糖液的制造方法及其装置 |
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| 申请号 | CN201180013901.9 | 申请日 | 2011-03-14 | 公开(公告)号 | CN102791874A | 公开(公告)日 | 2012-11-21 |
| 申请人 | 东丽株式会社; | 发明人 | 栗原宏征; 南野淳; 山本优树; 山田胜成; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的在于提供糖液的制造方法，其特征在于，是重复包含以下工序(1)～(3)的糖液制造工艺而制造糖液的方法，其中，将工序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造工艺的工序(1)中使用。(1)在 纤维 素中添加来源于丝状菌的 纤维素 酶而进行一次 水 解 的工序；(2)在工序(1)的水解物中添加未使用的来源于丝状菌的纤维素酶而进行二次水解的工序；以及(3)将工序(2)的水解物进行固液分离，从所得的糖液中获得回收酶的工序。由此，提供在由纤维素前处理物制造糖液的方法中，削减纤维素酶等的酶使用量的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.糖液的制造方法，其特征在于，是重复包含以下工序(1)～(3)的糖液制造工艺而制造糖液的方法，其中，将工序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造工艺的工序(1)中使用， |
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| 说明书全文 | 糖液的制造方法及其装置技术领域背景技术[0002] 以糖为原料的化学品发酵生产工艺被用于各种工业原料生产中。作为该成为发酵原料的糖，现在工业上使用来源于甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是从今后世界人口增加引起食用原料价格暴涨、或与食用竞争这样的伦理方面出发，构建由可再生的非食用资源、即含纤维素的生物质来有效地制造糖液的工艺，或者以所得的糖液为发酵原料有效地转换成工业原料的工艺成为今后的课题。 [0003] 作为由含纤维素的生物质制造糖液的方法，公开了使用浓硫酸将纤维素和半纤维素进行酸水解来制造糖液的方法(专利文献1或2)；通过将含纤维素的生物质用稀硫酸进行水解处理之后再用纤维素酶等进行酶处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。此外，作为不使用酸的方法，公开了：使用250～500℃左右的亚临界水将含纤维素的生物质进行水解来制造糖液的方法(专利文献3)；通过在对含纤维素的生物质进行亚临界水处理之后再进行酶处理来制造糖液的方法(专利文献4)；以及通过在将含纤维素的生物质用240～280℃的加压热水进行水解处理之后再进行酶处理来制造糖液的方法(专利文献5)。 [0004] 近年来，特别广泛研究了能量使用量和环境负荷少、且糖收量多的使用酶的生物质的水解方法。然而，作为这样的使用酶的方法的缺点，存在酶费高这样的课题。 [0005] 作为解决这样的技术课题的方法，提出了将水解所使用的酶回收再利用的方法。公开了例如：利用自旋过滤器进行连续固液分离，将所得的糖液通过超滤膜进行过滤，从而回收酶的方法(专利文献6)；通过在酶糖化的阶段加入表面活性剂来抑制酶吸附，从而提高回收效率的方法(专利文献7)；将酶糖化后的残渣进行通电处理从而回收酶成分的方法(专利文献8)；将酶糖化后的残渣再次加入到新的生物质中从而将酶进行回收再利用的方法(专利文献9)等。 [0006] 现有技术文献 [0007] 专利文献 [0008] 专利文献1:日本特表平11-506934号公报 [0009] 专利文献2:日本特开2005-229821号公报 [0010] 专利文献3:日本特开2003-212888号公报 [0011] 专利文献4:日本特开2001-95597号公报 [0012] 专利文献5:日本特许3041380号公报 [0013] 专利文献6:日本特开2006-87319号公报 [0014] 专利文献7:日本特开昭63-87994号公报 [0015] 专利文献8:日本特开2008-206484号公报 [0016] 专利文献9:日本特开昭55-144885号公报 [0017] 非专利文献 [0018] 非专利文献1:A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002)发明内容 [0019] 发明要解决的课题 [0020] 如上所述，对于使用酶的纤维素的水解方法进行了开发，但在削减酶使用量这样的观点中，其效果不充分。因此，本发明的课题是开发提高现有的方法中的酶使用量的削减效果的工艺。 [0021] 用于解决课题的方法 [0022] 本发明具有以下[1]～[11]的构成。 [0023] [1]糖液的制造方法，其特征在于，是重复包含以下工序(1)～(3)的糖液制造工艺而制造糖液的方法，其中，将工序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造工艺的工序(1)中使用， [0024] (1)在纤维素中添加来源于丝状菌的纤维素酶而进行一次水解的工序； [0025] (2)在工序(1)的水解物中添加未使用的来源于丝状菌的纤维素酶而进行二次水解的工序；以及 [0026] (3)将工序(2)的水解物进行固液分离，从所得的糖液中获得回收酶的工序。 [0027] [2]根据[1]所述的糖液的制造方法，其特征在于，作为糖液制造工艺中的上述工序(1)中的来源于丝状菌的纤维素酶，使用从利用来源于丝状菌的纤维素酶获得的纤维素水解物中回收的回收酶成分。 [0028] [3]根据[1]或[2]所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述工序(1)或(2)中的来源于丝状菌的纤维素酶包含来源于木霉属微生物的培养液的成分。 [0029] [4]根据[1]～[3]的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述回收酶包含木聚糖酶和/或木糖苷酶。 [0030] [5]根据[1]～[4]的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述回收酶包含水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶。 [0032] [7]根据[1]～[6]的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，一次水解和二次水解中的酶添加量满足以下关系式：工序(1)中的回收酶的添加量＞工序(2)中的未使用酶量的添加量。 [0033] [8]根据[1]～[7]的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述工序(3)中的来源于丝状菌的纤维素酶的回收，是将糖液通过超滤膜进行过滤，从非透过侧回收。 [0034] [9]装置，是用于包含水解纤维素的工序的糖液的制造方法的装置，其中，作为构成，包含：连接了回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽、将水解物进行固液分离的装置、具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管内的回收酶的除去的水供给配管的糖液保持罐、以及用于分离酶与糖液的超滤膜装置。 [0035] [10]装置，是用于包含水解纤维素的工序的糖液的制造方法的装置，其中，作为构成，包含：用于将回收酶与纤维素混合而进行一次水解的纤维素/回收酶混合装置、连接了纤维素/回收酶混合物供给配管和未使用酶投入配管的水解槽、将水解物进行固液分离的装置、具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管内的回收酶的除去的水供给配管的糖液保持罐、和用于分离酶与糖液的超滤膜装置。 [0036] [11]装置，作为构成，除了[9]或[10]所述的装置构成之外，进一步包含浓缩糖液的反渗透膜和/或纳滤膜装置。 [0037] 发明的效果 [0038] 在回收再利用纤维素酶的纤维素的水解方法中，通过在添加未使用酶之前，实施添加回收酶的一次水解，接着进一步添加未使用酶进行二次水解，从而可以大幅削减水解时使用的酶量，进而来自含纤维素的生物质的糖生成效率大幅提高。附图说明 [0039] 图1是显示本发明的水解方法中的步骤的概略图。 [0040] 图2是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0041] 图3是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0042] 图4是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0043] 图5是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0044] 图6是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0045] 图7是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0046] 图8是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0047] 图9是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0048] 图10是显示本发明中使用的装置的概略图。 [0049] 图11是显示将水不溶性的来源于木霉属的纤维素酶成分进行SDS-PAGE的结果的图。 具体实施方式[0050] 纤维素在甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸、稻秸、麦秸等草本系生物质、或树木、废建材等木质系生物质中大量含有，在本发明中，优选利用这些含纤维素的生物质作为原料。 [0051] 含纤维素的生物质中，除了纤维素和半纤维素(以下作为纤维素和半纤维素的总称称为“纤维素”)之外，还含有作为芳香族高分子的木质素等，因而在本发明的糖液的制造方法中以来源于生物质的纤维素为糖液的原料的情况下，可以通过进行前处理来提供利用酶的水解效率。作为含纤维素的生物质的前处理方法，可列举酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、苛性钠处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理，但在本发明中优选碱处理、水热处理或稀硫酸处理。 [0052] 碱处理有作为碱使用氢氧化钠、氢氧化钙、氨等碱的方法，但可以特别优选使用氨。这样的氨处理可以通过日本特开2008-161125号公报和日本特开2008-535664号公报所记载的方法实施。例如，使用的氨浓度相对于生物质以0.1～15重量％的范围添加，在4～200℃、优选为90～150℃进行处理。添加的氨可以是液体状态、或气体状态的任一者。 进而添加的方式可以是纯氨也可以是氨水溶液的方式。对处理次数不特别限定，将上述处理进行1次以上即可。特别是在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。通过氨处理所得的处理物为了进一步进行利用酶的水解反应，需要进行氨的中和或氨的除去。中和可以对从水解物通过固液分离而除去固体成分后的氨进行，也可以在含有固体成分的状态下直接进行。对中和所使用的酸试剂不特别限定。 氨的除去可以通过将氨处理物保持在减压状态下使氨以气体状态挥发而除去。另外除去的氨可以回收再利用。 [0053] 在水热处理的情况下，以含纤维素的生物质为0.1～50重量％的方式添加水，然后100～400℃的温度下处理1秒～60分钟。通过在这样的温度条件下处理，从而纤维素的水解发生。对处理次数不特别限定，将该处理进行1次以上即可。特别在将该处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。 [0054] 在稀硫酸处理的情况下，硫酸的浓度优选为0.1～15重量％，更优选为0.5～5重量％。反应温度可以在100～300℃的范围内设定，优选在120～250℃设定。反应时间可以在1秒～60分钟的范围内设定。对处理次数不特别限定，将上述处理进行1次以上即可。特别是在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。稀硫酸处理所得的水解物含有酸，为了进一步进行利用纤维素酶的水解反应，或为了作为发酵原料使用，需要进行中和。 [0055] 本发明的特征在于，将上述的纤维素通过来源于丝状菌的纤维素酶进行水解。纤维素的水解是指，通过纤维素酶的作用使纤维素低分子量化，生成单糖或寡糖。作为水解的反应条件，只要依据纤维素酶的优选反应条件进行即不限定，一般反应温度优选为15℃～100℃的范围，更优选为40℃～60℃，进一步优选为50℃。水解的pH值优选为pH值3～9的范围，更优选为pH值4～5.5，进一步优选为pH值5。pH值调整可以通过添加酸或碱至所需的pH值来调整。另外，可以使用适宜的缓冲液。在水解中，为了促进纤维素与酶的接触，另外为了使水解物的糖浓度均匀，优选进行搅拌混合。纤维素的固体成分浓度优选加水至1～25重量％的范围，更优选8～20重量％的范围。 [0056] 作为来源于丝状菌的纤维素酶，可以例示木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌、褐腐菌等。在这样的来源于丝状菌的纤维素酶的中，优选使用纤维素分解活性高的来源于木霉属的纤维素酶。 [0057] 来源于木霉属的纤维素酶是以来源于木霉属微生物的纤维素酶为主成分的酶组合物。