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高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05及其应用
申请号	CN201610531527.6	申请日	2016-07-07	公开(公告)号	CN106167766A	公开(公告)日	2016-11-30
申请人	华中农业大学;			发明人	齐德生; 杨双琦; 张妮娅; 孙铝辉; 宋文静; 刘婕; 高鑫; 张家才; 李翀;
摘要	本发明公开了一种黄曲霉菌CS05(Aspergillus flavus，CS05)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M2016271。本发明的黄曲霉菌具有较强的黄曲霉毒素B1产生能力。该菌在PDA培养基及玉米、小麦、大豆、豆粕、棉籽、棉粕等饲料原料和副产品中均有较高的产毒量。可作为AFB1产毒菌株用于AFB1的生产；用于AFB1污染的防控技术研究；为AFB1的生物合成机制、合成条件及去除方法研究提供实验材料。
权利要求	1.一种高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05，其命名为黄曲霉菌CS05Aspergillus flavus，CS05，其保藏号为：CCTCC NO:M 2016271。 2.根据权利要求1所述高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05，其特征在于：所述黄曲霉菌CS05的形态学鉴定结果如下： CS05：菌丝白色，紧贴培养基生长，气生菌丝发达。菌落生长较快，在察氏培养基上培养 7天直径为7.2cm，带有浅黄色的孢子；菌落反面有不规则的褶状纹路，自中心产生，培养基反面呈浅褐色。培养14天后，菌落布满整个平皿，孢子由黄色逐渐变为黄绿色，菌落反面呈褐色；在显微镜下观察，可以看到分生孢子头呈疏松放射状，顶囊呈圆球形，着生单层或双层小梗，分生孢子呈球形、近球形。 3.一种权利要求1所述的黄曲霉菌CS05在AFB1生产、AFB1的产生机制、菌株污染影响因素及AFB1污染和危害的防控方面研究中的应用。
说明书全文	高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及黄曲霉菌，具体地指一种高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05及其应用。背景技术 [0002] 霉菌是某些丝状真菌的俗称，霉菌毒素(Mycotoxins)是霉菌在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，普遍存在于饲料和饲料原料中。黄曲霉毒素(Afltoxin,AFT)是霉菌毒素中较普遍的一种，主要是由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等霉菌产生的一类具有致癌、致畸和致突变作用的次级代谢产物，以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)最为常见，并且毒性最强。黄曲霉毒素广泛存在于饲料、食品原料及其制品中，对人类和畜禽健康的危害极大。农作物或饲料原料从田间生长到收获、贮存、运输以及加工处理等各个环节中，由于生产管理或者环境条件不当，都有可能会被霉菌或者霉菌毒素污染，加之近些年，多种不规则气候(干旱、暴雨、霜冻和洪涝灾害)在全球范围内频发出现，使饲料、粮食原料及其副产品受到霉菌毒素污染的情况愈加严重。 [0003] 寄生曲霉有3～6％的菌株不产生黄曲霉毒素，而黄曲霉有0～80％的菌株不产生黄曲霉毒素。因此AFB1高产菌株的筛选对于研究AFB1的产生机制及有效预防和控制AFB1的污染，从而保证饲料产品的质量安全具有重要的指导意义。 [0004] 而目前国内常用的标准产毒菌株黄曲霉菌NRRL3357，产毒量较小。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供了一种高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05及其应用。其为黄曲霉毒素高产毒菌株的筛选研究奠定基础，为进一步的研究提供了试验材料。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供的一种高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05，其命名为黄曲霉菌CS05Aspergillus flavus，CS05，其保藏号为：CCTCC NO:M2016271。 [0007] 所述黄曲霉菌CS05的形态学鉴定结果如下： [0008] CS05：菌丝白色，紧贴培养基生长，气生菌丝发达。菌落生长较快，在察氏培养基上培养7天直径为7.2cm，带有浅黄色的孢子；菌落反面有不规则的褶状纹路，自中心产生，培养基反面呈浅褐色。