纤维素的酶促

申请号 CN201180028142.3 申请日 2011-06-16 公开(公告)号 CN103068996A 公开(公告)日 2013-04-24
申请人 宝丽格公司; 发明人 安德斯·斯乔德; 安德斯·弗洛兰德; 马丁·莱尔施; 古德布兰德·罗德斯拉德; 克里斯廷·哈尔斯; 安·玛里·克罗夫顿; 伦纳特·德林; 玛特斯·H·约翰森;
摘要 本 发明 涉及用于酶促 水 解 纤维 素 生物 质 的连续方法且涉及用于实施所述方法的装置。根据本发明,在反应器中实现关于水解反应的稳定状态。其中,高的总固体含量(优选10%或更高,还优选15-30%)的 纤维素 生物质被不断地添加到所述反应器中,同时至少部分水解的纤维素生物质被不断地从所述反应器中取出。调节稳定状态,即调节添加的纤维素生物质的量和取出的至少部分水解的纤维素生物质的量,使得添加的纤维素生物质的给定部分在反应器中的保留时间比其“ 液化 时间”长,“液化时间”即在水解期间将固体浆体转 化成 可 泵 送的液体所需要的时间段,即将浆体的 粘度 降低到对于进一步加工可接受的值所需要的时间。
权利要求

1.用于连续纤维生物质的方法,包括至少以下步骤:
(P)提供至少一个反应器,其能够在稳定状态下操作;
(A)将预定量的纤维素生物质添加到所述反应器中,其中所述纤维素生物质具有至少
10%的固体含量;
(A′)将预定量的酶添加到所述反应器中;
(E)在所述反应器中进行所述纤维素生物质的至少部分酶促水解,
其中在所述方法中实现稳定状态,其中纤维素生物质被不断添加到所述反应器中,同时至少部分水解的纤维素生物质被不断地从所述反应器中取出,其中被不断取出的所述至少部分水解的纤维素生物质具有如在带搅拌器(FL 100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测得的不大于25Pas(帕斯卡秒)的粘度
2.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤(P)中提供级联的至少两个反应器,优选地额外包括以下步骤:
(T)从步骤(E)中不断地取出部分水解的纤维素生物质,其具有如在带搅拌器(FL
100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测得的不大于25Pas(帕斯卡秒)的粘度,然后将其转移到后面的反应器中,所述后面的反应器能够在稳定状态下操作;
(E′)在所述后面的反应器中,使来自步骤(E)的所述部分水解的纤维素生物质进行进一步的酶促水解。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中被添加到所述反应器中的所述纤维素生物质的固体含量为至少15%,优选至少20%,优选至少25%,还优选至少30%;还优选
10%-45%,还优选15%-45%,还优选20%-40%或15%-30%。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中如在带搅拌器(FL100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测得的不断取出的部分水解的纤维素生物质的粘度不大于
10Pas,优选不大于5Pas,还优选不大于3Pas,还优选地不大于1Pas。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纤维素生物质为木素纤维素生物质且优选地包括木材、一年生植物、农业残余物或废弃物,尤其是甘蔗渣或能源作物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纤维素生物质包含大于20%的纤维素,优选大于50%的纤维素,还优选大于70%的纤维素。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纤维素生物质在所述水解之前经历预处理,其中所述预处理优选地是亚硫酸盐蒸煮且所述纤维素生物质优选地是木素纤维素生物质。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述反应器为CSTR即连续搅拌罐反应器。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在所述水解步骤中使用能够将纤维素聚合物特异性地水解成可溶性葡萄糖单体的细胞外或细胞膜相关的酶复合物,特别是纤维素酶和β-葡糖苷酶的混合物。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述酶包括纤维素酶、半纤维素酶和/或β-葡糖苷酶。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中从所述反应器中不断取出的所述至少部分水解的纤维素生物质中的至少一些经历分离步骤,其中未水解的固体至少部分地与水解产物的至少一部分分离,所述水解产物即包含水解的纤维素生物质和酶的液相,其中所述液体水解产物然后与纤维素生物质混合,接着被引入到反应器中,优选专用的混合反应器。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法,其中使用级联的两个或更多个用于水解的反应器,
