[0001] 本发明涉及布丘氏菌属菌(Buttiauxella spp.)植酸酶变体，编码该植酸酶的核酸和异源表达的方法。本发明涵盖的植酸酶可以用于的工业应用包括淀粉液化的方法、醇发酵和用于提高食物和动物饲料中磷酸酯的消化。

[0002] 发明背景

[0003] 磷(P)是生长的必需元素。常规牲畜饲料例如谷粒、油粕饼、和来源于种子的副产品中发现的大量的磷为在称为植酸的分子中共价结合的磷酸酯形式。对于非反刍动物，这种形式的磷的生物利用度通常非常低，例如家禽和猪，因为它们缺乏从植酸分子中分离出磷的消化酶。

[0004] 注意到非反刍动物不能利用植酸的几个重要后果。例如，为了满足动物对磷的营养需要，加入无机磷(例如，磷酸二钙、脱氟磷酸盐)或动物产品(例如，肉类和骨粉、鱼粉)产生了花费。另外，植酸能结合或螯合胃肠道中的许多矿物质(例如，钙、锌、铁、镁和铜)，因此使得所述矿物质不能被吸收。此外，饲料中的大部分植酸经过胃肠道，排泄物中的磷含量提高了。这导致增加了环境中的生态学的磷负担。

[0005] 微生物的植酸酶作为饲料添加剂改善了典型的非反刍动物饲料中植酸磷的生物利用度(参见，例如，Cromwell等人，1993)。结果是向动物饲料中添加无机磷的需要减少了，排泄物中的磷水平也降低了(参见，例如，Kornegay等人，1996)。除了饲料添加剂之外，植酸酶还可以用于低植酸钙镁饲料组分的生产。例如，植酸酶可以用于谷物的湿磨法中，以生产例如低植酸钙镁玉米浆和低植酸钙镁谷物蛋白(corn gluten)；或与淀粉水解酶结合用于干磨法中，以生产葡萄糖和醇(例如，乙醇)。

[0006] 尽管植酸酶有上述用途的优点，令人惊讶的是很少有已知的植酸酶得到广泛接受的应用于饲料、淀粉液化和醇发酵工业中。其原因是酶和酶的不同。典型的担心是关于该酶在所希望的应用环境中的高生产成本和/或低稳定性/活性。如果要使植酸酶在工业应用中引起广泛关注，其必须满足许多酶标准。较重要的酶标准包括高的总比活性、低的pH最适度、对胃肠道蛋白酶的耐受和热稳定性。

[0007] 热稳定性是植酸酶作为饲料酶成功应用和淀粉液化中最重要的前提条件之一，因为在饲料和/或工艺中植酸酶暴露于升高的温度。例如，在饲料造粒工艺中温度在60到95℃之间，在淀粉液化工艺中温度在75到120℃之间。

[0008] WO 06/043178中报道了布丘氏菌属P1-29菌中编码植酸酶的基因的DNA序列，公开于2006年4月27日。参考其中报道的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶基因的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)。基于多个固有的特性，布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶代表了一个很好的开端，从此为不同的商业应用开始了热稳定植酸酶的诱变方案。WO06/043178公开了布丘氏菌属P1-29菌植酸酶的许多变体(参见，例如，表1)。在WO06/043178公开的至少一种变体被进一步改良，其中所述变体在本发明中称为BP-11。本发明涉及具有改变的特性的变体，例如改良的特性，包括但不限于与布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶或BP-11变体相比较a)提高的热稳定性，b)增加的比活性，和/或c)增加的比活性并保留热稳定性。

[0009] 发明概述

[0010] 一方面，本发明涉及这样的植酸酶，它是编码植酸酶的突变的DNA序列的表达产物，突变的DNA序列衍生自布丘氏菌属菌植酸酶前体。在一个实施方案中，植酸酶衍生自布丘氏菌属P1-29菌株。

[0011] 另一方面，本发明涉及植酸酶变体，所述变体包含对应于衍生自布丘氏菌属P1-29菌株的植酸酶中A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240， A242，S281，Q289，A294和N303位置的替代。

[0012] 另一方面，本发明涉及分离的植酸酶，包含对应于SEQ ID NO：1的位置A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303的替代，并且包括所述变异替代在内具有与SEQ ID NO：1的第34-446位氨基酸残基至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，替代包含SEQ ID NO：1的A122T，D125A，T167I，F197S，T209K，A211P，K240E，A242S，S281L，Q289Y，A294E和N303K位置。在另一个实施方案中，替代对应于SEQ ID NO：1的R51，R55，T58，K59，D125，R127，K164，N239，G248，T252，E255，E276，H286，F290，M293，N303，H339，D340，T341，和/或D361位置。

[0013] 另一方面，本发明涉及名为BP-11的植酸酶的变体，所述变体包含对应于SEQ ID NO：4的R24，R28，T31，K32，D98，R100，K137，N212，G221，T225，E228，E249，H259，F263，M266，N276，H312，D313，T314，和/或D334位置的替代。在一个实施方案中，BP-11的变体具有一个对应于D98位置的替代。在一个优选实施方案中，替代是D98A。

[0014] 在另一个方面，本发明涉及具有植酸酶活性的包含SEQ ID NO：3的多肽。在一个实施方案中，本发明涉及具有植酸酶活性的由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的多肽。 [0015] 在另一方面，本发明涉及分离的编码本发明所述植酸酶变体的DNA和包括所述DNA的表达载体。

[0016] 在另一方面，本发明涉及布丘氏菌属菌的具有改善的植酸酶特性的变体。在一个实施方案中，改善的植酸酶特性是相比于天然布丘氏菌属菌增加的热稳定性，更具体的是衍生自P1-29菌株的布丘氏菌属菌植酸酶。在另一实施方案中，变体具有与BP-11相比改善的特性。

[0017] 在另一方面，本发明涉及包含具有植酸酶活性的蛋白质的酶组合物，其中酶组合物用于商业应用。在一个实施方案中，该酶组合物是动物饲料组合物。在另一个实施方案中，该酶组合物可用于淀粉水解(如液化)工艺。在进一步的实施方案中，包含本发明中所述的植酸酶的酶组合物包含 额外的酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、和它们的组合。

[0018] 在一方面，本发明涉及发酵培养基，所述发酵培养基包括来自丝状真菌细胞培养物的布丘氏菌属菌植酸酶或其变体。在一个方面，丝状真菌细胞是木霉属(Trichoderma)细胞，例如里氏木霉(T.reesei)。在一个方面，植酸酶具有与SEQ ID NO：1有至少75％序列同一性的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

[0019] 在另一方面，本发明涉及丝状真菌宿主细胞中生产植酸酶方法，用DNA构建体转化丝状真菌宿主细胞，该构建体包括在丝状真菌宿主细胞中具有转录活性的启动子和与其有效连接的编码植酸酶的异源多核苷酸，该植酸酶具有植酸酶活性并且其氨基酸序列与SEQ ID NO：1有至少75％序列同一性；在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许表达所述植酸酶；和生产植酸酶。该方法也可以包括回收产生的植酸酶。在一个实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞，例如里氏木霉。在一个方面，植酸酶具有与SEQ ID NO：1至少95％的氨基酸序列同一性。在进一步的方面，植酸酶具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的序列。另一方面，本发明涉及按照上述方法获得的木霉属细胞。

[0020] 附图简述

[0021] 图1A描述了由来源于布丘氏菌属P1-29菌株植酸酶基因编码的多肽(BP-WT)(SEQ ID NO：1)，包括天然信号序列和成熟蛋白(SEQ ID NO：2)。信号序列有下划线。 [0022] 图1B描述了变体BP-11成熟蛋白，没有信号序列但包括N端His标签(SEQ ID NO：4)。BP-11变体与BP-WT比对时具有一个11个氨基酸残基的替代。这些替代突出显示并且在图中具有下划线。

[0023] 图1C描述了变体布丘氏菌属菌植酸酶的成熟蛋白(BP-17)(SEQ IDNO：3)。BP-17变体具有与BP-11相同的11个氨基酸的替代加一个其它替代，在图中的突出显示和下划线部分。

[0024] 图2说明实施例3中较详细描述的表达载体pCDP(SHOK)。

[0025] 图3显示大肠杆菌(E.coli)表达的BP-17和实施例3中进一步描述的BP-WT的pH曲线图比较。

[0026] 图4显示实施例3中进一步描述的BP-WT和BP-17突变体的胃蛋白酶抗性。 [0027] 图5说明实施例4中进一步描述的pTREX4/植酸酶融合构建体。

[0028] 图6说明实施例6中进一步描述的pTREX4/植酸酶直接构建体。

[0029] 发明详述

[0030] 除非本发明有其他定义，在文中使用的所有的技术和科技术语具有相同于本发明所属领域普通技术人员所知道的一般含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)，和 Hale & Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的一些术语的通用词典。

[0031] 尽管和本发明描述的相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或实验中，优选的方法和材料在本发明中描述。数字范围包含定义该范围的数值。除非另外说明，核酸序列从左至右是5′到3′方向，氨基酸序列从左至右是从N端到C端方向。 [0032] 本发明标题不局限于本发明不同的方面或具体实施方案。相应的，以下定义的术语参考说明书作为整体给出更完整的定义。

[0033] 定义：

[0034] 本发明使用的术语“植酸酶”或“植酸酶活性”是指这样的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽可以催化植酸水解为(1)肌醇和/或(2)肌醇单，二，三，四和/或五磷酸酯和(3)无机磷酸盐。例如，有催化活性酶定义为酶学委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26。 [0035] 本发明使用的术语“布丘氏菌属菌植酸酶”是指从布丘氏菌属中的种获得的植酸酶蛋白。在一个实施方案中，布丘氏菌属菌植酸酶包含NCIMB(英 国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)的登录号为NCIMB 41248的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，布丘氏菌属菌植酸酶包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：1的第34到446位氨基酸残基。

[0036] 本发明使用的术语“对应于布丘氏菌属菌植酸酶”涉及这样的酶，所述酶具有与布丘氏菌属菌植酸酶相同的功能特性或序列，但不必获自布丘氏菌属菌。

[0037] 术语“布丘氏菌属(Buttiauxella)”是指肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性兼性厌氧菌的一个属，并且布丘氏菌属中的种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)，布里纳氏布丘氏菌(B.brennerase)，费拉格布丘氏菌(B.ferragutiae)，伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)，伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)，诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属的菌株可以是例如获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)和DSMZ，德国国家生物材料资源中心。

[0038] 术语“野生型植酸酶”或“野生型”是指具有自然界中发现的氨基酸序列的酶。 [0039] 术语“布丘氏菌属菌植酸酶变体”是这样的植酸酶，该酶的氨基酸序列衍生自亲本植酸酶或前体植酸酶的氨基酸序列，但至少有一个称为突变的氨基酸的替代、插入和/或删除。