对木霉属微生物不特别限定，优选为里氏木霉(Trichoderma reesei)，具体可以例示里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reesei QM9123)、里 氏 木 霉RutC-30(Trichoderma reesei Rut C-30)、里 氏 木 霉ATCC68589(Trichoderma reeseiATCC68589)、里 氏 木 霉 PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里 氏 木 霉 MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿 色 木 霉QM9123(Trichoderma viride 9123)。另外，还可以是对来源于上述木霉属的微生物通过突变剂或紫外线照射等进行突变处理，从而纤维素酶生产性提高了的突变株。 [0058] 本发明中使用的来源于丝状菌的纤维素酶，是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多种酶成分的、具有将纤维素水解并糖化的活性的酶组合物。来源于丝状菌的纤维素酶在纤维素分解中，通过多种酶成分的协同效果或互补效果，从而可以进行有效的纤维素的水解。 [0059] 纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始水解下去为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。 [0060] 内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。 [0061] 外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。 [0062] β-葡糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.21记载了归属于β-葡糖苷酶的酶群。 [0063] 木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别作用于木聚糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.8记载了归属于木聚糖酶的酶群。 [0064] 木糖苷酶是以作用于木寡糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.37记载了归属于木糖苷酶的酶群。 [0065] 作为来源于木霉属的纤维素酶，优选使用包含来源于木霉属微生物的培养液的成分的物质。来源于木霉属的培养液的成分包含：在以使木霉属的微生物产生纤维素酶的方式调制的培养基中培养而得的培养液所含的纤维素酶以外的全部成分。即，可以例示纤维素酶以外的酶成分、木霉属微生物菌体、培养中使用的培养基成分等。特别作为培养中使用的培养基成分，可以例示葡萄糖或木糖等单糖、玉米浆、酵母提取液(yeast extract)、纤维素等的纤维素酶生产诱导物质、矿物、维生素成分等。作为来源于木霉属微生物的培养液的成分，还可以包含木霉属微生物菌体。这是因为，通过包含木霉属微生物菌体作为本发明的来源于木霉属的纤维素酶的成分，可以增大回收酶的活性量。 [0066] 对来源于木霉属的纤维素酶中的各酶成分的重量比不特别限定，例如，来源于里氏木霉的培养液中包含50～95重量％的纤维二糖水解酶，残余成分中包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、外切-1,4-β-D-氨基葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内切-1,4-甘露糖苷酶、1,2-α-甘露糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、壳聚糖酶、壳多糖酶、1,4-α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酯酶、扩张蛋白(swollenin)、疏水蛋白(hydrophobin)等。另外，木霉属的微生物在培养液中生产强的纤维素酶成分，另一方面关于β-葡糖苷酶，由于保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β-葡糖苷酶活性低，因此除了本来保有的来源于木霉属的纤维素酶成分之外，可以进一步添加异种或同种的β-葡糖苷酶。作为异种的β-葡糖苷酶，可以优选使用来源于曲霉属的β-葡糖苷酶。作为来源于曲霉属的β-葡糖苷酶，可以例示由ノボザイム社市售的Novozyme188等。作为添加异种或同种的β-葡糖苷酶的方法，可以是培养以在木霉属的微生物导入基因使其在其培养液中产生β-葡糖苷酶的方式进行基因重组而得的木霉属的微生物，分离其培养液的方法。 [0067] 本发明的特征在于，将利用上述的来源于丝状菌的纤维素酶的纤维素的水解分成一次水解和二次水解来实施。以下按照工序依次进行说明。 [0068] 本发明中的一次水解是指对未进行酶处理的纤维素添加来源于丝状菌的纤维素酶进行水解。作为一次水解而使用的酶可以是后述的未使用酶也可以是回收酶，但由于通过使用回收酶可以提高糖生成效率，因而优选使用回收酶。作为通过在一次水解中使用回收酶来提高糖生成效率的机理，回收酶中包含由于水解时的热而一部分结构变性的酶成分，这样的酶成分对纤维素的表面存在的吸附点的吸附特别强，作为结果，非特异性地吸附于纤维素中的木质素等的吸附性的表面部位。因此，可以抑制之后投入的未使用酶成分的非特异吸附。一般地，如果比较回收酶和未使用酶在纤维素酶分解中的比活性(单位蛋白质重量的酶活性)，则未使用酶显示高活性。即，能够抑制这样的比活性更高的未使用酶成分的非特异性的吸附的结果，可以提高糖生产性和酶的回收效率。另外，作为第2的理由，本发明的回收酶具有每重复回收次数而木聚糖分解活性升高这样的特征。回收酶所含的木聚糖分解活性可以通过使用来源于桦树的木聚糖(Birch wood xylan)等的试剂木聚糖作为分解底物来测定。作为与木聚糖分解活性相关的来源于丝状菌的纤维素酶成分，有木聚糖酶和木糖苷酶。作为木聚糖酶，存在xyn1(GH11)、xyn2(GH11)、xyn3(GH10)、xyn4(GH5)、xyn5b(GH5)、xyn11(GH11)的基因。作为木糖苷酶，存在bxl1/bxl3a(GH3)、bxl3b(GH3)、bxl3c(GH3)的基因。上述基因分别编码木聚糖酶和木糖苷酶，作为来源于丝状菌的纤维素酶成分而含有。特别作为回收酶被提高了的木聚糖分解酶，可以例示木聚糖酶3(分子量38kDa、xyn3)、内切-β-1,4-木聚糖酶(分子量25kDa、xyn1)、β-木糖苷酶(分子量88kDa、bxl1/bxl3a)。通过将这样的木聚糖分解活性被提高了的回收酶添加在一次水解中，从而包围纤维素的木聚糖成分优先被水解，可以提高一次和二次水解中的糖生产性。 [0069] 一次水解的反应时间优选为15分钟～6小时的范围。如果少于15分钟，则有时糖生成效率的提高程度降低，另一方面，如果为6小时以上，则有时相对于时间的糖生成效率降低。对纤维素浓度、反应温度和pH值不特别限定，优选可以应用上述的水解条件。 [0070] 一次水解中的酶添加量优选相对于纤维素前处理物重量为1/1000～1/50的量。纤维素前处理物的重量可以通过测定纤维素前处理物所含的固体成分的重量来计算出。这样的固体成分的重量可以通过将前处理物用离心分离、膜过滤等的方法进行固液分离和水洗涤，从而分离除去水溶性化合物，然后将所得的含水固体干燥至重量恒定，测定其重量，从而计算出。