且其中来自第一反应器的所述水解产物即包含水解的纤维素生物质和酶的所述液相中的至少一些与固相分离且经历另外的加工,
且其中来自所述分离的所述固相被添加到优选地尺寸和/或体积小于所述第一反应器的后面的反应器中,还优选其中额外的预定量的酶被添加到所述后面的反应器中。
13.根据权利要求12所述的方法,其在级联的三个或更多个用于水解的反应器中的任何后面的两个相邻反应器中被重复进行,其中优选每一个后面的反应器的尺寸和/或体积分别比每一个前面的反应器小。
14.用于由木素纤维素生物质生产单糖、基于糖的化学品、生物燃料或材料以及磺化木素的方法,包括至少以下步骤:
(i)预处理木素纤维素生物质,优选地在亚硫酸盐蒸煮步骤中;
(ii)将来自步骤(i)的预处理的木素纤维素生物质分成
(a)液体“消耗的亚硫酸盐液”相,优选地包含50%或更多的呈磺化木素形式的所述木素纤维素生物质的所述木素,及
(b)浆料,优选地包含70%或更多的所述木素纤维素生物质的所述纤维素;
(iii)将来自步骤(ii)的所述浆料(b)水解成包含单糖的糖化学平台;其中所述水解步骤是根据前述权利要求中任一项所述的方法;
(iv)任选地,进一步加工来自步骤(iii)的所述单糖,得到有用的化学品、生物燃料和/或蛋白质;及
(v)将来自步骤(ii)的所述液相(a)的所述磺化木素直接转化成或进一步加工成有用的化学品、生物燃料和/或材料。

说明书全文

纤维素的酶促

[0001] 发明概述
[0002] 本发明涉及用于酶促水解纤维素生物质的连续方法。根据本发明的改进的水解在用于纤维素的全部生物质转化中是特别有用的,即将纤维素生物质转化成有用的化学品或商品例如生物燃料的方法。
[0003] 在一个实施方式中,本发明涉及用于连续水解纤维素生物质的方法,包括至少以下步骤:
[0004] (P)提供至少一个反应器,其能够在稳定状态下操作;
[0005] (A)将预定量的纤维素生物质添加到所述反应器中,其中所述纤维素生物质具有至少10%、优选至少15%、优选至少20%、优选至少25%、还优选至少30%;还优选10%-45%,还优选15%-45%,还优选20%-40%或15%-30%的固体含量;
[0006] (A′)将预定量的酶添加到所述反应器中;
[0007] (E)在所述反应器中进行所述纤维素生物质的至少部分酶促水解。
[0008] 在所述方法中,实现稳定状态,其中纤维素生物质被不断地添加到所述反应器中,同时至少部分水解的纤维素生物质被不断地从所述反应器中取出,其中被不断取出的所述至少部分水解的纤维素生物质具有如在带搅拌器(FL 100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测得的不大于25Pas(帕斯卡秒),优选不大于10Pas,优选不大于5Pas,还优选不大于3Pas,还优选不大于1Pas的粘度
[0009] 粘度是在标准条件(20℃,1巴)下测量的。对于如何测量所述粘度,本领域的技术人员将从本发明给出的实施例中获得进一步的信息。
[0010] 优选地,在所述稳定状态下,所述粘度在延长的时间段内基本上保持恒定或基本上保持在前面公开的粘度的值的任意一个以下,延长的时间例如2小时、4小时、6小时、12小时或更多小时的期间内。
[0011] 在所述反应器中建立稳定状态的目的是允许水解具有比较高的固体含量的纤维素生物质。尤其是从环境和经济的度,期望在高固体负载量优选10%的总固体含量(“TS”)或更高下运行酶促水解,因为这减少了水和能量的消耗及设备投资成本。然而,考虑到具有高固体含量的浆料的高粘度,水解高固体含量的纤维素生物质的挑战之一是实现充分的混合。通常,尤其是在本领域已知的分批法中,只有使用能量要求高且设计复杂的机械才可能进行混合。
[0012] 根据本发明,在所述反应器中,实现在稳定状态下的水解反应。其中,高的总固体含量(优选10%或更高,还优选15-40%)的纤维素生物质被不断地添加到所述反应器中,同时至少部分水解的纤维素生物质被不断地从所述反应器中取出。调节稳定状态,即调节添加的纤维素生物质的量和取出的至少部分水解的纤维素生物质的量,使得纤维素生物质在反应器中的平均保留时间比各自的平均“液化时间”长,“液化时间”即在水解期间将固体浆料转化成可送的液体所需要的时间段,即将浆料的粘度降低到对于进一步加工可接受的值所需要的时间。