[0040] 术语“成熟的植酸酶”是指信号加工后的植酸酶，例如删除分泌信号序列。 [0041] 术语“BP-11”是包含SEQ ID NO：4的第7-419位置所示氨基酸序列的植酸酶。BP-11是具有SEQ ID NO：1所示序列的野生型布丘氏菌属菌植酸酶的变体。

[0042] 术语“BP-17”表示包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的植酸酶。

[0043] 在文中使用的“蛋白质”包括蛋白质、多肽、和肽。为本领域技术人员所理解，如下定义和此处进一步所描述，本发明的核酸序列可以用于生成蛋白质序列。

[0044] 术语“等同于…的氨基酸残基”，“对应于…的氨基酸”及其语法上等同 的说法，用于文中表示与特定蛋白的特定氨基酸序列具有类似位置和类似作用的蛋白的氨基酸残基。本领域的技术人员可以认识到在可比较的植酸酶蛋白质中特定残基的等同物。

[0045] 关于两个氨基酸或多核苷酸序列的“百分序列同一性”，是指当两个序列最佳比对时，其中相同的残基的百分比。例如，80％氨基酸序列同一性是指在两个最佳比对的多肽序列中有80％的氨基酸残基是相同的。例如，通过直接比较两个分子的序列信息可以确定同一性百分数，通过比对序列、数出两个所比对序列的匹配的准确个数，除以较短序列的长度，并且结果乘以100。易于获得的计算机程序可以用于辅助这些分析，例如ALIGN，Dayhoff，M.O. 在 M.O.Dayhoff编 辑 的 Atlas of Protein Sequence andStructure，Suppl.3：353-358中，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC，其改编了Smith和Waterman(1981)Advances in Appl.Math.2：482-489的局部同源性算法用于肽分析。Wisconsin SequenceAnalysis Package，版本8(可获自Genetics Computer Group，Madison，WI)提供了确定核苷酸序列同一性的程序。例如BESTFIT，FASTA和GAP程序也是基于Smith和Waterman算法。这些程序可容易的根据生产商推荐的默认参数和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所描述的进行使用。一个适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，该算法在Altschul等人，J.MoI.Biol.215：403-410(1990)中描述。BLAST分析软件可以通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

[0046] 术语“特性”或与其语法上相同的词，在文中所用的表示多肽的上下文中，是指一个多肽的可以选择的或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性曲线、和分泌能力。

[0047] 术语“热稳定的”是指本发明中的植酸酶在暴露于升高的温度后能保持特定量的酶活性。

[0048] 术语“增加的稳定性”在特性如热稳定性的上下文中是指随着时间的推 移，与其他植酸酶相比更高地保留酶活性。

[0049] 本发明可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单、双或三螺旋DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和嘧啶碱基、或其他天然的、化学的、生化化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸的聚合物。

[0050] 本发明使用的术语“基因”是指这样的多核苷酸(例如，DNA片段)，该多核苷酸编码多肽并包括在编码区之前和之后的区域，也包括在分别的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

[0051] 本发明使用的术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，是指用于将序列导入宿主细胞或生物体的DNA。这种DNA可以在体外由PCR或任何其他适合的本领域已知的合适技术生成。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可以被掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，以及其它序列。在一个优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中掺入并表达异源DNA片段的能力。

[0052] 本发明使用的术语“载体”是指为引核酸入一个或多个细胞型而设计的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。

[0053] 在将核酸序列导入细胞的上下文中，所用的术语“导入”是指任何在细胞中导入核酸序列的适合方法。该导入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合、和转导，并包括提到的将核酸序列掺入于真核细胞或原核细胞，其中所述核酸序列可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体、或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

[0054] 术语“最佳比对”是指给予最高百分同一性分值的比对。

[0055] 术语“蛋白质”和“多肽”在此可以互换使用。本发明的说明书和权利要求中，使用常规的一个字母和三个字母代码表示氨基酸残基。氨基酸的三 个字母代码符合IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(Joint Commissionon Biochemical Nomenclature；JCBN)的规定。可以理解的是，因为遗传密码子的简并性，多肽也可以由多于一个的核苷酸序列编码。 [0056] 本发明中的变体按照下述命名法描述：[原始氨基酸残基/位置/替代的氨基酸残基]。例如，SEQ ID NO：1中51位置用谷氨酸(E)替代精氨酸(R)表示为R51E。在一个给定的位置用多于一个的氨基酸替代时，则所述替代表示为1)R51E，R51A，R51H或R51W；2)R51E，A，H，或W；或者c)R51/E/A/H/W。当文中鉴定了一个适合替代的位置而未给出具体替代氨基酸的建议时，理解为任何氨基酸残基可以替代在位置上出现的氨基酸残基。当与其它植酸酶相比，植酸酶变体包含缺失，该缺失用“*”表示。例如，在R51位置处的缺失表示* *为R51。两个或多个连续的氨基酸缺失表示例如为(51-54)。

[0057] “前序列(prosequence)”是在信号序列和成熟蛋白之间的氨基酸序列，是蛋白质分泌所必需的。前序列的切割导致生成成熟有活性的蛋白质。

[0058] 术语“信号序列”或“信号肽”是指任何可参与成熟蛋白或前体形式蛋白质的分泌的核苷酸序列和/或氨基酸序列。信号序列的这种定义是功能性的，是指包括所有参与完成蛋白质分泌的N端蛋白质基因编码的氨基酸序列。信号序列通常但全部是结合于蛋白质的N端部分或前体蛋白的N端部分。

[0059] “宿主菌株”或“宿主细胞”是指适合包含本发明所述DNA的表达载体表达的宿主。 [0060] 术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由或可由所讨论的生物体的菌株产生的，也指由分离自该菌株的DNA序列编码的和在包含该DNA序列的宿主生物体中产生的植酸酶。另外，这个术语也指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的植酸酶，并且这种植酸酶具有正在讨论的植酸酶的鉴别特征。

[0061] 术语“分离的”、“回收的”或“纯化的”是指从其原始的环境中移出的物质。 [0062] “饲料”和“食物”分别是指任何天然或人工的饮食、膳食等、或分别用于或适用于动物和人食用、摄入、消化的此类膳食的组分。

[0063] “食物或饲料添加剂”是用于或适用于添加到食物或饲料中的基本上纯的化合物或多组分组合物。其通常包含一种或多种化合物，例如维生素、矿物质或饲料增强酶和适合的载体和/或赋形剂，并且其通常以适合添加到动物饲料中的形式提供。

[0064] 术语“淀粉液化”是指淀粉转化为较短链和较少粘性糊精的过程。

[0065] 术语“天然的布丘氏菌属菌植酸酶(n-布丘氏菌属菌植酸酶)”是指自内源表达的布丘氏菌属菌植酸酶产生的布丘氏菌属菌植酸酶。例如，术语″n-布丘氏菌属菌植酸酶″是指由布丘氏菌属的物种内源表达的布丘氏菌属菌植酸酶(即SEQ ID NO：1)。

[0066] 术语“重组布丘氏菌属菌植酸酶(r-布丘氏菌属菌植酸酶)”、“重组表达的布丘氏菌属菌植酸酶”和“重组产生的布丘氏菌属菌植酸酶”是指成熟的布丘氏菌属菌植酸酶蛋白质序列或变体，其自异源多核苷酸在宿主细胞中的表达产生。例如，术语“r-布丘氏菌属菌植酸酶”是指在导入了编码布丘氏菌属菌植酸酶或变体的多核苷酸的宿主中表达的布丘氏菌属菌植酸酶(即SEQ ID NO：1，2或3)。

[0067] “启动子”是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调控序列。

[0068] 术语“在转录调控下”是本领域已知的，是指多核苷酸序列的转录(通常是DNA序列的转录)取决于其被有效连接至一个有助于起始或促进转录的元件。

[0069] “在翻译调控下”是本领域中已知的，是指在mRNA形成后发生的调控过程。 [0070] 如文中所用，当描述蛋白质和编码其的基因时，基因的术语用斜体表示(例如，编码布丘氏菌属菌植酸酶的基因)。蛋白质的术语通常不是斜体的并且首字母通常是大写的。 [0071] 术语“有效连接的”是指元件位于允许它们发挥相关功能地排列的毗邻关系。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则该启动子被有效连接至 编码序列。

[0072] 术语“选择性标记”是指能够在宿主中表达的基因，这些基因允许方便地选择那些转入了核酸或载体的宿主。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物抗性(例如，潮霉素抗性、博莱霉素抗性、或氯霉素抗性)和/或赋予代谢优势的基因，例如宿主细胞的营养优势。

[0073] 谈及多核苷酸或蛋白质时所用的术语“异源的”，是指多核苷酸或蛋白质不在宿主细胞中天然产生。

[0074] 谈及多核苷酸或蛋白质时所用的术语“内源的”，是指多核苷酸或蛋白质在宿主细胞中天然存在。

[0075] 在文中使用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从与其天然相关的至少一个组分中移出化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

[0076] 如文中所使用的，谈及细胞时所用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”，是指细胞具有非天然的(例如，异源的)核酸序列掺入其基因组或其作为附加型质粒保留多个世代。

[0077] 如文中所使用的，术语“表达”是指一个过程，通过该过程基于基因的核酸序列产生了多肽。该过程包含转录和翻译。

[0078] 虽然任何相似或等同于这些在文中描述的方法和物质可以用于本发明的实践或实验，现在描述典型的优选的方法和材料。所有在此记载的出版物作为参考引入，用于公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。

[0079] 其他术语的定义可以在说明书中出现。在示例性的实施方案更详细的描述之前，可以理解本发明不限于如此处描述的优选的实施方案，当然也可以不同。也可以理解在文中使用的术语的目的仅仅是描述优选的实施方案，并不是用于限制范围，因为本发明的保护范围仅以后面的权利要求为限。

[0080] 在提供数值范围之处，可以理解的是指每个居中值，到下限的单位的十分之一，除非上下文中明确规定并非如此，这个范围的上限和下限之间也明确的公开了。本发明包含任何公开数值或公开范围的居中值之间的每个较小范围和任何其它公开的或公开范围内的居中值。这些较小范围的上 下限可被独立的包括或排除在该范围中，每个范围(在该较小范围中只包含上限或下限之一、不包含上下限或同时包含上下限)同样被涵盖到本发明中，同时在公开的范围内具有任何明确排除的端值。若记载的范围包含一个或两个端值，在包含端值的范围内排除两端值之一或两者的范围也包含在本发明中。

[0081] 在文中和权利要求中，单数形式“一”、“一个”和“该”包含多于一个的情况，除文中清楚地指明了例外。因此，例如，谈及的“基因”包括多个此类候选基因，谈及的“该细胞”包括一个或多个细胞和本领域技术人员已知的等同物等。