另外，酶添加量可以通过用BCA法测定包含未使用酶的溶液中的蛋白质浓度，将该蛋白质浓度乘以添加的未使用酶的溶液量，从而计算出。 [0071] 一次水解所得的一次水解物中积累了水解所生成的单糖成分。特别是在一次水解中使用回收酶的情况下，木聚糖分解活性倾向于提高。即，在一次水解中使用回收酶时的一次水解物具有大量生成木糖这样的特征。通过本发明的一次水解获得的一次水解物可以直接在该状态下或在进行了固液分离等提高未分解的固体物浓度的操作之后，进行后述的二次水解。另外在一次水解之后进行固液分离的情况下，分离所得的溶液成分可以作为糖液利用。 [0072] 本发明中的二次水解是指相对于上述的一次水解所得的水解物进一步添加未使用酶而进行水解。对一次水解物，不需要进行特别的固液分离操作。另外，根据需要，也可以进一步添加水，但不特别限定。 [0073] 在本发明中，将未使用酶在二次水解中投入和使用。作为其目的，可列举1)通过一次水解中的投入酶量(未使用酶或回收酶)纤维素的分解效率不充分，因而通过追加投入来获得充分的纤维素分解效率，2)分成一次水解和二次水解的2次，通过投入未使用酶可以提高糖生成效率和酶回收效率，作为其目的。另外特别是在仅实施使用回收酶的一次水解的情况下，第2次以后的糖生产量减少，因此不优选。因此，通过除了回收酶，在二次水解中进一步投入未使用酶，可以进行与第1次、或上一次的糖生产量同等的生产。即在本糖液的制造方法中，可以重复进行一定以上的糖浓度的生产。 [0074] 二次水解中的未使用酶的添加可以分多次投入(分开投入)。例如，可考虑一次水解结束后，投入应在二次水解中添加的未使用酶量的一半，进行数小时水解之后，进一步投入剩余的一半等的方法。在本发明中，即使如这样在二次水解中分几次分开投入新酶，也将这些操作总称为二次水解。 [0075] 二次水解的反应时间优选比一次水解长。另外，作为具体的二次水解的反应时间，优选为1～200小时的范围，更优选为6～72小时的范围，进一步优选为12～24小时的范围。反应时间是应根据酶的使用量、反应温度、和目的糖浓度等调整的事项，但在考虑纤维素酶的回收再利用的情况下，如果反应时间超过200小时，则有时发生纤维素酶的热失活。另一方面，如果反应时间不足1小时，则有时不能获得充分的糖浓度的水解物。 [0076] 二次水解中的酶添加量优选相对于纤维素前处理物重量为1/1000～1/50的量。关于纤维素前处理物重量，可以用上述一次水解前的纤维素前处理物的固体成分的重量来计算出。 [0077] 关于一次水解和二次水解中的酶添加量，优选满足以下关系式：一次水解中的酶添加量＞二次水解中的酶添加量。这里所说的添加量，可以通过对添加的未使用酶或回收酶的蛋白质浓度乘以投入的酶溶液量来计算出。蛋白质浓度的测定可以通过上述的公知的方法来计算出回收酶以及未使用酶的蛋白质浓度。这里所说的蛋白质浓度单纯地是蛋白质浓度，不限定其是来源于纤维素酶的成分还是其他成分。在本发明中，在满足该添加量的关系式时，可以获得更多的糖生产量，另外酶的回收效率也可以进一步提高。 [0078] 另外本发明的特征在于，具有将二次水解物进行固液分离，从所得的糖液中回收来源于丝状菌的纤维素酶的工序，和将回收的来源于丝状菌的纤维素酶在一次水解中再利用的工序。以下，按工序依次说明。 [0079] 二次水解物的固液分离是为了分离二次水解所得的糖液和水解残渣而进行的。糖液是指通过上述的纤维素的水解而得的糖溶液。一般糖根据单糖的聚合度来分类，可分类为葡萄糖、木糖等单糖类，2～9个单糖脱水缩合而成的寡糖类，以及10个以上单糖脱水缩合而成的多糖类。本发明所得的糖液中包含葡萄糖或木糖作为主成分，另外虽然为少量但也包含纤维二糖等寡糖、和阿拉伯糖、甘露糖等单糖。作为具体的溶解于水的单糖、寡糖、多糖的分析方法，可以利用HPLC通过与标准品的比较来定量。对固液分离的方法不特别限定，可以通过螺旋沉降器等的离心法、压滤机等的过滤法、精滤膜等的膜分离法来进行固液分离。 [0080] 另外，来源于丝状菌的纤维素酶在二次水解物中以溶解于糖液的状态或吸附于作为未分解物的固体残渣上的状态的任一状态存在，可以将这样的来源于丝状菌的纤维素酶通过固液分离从糖液侧回收。作为从糖液中回收来源于丝状菌的纤维素酶的方法，可列举将糖液通过超滤膜进行过滤，从非透过侧回收纤维素酶的方法作为优选例。作为使用的超滤膜，可以使用聚醚砜(PES)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素等原料的膜，由于再生纤维素受到纤维素酶的分解，因而优选使用以PES、PVDF等合成高分子为原料的超滤膜。超滤膜的截留分子量只要能够有效地回收所使用的纤维素酶即可，不特别限定，优选为截留分子量1000～50000的范围的超滤膜。回收酶量根据二次水解中添加的未使用酶的添加量而其回收酶量发生变动，因此不特别限定。 [0081] 在重复本发明中的回收再利用的操作中，特别是在利用超滤膜的回收酶的分离过程中，有时作为回收酶成分得到水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分。这样的水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分是在水解中的过程、或利用超滤膜等的酶回收的过程中生成的酶成分。这样的水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分优选不通过固液分离、过滤等除去，而直接作为回收酶成分使用。作为水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分，主要由纤维二糖水解酶构成。水不溶性是指在回收酶液中作为沉淀、絮凝物、颗粒、微粒的状态存在，通过将回收酶装入管中进行离心处理，可以将水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分作为沉淀分离。作为沉淀回收的水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分可以以白色、淡黄色、褐色、等颜色确认。可以分离水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分，通过再悬浮于水中而使其一部分溶解。但是，为了使其完全溶解，需要添加尿素、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、Tween80、Triton X等)。通过将包含这样的水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分的回收酶在一次水解中再利用，可以获得更高的糖生产性。 [0082] 从二次水解物中回收的来源于丝状菌的纤维素酶(以下称为回收酶)在一次水解中被再利用。在一次水解中使用回收酶的优点如上所述。对于回收酶的再利用次数不特别限定。 [0083] 在本发明中，将来自二次水解物的回收酶在一次水解中再利用时的酶添加量优选多于二次水解中的未使用酶的添加量。这里的酶添加量如上所述通过蛋白质的量来测定。一般地，回收酶的纤维素酶活性(相对于蛋白质的量酶活性)低于未使用酶的纤维素酶活性，但在本发明中，在一次水解中再利用的回收酶添加量＞二次水解中的未使用酶添加量的情况下，相对于未使用酶量的糖生成效率增大。 [0084] 由本发明获得的糖液中包含来源于纤维素、半纤维素(木聚糖、阿拉伯聚糖)的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等单糖。对单糖的构成比率不特别限定，主要的单糖成分是葡萄糖和木糖。本发明的糖液中虽然与单糖相比为微量，但也包含纤维二糖等寡糖等。对糖液所含的单糖浓度不特别限定，优选为0.1～20重量％，进一步优选为5～20重量％。如果糖液浓度在5～20重量％的范围内，则糖液不需要特别的浓缩就可以作为微生物的发酵原料使用。 [0085] 本发明的糖液可以通过纳滤膜和/或反渗透膜进行浓缩。本发明中使用的纳滤膜或反渗透膜的原料可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、乙烯基聚合物、聚砜等高分子原料，但不限于由上述1种原料构成的膜，可以是包含多种膜原料的膜。 [0086] 本发明中使用纳滤膜优选使用螺旋型的膜元件。作为优选的纳滤膜元件的具体例，可列举例如，作为乙酸纤维素系的纳滤膜元件的GE Osmonics社制GEsepa、以聚酰胺为功能层的ァルファラバル社制纳滤膜元件NF99或NF99HF、以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フィルムテック社制纳滤膜元件NF-45、NF-90、NF-200、NF-270或NF-400、或包含以交联哌嗪聚酰胺为主成分的東レ株式会社制纳滤膜UTC60的東レ株式会社制纳滤膜元件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选为NF99或NF99HF、NF-45、NF-90、NF-200或NF-400、或SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，进一步优选为SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。 [0087] 另外，本发明中使用的反渗透膜与纳滤膜同样地优选使用螺旋型的膜元件。作为优选的反渗透膜元件的具体例，可列举例如，作为東レ株式会社制聚酰胺系反渗透膜组件的低压型的SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P，以及包含作为反渗透膜的UTC70的高压型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA、東レ株式会社制乙酸纤维素系反渗透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200、日东电工(株)制NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D、ァルファラバル制RO98pHt、RO99、HR98PP、CE4040C-30D、GE制GE Sepa、Filmtec制BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040等。 [0088] 关于用于实施利用本发明的酶水解纤维素的糖液的制造方法的装置，参考附图进行具体说明。 [0089] 本发明的装置的特征在于，作为用于实施上述糖液的制造方法的装置机构，是将以下1～4功能性地连接而成的装置构成：1.连接有回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽、2.将水解物进行固液分离的装置、3.具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管内的回收酶的除去的水供给配管的糖液保持罐、4.用于分离酶和糖液的超滤膜装置。即本发明的糖液的制造方法的特征在于，进行使用回收酶的一次水解。为了实施该水解，设置了1.连接有回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽。接着，为了分离水解物所含的回收酶，设置了2.将水解物进行固液分离的装置、和4.用于分离酶和糖液的超滤膜装置。进而为了在除去回收的回收酶液的同时进行超滤膜的洗涤，设置了3.具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管内的回收酶的除去的水供给配管的糖液保持罐。以下作为更具体的装置实施例，例示图2～图10，以下进行说明。 [0090] 图2是实施本发明的方法的装置的一例。即，图2的装置是包含独立地连接有回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6的水解槽1、以及将水解物进行固液分离的压滤装置9、具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管15内的回收酶的除去的水供给配管11的糖液保持罐12、和用于分离酶与糖液的超滤膜装置14作为构成的装置，其中，所述回收酶投入配管4能够将回收酶独立地投入水解槽、或能够进一步控制投入，未使用酶投入配管6能够将未使用酶独立地投入水解槽，或能够进一步控制投入。水解槽1进一步设置了用于保持水解的温度的保温设备2、用于搅拌混合木质纤维素的搅拌翼3、纤维素投入口7。回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6分别介由阀与回收酶保持罐5和未使用酶保持罐8连接。阀优选为夹管阀并被另外电子控制。 [0092] 通过压滤获得的糖液被保持在糖液保持罐12中。糖液保持罐12介由循环泵13与超滤膜装置14连接。通过到超滤膜的膜侧(非透过侧)的回收酶经由循环配管15返回糖液保持罐12。除去了酶的糖溶液在二次侧(透过侧)作为滤液被回收。被回收至糖液保持罐12的回收酶经由回收酶配管16和泵被送液至回收酶保持罐5。由水供给配管11向糖液保持罐12供水，使该水通过循环泵13在超滤膜装置14以及循环配管15中循环，从而将保持在超滤膜的表面或循环配管15内的回收酶成分进一步作为溶液回收，因此是有效率的。另外，还可以回收附着于超滤膜表面等的水不溶性的来源于丝状菌的纤维素酶成分。进而另外，该水的循环还可以洗涤超滤膜装置14所具备的超滤膜的表面，对膜污染的抑制也发挥作用。进一步通过该操作而保持在糖液保持罐12中的水经由回收酶配管16被送入回收酶保持罐5。因此，由水供给配管11供给的水可以在水解槽1中的木质纤维素的水解中使用。 [0093] 图3是实施本发明的方法的装置的另外一例。即，图3记载的装置是包含水解槽1、将水解物进行固液分离的压滤装置9、具有用于超滤膜的洗涤和/或保持在循环配管15内的回收酶的除去的水供给配管11的糖液保持罐12、和用于分离酶与糖液的超滤膜装置 14作为构成的装置，所述水解槽1独立地连接有用于将回收酶与纤维素混合而进行一次水解的纤维素/回收酶混合装置18、纤维素/回收酶混合物投入配管17和未使用酶投入配管 6。与图2的装置的不同点是，纤维素/回收酶混合装置18、及其供给口17。纤维素/回收酶混合装置18是用于将纤维素与回收酶混合的装置，其中，通过内部螺旋而将回收酶与纤维素搅拌混合。在纤维素/回收酶混合装置18中，进行工序(1)的一次水解。