[0013] 根据本发明,通过被不断从反应器中取出的至少部分水解的纤维素生物质的粘度来适当地描述这种“液化时间”。如在带搅拌器(FL 100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测得的,所述粘度不大于25Pas(帕斯卡秒),优选不大于10Pas,优选不大于5Pas,还优选不大于3Pas,还优选不大于1Pas。
[0014] 在优选的实施方式中,根据这个实施方式,整个方法的葡萄糖收率是增加的,用于连续水解纤维素生物质的方法是在级联的至少两个反应器中实施的,即步骤(P)为:
[0015] (P)提供级联的至少两个反应器,其能够在稳定状态下操作
[0016] 在优选的实施方式中,用于连续水解纤维素生物质的所述方法至少包括以下步骤:
[0017] (P)提供级联的至少两个反应器,其能够在稳定状态下操作;
[0018] (A)将预定量的纤维素生物质添加到第一反应器中,其中所述纤维素生物质具有至少10%、优选至少15%、优选至少20%、优选至少25%、还优选至少30%;还优选10%-45%,还优选15%-45%,还优选20%-40%或15%-30%的固体含量;
[0019] (A′)将预定量的酶添加到所述第一反应器中;
[0020] (E)在所述第一反应器中进行纤维素生物质的部分酶促水解。
[0021] (T)从步骤(E1)中不断取出部分水解的纤维素生物质,其具有如在带搅拌器(FL100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪所测得的不大于25Pas(帕斯卡秒),优选不大于10Pas,优选不大于5Pas,还优选不大于3Pas,还优选不大于1Pas的粘度,且将其转移到第二反应器中,第二反应器可以在稳定状态下操作;
[0022] (E′)在所述第二反应器中,使来自步骤(E)的部分水解的纤维素生物质进行进一步的酶促水解。
[0023] 背景和现有技术
[0024] 正如普遍接受的,基于石油的化学品及用作(化石)燃料的石油的来源是有限的。目前使用的一种可替代来源是如从生物质中得到的“生物燃料”。可以使用各种来源的生物质。
[0025] “第一代生物燃料”是用传统技术从糖、淀粉植物油或动物脂肪中制得的生物燃料。用于生产第一代生物燃料的示例性基础原料是种子或谷物比如小麦(其产生被水解且发酵成生物乙醇的淀粉),或葵花籽(其被压榨以产生可转化成生物柴油植物油)。然而,这些原料本来可以进入动物或人的食物链中。因此,由于将食物从人的食物链中转移出去,导致食物短缺和价格增长,第一代生物燃料受到了批评。
[0026] 相反,通过使用由当前作物的残余的非食物(即不可食用)部分,可以可持续地生产“第二代生物燃料”,残余的非食物部分比如粮食作物被提取后所留下的茎、叶、甘蔗渣(甘蔗纤维残余物)、壳等,及非用于食物目的的其它原料(非粮食作物)比如木材、一年生植物和几乎不包含谷粒的谷类,且还包括工业废弃物比如锯屑,水果压榨、酒加工等产生的果皮和浆料。
[0027] 用于该第二代生物燃料的整个生物质转化的关键步骤是未处理的或预处理的纤维素生物质水解成较小的单元。在所述水解步骤中,纤维素链通过断裂至少一个β-1-4-糖苷键而发生断裂。
[0028] 更具体地,纤维素是通过β-1-4-糖苷键连接的重复的葡聚糖单元的不溶的直链聚合物。在水中,纤维素通常是通过水分子的亲电子的氢进攻糖苷键而发生水解。在纤维素链中,每一个葡萄糖单元具有与相邻链中的单体形成三个氢键的可能性,从而产生不易水解的稳定的晶体结构。通过增加的温度和压的使用或可以通过稀酸或浓酸或通过酶(如在本发明的情况下)的催化,可以使水解反应的速率增加。
[0029] 在工业化规模中,尤其感兴趣的是水解具有高固体含量的纤维素生物质。通常,用过多的水解时间来水解具有高固体含量的纤维素生物质,通常持续5-7天,在水解和发酵同时进行的情况下,有时采用组合装置。
[0030] US 2009/0209009涉及纤维素的酶促水解且公开了可以通过将纤维素结合域引入到纤维素降解所需要的酶组分中的一个即β-葡糖苷酶上以减少酶的成本。为了实现这点,需要特异性结合剂。这种结合剂允许酶结合到纤维素上以方便再循环。而且,在专用的保留固体的反应器中进行水解反应,其中固体具有比液体的保留时间长的保留时间。
[0031] WO 2009/14067描述了具有固体的分离和底物的稀释的原料分批法,以能够在反应器中处理大量的总悬浮固体(TSS)。
[0032] Brethauer S.、Wyman C.E.等 的 文 章 Biores.Technol.2010,4862“Review:Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production”概括讨论分批的或连续的水解和发酵方法,但重点在于发酵。提及的益处包括:减少用于清洁和填充的容器停工时间,其转化成增加的容积生产率、更小的反应器、更低的资本投入及易于控制在稳定状态。文章所呈现的数据来自连续发酵试验。