[0082] 此处所讨论的出版物仅是在本发明的申请日之前公开的出版物。此处没有内容被理解为承认本发明由于在先发明而不能早于这些出版物。

[0083] 植酸酶/变体：

[0084] 作为亲本酶或前体酶所用的植酸酶包括布丘氏菌属菌植酸酶和对应于布丘氏菌属菌植酸酶的酶。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶包含NCIMB(英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心)的登录号为NCIMB41248的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：1所示的34到446位氨基酸残基(如SEQ ID NO：2)。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属菌植酸酶衍生自乡间布丘氏菌、布里纳氏布丘氏菌、费拉格布丘氏菌、伽瓦尼布丘氏菌、伊查德氏布丘氏菌、诺基亚布丘氏菌和瓦姆波德布丘氏菌。如WO 2006/043178所述，明确引入本文作为参考，描述了所述可获得自或衍生自亲本布丘氏菌属菌和对应于布丘氏菌属菌植酸酶的植酸酶。在一些实施方案中，野生型布丘氏菌属菌植酸酶与SEQ ID NO：1所示多肽或SEQID NO：
2所示多肽有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少93％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，和至少99％的氨基酸序列同一性。

[0085] 本发明涉及植酸酶变体(例如，布丘氏菌属菌植酸酶变体)。特别是，WO2006/043178描述了野生型植酸酶的诱变，其中所述野生型植酸酶具有 其中公开的SEQ ID NO：3所示序列，并在本申请中称为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。WO 2006/043178教导了许多优选的突变。植酸酶变体包含至少一个氨基酸替代、删除或插入，特别优选的是氨基酸的替代。氨基酸的替代、插入或删除可以发生在植酸酶多肽的任意残基处。本发明的植酸酶变体是不具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的相同序列的变体。

[0086] 本发明一个优选实施方案中，变体包含对应于布丘氏菌属菌植酸酶的A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303位置的替代，更具体的对应于SEQ ID NO：1的所述等同位置的替代。在一些实施方案中，替代包含任意的对应于A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y的19种氨基酸。在一些实施方案中，突变包含下述对应于SEQ ID NO：1的A122T，D125A，T167I，F197S，T209K，A211P，K240E，A242S，S281L，Q289Y，A294E和N303K位置的氨基酸替代。

[0087] 在一些实施方案中，植酸酶是称为BP-11的变体植酸酶，所述变体BP-11包含SEQ ID NO：4的第7-419位置所示的氨基酸残基。BP-11是BP-WT的变体(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。

[0088] 在一些实施方案中，所述BP-11植酸酶的变体包含至少一个对应于SEQ ID NO：4的R24，R28，T31，K32，D98，R100，K137，N212，G221，T225，E228，E249，H259，F263，M266，N276，H312，D313，T314和/或D334位置的替代，或是包括所述变异替代在内的序列，其与SEQ ID NO：4的第7-419位氨基酸残基具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％和至少99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体包括多于一个的替代，例如，二个、三个、四个或更多个的替代。在另一实施方案中，BP-11的变体具有对应于D98位置的替代。替代的氨基酸可以是19种剩余氨基酸中的任一种，在一个优选的实施方案中，替代是D98A。在一个更进一步的实施方案中，具有对应于D98位置的替代的BP-11变体包括一个或多个对应于SEQ ID NO：4的R24，R28，T31，K32，R100，K137，N212，G221，T225，E228，E249，H259，F263，M266，N276，H312，D313，T314和/或D334位置的替代。在一些实施方案中，变体具有与BP-11植酸酶相同的或更高的活性。

[0089] 在一个特别优选的实施方案中，植酸酶变体包含SEQ ID NO：3所示的多肽。在另一个实施方案中，植酸酶变体由SEQ ID NO：3所示的多肽组成。

[0090] 在一些实施方案中，本发明的在SEQ ID NO：1的A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303位置包括氨基酸替代的变体进一步包含具有与SEQ ID NO：1所示的野生型植酸酶的34-446位氨基酸残基至少有90％，至少92％，至少93％，至少94％和至少95％的序列同一性的植酸酶。

[0091] 在一些实施方案中，本发明的变体除包括对应于SEQ ID NO：1的A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303位置的替代外，还包括一个或更多个对应于59，70，193，204，221，223，225，268，336和351氨基酸残基的替代。在一些实施方案中，变体包括对应于SEQ ID NO：1的K59E，N70Y，H193R，T204I，S221N，D223E，G225A，A268V，I336F和N351D的替代。

[0092] 在一些实施方案中，本发明的变体包括功能性片段。功能性片段是指仍能保留其酶功能的布丘氏菌属菌植酸酶的一部分，优选的是与它来源的植酸酶多肽相比，所述片段保持基本上等量的酶功能或更高量的酶功能。在一些实施方案中，变体为这样的片段，其包括对应于SEQ ID NO：1的A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303位置的替代和SEQ ID NO：1的至少350个，至少375个，至少400个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体(例如SEQ ID NO：3)可以是具有至少350个，至少375个或至少400个氨基酸残基的片段。

[0093] 变体可以由编码植酸酶蛋白质的DNA的核苷酸随机诱变、位点饱和诱变、和定点诱变产生，使用盒或PCR诱变或其他本领域已知的技术产生变体，之后变体在细胞培养物中产生。参考Morinaga等人(1984)Biotechnology 2：646-649；Nelson和Long(1989)Analytical Biochem.，180：147-151；以 及 Sarkar和 Sommer(1990)Biotechniques 8：404-407。植酸酶变体蛋白质片段也可以通过已建立的技术由体外合成制备。

[0094] 多核苷酸：

[0095] 本发明还包含编码本发明的植酸酶变体的多核苷酸。本领域技术人员知道，因为遗传密码的简并性，核苷酸序列可以由三密码子使用产生，由最初的序列编码的一些氨基酸发生改变从而产生不同的核酸序列但其仍编码和最初的核苷酸序列所编码的相同的植酸酶。例如，具有对所有的三核苷酸密码子在第三个位置的改变的核苷酸序列大约与原始序列有66％的同一性，然而，改变的核苷酸序列可以编码相同的植酸酶(例如具有相同的一级氨基酸序列)。

[0096] 多核苷酸可以由本领域已知的标准方法获得，例如，克隆的DNA(例如DNA文库)、通过化学合成、通过cDNA克隆、通过PCR(USP 4,683,202或Saiki等人(1988)239：487-491)、通过合成建立的方法(Beucage等 人(1981)Tetrahedron Letters 22：
1859-1869，以及Matthes等人(1984)EMBO J.3：801-895)或通过基因组DNA或其片段的克隆、从目的细胞中大量纯化，例如布丘氏菌属菌(参见，例如，Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，DM and Hames，BD(Eds.)，1995，DNA Cloning 1：A Practical Approach and DNA Cloning 2：A PracticalApproach，Oxford University Press，Oxford)。从基因组DNA和其衍生物中衍生的核酸序列除编码区域外还可以包含调控区域。

[0097] 表1：BP-WT的多核苷酸序列

[0098] TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTT

[0099] CTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAA

[0100] TGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTG

[0101] TTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAA

[0102] CGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCC

[0103] GCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTA

[0104] ACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCC

[0105] ACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGT

[0106] TTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCA

[0107] ATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGC

[0108] TTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGC

[0109] AGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACC

[0110] TGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCA

[0111] AACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA

[0112] TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGC

[0113] GCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGAT

[0114] AAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGT

[0115] CTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAA

[0116] GCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAA

[0117] ACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCA

[0118] GACATAACGGCACGCCTTTATTGCAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCG

[0119] AATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCT

[0120] GTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCA

[0121] ACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGC

[0122] GCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAG

[0123] CGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCAC

[0124] TTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGT

[0125] AACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGT

[0126] GGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACA

[0127] AAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCC

[0128] AGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTT(SEQ ID NO：5)

[0129] 可以理解的是，WO 2006/043178提供的多核苷酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)可以用于自编码具有植酸酶活性的酶的其他菌株获得相 同的或同源的多核苷酸片段。
包含来自布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶基因(BP-WT)的多核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，如下述表1中所例举。包含来自BP-17变体的植酸酶基因的多核苷酸序列(SEQ ID NO：14)在下述表2中显示。

[0130] 表2：BP-17的多核苷酸序列

[0131] AACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCA

[0132] CGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCCCCAACA

[0133] CCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTC

[0134] ATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAG

[0135] CCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCTACGTCTGGACTGACGTCGCCCAGC

[0136] GCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTC

[0137] ACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAA

[0138] GGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGG

[0139] CCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCAGCCTCGCCCTCATG

[0140] AACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGCCGACAA

[0141] GAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACAACGGCA

[0142] ACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAGATCTTC

[0143] CTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCGCCTGGGGCAACATCCACAGCGA

[0144] GCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCTACTTCGACCTCATGGAGC

[0145] GCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCAGCAAC

[0146] GCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGACAACAA

[0147] GATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCATGCTCA

[0148] ACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCTGGCGGCGCTCTC

[0149] GTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAGTACGTCAGCGTCAGCATGGT

[0150] CTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAGCCTG

[0151] CCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGC CGAGGGCTAC

[0152] TGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTGCCA

[0153] GCTCCAGTAA(SEQ ID NO：14)

[0154] 特性：

[0155] 在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体具有改变的特性。优选的本发明的变体具有改进的特性。在一些实施方案中，改变的特性，例如改进的特性是底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性曲线、比活性和/或从植酸中释放磷酸基团的活性。

[0156] 在一些实施方案中，本发明包含的变体相比于亲本植酸酶(例如，BP-WT或BP-11)具有增加的热稳定性。在一些实施方案中，变体具有相比于BP-WT或BP-11至少1.5，至少2.0，至少2.5，至少3.0，至少5.0，至少8.0，至少10.0，至少15.0，至少18.0和至少20.0的热稳定性差别(TD)。

[0157] 在一些实施方案中，本发明包含的变体(例如BP-17)具有在pH为4.5，5.0，5.5或6.0时至少3℃，至少5℃，至少10℃，至少12℃，至少15℃和至少20℃的增加的热稳定性。更具体地，本发明的变体(例如BP-17)在大约65℃，在约70℃，在约75℃，在约80℃或更高时是热稳定的。在一些实施方案中，如果本发明的植酸酶在pH5.5暴露于特定的温度10分钟保持大于50％的活性，则认为本发明的植酸酶是热稳定的。

[0158] 在一些实施方案中，变体具有更高的蛋白水解稳定性(残留活性)。蛋白水解稳定性可以由WO 2006/043178公开的方法，并具体参照其中的实施例12来确定。在一些实施方案中，本发明包含的变体具有至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％和至少85％的残留活性。

