地与纤维二糖酶或β-葡糖苷酶组合以 从LCB底物的纤维质级分释放葡萄糖和纤维二糖来。通过上清液从反 应混合物中除去这些可溶性反应产物。类似地，使用特定的酶系统例 如漆酶和木质素过氧化物酶将剩余在不溶的相中的木质素级分转化成 其不同的酚构建块。然后通过上清液或通过溶剂提取从反应混合物提 取这些酚类和寡聚酚(oligophenolic)化合物。实施该处理步骤的处 理条件对于本领域技术人员来说是已知的。可在酶应用的每一个连续 轮次之后分离由半纤维素、纤维素、木质素或其他LCB成分的酶促转 化而产生的每一单种产物(参见图1)。然后将所得的基本上纯的酚类 化合物、戊糖和己糖化学构建块进一步加工成高价值的商业产品(参见 图1)。一般说来，根据一个实施方案，将从未处理或已处理的聚合物 原料释放的确定的单体构建块或寡聚构建块进行纯化和任选地进一步 处理。

在另一个举例说明中，可将富含蛋白质和脂质的农业废物例如来 自油菜籽、向日葵或橄榄油的生产的废物随后与上述半纤维素和纤维 素以及任选地果胶酶接触，然后将该处理步骤的残余物与非特异性的 蛋白酶接触。此类非特异性蛋白酶对于本领技术人员来说是已知的并 且可大规模生产。蛋白酶处理使氨基酸和肽从聚合物原料中溶解。随 后可将此类氨基酸和肽用作混合物或通过本领域技术人员已知的方法 分离成单种物质。

在一个情况下，目的产物是阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、寡聚类苯 丙烷(oligophenylpropanoid)、单木质醇(monolignol)和/或单 酚(monophenolics)，这些产物可通过利用顺序酶促转化将未处理的 聚合物原料小麦秆转化成其组成成分来产生。

在此类顺序处理的第一步骤中，将具有大约5％w/w的含水量的 磨细的小麦秆(1kg wt，0.2μm)置于不锈钢容器中。加入最少21量的 水，将其与原料混合。让所得的浆状物在室温下浸泡4小时。除去过 量液体，留下大约200ml的溶液。密封容器，然后在常规的高压灭菌 器系统中于10bar的压力下加热1小时至121℃(Puls等人，1985； Harms，1989；Foody等人，1998)。快速释放容器压力，让内容物冷 却至室温。在这些条件下，聚合状态的原料成分减少，但只有极小部 分的成分以可溶性形式释放。通过过滤、筛分或离心方式分离所得的 液相(包含盐和少量不同的可溶成分)和不溶相(包含不溶的聚合物底 物例如纤维素、半纤维素和木质素)，然后进一步处理不溶相。

在下一个步骤中，为了调动不溶的半纤维素级分中包含的阿拉伯 糖组分，使用α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的混合物。所有下面提及的反应 都在具有pH 5-7的50mM磷酸盐缓冲液中于最低40℃下进行24小时。 加入0.08-1g来自热纤梭菌的GH 51α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶/kg原料 来水解阿拉伯聚糖和木聚糖的α-1，2/1，3-阿糖呋喃糖基部分(Taylor 等人，2006)。随后，加入0.08-1g来自特异腐质霉(Humicola insolen) 的GH43α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶/kg原料来水解α-1，5-阿糖呋喃糖 基单元(Sorensen等人，2006)。由于酶混合物的特异性，所得的液相 主要包含阿拉伯糖。通过过滤或离心将释放的和可溶的阿拉伯糖单元 与不溶的渣分离。保留剩下的不溶的级分以进行进一步加工。