培养14天后，菌落布满整个平皿，孢子由黄色逐渐变为黄绿色，菌落反面呈褐色；在显微镜下观察，可以看到分生孢子头呈疏松放射状，顶囊呈圆球形，着生单层或双层小梗，分生孢子呈球形、近球形。 [0009] 申请人将上述鉴定黄曲霉菌CS05(Aspergillus flavus，CS05)于2016年5月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO:M 2016271。 [0010] 高产黄曲霉毒素B1的黄曲霉菌CS05在AFB1生产、AFB1的产生机制、菌株污染影响因素及AFB1污染和危害的防控等方面研究中的应用。 [0011] 黄曲霉菌CS05具有较高的黄曲霉毒素B1产生能力。将黄曲霉菌S05和标准产毒菌株NRRL3357分别接种在PDA培养基上培养7天，其产毒量可达16.91(ug/plate)，显著高于NRRL3357的产毒量(10.24ug/plate)。 [0012] 由于饲料成分组成的不同，所以黄曲霉菌在不同饲料原料及副产品中的产毒量存在差异。在相同的培养条件下,所述的黄曲霉菌在饲料原料及其副产品中具有较高的产毒能力。将黄曲霉菌CS05和标准产毒菌株NRRL3357分别接种到粉碎的玉米、小麦、大豆、豆粕、棉籽、棉粕中，在恒温恒湿培养箱中培养10d后，黄曲霉菌CS05在上述饲料原料及副产品中的AFB1产量分别为11.313mg/kg，0.025mg/kg，0.461mg/kg，0.024mg/kg，0.089mg/kg，0.021mg/kg，均高于标准产毒菌株NRRL3357的AFB1产量(1.528mg/kg，0.004mg/kg， 0.094mg/kg，0.018mg/kg，0.008mg/kg，0.008mg/kg)。 [0013] 本发明的有益效果在于： [0014] 本发明所述的黄曲霉菌无论在PDA培养基还是饲料原料及其副产品中的AF B1产量均高于标准黄曲霉产毒菌株。因此该菌株可用于AFB1的产毒机制、菌株污染及产毒量的影响因素研究，为控制霉菌污染和霉菌毒素产生提供试验材料。附图说明 [0015] 图1为黄曲霉菌CS05的菌落形态特征图， [0016] 图中，图1A为菌落表面形态、图1B为菌落背面形态、图1C为显微形态(×400)； [0017] 图2为ITS片段扩增结果； [0018] 图3黄曲霉标准产毒菌株NRRL3357(图3A)和黄曲霉菌CS05(图3B)在AFPA培养基上(背面)的菌落形态图具体实施方式 [0019] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。 [0020] 实施例1黄曲霉菌CS05的分离、纯化、鉴定 [0021] 1.菌株的分离纯化 [0022] 方法参照《食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定》(GB/T 4789.16-2003)和《粮油检验储粮真菌标准图谱第1部分：曲霉属》(GB/T 26628.1-2011)。采用稀释分离法分离样品中的霉菌，然后用菌丝尖端挑取法或者点植法纯化得到的菌株，编号并保存备用。将棉籽样品粉碎处理后配制成孢子悬浮液，经稀释后选取合适的稀释度悬浮液，采用涂布法接种到察氏琼脂培养基中，28℃连续培养5～7天。为了将目的霉菌与其他霉菌和细菌分开，需要做进一步的分离和纯化培养。当霉菌在平板上生长出来以后，从远离其他杂菌的地方，用接种针从目的霉菌菌落的边缘挑取小块的培养基，连同上面生长的较嫩的菌丝，移到新的察氏培养基平板上，将菌丝朝下倒扣在培养基平板上进行纯化培养。将纯化得到的菌株编号并保存备用。 [0023] 2.菌株的鉴定 [0024] 2.1菌株的形态学鉴定 [0025] 观察菌落的生长速度，颜色，菌落表面质地，菌落边缘，培养基颜色变化等；挑取少许含有子实体的菌体制成玻片，于显微镜下观察菌丝的显微结构，包括分生孢子梗、分生孢子形态等。参照《真菌鉴定手册》对分离菌株进行初步鉴定。 [0026] 黄曲霉菌CS05的形态学鉴定结果如下 [0027] CS05：菌丝白色，紧贴培养基生长，气生菌丝发达。菌落生长较快，在察氏培养基上培养7天直径为7.2cm，带有浅黄色的孢子，中心部位较多。菌落反面有不规则的褶状纹路，自中心产生，培养基反面呈浅褐色。培养14天后，菌落布满整个平皿，孢子由黄色逐渐变为黄绿色，菌落反面呈褐色。在显微镜下观察，可以看到分生孢子头呈疏松放射状，顶囊呈圆球形，着生单层或双层小梗。分生孢子呈球形、近球形。初步认定CS05是黄曲霉菌。 [0028] 2.2菌株的菌落观察 [0029] 霉菌的菌落观察首先要用纯培养物在平板上培养出完整的巨大菌落以供观察记录。国标“食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定”(GB/T 4789.16—2003)中采用的是点植法，将平板倒转，向上接种一点，每个菌株接种两个平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养7天。观察和记载的主要项目有菌落正反面的颜色、菌落表面的质地、菌落边缘、培养基的颜色变化、菌落的生长或发育速度等。 [0030] 2.3菌株的制片和显微镜检查 [0031] 本试验参照国标“食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定”(GB/T 4789.16—2003)中的方法，挑取菌丝体制片，然后再进行显微镜检查。 [0032] 制片方法如下：取一片洁净的载玻片，在其中央加一滴乳酸-苯酚溶液。然后用解剖针(或接种针)从培养皿的纯化菌落上面挑取一小块含有菌丝体的霉菌培养物，放入载玻片中央的乳酸-苯酚液中，再将培养物撕开成小块，勿使菌丝体成团，注意不要涂抹，以免破坏霉菌结构。最后用镊子取盖玻片，从一边轻轻加盖，避免产生气泡，如果产生了气泡，可以稍微在酒精灯上加热排除。 [0033] 霉菌的显微镜检查，主要是观察菌丝体的形态和特征、孢子的形态和着生方式、孢子的排列等，并做详细的记录。 [0034] 2.4菌株的分子学鉴定 [0035] 提取菌株的DNA，通过PCR扩增、纯化、克隆、测序，获得CS05的ITS序列信息。测序结果利用DNAman 软件进行格式化和Alignment后，选择ITS1和ITS4两条引物(包含引物)之间的序列在GenBank核酸序列数据库中利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlin.nih.gov/blast)进行同源性比对，获得各个菌株的鉴定地位。并将得到的序列利用Sequin软件上传至GenBank核酸序列数据库，获得登录号(Accession Number)CS05菌株的ITS区域序列比对及分子鉴定结果如表1所示，包括菌株的GenBank登录号及最匹配的菌株鉴定地位等信息。 [0036] 表1黄曲霉菌CS05的ITS区域序列比对及分子鉴定结果 [0037] [0038] 实施例2黄曲霉菌CS05的产毒能力分析 [0039] 取2uL孢子悬浮液接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(25mL)中心位置，30℃，倒置培养7天，用高效液相色谱法测定AFB1含量。将准备的样品(玉米、小麦、大豆、豆粕、棉籽和棉粕)准确称量20g(精确至0.01g)，放入一系列150mL锥形瓶中，121℃高压灭菌20min。以同样的方式称量未灭菌样品。将装有样品的锥形瓶在无菌操作台中接种黄曲霉菌的孢子菌悬液，保证最终孢子浓度为106个/g。用无菌生理水将样品水分调至18％。用无菌玻璃棒充分混匀每个锥形瓶中的样品，使黄曲霉菌孢子菌悬液均匀分布并用无菌封口膜封口，将装有样品的锥形瓶放置于恒温恒湿培养箱(温度：28℃，湿度：85％)中培养，每种样品准备5个锥形瓶，即5个重复，每天定时摇匀1次并观察生长情况，在第10d时，用高效液相色谱法测定AFB1含量。 [0040] AFB1含量采用高效液相色谱(HPLC)法测定，参照《花生黄曲霉毒素B1的测定高效液相色谱法》(NY/T 1286-2007)。样品中的AFB1经提取、浓缩、衍生化，反相C18柱分离后，在激发波长365nm，荧光波长440nm检测，外标法定量，计算样品中AFB1含量。 [0041] 黄曲霉毒素B1含量测定的高效液相色谱仪分析条件 [0042] Agilent 1260高效液相色谱仪，配荧光检测器、四元泵、工作站和柱温箱等。 [0043] 色谱柱：依利特C18柱，ODS-BP，5μm×4.6mm×250mm [0044] 荧光检测器检测：激发波长(Ex)，360nm，发射波长(Em)，440nm [0045] 流动相：甲醇：乙腈：水(3：1：6,v/v/v)流速：0.8mL/min [0046] 柱温：30℃ [0047] 进样量：20μL [0048] 通过保留时间和峰面积计算样品中黄曲霉毒素的浓度。 [0049] 黄曲霉菌CS05在PDA培养基上的AFB1产量为16.91μg/plate在上述饲料原料及副产品中的AFB1产量分别为11.313mg/kg，0.025mg/kg，0.461mg/kg，0.024mg/kg，0.089mg/kg，0.021mg/kg。 [0050] 实施例3黄曲霉菌CS05与标准产毒菌株NRRL3357的产毒能力的比较 [0051] 按上述实施例2中的方法将黄曲霉菌CS05和标准产毒菌株NRRL3357分别接种到粉碎的玉米、小麦、大豆、豆粕、棉籽、棉粕中，在恒温恒湿培养箱中培养10d后，黄曲霉菌CS05在上述饲料原料及副产品中的AFB1产量分别为11.313mg/kg，0.025mg/kg，0.461mg/kg，0.024mg/kg，0.089mg/kg，0.021mg/kg，均高于标准产毒菌株NRRL3357的AFB1产量(1.528mg/kg，0.004mg/kg，0.094mg/kg，0.018mg/kg，0.008mg/kg，0.008mg/kg)。 [0052] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

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