[0159] 在一些实施方案中，本发明包含的变体具有在pH 4.0，在pH 4.5和在pH 5.0时，大于亲本植酸酶或其热稳定的变体(例如BP-WT，SEQ ID NO：2或BP-11)100％，大于105％，大于110％，和大于120％的比活性。在一些实施方案中，变体具有比BP-11植酸酶或BP-WT(SEQ ID NO：2)植酸酶高至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，和至少25％的比活性。在一些实施方案中，本发明包含的变体保持与BP-WT或BP-11基本上相同水平的热稳定性，但在基本上相同的条件下(例如pH)具有增加的比活性。

[0160] 在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体具有至少100U/mg、至少200U/mg、至少300U/mg、至少350U/mg，、至少400U/mg、至少450U/mg、至少500U/mg、至少600U/mg、至少
700U/mg、至少800U/mg、至少900U/mg、至少1000U/mg、和至少1200U/mg比活性，比活性是由WO2006/043178实施例1描述的条件下测定的，将植酸酶置于溶液中孵育，所述溶液包含
2mM植酸酶、0.8mMCaCl2的pH为3.5的200mM乙酸钠 缓冲液中。在一些实施方案中，酶比活性在最适pH4.0处测定。

[0161] 在一些实施方案中，本发明的植酸酶变体与SEQ ID NO：5所编码的植酸酶相比时，具有至少110，至少120和至少130的比活性比率。

[0162] 在一些实施方案中，pH活性最大值比相应的布丘氏菌属菌植酸酶(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)低至少0.1，至少0.15，至少0.2，至少0.25，至少0.3，至少0.5，至少
0.6，至少0.7，至少0.8，和至少1.0个pH单位，或比BP-11植酸酶低至少0.1，至少0.15，至少0.2，至少0.25，至少0.3，至少0.5，至少0.6，至少0.7，至少0.8，和至少1.0个pH单位。在一些实施方案中，本发明包含的变体在pH 2.0到6.0范围内具有活性，在一些实施方案中pH 4.0至pH 5.5附近和4.0至pH 4.5附近有最大活性。

[0163] 在一些实施方案中，本发明包含的变体可以用于产生磷酸酯/磷酸盐化合物的方法中，包括用本发明包含的植酸酶变体(如BP-17)处理植酸。植酸可以是肌醇二、三、四、和/或五磷酸。另一些合适的有机磷酸酯包括肌醇四磷酸酯和肌醇-寡磷酸酯。

[0164] 在宿主细胞中生产植酸酶：

[0165] 在一些实施方案中，本发明提供具有植酸酶活性的酶的产生方法，包括：(a)提供用包含编码本发明的植酸酶变体的多核苷酸的表达载体转化了的宿主细胞，其中所述变体包含至少文中所述的至少一个氨基酸残基的至少一个修饰；(b)在适合宿主细胞产生植酸酶的条件下培养经转化的宿主细胞；和(c)回收植酸酶。

[0166] 在一些实施方案中，表达载体包含编码这样的植酸酶的多核苷酸，所述植酸酶包含在对应于SEQ ID NO：1的A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240，A242，S281，Q289，A294和N303的位置具有氨基酸残基替代的氨基酸序列，在另一些实施方案中，替代对应于SEQ ID NO：1的A122T，D125A，T167I，F197S，T209K，A211P，K240E，A242S，S281L，Q289Y，A294E和N303K。在一些实施方案中，表达载体包含编码这样的植酸酶变体的多核苷酸，所述的植酸酶变体包含在对应于SEQ ID NO：4的R24，R28，T31，K32，D98，R100，K137，N212，G221，T225，E228，E249，H259，F263， M266，N276，H312，D313，T314，和/或D334位置的替代。在另一些实施方案中，载体包括编码包含SEQ ID NO：3的植酸酶的多核苷酸。 [0167] 在本发明的一些实施方案中，宿主菌株经过遗传工程设计来表达异源的植酸酶或具有本发明的植酸酶活性的变体。

[0168] 宿主细胞：

[0169] 本发明包含的用于产生植酸酶的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞和植物细胞。宿主细胞包括细胞和细胞后代和由用于产生本发明的植酸酶变体的细胞制备的原生质体。 [0170] 在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞和优选地是丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式的真菌(参见，Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，NewYork)。这些真菌的特点在于，具有包含壳多糖、纤维素、和其他复杂多糖的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌是形态学上的、生理学上的、和遗传上不同于酵母的。丝状真菌亲本细胞可以是这样的细胞，包括但不限于木霉属中的种(Trichoderma sp.)，(如，里氏木霉(Trichoderma reesei)，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形态，以前分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康宁木霉(Trichodermakoningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum))；青霉属中的种(Pencilliumsp.)，腐质霉属中的种(Humicola sp.)(如，特异腐质霉(H.insolens)，面包腐质霉(H.lanuginosa)和灰腐质霉(H.grisea))；金孢子菌属中的种(Chrysosporium sp.)(如，C.lucknowense)，粘帚霉属中的种(Gliocladiumsp.)，曲霉属中的种(如，米曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)，酱油曲霉(A.sojae)，日本曲霉(A.japonicus)，构巢曲霉(A.nidulans)，和泡盛曲霉(A.awamori))，镰孢属中的种(Fusarium sp.)，(如，粉红镰孢(F.roseum)，禾谷镰孢(F.graminum)，F.cerealis，尖镰孢(F.oxysporium)和F.venenatum)，脉孢菌属中的种(Neurospora sp.)，(粗糙脉孢菌(N.crassa))，肉座菌属中的种(Hypocrea sp.)，毛霉菌属中的种(Mucor sp.)(米赫毛霉(M.miehei))，根霉属中的种(Rhizopus sp.)和翅孢霉属中的种(Emericella sp.)(也参见， Innis等(1985)Sci.228：21-26)。应用于表达本发明的植酸酶(和/或α淀粉酶)的曲霉菌株公开于如Ward等人(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743；和Goedegebuur等人(2002)Curr Gene 41：89-98。在一些实施方案中，宿主是木霉属的菌株，优选是里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的并且非限制性的例子包括如ATCC No.13631，ATCC No.26921，ATCC No.56764，ATCC No.56765，ATCC No.56767和NRRL15709。
在一些实施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生菌株。RL-P37公开于Sheir-Neiss等人(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53。

[0171] 在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。非限制性的例子包括链霉菌属的菌株(如变铅青链霉菌(S.lividans)，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。在本发明中使用的芽孢杆菌属包括本领域已知的芽孢杆菌属的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌(B.brevis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)，耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢杆菌(B.circulans)，灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。 [0172] 在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌或假单胞菌属中的种(Pseudomonas sp.)。

[0173] 在其它实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属中的种(Schizosaccharomyces sp)，毕赤酵母属中的种(Pichia sp.)，或假丝酵母属中的种(Candida sp)。

[0174] 在一些实施方案中，宿主菌株可以是之前经过基因工程处理的。在一些实施方案中，已经失活了真菌宿主细胞的多个天然基因。这些基因包括例如编码纤维素水解酶如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)的基因(如cbh1，cbh2，egl1，egl2和egl3)。例如美国专利号5,650,322 公开了RL-P37的在cbh1基因和cbh2基因中有删除的衍生菌株。(参见，例如USP 5,847,276和WO 05/001036)

[0175] 在其他实施方案中，宿主细胞可以是植物细胞，并且本发明应用于双子叶植物(例如，番茄、马铃薯、大豆、棉花、和烟草)和单子叶植物，包括但不限于禾本科单子叶植物如小麦(Triticum spp.)、稻(Oryza spp.)、大麦(Hordeum spp.)、燕麦(Avenct spp.)、黑麦(Secale spp.)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghum spp.)和小米(Pennisetum spp)。 [0176] 载体

[0177] 适用的载体包括这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含编码本发明植酸酶的多核苷酸，并且宿主细胞转化方法是本领域已知的，可以使用标准的技术和方法。 [0178] 根据本发明，构建包含编码本发明的植酸酶变体的核酸的DNA构建体以转化和/或在宿主细胞中表达变体。在一个实施方案中，DNA构建体通过包含有效连接于植酸酶变体编码序列的调控序列(如启动子、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列、增强子、激活序列、细胞特异性表达序列、信号序列、和/或终止子)的表达载体转移至宿主细胞。

[0179] 包含具有编码植酸酶变体的多核苷酸的DNA构建体的表达载体可以是任意载体，能够在给定的真菌宿主生物体中自主复制或能够整合入宿主DNA。在一些实施方案中，表达载体是质粒或噬菌体。在一些实施方案中，表达载体是预组装的并且包含高水平转录所需的序列和选择性标记。在一些实施方案中，将植酸酶变体基因的编码区或其部分插入通常目的的表达载体，从而在表达构建体启动子和终止子序列的转录调控之下。在一些实施方案中，基因或其部分插入cbh1强启动子下游。

[0180] 简而言之，在真菌宿主细胞中产生植酸酶可以参考Sambrook等(1989)见上文，Ausubel(1987)见上文，van den Hondel等(1991)，在Bennett和Lasure(编著)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，AcademicPress(1991)pp.70-76和396-428；Nunberg等(1984)Mol.Cell Biol. 4：2306-2315；Boel 等 (1984)EMBO J.3：1581-1585；Finkelstein，在BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein等编著，Butterworth-Heinemann，波士顿，MA(1992)，第6章；Kinghorn等(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，伦敦；Kelley等(1985)EMBO J.4：475-479；Penttila等(1987)Gene 61：155-164；和美国专利号5,874,276。适合的载体列表可以在Fungal Genetics Stock CenterCatalogue of Strains(FGSC，www at fgsc.net)中找到。适合的载体包括可获得于例如Invitrogen Life Technologies和Promega的载体。适合在真菌宿主细胞中应用的特定载体包括载体例如pFB6，pBR322，TM TM TMpUC18，pUC100，pDON 201，pDONR 221，pENTR ，pGEM 3Z和pGEM 4Z。

[0181] 在一些实施方案中，载体可以是当导入真菌宿主细胞时整合入宿主细胞基因组中和复制的任意载体。Fungal Genetics Stock Center Catalogue ofStrains(FGSC，)提供了这类载体的一些非限制性例子。Sambrook等(1989)见上文，Ausubel(1987)见上文，van den Hondel等(1991)在Bennett和Lasure(编著)MORE GENE MANIPULATIONS INFUNGI，Academic Press pp.396-428；和美国专利号5,874,276提供了另外一些适合的表达载体和/或整合载体的例子。特别有用的载体包括pTREX，pFB6，pBR322，PUC 18，pUC100和pENTR/D。用于细菌细胞中的适合的质粒包括能在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19，和例如允许在芽孢杆菌中复制的pE194。