在下一步骤中，为了将不溶的木聚糖成分转化成可溶性木糖单 元，使用木聚糖酶和木糖苷酶的混合物。所有反应都在50mM具有pH 5-7的磷酸盐缓冲液中于最低40℃下进行24小时。加入0.08-1g来自 特异腐质霉的1，4-β-木聚糖内切酶(GH10或11)/kg原料和0.08-1g 来自里氏木霉的β-木糖苷酶(GH 3)/kg原料以分别释放寡聚木糖和木 糖(xylanose)单元。由于酶混合物的特异性，所得的液相主要包含 木糖。通过过滤或离心将可溶性木糖与不溶的原料残余物分离。

在下一步骤中，为了调动残留在半纤维素和纤维质级分中的己 糖，将各不溶的物质与包含纤维素内切和外切酶的最优化的酶混合物 接触。所有反应都在50mM醋酸钠缓冲液(pH 5-6)中于最低50℃下进 行16小时。加入来自里氏木霉的各0.005-1g的1，4-β-葡聚糖内切 酶(Ce15A，Ce17B，Ce112A，Ce161A)和1，4-β-纤维二糖水解酶(Ce17A， Ce16A)的混合物/kg不溶的原料以调动己糖(Irwin等人，1993，Kim 等人，1998)。纤维素至单体糖的转化的效率和动力学任选地通过每 kg原料加入0.0005-0.01g来自黄孢原毛平革菌(Phanerocaete chrysosporium)的纤维二糖脱氢酶与0.05-1g亚铁氰化物和 0.0005-0.1g来自黑曲霉的β-糖苷酶(10％wt酶混合物)组合来增 强(Igarashi等人，1998，Rosgaard等人，2006)。由于酶混合物的 特异性，所得的液相主要包含己糖，主要由葡萄糖组成。进一步通过 过滤或离心将此类物质与原料的细颗粒残余物分离。

在下一步骤中，通过与木质素过氧化物酶和漆酶系统的顺序接触 将在之前的酶处理后剩余的不溶的木质素转化成其组成成分。在最低 50mM的酒石酸钠(pH 3.5)中和在最高32℃的温度下进行与木质素过氧 化物酶的反应。通过与各0.5-1g的来自黄孢原毛平革菌的木质素过氧 化物酶(LIP)/kg原料接触来氧化分解高度聚合的木质素不溶的物质 (Ward等人，2003)。为了防止由于过量的H 2O2在反应混合物中的存在 而导致的LIP的催化失活(Compound III formation，Wariishi和Gold 1990)，将产H2O2的可溶性酶促系统用于为H2O2的形成提供受控且连续 的环境。可使用乙二醛氧化酶(GLOX)(Kersten 1990)的产H2O2能力， 所述乙二醛氧化酶是与木质素过氧化物酶协同作用的天然辅酶 (accessory enzyme)。GLOX的反应需要与针对LIP所描述相同的pH、 离子强度和温度分布。通过加入0.05-1g GLOX和0.1-1g GLOX底物甲 基乙二醛/kg原料来诱导H2O2的产生。为了诱导和增强LIP对聚合物 木质素的氧化分解，加入氧化还原介体藜芦醇(3，4-二甲氧基苄醇)以 继续进行至反应完成(Ferapontova等人，2006)。可通过加入2g藜芦 醇/kg原料来获得不溶的木质素的更有效降解(Ba rr等人，1993)。LIP- 催化的不溶的木质素的氧化分解的主要反应产物是寡聚类苯丙烷，而 单木质醇只是产物混合物中的少量组分。

为了增加产物混合物中单酚的量，将LIP产生的产物混合物进一 步与漆酶反应(d′Acunzo等人，2002)。反应在100mM的具有pH 5-6 的磷酸盐缓冲液中于最低40℃下进行6小时。加入0.0004g来自变色 栓菌(Trametes versicolor)的漆酶和0.0005g 2，2，6，6-四甲基哌 啶-1-基氧(TEMPO)作为氧化还原介体/kg原料(Arias等人，2003)来将 寡聚酚(oligophenolics)氧化成单酚木质素单元。由于酶混合物的 特异性，所得的液相主要包含单酚木质素单元。通过膜过滤和简单的 离心将所得的产物混合物与剩余的渣分离。