纤维素/回收酶混合装置18可以被保温在适合一次水解的温度。另外也可以将回收酶预先保温，使其在纤维素/回收酶混合装置18内与纤维素混合来进行一次水解。通过在该纤维素/回收酶混合装置18中预先实施回收酶与纤维素的混合，可以削减水解槽1中的搅拌混合动力消耗。另外通过在纤维素/回收酶混合装置18中预先实施回收酶与纤维素的混合，还可以缩短水解槽1中纤维素的均匀分散化所花费的时间，作为结果可以进一步缩短水解时间。进而从纤维素/回收酶混合装置18获得的一次水解物通过纤维素/回收酶混合物供给配管 17而被投入水解装置1中。然后，由未使用酶投入配管6添加工序(2)的未使用的含有来源于丝状菌的纤维素酶的酶进行二次水解。关于之后的固液分离、和酶回收操作，与图2的装置相同。 [0094] 图4是实施本发明的方法的装置的另外一例。图4的装置是对上述图2的装置设置包含压滤机的固液分离装置19时的装置。另外，关于图2所述的回收酶保持罐5、未使用酶保持罐8、搅拌翼3，根据需要设置即可，因此在图4中未记载。通过固液分离装置19被分离的固体物由固体物排出配管20被除去。固液分离装置19可以如上述图2和图3那样是压滤机，另外作为其他固液分离装置，可以例示连续离心机、螺旋沉降器、德拉瓦尔(De Laval)离心机、螺旋压力机、带型过滤器、鼓型过滤器等。基本的装置特征有：回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6独立地与水解槽连接，可以独立地控制回收酶的添加和未使用酶的添加；水供给配管11与糖液保持罐12连接，由水供给配管11供给的水在超滤膜装置14中循环，以该水通过回收酶配管16而能够供给至水解槽1的方式连接，与图2、图3的装置相同。 [0095] 图5是实施本发明的方法的装置的另外一例。图5的装置是与上述图4的装置基本相同，但超滤膜14的非透过液与回收酶保持罐5连接的装置。特别该装置是作为超滤膜使用螺旋元件并将其串联连接、或树状连接时的装置。该装置中也与图2～4相同，水供给配管11与糖液保持罐12连接，由水供给配管11供给的水通过由三通阀21切换配管而在超滤膜装置14中循环，进一步切换三通阀21后，该水被供给至回收酶保持罐5。进而回收酶保持罐5上连接有回收酶配管16，通过该回收酶配管16能够供给至水解槽1。回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6独立地与水解槽连接，可以独立地控制回收酶的添加和未使用酶的添加，这与图2～4的装置相同。 [0096] 图6是实施本发明的方法的装置的另外一例。在图6装置中，显示在固液分离装置19的后段进一步设置了精滤膜装置22的装置。在固液分离装置19中不能充分除去固体物的情况下，进一步通过用精滤膜装置22处理，可以获得几乎完全不含固体物的液。由此，可以降低后段超滤膜装置14的膜污染。 [0097] 图7是图6的精滤膜装置22的详细图，是显示实施错流过滤的装置构成的图。是将在固液分离装置19中被分离的滤液保持在固液分离滤液罐23中，介由泵24对精滤膜25进行错流过滤的装置。精滤膜25可以是平膜、中空丝膜的任一种。中空丝膜可以是内压式或外压式的任一种。 [0098] 图8是图6的精滤膜装置22的详细图，是显示在精滤膜装置22中实施死端过滤的装置构成的图。将在固液分离装置19中分离的滤液保持在固液分离滤液保持罐23中，用精滤膜25进行过滤。在死端过滤的情况下，可以具备用于进行膜表面的气泡洗涤的压空供给装置26，另外还可以设置用于逆洗的逆洗泵27。此外，逆洗可以是回收于糖液保持罐12中的滤液，也可以是一般的膜洗涤水和药液。精滤膜25可以是平膜、中空丝膜的任一种。 中空丝膜可以是内压式或外压式的任一种。 [0099] 图9是实施本发明的方法的装置的另外一例。本发明的糖液的制造装置可以是进一步具备浓缩糖液的反渗透膜和/或纳滤膜的装置。作为图9，显示了在图4的装置上连接了纳滤膜或反渗透膜装置30的装置。在超滤膜装置14的滤液侧进一步连接糖液浓缩罐28，介由高压泵29用反渗透膜和/或纳滤膜30进行过滤。糖液被反渗透膜和/或纳滤膜阻止，因此被浓缩于糖液浓缩罐28中。另一方面，剩余水可以作为滤液除去。反渗透膜和/或纳滤膜装置30可以是图2～6的任一装置，也可以通过与超滤膜装置14的滤液侧连接来设置。 [0100] 图10是实施本发明的方法的装置的另外一例。优选回收酶投入配管4、和未使用酶投入配管6独立地与水解槽1连接，但只要上述配管4和配管6能够控制各自的酶成分的投入，则也可以是通过三通阀31等合流连接后、作为1个配管(未使用酶或回收酶投入配管)与水解槽1连接的方式。 [0101] 由水供给配管11供给的水可以是温水。如果考虑到酶的失活，则温水的温度优选为60℃以下。另外，通过使由水供给配管供给的水为温水，从而可以在超滤膜装置14内循环时获得超滤膜的高的洗涤效果。洗涤效果优选温水的温度为30℃～60℃。 [0102] 实施例 [0103] 以下，通过实施例更具体地说明本发明。但是本发明不限于这些实施例。 [0104] (参考例1)纤维素酶的制备(来源于木霉属的纤维素酶酶组合物) [0105] 来源于木霉培养液的酶组合物通过以下方法来制备。 [0106] [前培养] [0107] 以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.01％(w/vol)。在该前培养培养基中接种里氏木霉5 ATCC68589使其为1×10 个/mL，以28℃、72小时、180转/分钟振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKERBR-40LF)。 [0108] [主培养] [0109] 以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(艾维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2%(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.1％，接种250mL预先通过上述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉ATCC68589。然后，以28℃、87小时、300转/分钟、通气量1vvm进行培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(Millipore公司制ステリカップ-GV材质：PVDF)。对以该上述条件制备的培养液，添加蛋白质重量比为1/100的量的β-葡糖苷酶(Novozyme188)，将所得产物作为来源于木霉属的纤维素酶在以下实施例中使用。 [0110] (参考例2)纤维素前处理物的制备 [0111] [纤维素前处理物1的制备] [0112] 将市售的艾维素(メルク社制)不进行特别处理而作为纤维素前处理物1在以下的实施例中使用。 [0113] [纤维素前处理物2的制备] [0114] 作为含纤维素的生物质使用稻秸。将含纤维素的生物质浸于硫酸1％水溶液中，在150℃进行30分钟高压釜处理(日东高压制)。处理后进行固液分离，分离成硫酸水溶液(以下称为稀硫酸处理液)和硫酸处理纤维素。接着将硫酸处理纤维素以固体成分浓度为10重量％的方式与稀硫酸处理液搅拌混合，然后用氢氧化钠将pH值调整至5左右。