[0033] Fan,Z.L.、South,C、Lyford,K.、Munsie,J.、van Walsum,P.、Lynd,L.R.的文章Biopro-cess Biosyst.Eng.2003,93“Conversion of paper sludge toethanol in a semi continuous solids-fed reactor”描述了半连续的反应器,其中以一定的间隔将造纸污泥供给到运行SSF(=同时糖化和发酵)的反应器中。作者观察到,通过降低进料频率(每停留时间的原料添加量),可以减少纤维素酶加载量。
[0034] 鉴于如上所讨论的现有技术,本发明的一个目的是提供用于酶促水解纤维素生物质的方法,其中相对高固体含量的纤维素生物质可以在工业规模的条件下水解,同时使成本(投资和操作)最少。
[0035] 这个目的(和其它目的)是通过用于连续水解纤维素生物质的以下方法来实现的,方法包括至少以下步骤:
[0036] (P)提供至少一个反应器,其能够在稳定状态下操作;
[0037] (A)将预定量的纤维素生物质添加到所述反应器中,其中所述纤维素生物质具有至少10%,优选至少15%,优选至少20%,优选至少25%,还优选至少30%;还优选10%-45%,还优选15%-45%,还优选20%-40%或15%-30%的固体含量;
[0038] (A′)将预定量的酶添加到所述反应器中;
[0039] (E)在所述反应器中进行所述纤维素生物质的至少部分酶促水解,
[0040] 其中,实现稳定状态,其中纤维素生物质被不断地添加到所述反应器中,同时至少部分水解的纤维素生物质被不断地从所述反应器中取出,其中被不断取出的所述至少部分水解的纤维素生物质具有如在带搅拌器(FL100/6W)的杯中在Physica MCR 101流变仪中所测量的不大于25Pas(帕斯卡秒),优选不大于10Pas,优选不大于5Pas,还优选不大于3Pas,还优选不大于1Pas的粘度。
[0041] 其中,且贯穿本发明的整个说明书,术语“固体含量”(本领域的技术人员也称为“TS”或“总固体”)表示样品在105℃下干燥16小时后的重量与相同样品在所述干燥之前的重量之间的比值。
[0042] 相应地,如整个本申请中所使用的,术语“TDS”或“总的溶解固体”表示样品过滤后得到的干燥(105℃下16小时)滤液的重量与相同样品在所述过滤和干燥之前的重量之间的比值。
[0043] 术语“TSS”或“总的悬浮固体”表示样品过滤后得到的干燥(105℃下16小时)滤饼的重量与相同样品在所述过滤和干燥之前的重量之间的比值。因此,这些测量值之间的关系为TS=TDS+TSS。
[0044] 通过实施根据本发明的连续方法,即通过建立稳定状态和定义的粘度方案,解决基于高的起始粘度和复杂的反应器设计的问题。尤其,本发明解决了在高固体负载量下进行商业上可行的酶促水解的问题,同时在反应器中保持低的粘度。本发明允许在高的总固体含量和在低的总悬浮固体(“TSS”)含量下运行酶促水解,作为具有或不具有酶的重复利用的连续法。
[0045] 反应器不需要特别的搅拌,因为没有高的TSS的问题。因此,传统的CSTR(连续搅拌罐反应器)可以用于本发明的方法中。因此,优选地,用于根据本发明的方法的(至少一个)反应器是连续搅拌反应器,还优选连续搅拌罐反应器。
[0046] 实现前述目的的另外的实施方式还增加了整个方法的葡萄糖收率。其中,根据本发明的用于连续水解纤维素生物质的方法尤其是步骤(P)是在级联的至少两个反应器中实施的。
[0047] 未限制关于反应器的最大数目。级联操作(即顺序操作)的反应器的数目基本上取决于期望的葡萄糖收率。
[0048] 在本发明的优选方面,通过包含循环回路,其中酶被重复利用,在整个方法中所需要的酶的量减少了至少30%,优选至少40%。其中,来自(最后的)反应器的水解产物即包含水解的纤维素和酶的液相经历分离步骤,其中未水解的固体与仍包含酶的水解产物分离。然后,所述液体水解产物与未水解的(“新鲜的”)纤维素生物质混合,其然后被引入到(“第一”)水解反应器中。
[0049] 附图简述
[0050] 图1显示了具有任选的随后的级联的另外的反应器的根据本发明的方法操作的连续反应器;
[0051] 图2显示了在级联的至少两个反应器中连续酶促水解纤维素生物质的流程图,其中添加到反应器中的至少一部分酶被重复利用;
[0052] 图3显示了在级联的至少两个反应器中连续酶促水解纤维素生物质的流程图,其中高的糖负载量对水解的抑制在级联的反应器中被最小化,级联的反应器的容积是顺序减小的;
[0053] 图4描绘了经历酶促水解的纤维素生物质的粘度随时间的发展,提供了有关在稳定状态下所预期的最短保留时间的信息;
[0054] 图5是根据本发明的一个实施方式的整个生物精炼(biorefinery)概念的流程表;
[0055] 图6显示了根据实施例2和实施例3的在级联的三个反应器中连续酶促水解纤维素生物质的流程图。
[0056] 发明详述