下列实施例显示酶促处理步骤的顺序对不同木质纤维原料的影 响。本文中的实施例意欲进一步举例说明本发明，但将不被解释为以 任何方式限定本发明的范围。

底物的制备：

预处理的小麦秆：将干小麦秆碾磨至120μm。然后将2g磨细的 麦秆悬浮于39.6ml重蒸水和0.4ml 12N H2SO4(1％v/v)中。将悬浮 液在135℃下进行高压灭菌30分钟。将混合物冷却至室温，然后以 10.000g离心15分钟。弃去所得的上清液。使用50mM醋酸钠缓冲液 (pH 5)，通过三次中间清洗/离心循环(10.000g/15分钟)处理剩余的 沉淀。在最后的离心步骤之后，将固体重悬浮于35ml的50mM醋酸钠 (pH 5)中，从而产生5％w/w(总共40g)底物原液。

未处理的小麦秆、甜菜浆、燕麦木聚糖(oat spelt xylan)、 黑麦阿拉伯木聚糖：将小麦秆(地方农产品)、甜菜浆(动物饲料添加 剂)、燕麦木聚糖(Sigma，Weilheim，Germany，Cat no：X0627)的干 样品碾磨至120μm。为了制备各个底物原液，将2g各磨细的材料置 于Flacon管中。然后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 5)充注管，达到40g 标志，产生5％(w/w)的终底物悬浮液。

以白色细粉的形式提供黑麦阿拉伯木聚糖(Megazymes，Ireland， Cat no：P-RAXY)。为了制备底物原液，称取0.2g加至Flacon管(15ml) 中。然后用50mM醋酸钠缓冲液充注管，达到4g标记，从而产生5％ (w/w)的终原液。

酶的制备：

阿拉伯糖酶(Ara，来源：黑曲霉，Cat.：E-EARAB)、阿拉伯岩藻 糖苷酶(Arafus，来源：黑曲霉，Cat.：E-AFASE)、纤维二糖水解酶 I(CBH I，来源：木霉属，Cat.：E-CBHI)、β-D-葡聚糖内切酶(EGII， 来源：木霉属，Cat.：E-CELTR)、β-甘露聚糖内切酶(Man，来源： 黑曲霉，Cat：E-BMANN)、木聚糖酶(Xyl 1，来源：绿色木霉；Cat. E-XYTRI)、多聚半乳糖醛酸酶(Poly，来源：针尾曲霉，Cat.E-PGALUSP) 由Megazymes Inc.，Ireland以硫酸铵沉淀(总体积：1ml)的形式提 供。使用50ml Amicon离心超滤装置(10kDa的截断值；Millipore， Maidstone，UK)，用45ml醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5)对这些酶制剂 进行脱盐和浓缩。

包含纤维二糖水解酶(CBH I和CBH II)、纤维素内切酶(EG I、EG II)、β-糖苷酶(BGL)和木聚糖内切酶活性的商业纤维素酶混合物 (Worth.Cel.，Cat：Cel；108U/mg DW)由Worthington Biochemical Corp.(NJ.，USA)以干燥白色粉剂的形式提供。在10ml醋酸钠缓冲液 (50mM，pH 5)中制备该纤维素酶制剂的原液(0.5mg/ml)。

来自针尾曲霉的果胶酶(50mM，pH 5)(Pec，Activites：果胶 酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶；Cat：Pectinex Ultra SP-L)和来自 黑曲霉的β-葡糖苷酶(BGL，Cat：Novo 188)由Novozymes，Denmark 以即可使用的浓缩液的形式提供。

将来自嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)株系YX的另外的木聚糖 内切酶活性(Xyl 2，BLAST参考号：AAZ56956/gi：71917054； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)在酿酒酵母(S. cerevisiae)中重组表达。使用Amicon离心超速离心装置(Millipore， Maidstone，UK)从澄清的和浓缩的发酵液中获得酶活性。