[0182] 在一些实施方案中，编码本发明的植酸酶变体的核酸有效连接至适合的启动子，该启动子在宿主细胞中显示转录活性。一般而言，植酸酶变体的表达可在任意本领域已知的或随后发现的适合的启动子下完成。在一些实施方案中，植酸酶变体在宿主天然的启动子下表达。在一些实施方案中，植酸酶变体在异源启动子下表达，该启动子在宿主细胞中有活性。例如，如果木霉属细胞用于作为宿主细胞，优选地，启动子是在木霉属宿主细胞中有活性的。

[0183] 在一些实施方案中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是在多数环境的和发育的条件下有活性的。“诱导型”或“可抑制型”启动子是在环境的或发育的调节下有活性。在一些实施方案中，启动子是随环境因子的改变可诱导的或可抑制的，环境因子包括但不限于碳、氮或其他营养因子的可获得性、温度、pH、渗透性、重金属的存在，抑制剂的浓度、应激或上述因素的组合，这一点为本领域所知。在一些实施方案中，诱导型或可抑制型启动子可以由代谢因子诱导或抑制，例如某些碳源的水平、某些能源的水平、某些代谢物的水平或上述因素的组合，这一点为本领域所知。在一个实施方案中，启动子是对于宿主细胞来说是天然的启动子，例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是里氏木霉天然的启动子，例如cbh1启动子，GenBank登录号为D86235。

[0184] 启动子的合适的非限制性例子包括cbh1，cbh2，egl1，egl2，egl3，egl4，egl5，xyn1和xyn2，产黄青霉(P.chrysogenus)的可抑制的酸性磷酸酶基因(phoA)的启动子(参见如Graessle等(1997)Appl.Environ.Microbiol，63：753-756)、葡萄糖可抑制的PCK1启动子(参见如，Leuker等(1997)，Gene，192：235-240)，麦芽糖可诱导的，葡萄糖可抑制的MET3启动子(参见Liu等(2006)，Eukary.Cell，5：638-649)、pKi启动子和cpc1启动子。有用的启动子的其它例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(参见如Nunberg等(1984)Mol.Cell Biol.4：2306-2315；和Boel等(1984)EMBO J.3：1581-1585)。里氏木霉xln1基因的启动子也是有用的(参见如EPA 137280A1)。

[0185] 在一些实施方案中，启动子是温度敏感的启动子。优选地，温度敏感的启动子的活性被升高的温度抑制。在一些实施方案中，启动子是代谢物抑制的启动子或被渗透性的改变而抑制的启动子。在一些实施方案中，启动子是可由培养基中存在的多糖、二糖、或单糖的水平诱导的或抑制的。

[0186] 在一些实施方案中，编码植酸酶变体的序列有效地连接至信号序列。信号序列不是本发明中重要的，但可以是任意在宿主细胞中有信号序列活性的信号序列。编码信号序列的DNA可以是与宿主细胞、启动子、或植 酸酶天然相关的。在一些实施方案中，信号序列是与待表达的植酸酶变体的基因天然相关的。在另一些实施方案中，包含在待转入真菌宿主细胞的DNA构建体或载体中的信号序列和启动子序列衍生自相同来源。例如，在一些实施方案中，信号序列是cbh1信号序列，该信号序列有效连接至cbh1启动子。

[0187] 在一些实施方案中，表达载体也包括在结构基因下游的转录终止序列以提供高效终止。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列是来源相同的。在另一些实施方案中，终止序列和宿主细胞是同源的。一个尤其适合的终止子序列是衍生自木霉属菌株的cbh1、更具体的是衍生自里氏木霉的cbh1的终止子序列。其他有用的真菌终止子包括来源于黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因的终止子(参见如Nunberg等(1984)见上文，和Boe等(1984)见上文)。

[0188] 在一些实施方案中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的例子包括赋予抗微生物抗性的标记(如潮霉素和腐草霉素)。也可用于本发明的营养选择性标记包括本领域已知的那些标记，例如amdS argB和pyr4。用于转化木霉的载体系统的标记是本领域已知的(参见如，Finkelstein，在BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，第6章，Finkelstein等编著，Butterworth-Heinemann，波士顿，MA(1992)，第6章；和Kinghorn等(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapmanand Hall，伦敦)。在一些实施方案中，选择性标记是amdS基因，该基因编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉amdS基因作为选择性标记的使用在例如Kelley等(1985)EMBO J.4：475-479和Penttila等(1987)Gene61：155-164中描述。

[0189] 用于连接包含编码植酸酶变体的多核苷酸、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体和将它们插入合适的载体的方法是本领域已知的。连接通常可以通过在方便的限制性位点处的连接而完成。如果这样的位点不存在，根据常规实验使用合成的寡核苷酸接头(参见如Sambrook(1989)见 上文；以及Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS INFUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp70-76)。另外，可以应用已知的重组技术构建载体(Invitrogen Life Technologies，GatewayTechnology)。

[0190] 转化、表达和培养宿主细胞

[0191] 将DNA构建体或载体导入宿主细胞包括如下技术，如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(如脂转染介导的转染和DEAE-葡聚糖介导的转染)；与磷酸钙孵育；DNA沉淀；
用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。

[0192] 用于曲霉属和木霉属的转化方法在如Yelton等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474；Berka等(1991)，在Applications of EnzymeBiotechnology一书中，Kelly和Baldwin编辑，Plenum Press(NY)；Cao等(2000)Sci.9：991-1001；Campbell等(1989)Curr.Genet.16：53-56；Pentilla等(1987)Gene 61：155-164)；de Groot等(1998)Nat.Biotechnol.16：839-842；USP 6,022,725；USP 6,268,328和EP 238 023中描 述。在木霉属中表达异源蛋白在USP 6,022,725；USP 6,268,328；Harkki等(1991)；Enzyme Microb.Technol 13：227-233；Harkki 等 (1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；
EP 215,594；和 Nevalainen 等 ″ The Molecular Biology of Trichoderma andits Application to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes″，在MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Leong和Berka编著，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148)中描述。转化镰孢属菌株可以参考WO96/00787和Bajar等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8202-28212。

[0193] 用于转化植物的DNA构建体的构建方法和植物转化方法是已知的。这些方法的一些例子包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转化、微粒轰击，PEG介导的原生质体转化、电穿孔等。可参考例如USP 5,780,708；USP 6,803,499；USP 6,777,589；Fromm等人(1990)Biotechnol.8：833-839；Potrykus等(1985)Mol Gen.Genet.199：169-177； Brisson等(1984)Nature 310：511-514；Takamatsu等(1987)EMBO J6：307-311；Coruzzi 等 (1984)EMBO J 3：1671-1680；Broglie 等 (1984)Science 224：
838-843；Winter J和Sinibaldi RM(1991)Results Probl CellDiffer 17：85-105；Hobbs S或Murry LE(1992)，McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp191-196；以 及 Weissbach和 Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。转化的细胞可以在适当条件下用标准技术摇瓶培养、在实验室发酵罐中小规模发酵或在工业发酵罐中大规模发酵(包括连续、分批和补料分批发酵)，并用包含生理盐类和营养物的合适培养基(参见如Pourquie，J.等，BIOCHEMISTRY ANDGENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION，Aubert，J.P.等编著，Academic Press，pp.71-86，1988；和Ilmen，M.等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。常见的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(YM)培养基，Luria Bertani(LB)培养基和沙氏葡萄糖(SD)培养基)可用于本发明。丝状真菌细胞优选的培养条件是本领域已知的，并且可以参考科学文献和/或来源于如美国典型培养物保藏中心和真菌遗传学原种中心(Fungal Genetics Stock Center)的真菌资源。 [0194] 在一些实施方案中，构建了具有载体系统的遗传上稳定的转化体，其中编码植酸酶变体的核酸稳定地整合入宿主菌的染色体中。然后用已知的技术纯化转化体。 [0195] 在一个非限制性的例子中，包括amdS标记的稳定的转化体与不稳定的转化体的区别在于更快的生长速率和在包含乙酰胺的固体培养基上形成环状的光滑菌落克隆而不是粗糙的外形。另外，在某些情况下做了更进一步的稳定性实验，在非选择性固体培养基(即，无乙酰胺的培养基)上生长转化体，从这种培养基收集孢子并测定这些孢子中随后可发育并生长在含有乙酰胺的选择性培养基上的孢子的比率。备选地，其他已知的方法可以用于选择转化体。

[0196] 在一个具体实施方案中，木霉属转化的制备涉及制备来自真菌菌丝体 的原生质体。(参见，Campbell等，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方案中，菌丝体获得自萌发的营养孢子。菌丝体用消化细胞壁而产生原生质体的酶来处理。原生质体然后通过悬浮培养基中存在的渗透稳定剂得到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常这些稳定剂的浓度在0.8M到1.2M之间变化。优选的是在悬浮培养基中使用浓度大约为1.2M的山梨醇溶液。

[0197] 在建立了真菌的生长后，使转化体细胞暴露于能有效引起或允许表达本文中定义的植酸酶变体的条件。在编码植酸酶变体的序列位于诱导型启动子控制下的情况时，诱导剂(如，糖、金属盐或抗微生物剂)以能有效地诱导表达的浓度加入培养基中。

[0198] 植酸酶表达/活性的测定法

[0199] 为了评价具有植酸酶活性的植酸酶变体被本发明的编码具有植酸酶活性的植酸酶变体的异源多核苷酸转化的细胞系的表达，可以在蛋白质水平、RNA水平进行测定或通过使用特定的植酸酶活性和/或产生的功能性生物测定法。通常，所使用的测定法包括RNA印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、或用适当的探针标记(基于核酸编码序列)的原位杂交和常规的DNA印迹和放射自显影术。

[0200] 另外，具有植酸酶活性的植酸酶变体的产生和/或表达可以在样品中直接测量，例如，通过无机磷酸盐的释放直接测量植酸酶活性(FTU)的测定法。无机磷酸盐和酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色复合体，黄色复合体在分光光度计中于415nm波长处测定，并且释放的无机磷酸盐由磷酸盐标准曲线定量。一个单位植酸酶(FTU)是按欧洲标准(CEN/TC327，2005-TC327WI 003270XX)给出的反应条件下每分钟从植酸释放1微摩尔无机磷酸盐所用酶的量。

[0201] 另外，基因表达可以由免疫学的方法评价，例如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或组织培养基的免疫测定法，例如，通过蛋白质印迹或ELISA。这些免疫测定法可以用于定性和定量评价植酸酶的表达。这些方法的详细内容是本领域技术人员已知的，并且用于这些方法的许多试剂是 商业上可得到的。