[0057] 本发明涉及纤维素生物质的水解。除了所述生物质包含纤维素以外,关于纤维素生物质的类型或组成没有限制。根据一个合适的定义,“生物质”是在给定单位的环境区域内的(之前)有生命的物质尤其是有机物质的总质量,优选用作燃料或能源的植物材料、植物或农业废弃物。“之前”有生命的生物质还作为“纤维素生物质”被包括的事实使得还包括回收的纤维素材料,尤其是回收的质材料和/或回收的基于纸的产品或其它能想到的基于纤维素的回收材料。还包括回收的纤维素材料比如回收的纸质产品与任意其它类型的纤维素生物质的任意混合物。
[0058] 根据优选的实施方式,所述纤维素生物质包含多于30%的纤维素(按重量计基于总质量的%),优选地大于50%的纤维素,优选地大于70%的纤维素。其中,术语“纤维素”还包括术语“半纤维素”。根据本发明的优选的纤维素生物质包括棉花、棉绒和木素纤维素生物质,即,既包含木素组分又包含纤维素和/或半纤维素组分的生物质。
[0059] 特别适合于根据本发明的方法的优选的纤维素生物质基于能源作物、一年生植物、农业残余物及木材。
[0060] 商品能源作物通常是密集种植的、高产量的作物种类,优选没有食物价值的或有限的食物价值的作物种类。例如,木质作物比如柳属植物(Salix)、芒属植物(Miscanthus)、柳树或杨属植物(Poplar)是优选的能源作物。
[0061] 一年生植物的优选实例为稻草、甘蔗和木薯。
[0062] 农业残余物包括可耕种作物未用于生产粮食、饲料或纤维的初级目的的那些部分,例如使用的动物草垫(bedding)和羽毛
[0063] 这些残余物通过来自甘蔗的甘蔗渣和玉米秆来示例。
[0064] 糖甘蔗的特别优选的起始材料可以被分成甘蔗渣、糖和茎秆。甘蔗渣是由纤维素、半纤维素、木素、提取物、无机盐和其它有机物质比如蛋白质有机酸组成的纤维材料。
[0065] 甘蔗渣和硬木具有很多相似性,即与软木相比,高的木聚糖含量、较短的纤维长度和较低的木素和纤维素含量。然而,甘蔗渣具有稍微更高的灰分含量。灰分含量可以通过植物形态学和收获方法的差异来解释。甘蔗渣中的较短的纤维长度主要归因于其高的木髓含量(~30%)。
[0066] 总的来说,基于可以不需要机械的尺寸减小(mechanical size reduction)和得到较高的水解收率的事实,尤其优选的是,用非木质农业残余物特别是甘蔗渣作为纤维素生物质来进行根据本发明的方法。
[0067] 木材也是用于本方法的合适材料。其中,所有类型的木材是合适的。
[0068] 根据本发明,纤维素生物质浆料被酶促水解。纤维素是通过β-1-4-糖苷键连接的重复的葡聚糖单元的不溶的直链聚合物。纤维素在水中因水分子的亲电子的氢进攻糖苷键而发生水解。在纤维素链中,每一个葡萄糖单元具有与相邻链中的单体形成三个氢键的可能性,产生稳定的晶体结构,其不易水解。通过增加的温度和压力的使用或通过稀酸或浓酸或通过酶的催化,如本发明的情况下通过酶的催化,可以使水解反应的速率增加。
[0069] 根据本发明的优选的实施方式,在水解步骤中使用可特异性地将纤维素聚合物水解成可溶性葡萄糖单体的细胞外或细胞膜相关的酶复合物(纤维素酶)。纤维素酶是由具有不同的特异性活性的协同酶组成的多蛋白质复合物,协同酶可以被分成外切纤维素酶和内切纤维素酶(葡聚糖酶)及β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)。此外,存在可以分解纤维素生物质的其它主要组分的酶(半纤维素酶、漆酶、木素降解过化物酶等)。所有的这些酶及其任意组合是可用于本发明的酶促水解的优选的酶。
[0070] 纤维二糖是葡聚糖酶的已知的终产物抑制剂,且已知β-葡糖苷酶通过将纤维二糖转化成葡萄糖(限速步)缓解这种抑制作用。在工业化方法中,例如通过酵母的乙醇发酵,通过同时糖化和发酵(SSF)可以改进纤维素酶糖化效率。采用SSF的最大挑战涉及用于常用的水解酶和发酵有机体的最佳温度不同。除终产物抑制外,已知木素通过非特异性地结合到纤维素酶上以降低酶性能。
[0071] 优选的是,在水解之前,纤维素生物质经历至少一种类型的预处理,其使得纤维素生物质的至少一些木素呈水溶性的形式,因此使得其特别好地适合于本发明的水解步骤。
[0072] 因此,根据优选的实施方式,进行纤维素的预处理,以增加纤维素的比表面积。恰当的预处理具有以下益处:由于更加易于接近的底物且还通过去除潜在的抑制物质,使酶水解速率增加。
[0073] 尽管根据本发明的方法可适用于所有类型的纤维素材料,优选的是,在水解步骤之前,在单独的步骤中预处理材料。发现,所述预处理步骤使酶促水解的效率增加。
[0074] 所述预处理是机械的或化学的,优选化学的。
[0075] 在机械(预)处理中,动量或能量被转移到纤维素生物质中,例如通过分开或切割或敲打使生物质成为较小的颗粒。其中,未添加化学试剂且材料的组分的化学结构保持基本上不受影响。
[0076] 在化学(预)处理中,添加至少一种化学试剂且改变生物质中的组分中的至少一种组分的化学结构。如将在下文更加详细地讨论的,“亚硫酸盐蒸煮”是化学预处理且事实上是优选类型的预处理。