通过Bradford法(Bradford，M.，1976)测定蛋白质浓度。

水解木质素的制备：

在1％(w/v)12N H2SO4存在的情况下，使用常规蒸汽爆破法(25 巴蒸汽/5分钟，进行突然的压力释放)预处理小麦秆(300g)。以 10.000g(15分钟)离心所得的悬浮液，然后倾析出上清液。用40ml 醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5)清洗/中和剩下的固体3次，此后于真空中 对其进行干燥，然后碾磨至120μm产生细粉。为了制备5％(w/w)的 悬浮液，将2g麦秆粉与35ml醋酸钠缓冲液(50mM，pH5)混合，产生 40ml的总体积。将40ml麦秆悬浮液与4％(w/w底物)Worthington 纤维素酶混合物和0.5％(w/w)的来自黑曲霉的β-糖苷酶活性(Novo 188，Novozymes)混合。将所得的混合物在Eppendorf旋转混合器中于 45℃(250rpm)下温育48小时。在初始温育期，以12.000g(15分钟) 离心悬浮液，然后倾析出所得的上清液。使用重蒸水清洗剩下的固体 2次，离心(12.000g/15分钟)并重悬浮于醋酸钠缓冲液(50mM，pH5) 中，产生40ml的终体积。在将其于45℃下再温育另外24小时之前， 再次将悬浮液与4％(w/w底物)Worthington纤维素酶混合物和0.5 ％(w/w)的来自黑曲霉的β-糖苷酶活性(Novo 188，Novozymes)混合。 在该第二温育期之后，如之前所述，通过离心分离固体。再次用重蒸 水清洗固体2次，然后离心(10.000g/15分钟)以分离液相和固相。然 后将所得的固体在真空中干燥24小时，产生用于下面实验程序的水解 木质素级分(374mg)。为了确保通过该方法获得的木质素不保留任何残 留的糖，按照已公布的NREL方案(5)将50mg获得的固体经完全的酸 催化的水解。通过与脉冲安培检测(HPAE-PAD)分析(Dionex，Ca.，USA， 6)结合的高效阴离子交换色谱检测可能的糖成分的存在。虽然该方法 比标准HPLC方案更灵敏(大约1000倍)，但在此处获得的水解木质 素残余物中未检测到残留的糖。

顺序酶促水解实验：

所有反应都以0.5ml总体积使用醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5)系 统进行。对于各底物(2.5％w/v＝25mg/ml)，阳性对照由使用 Worthington纤维素酶混合物(1％w/w底物＝0.25mg/ml)的各个酶 促水解步骤组成。在两个独立的步骤中进行不同底物的下列顺序水解 反应。

第一水解反应的起始底物浓度是2.5％(w/v)，而总酶浓度是1％ (w/w底物)，在各反应中保持恒定。通过表1A清楚地显示糖成分在单 个底物中的质量分布。将各酶促反应在Eppendorf旋转混合器中于45 ℃/250rpm下温育48小时。在第一次水解后，以10.000g离心悬浮液 15分钟。倾析上清液，将其过滤(0.2μm)，然后经HPAE-PAD分析 (Dionex，Ca.，USA，6)以测定其糖和糖醛酸的组成。

将第一水解后剩下的沉淀重悬浮于1ml水中，然后离心 (10.000g/15分钟)。在离心后，弃去清洗的水，沉淀(大约100ml体 积)用于第二水解实验。就初始底物的浓度而言，在第二次水解设置 (set-up)中加入的酶浓度是1％w/w(0.25mg/ml)。在加入酶后，使 用醋酸钠缓冲液将反应体积补足至0.5ml。对于第二次水解步骤，使 用与在第一反应步骤中不同的酶促活性。然而，在使用工业酶混合物 的情况下，可允许少量相当于第一反应步骤的酶活性。在48小时的温 育期后，以10.000g离心水解悬浮液15分钟。如之前所述处理上清液， 然后将其经HPAE-PAD分析(Dionex，Ca.，USA，6)以测定其糖和糖醛 酸的组成。