[0202] 植酸酶活性的测定法是本领域已知的，一个例子是由Fiske和SubbaRow，Journal of Biological Chemistry 66：375-392(1925)开发的释放无机磷酸盐的经典测定法。Mitchell等Microbiol.143：245-252(1997)建立了这个方法的变化的方法。FOOD CHEMICALS CODEX，第4版，Committee on Food Chemicals Codex，Institute of Medicine，NationalAcademy Press，Washington，DC，1996，809-810页描述了备选方法。这些参考文献均掺入本发明。在许多这些测定法中，随后使用分光光度计进行比色，并与无机磷酸盐的浓度已知的对照(Pi)相比较和/或与通过用具有已知植酸酶活性的酶反应产生的对照相比较。将一单位活性确定为在定义的反应条件下每分钟从植酸释放1μmol Pi所需酶样品的量。也可以参考USP6,221,644和USP 6,139,902。

[0203] 在本发明的一些实施方案中，由木霉属或曲霉属宿主表达的具有植酸酶活性的植酸酶变体在每升培养基中具有大于1克蛋白每升(g/L)，大于2g/L，大于5g/L，大于10g/L，大于20g/L，大于25g/L，大于30g/L，大于50g/L和大于100g/L。

[0204] 蛋白回收

[0205] 本发明的核酸序列表达后产生的多肽可以从细胞培养发酵中回收或分离，并且可以用按照本领域已经建立的多种方法大量纯化。本领域技术人员能够选择最适当的分离和纯化技术。本发明的植酸酶可以从培养基或宿主细胞裂解物中回收。如果蛋白是膜结合的，通过使用适合的去污剂溶液(如Triton-X 100)或通过酶裂解将蛋白从膜释放出来。表达植酸酶所用的细胞可以通过各种物理的或化学的方法破坏，例如冻融循环、超声处理、机械破碎、或细胞裂解剂。期望从重组细胞蛋白或多肽纯化植酸酶。下列方法是适合的纯化方法的例子：通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相高压液相层析；二氧化硅色谱法或阳离子交换树脂色谱法如DEAE；色谱聚焦、SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A琼脂糖凝胶柱去除污染物；和金属螯合物柱结合植酸酶的表位标记形 式。可以使用多种蛋白纯化方法，并且这些方法是本领域已知的，例如在Deutscher，METHODS IN ENZYMOLOGY，182(1990)；Scopes，PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，New York(1982)中描述。选择的纯化步骤取决于如所使用的生产工艺的本质和产生的植酸酶的特定形式。

[0206] 一般而言，细胞培养产生的植酸酶变体(包括n-布丘氏菌属菌植酸酶或r-布丘氏菌属菌植酸酶)分泌到培养基中并且可以纯化或分离，如通过去除细胞培养基中不需要的成分。在一些情况下，植酸酶变体可以以细胞的形式产生，使得从细胞裂解物中回收植酸酶变体成为必需。在这些情况下，使用本领域常规的技术从产生植酸酶变体的细胞中纯化酶。例子包括但不限于亲和层析(参见如Tilbeurgh等(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换色谱法(参见如Goyal等(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等(1983)Eur.J.Appl Microbiol Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等(1984)J.ApplBiochem.6：336；和Ellouz等(1987)Chromatography 396：307)，包括用高分辨能力材料的离子交换(参见如，Medve等，(1998)J.Chromatography A808：153)；疏水相互作用色谱(参见如，Tomaz和Queiroz(1999)J.Chromatography A 865：123)；二相分配(参见如，Brumbauer等(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相高压液相层析；二氧化硅色谱法或阳离子交换树脂色谱法如DEAE；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和/或使用如Sephadex G-75的凝胶过滤。

[0207] 发酵

[0208] 在本发明的一些实施方案中，表达异源植酸酶变体的真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭的系统，在这个系统中，培养基的组成是在发酵开始时设定的，并且在发酵过程中不受到人为的修改。因此，在发酵开始时用目的生物体接种培养基。在这种方法中，允许发酵在不向系统中添加任何成分地进行。一般，分批发酵称为“分批”在于碳源加入，和经常尝试控制pH和氧浓度等因素。分批发酵系统的代谢物和生物量组分不断的发生变化直到发酵结束时。在分批培养中，细胞经历 延滞期到高生长对数期的过程，并且最终到稳定期，在稳定期生长速率减小或停止。如果不进行处理，在稳定期的细胞最后会死亡。通常的，在对数生长期的细胞进行大量终产物的生产。

[0209] 标准分批系统的变化形式是“补料分批发酵”系统，该系统也可用于本发明。在这种典型分批系统的变化形式中，在发酵过程中以增量加入底物。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞代谢时和当想让培养基中具有受限量的底物时补料分批系统是有用的。测量补料分批系统中真实的底物浓度是困难的，因此基于对如pH、溶解氧和如CO2的废气的分压这些可测量因素的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵是常用的和本领域熟知的。 [0210] 连续发酵是开放的系统，在这个系统中，将确定的发酵培养基连续的加入到生物反应器中，并且相等量的条件培养基同时被移出用于处理。连续发酵通常使培养物保持衡定高密度并且细胞主要处于对数生长期。

[0211] 连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物物浓度的一个因子或任何数量的因子。例如，在一个实施方案中，限制性营养成分如碳源或氮源维持在固定的比率，所有其他参数允许调节。在其他系统中，许多影响生长的因子可以连续的变化，而通过测量培养基混浊度将细胞浓度保持衡量。连续发酵系统力争保持稳态生长条件。因此，在发酵中由于取出培养基而引起的细胞损失必须和细胞生长速率相平衡。调节连续发酵过程的营养和生长因子的方法以及产物形成率最大化的技术是工业微生物领域熟知的。

[0212] 应用和使用的方法

[0213] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含本发明的至少一种植酸酶的酶组合物。本发明的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干的组合物形式。 [0214] 液体组合物只需要包含植酸酶，可以是基本上纯的或不纯的形式，优选的是基本上纯的形式。然而，通常地也加入稳定剂如甘油、山梨醇或单体丙二醇。液体组合物也可以包含一种或多种其他添加剂，如盐类、糖类、防腐剂、pH调节剂(即，缓冲剂)、蛋白质、或植酸(植酸酶底物)。典型的液体组合物是含水的或基于油的浆液。

[0215] 干的组合物可以是喷雾干燥组合物，在这种情况下，干燥组合物仅需要包含干的形式的酶。然而，通常地，干的组合物也是所谓的颗粒，可以容易的与例如食物或饲料成分混合，或者更优选的形成预混合物的组分。酶颗粒的大小优选的是与混合物中的其他组分一致。

[0216] 在一些实施方案中，包括本发明的植酸酶变体的酶组合物可以任选地用于与任一以下酶或以下酶的组合进行组合：葡糖淀粉酶、α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶(cutinase)、其他植酸酶、和它们的组合。

[0217] 在一些实施方案中，植酸酶组合物是食物或动物饲料组合物。食物或动物饲料组合物可以包含浓度为10到15,000U/kg饲料或食物(例如，100到5,000U/kg，200到2,000U/kg，和500-1000U/kg)的植酸酶。植酸酶组合物可以用作在牲畜例如家禽和猪以及包括鱼和虾在内的水生养殖动物的消化道中有活性的添加剂。本发明考虑了产生食物或动物饲料的方法，特征是将本发明的植酸酶与所述食物或动物饲料混合。液体组合物可以在其任选的粒化过程后添加到食物或饲料中。

[0218] 在一些实施方案中，动物饲料包含一种或多种下述组分：a)谷类，例如小粒谷物(如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和其组合)和/或大粒谷物如玉米或高粱；b)谷类的副产品，如谷物蛋白质粉、可溶性干酒糟(DistillersDried Grain Solubles；DDGS)、麦麸、小麦次粉(wheat middlings)、次小麦粉(wheat shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈核、和柑橘果肉；c)获得自如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、芸苔、鱼粉、干燥的血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻来源的蛋白；d)获得自蔬菜和动物源的油和脂肪；e)矿物质和维生素；f)添加剂，如酶、甜菜碱、香料、香精油、抗生素生长促进物质、抑球虫剂、益生菌剂和益生素。

[0219] 也提供了减少动物粪中磷水平的方法，特征在于给动物喂饲本发明的动物饲料，在所述动物饲料中含有的植酸酶的量为有效转化植酸的量。

[0220] 更进一步，本发明包含的植酸酶组合物可以用于淀粉水解的方法。植酸酶组合物可以在淀粉液化步骤、糖化步骤和/或发酵步骤期间添加。在使用减少的植物材料例如碾碎的谷类作为给料的工业淀粉水解工艺中(如在酿造和烘焙中)α-淀粉酶用于分解淀粉1-4连接键。淀粉酶是分解淀粉所必须的，并且获得足够的这些酶的活性有时是有问题的。
一段时间以来人们已知植酸具有对淀粉酶的抑制作用。因此包含本发明所述的植酸酶的酶组合物可以用于淀粉水解工艺来减少植酸对α-淀粉酶的抑制作用(EP 0813607B)。 [0221] 发现植酸酶、植酸和较低磷酸的植酸衍生物有许多其他用途，用于个人护理产品、医药产品、以及食物和营养产品，还有多种工业应用，尤其在清洁、织物、平板印刷和化学领域中。

[0222] 提供了以下实施例仅为了阐明目的，并不是以任何方式用于限制本发明的保护范围。

[0223] 实验

[0224] 缩写

[0225] 在下文公开的内容和实验部分应用了以下缩写。℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；aa或AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；
μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(s)或s(s)(秒)；min(s)或m(s)(分钟)；
hr(s)或h(s)(小时)；AMM溶液(7.5NH2SO4，15mM钼酸铵和丙酮(1∶1∶2))；ABS(吸光度)；EtOH(乙醇)；PPS(生理盐溶液)；m/v(质量/体积)；和MTP(微量滴定板)。

[0226] 在以下提供的实施例中使用了以下测定法和方法：

[0227] 以下描述了用于提供变体的方法。然而值得注意的是，不同的方法可以用于提供亲本分子的变体，并且本发明并不限于实施例中应用的方法。可以预期的是，可以使用任何用于制造变体和选择变体的合适方法。

[0228] 布丘氏菌属P1-29菌株保藏于NCIMB，保藏号为41248。WO2006/043178描述了从植物材料中分离该菌株和其分类鉴定(参见，实施例1-4)。另外，WO 2006/043178也描述了染色体DNA的克隆和在大肠杆菌中扩增和表达布丘氏菌属P1-29菌株的植酸酶基因(参见，实施例5-6)。WO 2006/043178中描述的布丘氏菌属P1-29菌株植酸酶在本文中也称为BP-WT，并参考本文中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2