将该产物作为纤维素前处理物2在以下的实施例中使用。 [0115] [纤维素前处理物3的制备] [0116] 作为纤维素使用稻秸。将上述含纤维素的生物质加入小型反应器(耐压硝子工业制、TVS-N2 30ml)中，用液氮冷却。在该反应器中流入氨气，使样品完全浸渍于液体氨中。盖上反应器的盖，在室温放置15分钟左右。接着，在150℃的油浴中处理1小时。处理后将反应器从油浴取出，在通风中直接漏掉氨气，然后再用真空泵将反应器内抽真空至10Pa使其干燥。将产物作为纤维素前处理物3在以下实施例中使用。 [0117] [纤维素前处理物4的制备] [0118] 作为含纤维素的生物质使用稻秸。将含纤维素的生物质浸于水中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。此时的压力为10MPa。处理后使用离心分离(3000G)而固液分离成溶液成分(以下称为水热处理液)和处理生物质成分。将该处理生物质成分作为纤维素前处理物4在以下实施例中使用。 [0119] (参考例3)糖浓度的测定 [0120] 糖水溶液所含的葡萄糖和木糖浓度在下述所示HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。 [0121] 柱：Luna NH2(Phenomenex社制) [0122] 移动相：Milli-Q:乙腈＝25:75(流速0.6mL/分钟) [0123] 反应液：无 [0124] 检测方法：RI(差示折射率) [0125] 温度：30℃。 [0126] (参考例4)来源于木霉属的纤维素酶的酶活性测定 [0127] 来源于木霉属的纤维素酶的酶活性按照以下步骤进行测定。 [0128] 1)结晶纤维素分解活性 [0129] 相对于酶液(以规定条件制备)，添加艾维素(メルク社制、要确认)1g/L、乙酸钠缓冲液(pH值5.0)100mM，在50℃反应24小时。反应液在1mL管中制备，以上述条件一边旋转混和一边进行反应。反应后将管进行离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依照参考例3所记载的方法测定。艾维素分解活性将生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性值。 [0130] 2)纤维二糖分解活性 [0131] 相对于酶液，添加纤维二糖(和光纯药)500mg/L、乙酸钠缓冲液(pH值5.0)100mM，在50℃反应0.5小时。反应液在1mL管中制备，以上述条件一边旋转混和一边进行反应。反应后，将管进行离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依照参考例3所记载的方法进行测定。纤维二糖分解活性将生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性值。 [0132] 3)木聚糖分解活性 [0133] 相对于酶液，添加木聚糖(Birch wood xylan、和光纯药)10g/L、乙酸钠缓冲液(pH值5.0)100mM，在50℃反应4小时。反应液在1mL管中制备，以上述条件一边旋转混和一边进行反应。反应后，将管进行离心分离，测定其上清成分的木糖浓度。木糖浓度依据参考例3所记载的方法进行测定。木糖分解活性将生成的木糖浓度(g/L)直接作为活性值。 [0134] (比较例1) [0135] 以下作为比较例，不实施一次水解和二次水解而由纤维素制造糖液。 [0136] [工序1：水解] [0137] 在纤维素前处理物1～4(各1g)中混合添加参考例1记载的未使用酶(蛋白质浓度50mg/mL)0.2mL(蛋白质的量10mg)、以及后述的工序2的步骤中回收的回收酶溶液。进一步添加蒸馏水使得添加后的溶液的重量为10g。将本组合物移至带分枝反应容器(东京理化社制 NS14/23)，以50℃保温和搅拌19小时进行水解(东京理化社制：小型机械搅拌器CPS-1000、转换适配器、带三通旋塞的添加口、保温装置MG-2200)。 [0138] [工序2：固液分离和由糖液的酶回收(回收酶)] [0139] 将工序1的水解物通过离心分离(4500G、10分钟)进行固液分离，分离成糖液和残渣。糖液的葡萄糖和木糖浓度通过参考例3记载的方法测定，作为生成糖而计算出。 [0140] 进一步将糖液进行膜过滤(Millipore公司制ステリフリップ-GP材质：PES)，将所得的上清利用截留分子量10000的超滤膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN20、材质：PES)以4500G离心至膜级分为1mL。将蒸馏水10mL添加至膜级分中，再次以4500G离心至膜级分为1mL。然后，从膜级分中回收酶，将该酶作为回收酶。回收酶在上述的工序 1的水解中再利用。 [0141] 在本比较例中，通过使工序1和2循环进行，从而进行纤维素酶的回收再利用。将工序1～2的工序作为一套，共计进行6次回收再利用。此外，不进行回收再利用的第0次的反应通过以下步骤进行。 [0142] [工序0：第0次的水解] [0143] 在纤维素前处理物1～4(各1g)中添加未使用酶(蛋白质浓度50mg/mL)0.3mL(蛋白质的量15mg)(因为是第0次所以不添加回收酶)。添加蒸馏水至添加后的溶液的重量为10g。将本组合物移至带分枝反应容器(东京理化社制 NS14/23)，以50℃保温和搅拌19小时进行水解(东京理化社制：小型机械搅拌器CPS-1000、转换适配器、带三通旋塞的添加口、保温装置MG-2200)。所得的水解物通过上述工序2记载的方法分离，获得回收酶。另外测定此时的糖液的葡萄糖和木糖浓度。 [0144] 表1中，将工序0和2实施1次，以及将工序1～2依次实施共计6次时，将各反应所得的糖液的葡萄糖浓度(Glc、g/L)和木糖浓度(Xly、g/L)归纳于表1。随着回收再利用的次数增加，葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)减少。另外，判明了糖生成效率随着再利用次数(N)增加而缓缓减少。 [0145] [表1] [0146] [0147] (实施例1) [0148] 以下作为实施例，通过进行纤维素的一次水解和二次水解来制造糖液。 [0149] [工序1：一次水解] [0150] 在纤维素前处理物1～4(各1g)中加入蒸馏水，添加后述的工序3的步骤中回收的回收酶，进一步添加蒸馏水使总重量为10g。将本组合物移至带分枝试管(东京理化社制NS14/23)、将本组合物移至带分枝反应容器(东京理化社制 NS14/23)，以50℃保温和搅拌1小时进行水解(东京理化社制：小型机械搅拌器CPS-1000、转换适配器、带三通旋塞的添加口、保温装置MG-2200) [0151] [工序2：二次水解] [0152] 对工序1的一次水解物添加参考例1记载的未使用酶(蛋白质浓度50mg/mL)0.2mL(蛋白质的量10mg)，以50℃反应18小时。 [0153] [工序3：固液分离和从糖液的酶回收(回收酶)] [0154] 将工序3的二次水解物通过离心分离(4500G、10分钟)进行固液分离，分离成糖液和残渣。糖液的葡萄糖和木糖浓度通过参考例3记载的方法测定，作为第N次的生成糖计算出。