用于各底物的第一和第二水解步骤的酶和底物的确切组合列于 表2A中。

下列列表包括用于各个反应的酶浓度/组合：

1.)阿拉伯糖酶(Ara：0.2mg/ml)+阿拉伯岩藻糖苷酶(Arafus： 0.05mg/ml)

2.)CBH I(0.175mg/ml)+EG II(0.005)+BGL(0.025mg/ml)

3.)甘露聚糖酶(Man：0.25mg/ml)

4.)多聚半乳糖醛酸酶(Poly：0.25mg/ml)

5.)果胶酶(Pec：0.25mg/ml)

6.)木聚糖酶(Xyl 1或Xyl 2：0.25mg/ml)

7.)木聚糖酶(Xyl 1或Xyl 2：0.2mg/ml)+β-糖苷酶(BGL： 0.05mg/ml)

8.)Worthington(0.25mg/ml)

对于使用预处理的小麦秆和甜菜浆进行的反应，只使用来源于绿 色木霉(Trichoderma viride)的Xyl 1进行适当的木聚糖酶第一或 第二水解步骤。

相比之下，所有其他木聚糖酶水解步骤都使用来源嗜热子囊菌株 系YX的Xyl 2进行。

表1A：在定量酸水解(1-4)后测定的底物成分的质量(％)分布：

  底物   葡萄糖   阿拉伯   糖   木糖   其他成   分   燕麦木聚糖   15   10   70   5   阿拉伯   糖   木糖   其他糖   黑麦阿拉伯木   聚糖   38   59   3   提取物   灰分   总木质   素   糖醛酸   阿拉伯   聚糖   木聚糖   甘露聚   糖   半乳聚   糖   纤维素   其他成   分   未处理的麦秆   12.95   10.22   16.85   2.24   2.35   19.22   0.31   0.75   32.64   2.47   葡萄糖   半乳糖   甘露糖   鼠李糖   木糖   阿拉伯   糖   半乳糖   醛酸   乙酸   木质素   其他成   分   甜菜浆   25   7   1   3   2   25   23   4   1.5   8.5   葡萄糖   木糖   木质素   其他成   分   预处理的麦秆   70   3   21   6

表2A：使用不同底物进行的顺序水解步骤

未处理的麦秆                  分析物的相对分布(％)

实验设置              葡萄糖   木糖     阿拉伯糖   半乳糖   寡聚糖    糖醛酸

1.1.1Ara+Arafus       0.766    1.278    93.888     0.000    1.066     3.002

1.1.2CBH I+EG II+BGL  95.031   1.589    0.067      1.064    0.294     1.954

1.2.1CBH I+EG II+BGL  74.930   14.601   10.507     0.469    0.047     0.063

1.2.2Ara+Arafus       8.213    4.710    85.583     0.000    1.095     0.399

阳性对照              83.855   12.193   0.118      1.044    1.588     1.201

黑麦阿拉伯木聚糖              分析物的相对分布(％)

实验设置              葡萄糖   木糖     阿拉伯糖   半乳糖   寡聚糖    糖醛酸

2.1.1Ara+Arafus       0.000    20.476   79.524     0.000    0.000     0.000

2.1.2Xyl 2            0.000    92.973   2.341      0.000    0.403     4.279

2.2.1Xyl 2            1.670    70.141   26.330     0.609    1.189     0.053

2.2.2Ara+Arafus       0.000    20.476   79.524     0.000    0.000     0.000

阳性对照              0.000    54.305   30.022     0.000    0.414     15.259

甜菜样品                      分析物的相对分布(％)