[0077] 在优选的实施方式中,纤维素生物质被用于本方法中,尤其是木素纤维素生物质,其不需要机械(预)处理且其中亚硫酸盐蒸煮是唯一的(预)处理。亚硫酸盐蒸煮可以划分成四个主要的组:酸、酸性亚硫酸氢盐、弱性的和碱性的亚硫酸盐制浆。
[0078] 在根据本发明的优选的预处理中,在酸性、中性或碱性条件下,用亚硫酸盐优选亚硫酸钠、亚硫酸、亚硫酸铵或亚硫酸镁蒸煮纤维素生物质。这个预处理步骤溶解了磺化木素(木素磺酸盐)形式的大多数的木素和部分的半纤维素。
[0079] 意外的是,在本方法中,发现在从可发酵的糖生产燃料或化学品中,作为预处理步骤的亚硫酸盐蒸煮的使用是非常有效的,因为其导致较高的化学品整体收率。大体上,与以任意其它已知的糖平台生物质精炼技术相比,实现了有用的化学品的更高的输出(>80%)。
[0080] 从一步预处理中得到的纤维素浆料的杂质尤其木素是非常低的事实,使得更容易开发或使酶适合于水解。
[0081] 根据下面的实施方式中的一个,优选进行亚硫酸盐预处理。其中且贯穿整个本公开内容中,“亚硫酸盐预处理”也被称为“蒸煮”。
[0082] ·酸性蒸煮(优选SO2与氢氧化物,还优选地与Ca(OH)2、NaOH、NH4OH或Mg(OH)2),[0083] ·亚硫酸氢盐蒸煮(优选SO2与氢氧化物,还优选地与NaOH、NH4OH或Mg(OH)2),[0084] ·弱碱性蒸煮(优选Na2SO3,还优选与Na2CO3)及
[0085] ·碱性蒸煮(优选Na2SO3与氢氧化物,还优选与NaOH)。
[0086] 关于亚硫酸盐预处理步骤(亚硫酸盐蒸煮),其是在根据本发明的酶促水解之前待实施的优选的预处理,2009年12月16日提交的标题为“Lignocellulosic Biomass Conversion”的WO 2010/078930的相应公开通过引用并入到本公开中。
[0087] 本发明还涉及用于从木素纤维素生物质中生产单糖、基于糖的化学品、生物燃料或材料与磺化木素的完整方法,方法包括至少以下步骤:
[0088] (i)木素纤维素生物质的预处理,优选地在亚硫酸盐蒸煮步骤中;
[0089] (ii)将来自所述步骤(i)的预处理的木素纤维素生物质分成
[0090] (a)液体“消耗的亚硫酸盐液”相,优选地包含50%或更多的呈磺化木素形式的木素纤维素生物质的木素,及
[0091] (b)浆料,优选地包含70%或更多的木素纤维素生物质的纤维素;
[0092] (iii)将来自步骤(ii)的所述浆料(b)水解成包含单糖的糖化学平台;其中所述水解步骤是如上所述用于连续水解木素纤维素生物质的方法。
[0093] (iv)任选地,进一步加工来自步骤(iii)的单糖,得到有用的化学品、生物燃料和/或蛋白质;及
[0094] (v)将来自步骤(ii)的液相(a)的磺化木素直接转化成或进一步加工成有用的化学品、生物燃料和/或材料。
[0095] 这个整体方法示意性地描述在图5中。
[0096] 所述方法的步骤(iv)涉及单糖的发酵,尤其是己糖和戊糖到乙醇或基于其它糖的化学品的发酵,或涉及生产生物质蛋白质。
[0097] 发酵涉及分解糖以释放能量的微生物,同时方法得到像醇或酸的产物。酿酒酵母(面包酵母)被最经常地用于将己糖发酵成乙醇。1摩尔的葡萄糖将化学计量地产生2摩尔的乙醇和2摩尔的二氧化。甘蔗渣浆料包含相对大量的戊糖。这些糖还可以被发酵或代谢,以产生生物质蛋白质。
[0098] 参考或不参考上述用于单糖生产的整体方法,本发明涉及如上所述的纤维素生物质的水解。关于所述水解,优选以下实施方式。
[0099] 在优选的实施方式中,在本发明的连续方法中,液体和固体组分的整个浆料以相同的速率移动通过反应器,即未水解的纤维固体和浆料的水相在所述反应器中被保持相同的时间间隔。
[0100] 根据第一个实施方式,如图1所示例的,底物即纤维素生物质被供给到反应器中且添加酶。方法被连续地运行,即在稳定的状态下。在所述反应器中,底物即纤维素生物质被水解。在根据本发明操作的反应器中,具有25%TS(由10%TSS和15%TDS组成的)的部分水解的纤维素生物质的粘度可以近似地为在相应的分批试验中在16小时的反应时间后的粘度。
[0101] 关于需要用来运行方法的反应器,不存在限制,尽管CSTR(连续搅拌罐反应器)是优选的。
[0102] 根据优选的实施方式,还显示在图1中,提供级联的反应器,以改进葡萄糖收率。在额外的反应器(上述的第一反应器之后的)中,底物进一步被水解,得到具有高的糖浓度(=高的总溶解固体,“TDS”)的水解产物和由不可水解的材料(木素、无机材料等)组成的固体残余物。
[0103] 即使反应器被供给了具有高固体含量例如25%TS的底物,反应器中的总悬浮含量(“TSS”)在稳定状态(假设串联的3个反应器具有48小时的总反应时间,每一个反应器16小时)下仅为约10%。在本发明的稳定状态下的反应器中,具有(由10%TSS和15%TDS组成的)25%TS的溶液的粘度相当于在16小时或更少的反应时间后在分批反应器中的粘度。