[0229] 植酸酶酶活性测定法：

[0230] 在两个缓冲系统中实施这些测定法。使用了pH4.0到5.5的乙酸钠缓冲液。用HCL滴定250mM乙酸钠到指定的pH值制备所述缓冲液。用HCL滴定250mM甘氨酸到指定的pH值来制备pH 2.0到3.5的缓冲液。在pH 4.0的测定法用做标准。除缓冲液外，反应混合物还含有6mM植酸和1.0mM CaCl2和0.05mg/ml BSA。反应允许在37℃进行1小时。使用钼酸盐测定法来测量磷酸的释放，如Heinonen等(Heinonen，J.K.，Lahti，RJ.，Anal Biochem.113(2)，313-31791981))描述的。简而言之，在每个微量滴定板孔中将200μl新鲜配制的AMM溶液加入到100μl反应混合物中。在添加AMM试剂后不早于10分钟也不晚于30分钟内在390nm测量吸光度。建立已知浓度的磷酸盐溶液的校正曲线来确定磷酸盐的量。使用Vector NTI software(Invitrogen)根据蛋白质的氨基酸组分计算植酸酶变体的比吸收值(A280)。

[0231] 比活性测定法

[0232] 在微量滴定板中使用酶联测定法来确定植酸酶活性：酶制备物用稀释缓冲液(50mM乙酸钠缓冲液，0.05％普流尼克F-68，1mg/ml BSA)稀释。将75μl植酸酶测定混合物(500mM甘氨酸/HCl，pH 4.0，10.67mM植酸，1mM CaCl2，0.05％(w/v)普流尼克F-68)加入到5μl酶溶液中。在37℃下孵育待测溶液1小时。然后10μl待测溶液与40μl检测混合物(1M Tris/HCl，pH 7.0，0.01％(v/v)Triton X-100，25μM ADHP(MoBiTec，
德国)，0.25u/ml麦芽糖磷酸化酶、0.3125mM麦芽糖、1.5625u/ml葡糖氧化酶、0.3125u/ml辣根过氧化物酶、1mM EDTA，0.35mg/ml BSA)混合， 并在37℃孵育1小时。在H2O中加入
30μl 2700u/ml的过氧化氢酶终止反应。使用535nm作为激发波长在595nm处测量荧光。
使用已知浓度的磷酸盐溶液的校正曲线确定磷酸盐的量。

[0233] 通过在A280nm处测定吸光度进行蛋白质测定。使用Gill和vonHippel(Anal.Biochem.182：319-326(1989))的方法基于蛋白质的氨基酸组分计算植酸酶变体的比吸收值(A280)。

[0234] 热稳定性

[0235] 变体的热稳定性以酶的失活温度表征。在不同温度反应10分钟并随后降至室温后测量植酸酶的残留活性确定失活温度。失活温度是与在室温相同条件下持续相同时间反应的残留活性相比较，残留活性是50％处的温度。为了确定对应于50％残留活性的温度，根据需要对测量的活性数据进行内推法(interpolation)和外推法计算。以℃表示的热稳定性差是将两酶的失活温度彼此相减计算出的。

[0236] 纯化BP-11突变体

[0237] 纯化如下进行：使用添加了20mg/1新霉素的标准LB培养基，37℃160转/分钟摇瓶培养用编码BP-11的质粒转化了的枯草芽孢杆菌。在这个阶段，培养基累积了显著量的植酸酶活性。将大约2L培养液调节到pH 8.0，滤过并上样至10ml Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂(Qiagen)填充的柱。用50mMTris-HCl缓冲液，300mM NaCl，pH 8.0洗柱子直到OD280降到0.05之下。随后用相同的包含250mM咪唑盐酸的缓冲液洗脱下结合的植酸酶。洗脱物对
50mM pH 5.0的乙酸钠缓冲液透析并在4℃保存。然后将酶溶液上样至用20mM pH 5.0乙酸钠缓冲液平衡的Resource S柱，并且使用超过10个柱体积的0-1M NaCl盐梯度进行洗脱。任选地，在4℃保存前用pH 5.0的20mM乙酸钠缓冲液透析洗脱物。

[0238] 胃蛋白酶稳定性

[0239] 此类变体的胃蛋白酶稳定性表征为：与对照条件相比，胃蛋白酶孵育后pH3.537℃测量的残留活性(残留活性＝胃蛋白酶孵育后的活性/对照条件下孵育后的活性)。在pH 2.0，0.25mg/ml胃蛋白酶，1mM CaCl2和5 mg/ml BSA 37℃2小时进行胃蛋白酶孵育。对照条件是pH5.0，1mM CaCl2和5mg/ml BSA，在37℃孵育2小时。

[0240] 在下文的实施例中，除非有其他注释，植酸酶变体序列的氨基酸残基按照BP-WT(SEQ ID NO：1)的序列编号。

[0241] 实施例1.植酸酶变体的产生和鉴定

[0242] 一般而言，使用如Morinaga等(Biotechnology(1984)2，646-649页)；Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151页)描述的那些方法；或WO92/18645描述的误差阈诱变(Error Threshold Mutagenesis)方案中公开的诱变方法，通过诱变SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列构建植酸酶变体。Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140)公开了另一合适的诱变PCR的方法。

[0243] 在一种或多种下述表达宿主：大肠杆菌K12、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中异源表达后表征了植酸酶变体。植酸酶变体是衍生自SEQ ID NO：1，在一个或多个氨基酸位置处有差异，包括两个位置、三个位置、四个位置、五个位置、六个位置、七个位置、八个位置、九个位置、十个位置、十一个位置、十二个位置。根据需要进行反复的诱变轮次。根据WO 2006/043178中描述的方案，在BP-WT中观察到多种突变。尤其是一个变体A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E /N303K称为BP-11，观察到具有超过BP-WT的增加的热稳定性(参见，SEQ IDNO：4所示序列的7-419氨基酸残基，对应于SEQ ID NO：6)。

[0244] 实施例2.BP-11的变体

[0245] 三种不同的方案用于获得BP-11的变体，包括随机诱变、定向诱变和位点饱和诱变。

[0246] A.按照WO 2006/043078中描述的用于获得BP-WT突变体如BP-11的教导进行随机诱变和高通量筛选。

[0247] 用这种方法获得的BP-11的一个具体变体称为BP-19。BP-19与BP-11不同，在对应于SEQ ID NO：4的54(Y54H)，84(S84G)，190(S190G)， 220(I220V)和289(N289D)位置发生替代。

[0248] 应用上文中描述的测定法测量比活性。确定了BP-19在pH 4.0具有比活性比BP-11高出大于26％，表3给出了参考。

[0249] B.在BP-WT骨架和BP-11骨架上进行了三个特定残基的定向诱变，对应于SEQ ID NO：4的G221S，T225M和N276R位置。突变体BP-15获自BP-WT骨架，突变体BP-16获自BP-11骨架。相对于亲本植酸酶的比活性在表3中描述。

[0250] C.基于变体BP-11分子在多个位置进行了位点饱和诱变获得文库。位置包括SEQ ID NO：4的R24，R28，T31，K32，D98，R100，K137，N212，G221，T225，E228，H259，F263，M266，N276，H312，D313，T314和D334。该文库最初用高通量筛选出提高的活性，然后筛选出具有上文描述的比活性的一些变体。所选择的变体更进一步纯化到约97％纯度并分析比活性。在位置D98处突变的两个变体获得了提高的比活性(D98A和D98Q)。分离出具有ala(A)代替asp(D)(D98A)的突变体并称为BP-17(参见，SEQ ID NO：3)。分离出具有gln(Q)代替asp(D)(D98Q)的突变体并称为BP-20。

[0251] 包括BP-16，BP-17，BP-18，BP-19和BP-20在内的BP-11的变体均按上文所述测定植酸酶活性。

[0252] 表3比活性(U/mg，pH 4.0，97％酶纯度)

[0253]变体 比活性 (U/mg) 比活性 (BP-WT活性的％) 比活性 (BP-11活性的％)
BP-WT(P1-29) 936 100 142
BP-11 632 70 100
BP-15 790 85 121
BP-16 760 74 106
BP-17 1017 109 156
BP-18 1005 107 153
BP-19 822 88 126
BP-20 840 93 133

[0254] 实施例3-在大肠杆菌中表达BP-17

[0255] 在大肠杆菌中表达的BP-17突变体的DNA序列经过了修饰，包括在″6xHis标签″之后的编码野生型布丘氏菌属菌植酸酶信号序列的DNA序列和对应于布丘氏菌属菌成熟植酸酶的突变体BP 17的编码序列。使用标准基因工程方法，将这个核苷酸序列插入到大肠杆菌dps基因的启动子和也来源于大肠杆菌的tufA基因转录终止子之间。

[0256] 表达盒插入到大肠杆菌载体pCR 2.1.(Invitrogen)SacI和ApaI限制性位点之间产生质粒pCDP(SHOK)。表达载体pCDP(SHOK)的结构如图2所示。

[0257] pCDP(SHOK)转化的大肠杆菌菌株XL-Blue MRF’在37℃和200转/分钟使用添加了50mg/1卡那霉素的标准LB培养基在摇瓶中培养。在这个阶段，培养基累积了显著量的植酸酶活性，该活性在转化了pCR2.1的受体菌株并在相同培养基上培养时未检测到。大约2L这种肉汤培养基调节到pH 8.0并上样至25ml Ni-NTA琼脂糖凝胶(Qiagen)填充的柱。用20mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0洗柱子直到OD280降到0.05之下，随后用相同的包含200mM咪唑盐酸的缓冲液洗脱下结合的植酸酶。洗脱物用20mM乙酸钠缓冲液pH 5.5透析并保持在4℃或冻存在-20℃。重复冷冻-融化没有观察到活性的损失。

[0258] 如下测量在大肠杆菌中表达的BP-17和野生型布丘氏菌属菌植酸酶(BP-WT)的pH特征曲线。含有250mM乙酸钠和7.5mM植酸钠的溶液用盐酸调节到pH 6，5.5，5，4.5，4.25，4.0，3.75，3.5，用于构建在pH 3.5到pH6.0范围的pH特征曲线。测量了在含有250mM甘氨酸和7.5mM植酸钠的并用盐酸调节到指定pH的底物溶液在pH值为3.0和2.5的酶的活性。发现在大肠杆菌中产生的BP-17的pH特征曲线显著偏离了野生型布丘氏菌属菌植酸酶的pH特征曲线(图3)。

[0259] 酶(稀释到大约30U/ml)在pH 2.0的包含3mg/ml BSA的0.25M甘氨酸-盐酸缓冲液中用不同浓度的胃蛋白酶在37℃处理2小时。孵育后， 在pH 5.5测定剩余的活性。如图4所示，BP-17基本上对胃蛋白酶稳定。BP-17的高胃蛋白稳定性与野生型布丘氏菌属菌植酸酶的非常低的胃蛋白酶稳定性形成对比，野生型布丘氏菌属菌植酸酶基本上完全被
1μg/ml胃蛋白酶降解(图4)。