实验设置                阿拉伯糖  半乳糖    葡萄糖    木糖     甘露糖    寡聚糖

3.1.1Ara+Arafus         76.956    1.000     1.044     0.000    0.000     19.660

3.1.2CBH I+EG II+BGL    1.604     1.354     83.458    3.772    8.050     0.517

3.2.1Ara+Arafus         76.956    1.000     1.044     0.000    0.000     19.640

3.2.2Worth cel.Mix      1.725     0.967     89.233    3.783    2.977     0.357

3.3.1CBH I+EG II+BGL    3.886     2.094     61.191    32.108   0.406     0.006

3.3.2Ara+Arafus         61.827    0.000     34.127    1.457    0.000     0.135

阳性对照                2.347     0.000     85.252    4.229    0.160     1.310

预处理的秆样品               分析物的相对分布(％)

实验设置                阿拉伯糖  半乳糖    葡萄糖    木糖     甘露糖    寡聚糖

4.1.1Xyl 1              0.735     1.907     6.842     87.328   0.00 0    3.120

4.1.2CBH I+EG II+BGL    0.000     0.364     95.398    3.076    0.439     0.721

4.2.1Xyl 1              0.735     1.907     6.842     87.328   0.000     3.150

4.2.2果胶酶             0.000     1.700     93.490    1.991    2.508     0.310

4.3.1Xyl 1              0.735     1.907     6.842     87.328   0.000     3.110

4.3.2Ara+Arafus         0.000     0.000     98.849    5.153    0.000     0.000

4.4.1CBH I+EG II+BGL   0.500     0.435     74.398   16.676   1.339     6.042

4.2.1Xyl 1             0.040     0.364     22.398   73.076   0.439     3.721

阳性对照               0.000     0.000     89.136   3.684    0.000     5.452

预处理的麦秆                 分析物的相对分布(％)

实验设置               阿拉伯糖  半乳糖    葡萄糖   木糖     甘露糖    寡聚糖

4.1.1Xyl1              0.735     1.907     6.842    87.328   0.000     3.120

4.1.2CBH I+EG II+BGL   0.000     0.364     95.398   3.076    0.439     0.721

4.2.1Xyl 1             0.735     1.907     6.842    87.328   0.000     3.150

4.2.2果胶酶            0.000     1.700     93.490   1.991    2.508     0.310

4.3.1Xyl 1             0.735     1.907     6.842    87.328   0.000     3.110

4.3.2Ara+Arafus        0.000     0.000     94.849   5.153    0.000     0.000

4.4.1CBH I+EG II+BGL   0.500     0.435     74.398   16.676   1.339     6.042

4.2.1XyII              0.040     0.364     22.398   73.076   0.439     3.721

阳性对照               0.000     0.000     89.136   3.684    0.000     5.452

作为阳性对照：使用Worthington(Worth.Cel.)。

通过比较表2A中的数据，表明通过选择酶促步骤的正确组合，可 从木质纤维底物的水解作用获得超过80％(w/w)的纯糖产物流。

也明显的是用于特定水解底物的酶促活性的顺序对所得的产物流 的组成和纯度具有显著影响。

在其他组实验中，研究木质素在原料中的存在对酶促处理步骤的 影响：

在水解木质素不存在/存在的情况下的选择性酶促水解：

在1ml Eppendorf管中，于0.5ml的总体积中使用醋酸钠缓冲液 (50mM，pH 5)系统进行所有反应。用1％(w/w底物＝0.25mg/ml)的阿 拉伯糖内切酶(Ara)、多聚半乳糖醛酸内切酶(Poly)或木聚糖内切酶 (Xyl 2)水解包含2.5％(w/v)的未处理的小麦秆(25mg/ml)或黑麦阿 拉伯聚糖(0.25mg/ml)的悬浮液。在2.5％(25mg/ml)额外的水解木质 素不存在或存在的情况下进行各反应。从而各反应中底物对木质素的 比例为1∶1。在Eppendorf旋转混合器中于45℃(250rpm)下对所有 反应物温育48小时。在温育期后，以10.000g离心样品15分钟。通 过移液除去所得的上清液，以使用HPAE-PAD法(6)来测定其糖和糖醛 酸组成。表3中显示的结果只集中在主要的单体糖成分的水解模式的 变化上。