进一步将糖液进行膜过滤(Millipore公司制ステリフリップ-GP、材质：PES)，将所得的上清利用截留分子量10000的超滤膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN 20、材质：PES)以4500G离心至膜级分为1mL。将蒸馏水10mL添加到膜级分中，再次以4500G离心至膜级分为1mL。然后，从膜级分回收酶，将此作为回收酶。回收酶在上述的工序1的水解中再利用。 [0155] 在本实施例中，通过将工序1～工序3循环进行，从而进行纤维素酶的回收再利用。将工序1～3的工序作为一套，共计进行6次回收再利用。此外，不进行回收再利用的第0次的反应通过以下步骤进行。 [0156] [工序0：第0次的水解] [0157] 在纤维素前处理物1～4(各1g)中添加未使用酶(蛋白质浓度50mg/mL)0.3mL(蛋白质的量15mg)(因为是第0次所以不添加回收酶)。添加蒸馏水至添加后的溶液的重量为10g。将本组合物移至带分枝反应容器(东京理化社制 NS14/23)，以50℃保温和搅拌19小时进行水解(东京理化社制：小型机械搅拌器CPS-1000、转换适配器、带三通旋塞的添加口、保温装置MG-2200)。所得的水解物通过上述工序3记载的方法分离，获得回收酶。另外测定此时的糖液的葡萄糖和木糖浓度。 [0158] 表2中，将工序0和3实施1次，以及将工序1～3依次实施共计6次时，将各反应所得的糖液的葡萄糖浓度(Glc)(g/L)和木糖浓度(Xly)(g/L)归纳于表2。确认了随着回收再利用的次数增加，葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)减少，但与比较例1(表1)相比，糖生成量缓缓增多。 [0159] ［表2］ [0160] [0161] 在本实施例中，将利用回收酶的一次水解进行1小时，进而添加未使用酶进行二次水解18小时，实施了与比较例1相同的19小时的水解反应。另外，未使用酶的添加量与比较例1条件相同。即，在本实施例中，在由纤维素的糖液的制造方法中，通过将1.在纤维素前处理物中添加回收酶而进行一次水解的工序、2.在上述水解物中添加未使用酶而进行二次水解的工序、3.将上述水解物进行固液分离、从所得的糖液中获得回收酶的工序循环进行，从而与比较例相比，显示回收再利用中的糖浓度、即糖生成量效率增大。 [0162] (实施例2)一次水解中的回收酶的添加量的测定 [0163] 在实施例1中，对一次水解中添加的回收酶的蛋白质浓度，使用BCA测定试剂盒(BCA Protein Assay Regent Kit、ピァス社)，以牛白蛋白(2mg/mL)为标准品测定562nm的吸光度，进行比色定量，从而测定。关于纤维素前处理物2，进行回收再利用，将回收次数第N次的回收酶的添加量与未使用酶的添加量的关系归纳于表3。通过本实施例可以进一步确认，与实施例1表2的葡萄糖生成量相比，在回收再利用回收第4次以后，即一次水解中的酶添加量＞二次水解中酶添加量、而且在一次水解中再利用的回收酶添加量＞二次水解中的未使用酶添加量的关系成立时，葡萄糖生成量进一步提高。 [0164] [表3］ [0165] [0166] (实施例3)回收酶的酶活性 [0167] 关于纤维素前处理物3，测定回收酶活性(比较例1：将回收酶与新酶同时投入的情况；实施例1：添加回收酶进行一次水解后，投入新酶的情况)。酶活性依据参考例3分成1)结晶纤维素分解活性、2)纤维二糖分解活性、3)木聚糖分解活性的3种分解活性进行测定。关于各分解活性，以未使用酶(10mg)中的酶活性为100(％)，将回收酶中的酶活性作为相对值(％)显示。关于回收次数第2次和第4次的回收酶活性，在表4(实施例1)、表 5(比较例1)中显示。 [0168] [表4］ [0169] [0170] [表5］ [0171] [0172] 判明了随着将回收酶进行一次水解，结晶纤维素分解活性、纤维二糖分解活性、木聚糖分解活性均倾向于增大，但特别是木聚糖分解活性提高。木聚糖分解活性特别与来源于木霉属的木聚糖酶和木糖苷酶相关，可以认为它们的回收效率随着次数增加而增大。 [0173] (实施例4)回收酶所含的凝集的来源于木霉属的纤维素酶成分 [0174] 判明了在回收次数第4次以后，作为超滤膜的非透过液回收的回收酶成分中生成水不溶性的成分。对该水不溶性的来源于木霉属的纤维素酶成分通过以下步骤进行分析。 [0175] 对纤维素前处理物3按照实施例1的步骤进行一次水解和二次水解，对回收次数第4次的回收酶成分进行分析。将回收酶(100μL)装入1.5mL离心管中，以15000转/分钟离心5分钟。离心后，除去上清，在管下部得到颗粒。添加纯粹100μL洗涤颗粒后，加入样品制备液缓冲液(Ez Apply、ATTO社)进行SDS-PAGE(e-PAGEL、15％凝胶浓度、ATTO社)。染色通过考马斯亮蓝(BioSafecoomassie Stain、BioRAD社)进行。此外为了测定分子量，使用分子量标志物(PrecisionPlus Protein Standard、Kaleidoscope、BioRAD社)。 [0176] 将所得的SDS-PAGE分析结果示于图11。该成分为分子量50～60kDa左右，判明了来源于木霉属的纤维二糖水解酶是主成分(图11)。 [0177] (实施例5)水不溶性的来源于木霉属的纤维素酶成分作为回收酶成分的效果[0178] 在实施例1(纤维素前处理物3)的工序3中，从膜级分回收酶，得到回收酶之后，进一步将回收酶以15000转/分钟离心5分钟。仅将所得的上清液作为回收酶，将再利用的情况的糖生成量与实施例1的结果进行比较。即，实施例5是除去回收酶所含的水不溶性的来源于木霉属的纤维素酶成分之后的回收酶的再利用。 [0179] [表6］ [0180] [0181] 即，判明了作为回收酶含有的水不溶性的来源于木霉属的纤维素酶成分不被除去的情况下，在下次的酶再利用中可获得高的糖生成率。 [0182] 产业可利用性 [0183] 通过本发明可以由纤维素高效地制造糖液，所得的糖液可以作为各种发酵产物的糖原料使用。 [0184] 符号说明 [0185] 1水解槽 [0186] 2保温设备 [0187] 3搅拌翼 [0188] 4回收酶投入配管 [0189] 5回收酶保持罐 [0190] 6未使用酶投入配管 [0191] 7纤维素投入口 [0192] 8未使用酶保持罐 [0193] 9压滤装置 [0194] 10压缩机 [0195] 11水供给配管 [0196] 12糖液保持罐 [0197] 13循环泵 [0198] 14超滤膜装置 [0199] 15循环配管 [0200] 16回收酶配管 [0201] 17纤维素/回收酶混合物供给配管 [0202] 18纤维素/回收酶混合装置 [0203] 19固液分离装置 [0204] 20固体物排出配管 [0205] 21三通阀 [0206] 22精滤膜装置 [0207] 23固液分离滤液罐 [0208] 24泵 [0209] 25精滤膜 [0210] 26压空供给装置 [0211] 27逆洗泵 [0212] 28糖液浓缩罐 [0213] 29高压泵 [0214] 30反渗透膜和/或纳滤膜装置 [0215] 31三通阀 |
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