[0104] 对于添加到水解反应器中的纤维素生物质,其在反应器中的平均保留时间应该为约,优选地稍微大于在具有良好搅拌下的分批反应器中的液化所需要的时间。因此,第一反应器的平均保留时间应被选择,使得浆料实现充分的液化,以是可泵送的。
[0105] 根据第二个实施方式,通过采用酶重复利用,降低酶成本。方法示意性地描述在图2中。
[0106] 在本发明的优选方面,通过包含循环回路,其中酶被重复利用,整体方法中所需要的酶的量减少了至少30%,优选至少40%。
[0107] 根据这个优选的实施方式,来自(最后的)反应器的水解产物即包含水解的纤维素和酶的液相经历分离步骤,其中未水解的固体与仍包含酶的水解产物至少部分地分离。然后,所述液体水解产物与未水解的(“新鲜的”)纤维素生物质混合,其然后被引入到用于水解的反应器中。
[0108] 这阐述在图2中。其中,在级联的三个水解反应器的水解罐3后,水解产物(包括酶)与未水解的固体残余物分离。经由混合罐(图2中的最左边的罐),所述水解产物被循环到系统中。在所述混合罐中,可能发生一些(残余的)水解作用,但所述反应器主要被预期用于混合包含酶的重复利用的水解产物和添加的纤维素生物质(“底物”)。在任选的分离步骤中,在所述专用的混合罐后,可以分离一些水解产物,特别是一些糖的终产物,用于进一步的加工。
[0109] 因此,根据优选的实施方式,从反应器中,优选地从级联的两个或更多个反应器的最后一个反应器中不断取出的至少部分水解的纤维素生物质中的至少一些经历分离步骤,其中未水解的固体至少部分地与水解产物分离,水解产物即包含水解的纤维素生物质和酶的液相,其中所述液体水解产物然后与纤维素生物质混合,优选地在专用的反应器或罐中,其然后被引入到根据本发明的方法中。
[0110] 用此方法的解决方案的增加的益处为:在(第一)反应罐之前,水解产物/糖溶液(在分离未水解的材料后)与底物混合。这将大幅度地降低所需要的酶的量,至少40%(由于替换浆料中的液相)。
[0111] 通过混合水解产物(在分离未水解固体后)和新鲜底物(即,纤维素生物质),在被供给到第一水解反应器之前,具有碳水化合物结合部分的酶可以结合到底物(纤维素)上。除了上述减少40%外,这将允许进一步减少酶消耗量。
[0112] 根据另外优选的实施方式,解决了基于糖含量过高(高的TDS)的水解抑制。
[0113] 其中,任意潜在的糖引起的水解抑制优选地通过糖的顺序分离来克服。
[0114] 根据这个优选的实施方式,如图3所示的,在第一反应器后,悬浮固体与液体分离,其中发生水解反应。
[0115] 通常,在根据本发明的稳定状态下操作的水解反应器中,可以实现纤维素/半纤维素到单糖的大约60%的转化。然后,将剩下的40%的未水解的纤维转移到第二反应器中。预期,具有碳水化合物结合部分的酶将结合到未水解的纤维上。而且,溶解在夹带在纤维中的液体中的酶也将被转移到第二反应器中。除了从第一反应器中回收的酶以外,少量的酶优选地被添加到第二反应器中。
[0116] 优选地,依据未水解的纤维的量,按比例地缩小第二水解反应器的尺寸,以实现与第一反应器中的相同或至少类似的TSS。
[0117] 对于任意后面的水解反应器,可以以相同的方式重复整个方法,然后所述反应器被适当地按比例缩小。
[0118] 总的来说,根据这个优选的实施方式,在根据本发明的方法中,使用级联的两个或更多个用于水解的反应器,其中至少一些水解产物与固相分离且在任意的后面的反应器中经历进一步的加工,水解产物即来自第一反应器的包含水解的纤维素生物质和酶的液相,且其中所述固相被添加到优选地尺寸和/或体积小于第一反应器的后面的反应器中,其中额外的预定量的酶可以被添加到所述后面的反应器中。实施例
[0119] 还应用到整个说明书中的以下约定应用于实施例中:
[0120] 温度以℃计给出
[0121] 除非另外说明,否则%表示重量%
[0122] 葡萄糖当量=可来源于底物中的纤维素的葡萄糖的量
[0123] 木糖当量=可来源于底物中的木聚糖的木糖的量
[0124] 实施例1
[0125] 为了确定第一反应器的近似的平均保留时间,水解以类似于WO2010/078930的实施例1中所描述的条件制备的碱性亚硫酸盐蒸煮的甘蔗渣底物的一个样品。在带搅拌器(FL 100/6W)的杯中在Phy-sica MCR 101流变仪中进行水解。转速为30rpm且温度为50℃。纤维素生物质浓度为10%且酶添加为40%V/w的Accellerase Duet(Genencor,CA,美国)连续监测粘度且图4中显示了随时间变化的粘度。
[0126] 水解导致粘度先快速下降,接着在一小段时间后,粘度曲线开始变平且达到其中样品可以被看作液体或液体样的水平。这种粘度取决于底物(在此:纤维素生物质)和试验条件,但当粘度小于3Pas(帕斯卡秒)即小于3000厘泊时,可以认为被水解的材料被液化。