表3：在额外的木质素不存在/存在的情况下阿拉伯聚糖和未处理 的小麦秆的选择性水解。

a.)关于阿拉伯木聚糖获得的结果

实验设置                相对分布(％)

                葡萄糖  木糖     阿拉伯糖

Xyl 2+木质素    0.12    95.63    4.27

Xyl 2-木质素    0.28    78.09    21.65

b.)获得的未处理的小麦秆的结果

实验设置                相对分布(％)

                葡萄糖  木糖     阿拉伯糖

Xyl 2+木质素    0.19    97.50    2.16

Xyl 2-木质素    4.31    84.50    12.10

我们已选择黑麦阿拉伯木聚糖(内源性木质素含量＜0.2％w/w) 和未处理的小麦秆(内源性木质素含量大约17％w/w)作为水解底物 来研究外源性木质素的加入的影响，因为此类底物在它们的内源性木 质素含量上具有显著的差异。

在外源性木质素存在的情况下，通过木聚糖内切酶2(Xyl 2)进 行的阿拉伯木聚糖和未处理的小麦的水解导致显著的产物选择性增 加。对于这两种底物，Xyl 2的阿拉伯糖内切酶的副活性(side activity)在木质素存在情况下都减小。

引用：

1.)http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/search2.cgi？4669

2.)Michel，F.et al.(2006)，J.of the Science of Food and Agriculture 42(1)， pp.77-85

3.)http://secure.megazyme.com/Dynamic.aspx？control＝CSViewProduct&catego ryName＝Polysaccharides&productld＝P-RAXY

4.)www.sigma.com

5.)http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf

6.)http://www.dionex.com.cn/technic/Afiles/AN92.PDF

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表1酶系统

表2

  底物   Sigma   Cat.号   酶   产物   纤维素   C6288   纤维素内切酶，纤维素外   切酶，β-糖苷酶   葡萄糖   纤维糊精   C4642   纤维素内切酶，纤维素外   切酶，β-糖苷酶   葡萄糖   β-甲基伞形酮基  (Methlylumbelliferry)   -寡聚糖   M6018   纤维素内切酶，纤维素外   切酶，β-糖苷酶   葡萄糖   对-硝基酚-寡聚糖   N0145   纤维素内切酶，纤维素外   切酶，β-糖苷酶   葡萄糖   CMC   C9481   纤维素内切酶   (Endocellulase)   寡聚糖   Avicel PH-101   11365   纤维素外切酶   葡萄糖

  4-硝基苯基-β-D-纤维   二糖苷   N5759   葡萄糖和pNP   木聚糖   X4252   木聚糖酶、木糖苷酶   木糖   4-硝基苯基-β-D-   木吡喃糖苷   N2132   纤维素酶   木糖和pNP   来自酵母的甘露聚糖   M7504   甘露聚糖酶   甘露糖苷和   甘露糖   来自长角豆(Ceratonia   siliqua)的D-半乳糖   -D-甘露聚糖   48230   半乳糖酶和甘露聚糖酶   半乳糖和甘露糖   4-硝基苯基α-L-阿拉伯   呋喃糖苷   N3641   阿拉伯岩藻糖苷酶   阿拉伯糖和pNP   2，3-二甲氧基苄醇   (藜芦醇)   38700   木质素过氧化物酶   (LIP)   藜芦醇自由基正   离子   木质素，水解的   371076   木质素过氧化物酶   (LIP)   苯丙素类   木质素，有机溶剂提取的   371017   木质素过氧化物酶   (LIP)   苯丙素类   2，2′-连氮基-双(3-乙基   苯并噻唑啉-6-磺酸   (ABTS)   A1227   木质素过氧化物酶   (LIP)   ABTS自由基正离   子   2，2′-连氮基-双(3-乙基   苯并噻唑啉-6-磺酸   (ABTS)   A1227   漆酶   ABTS自由基正离   子   氯化锰(MnCl2)   416479   锰过氧化物酶(MnP)   Mn3+离子