[0260] 在实施例4-8中，野生型和变体布丘氏菌属菌植酸酶直接或作为融合蛋白在里氏木霉中表达。在所有情况下观察到大于10g/L的非常强的表达水平。

[0261] 实施例4-构建并在里氏木霉中作为无Kex2位点的融合蛋白表达野生型布丘氏菌属菌植酸酶

[0262] 由GENEART AG(BioPark J osef-Engert-Str.11，D-93053Regensburg，Germany)合成了编码野生型布丘氏菌属菌植酸酶可读框的DNA。限制性位点SpeI和AscI为克隆目的引入其中(参见表4、SEQ ID NO：8)。植酸酶可读框(SEQ ID NO：8)插入到载体pTrex4的SpeI和AscI位点(见图5)。得到的构建体生物弹射击地转化入来源于里氏木霉的菌株，使用Bio-Rad的Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Hercules，CA)。使用的转化方案如Foreman(WO 2005/001036)所描述。在得到稳定的转化细胞后，这些转化细胞在摇瓶中生长，表达分析布丘氏菌属菌植酸酶蛋白，如Foreman(WO2005/001036)所述。WO2005/001036的转化和表达分析方案整体作为参考引入本发明。在MM乙酰胺板上生长数天后，显示稳定的形态的转化细胞接种到含有30ml Proflo培养基的250ml摇瓶中。Proflo培养基包含30g/Lα-乳糖；6.5g/L(NH4)2SO4；2g/L KH2PO4；0.3g/LMgSO4·7H2O；
0.2g/L CaCL2；1ml/L 1000X痕量元素盐溶液；2ml/L 10％吐温80；22.5g/L Proflo棉子粉(Traders Protein，Memphis，TN)；和0.72g/LCaCO3。在28℃和225转/分钟生长两天后，将
10％Proflo培养物转入包含30ml限定了乳糖的培养基(Lactose Defined Media)的250ml摇瓶中。限定了乳糖的培养基的组分如下：5g/L(NH4)2SO4，33g/L PIPPS缓冲液；9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/L KH2PO4，1g/L MgSO4·7H2O；5ml/L MazuDF60-P消泡剂(mazur Chemicals，Gurnee，IL)；1ml/L 1000X痕量元素盐溶 液；pH 5.5.40ml/L的40％(w/v)乳糖溶液灭菌后加入到培养基中。在28℃225转/分钟摇瓶培养限定了乳糖的培养基2-3天。培养上清液的样品用适当体积的含有还原剂的4X NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen Carlsbad，CA)混合，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，使用4-12％NuPAGE预制凝胶和MOPS电泳缓冲液(Invitrogen Carlsbad，CA)。用Simply BlueStain(Invitrogen Carlsbad，CA)染色的凝胶用于蛋白检测。在染色的凝胶上观察到具有约96kDa的表观分子质量的蛋白带。该融合蛋白的预期分子质量约为96kDa。发现该蛋白表达大于10g/L。

[0263] 表4：包含5′端的SpeI位点和3′端的AscI位点的野生型布丘氏菌属菌植酸酶的DNA序列。

[0264] ACTAGTAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAG

[0265] CCGCCACGGAGTCCGCGCCCCCACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCC

[0266] CCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCCCGCGGCGAG

[0267] CACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCAT

[0268] CCTCAGCCAGGGCTCGTGTCCCACCCCCAACAGCATCTATGTCTGGGCCGACGTCGA

[0269] CCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCG

[0270] GCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCC

[0271] GTCAAGGCCGGCACCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGA

[0272] AGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCTTCCTCGCC

[0273] CTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCACCAGCGCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGC

[0274] CGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACA

[0275] ACGGCAACAAGGTCGCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAG

[0276] ATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCTGCCTGGGGCAACATCCAC

[0277] AGCGAGCAGGAGTGGGCCAGCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCCAGTTCGACCTCAT

[0278] GGCCCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAACGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCA

[0279] GCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGAC

[0280] AACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCAT

[0281] GCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCCGGCGGCG

[0282] CTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAATATGTCTCTGTCAGCA

[0283] TGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAG

[0284] CCCGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGG

[0285] CTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTG

[0286] CCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC(SEQ ID NO：8)

[0287] 实施例5-构建并在里氏木霉中作为具有Kex2位点的融合蛋白表达野生型布丘氏菌属菌植酸酶

[0288] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶的可读框，使用GENEART合成的DNA作为模板(见表4，SEQ ID NO：8)。使用的PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR中使用 的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。使用的扩增植酸酶的可读框的引物是引物SK667(正向引物)5′CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG-3′(SEQ ID NO：9)，和引物SK6645′GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA-3′(SEQ ID NO：13)。正向引物含有氨基酸序列VAVEKR(SEQ ID NO：10)，用于Kex2蛋白酶的有效切割，也具有用于克隆目的的SpeI位点。扩增野生型植酸酶的可读框的PCR条件如下：步骤1，94℃1分钟，步骤2：94℃30秒，步骤3：58℃30秒，步骤4：72℃1分钟，步骤
2、3和4重复额外的24个循环，步骤5：72℃5分钟，步骤6：4℃保存。PCR产物用Qiaquick Gel Purification Kit(Qiagen)纯化，并用限制性酶SpeI和AscI(Roche)消化。消化的DNA用Qiaquick PCRPurification Kit纯化，并连接于pTrex4载体的SpeI和AscI位点(见图5)。连接产物转化入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。转化和蛋白表达的鉴定参见实施例4。在染色的凝胶上观察到具有约96kDa的表观分子质量的蛋白带。
该融合蛋白的预期分子质量约为96kDa。发现该蛋白表达大于10g/L。

[0289] 实施例6-构建并在里氏木霉中以直接构建体表达野生型布丘氏菌属菌植酸酶[0290] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶的可读框，使用GENEART合成的DNA作为模板(见表5，SEQ ID NO：6)。使用的PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。使用的扩增植酸酶的可读框的引物是引物SK680(正向引物)5′-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3′(SEQ ID NO：
11)，和引物SK65′-CCTTACTGGAGCTGGCAG-3′(SEQ ID NO：12)。正向引物在5′端包含附加的四个核苷酸(序列-CACC)，是克隆入pENTRY/D-TOPO载体 (Invitrogen)所必须的。扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶可读框的PCR条件如下：步骤1，94℃1分钟，步骤2：94℃30秒，步骤3：58℃30秒，步骤4：72℃1分钟，步骤2、3和4重复额外的24个循环。步骤5：
72℃5分钟，步骤6：4℃保存。PCR产物用Qiaquick Gel Purification Kit(Qiagen)纯化。PCR纯化产物最初克隆入pENTRY/D TOPO载体(Invitrogen)，并且转入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。用LR克隆酶II(Invitrogen)按照使用说明书，将具有植酸酶可读框的正确序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组(见图6)。如实施例
4所述将得到的构建体转化并鉴定蛋白表达。融合蛋白期望的分子质量大约为46kDa。蛋白表达大于10g/L。

[0291] 实施例7-构建并在里氏木霉中以具有Kex2位点的融合蛋白表达BP-17变体布丘氏菌属菌植酸酶

[0292] 由GENEART AG(BioPark Josef-Engert-Str.11，D-93053 Regensburg，Germany)合成编码BP-17变体可读框的DNA(见表5，SEQ ID NO：7)。包括氨基酸序列VAVEKR(SEQ ID NO：10)是为了Kex2蛋白酶切割融合蛋白，也具有为了克隆目的的限制性位点SpeI和AscI。植酸酶可读框(SEQ IDNO：7)在SpeI和AscI位点插入pTrex4载体(见图5)。如实施例4所述转化所得的构建体并表达。融合蛋白期望的分子质量大约为96kDa。蛋白表达大于10g/L。

[0293] 表5：包含5′端的SpeI位点和3′端的AscI位点的布丘氏菌属菌植酸酶的BP-17变体的DNA序列。

[0294] ACTAGTGTCGCCGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGA

[0295] GAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCACGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGA

[0296] CCATGCGCGACGTCACCCCCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTAC

[0297] ATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAA

[0298] GTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAGCCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCT

[0299] ACGTCTGGACCGACGTCGCCCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCC

[0300] GGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGC

[0301] CGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAAGGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGG

[0302] TCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCAC

[0303] TACATCCCCAGCCTCGCCCTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGG

[0304] TGCCAGAAGCACAGCGCCGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAA

[0305] GCTCAGCATCAAGGACAACGGCAACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCA

[0306] GCTCCACCCTCGCCGAGATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCG

[0307] CCTGGGGCAACATCCACAGCGAGCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAAC

[0308] GTCTACTTCGACCTCATGGAGCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCC

[0309] CTCCTCCAGGCCATCAGCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCC

[0310] CGACATCAGCCCCGACAACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCG

[0311] CCAACATCGCCGGCATGCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAAC

[0312] ACCCCCCCTGGCGGCGCTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCA

[0313] GTACGTCAGCGTCAGCATGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCC

[0314] CCCTCAGCCTCAACCAGCCTGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAAC

[0315] GACCAGACCGCCGAGGGCTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCA

[0316] GAGCGTCGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC(SEQ ID NO：7).

[0317] 实施例8-构建并在里氏木霉中以直接构建体表达BP-17变体布丘氏菌属菌植酸酶

[0318] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增BP-17变体布丘氏菌属菌植酸酶的可读框，使用由GENEART合成的DNA作为模板(见表5，SEQ ID NO：7)。使用的PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research)。在PCR中使用的DNA聚合酶是HERculase(Stratagene)。使用的扩增植酸酶可读框的引物是引物SK680(正向引物)5′-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3′(SEQ ID NO：11)，和引物SK65′-CCTTACTGGAGCTGGCAG-3′(SEQ IDNO：12)。正向引物在5′端包含附加的四个核苷酸(序列-CACC)，是克隆入 pENTRY/D-TOPO载体(Invitrogen)所必须的。扩增野生型布丘氏菌属菌植酸酶可读框的PCR条件如下：步骤1，94℃1分钟，步骤2：94℃30秒，步骤3：58℃30秒，步骤4：72℃1分钟，步骤2、3和4重复额外的24个循环，步骤5：72℃5分钟，步骤6：4℃保存。PCR产物用Qiaquick GelPurification Kit(Qiagen)纯化。PCR纯化产物最初克隆入pENTRY/DTOPO载体(Invitrogen)，并且转化入TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。使用LR克隆酶II(Invitrogen)按照制造商的使用说明书，将具有植酸酶可读框的正确序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组(见图6)。如实施例4所述转化所得的构建体并表达。在染色的凝胶上观察到具有约46kDa的表观分子质量的蛋白带。该融合蛋白的预期分子质量约为46kDa。发现该蛋白表达大于10g/L。