[0127] 通过液化时间来确定(第一)反应器的最小平均保留时间,液化时间又依赖于几个参数,比如底物、底物浓度及酶的量和类型。
[0128] 实施例2
[0129] 使在如WO 2010/078930的实施例2所描述的类似条件下制备的酸性亚硫酸盐蒸煮的甘蔗渣底物(甘蔗渣浆料)的样品在如图6所示的具有串联的3个反应器的实验装置中经历连续水解。系统的总体积被测量为约6.6升。覆盖(mantled)反应器且连接到用于温度控制的水浴中,且冷却水盖子中循环,以使来自反应器的蒸发最小化。
[0130] 酶(来自Genencor的Accellerase DUET,CA,美国)、缓冲液(醋酸钠缓冲液,在处于稳定状态下的反应器中浓度为50mM)和甘蔗渣浆料被不断地添加到反应器1中。反应混合物被保持在50℃的反应器1-3中。在被水冷却到约5℃的产物罐中收集水解产物。
[0131] 输入到系统的平均总输入为144.2g/h。在输入中的平均干燥底物浓度为17.1%且平均酶加载量为0.273g Accellerase DUET/g干燥底物。假设反应混合物的密度为1.0g/ml,计算出平均水解(保留)时间为46小时。
[0132] 定期称量从系统到产物罐的输出。输出比到系统的输入平均低5.1%。假设损失的主要原因是来自三个反应器的水的蒸发和/或材料在反应器中的积聚。每天从全部三个反应器中取出样品两次,以测量葡萄糖和木糖收率。4-5天后,葡萄糖和木糖的值在三个反应器中稳定,因此表明达到稳定状态条件。以(g葡糖糖输出/h)/(g葡萄糖当量输入/h)来计算葡萄糖收率。以稳定状态下的三天内的平均值计算的在三个反应器中的葡萄糖收率为24.6%(反应器1)、40.2%(反应器2)和49.6%(反应器3)。以(g木糖输出/h)/(g木糖当量输入/h)来计算木糖收率。以稳定状态下的三天内的平均值计算的在三个反应器中的木糖收率为33.7%(反应器1)、56.0%(反应器2)和66.0%(反应器3)。使用装有带搅拌器(FL 100/6W)的杯的Physica MCR 101流变仪来测量粘度,转速为1rpm且温度为50℃。在稳定状态下在反应器1中的粘度的平均值为1.7Pas(帕斯卡秒),相比之下,输入(17.1%底物悬浮液)的粘度被测量为82.2Pas。
[0133] 这个实例表明,仅使用常规的搅拌,在稳定状态下在高固体负载量下的连续水解方法以非常高的葡萄糖和木糖收率生产水解产物。在第一个反应器中的粘度显著低于在稳定状态下的进料的粘度。
[0134] 实施例3
[0135] 使在如WO 2010/078930的实施例1所描述的类似条件下制备的碱性亚硫酸盐蒸煮的甘蔗渣底物(甘蔗渣浆料)的样品在如图6所示的具有串联的3个反应器的实验装置中经历水解。系统的总体积被测量为约6.6升。覆盖反应器且连接到用于温度控制的水浴中,且冷却水在盖子中循环,以使来自反应器的蒸发最小化。
[0136] 酶(来自Genencor的Accellerase DUET,CA,美国)、缓冲液(醋酸钠缓冲液,在处于稳定状态下的反应器中浓度为50mM)和甘蔗渣浆料被不断地添加到反应器1中。反应混合物被保持在50℃下的反应器1-3中。在被水冷却到约5℃的产物罐中收集水解产物。
[0137] 输入到系统的平均总输入为144.1g/h。在输入中的平均干燥底物浓度为18.8%且平均酶加载量为0.173g Accelerase DUET/g干燥底物。假设反应混合物密度为1.0g/ml,平均水解(保留)时间被计算为46小时。
[0138] 定期称量从系统到产物罐的输出。输出比到系统的输入平均低1%。假设损失的主要原因是来自三个反应器的水的蒸发和/或材料在反应器中的积聚。每天从全部三个反应器中取出样品两次,以测量葡萄糖和木糖收率。4-5天后,葡萄糖和木糖的值在三个反应器中稳定,因此表明达到稳定状态条件。以(g葡萄糖输出/h)/(g葡萄糖当量输入/h)来计算葡萄糖收率。以稳定状态下的三天内的平均值计算的在三个反应器中的葡萄糖收率为39.8%(反应器1)、55.0%(反应器2)和58.8%(反应器3)。以(g木糖输出/h)/(g木糖当量输入/h)来计算木糖收率。以稳定状态下的三天内的平均值计算的在三个反应器中的木糖收率为75.0%(反应器1)、93.2%(反应器2)和89.6%(反应器3)。使用装有带搅拌器(FL 100/6W)的杯的Physica MCR 101流变仪来测量粘度,转速为30rpm且温度为
50℃。在稳定状态下在反应器1中的粘度的平均值为1.5Pas(帕斯卡秒),相比之下,模拟输入(因为粘度非常高,使用10%底物悬浮液而不是18.8%底物悬浮液)的粘度被测量为
249Pas。
[0139] 这个实施例表明,仅使用常规的搅拌,在稳定状态下在高固体负载量下的基于不同底物的连续水解方法以非常高的葡萄糖和木糖收率生产水解产物。在第一个反应器中的粘度显著低于在稳定状态下的进料的粘度。
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