通过扩环酶活性作用于青霉素G生产7－ADCA的方法

本发明涉及制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的生 物合成方法。

β一内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，并具有悠久的 临床应用史。这类抗生素中，突出的有青霉素类和头孢菌素类。这些 化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄 枝顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。

经过经典的菌种改进技术，使产黄青霉和产黄枝顶孢的抗生素生产 水平比过去几十年大大提高了。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物 合成途径的了解增多和重组DNA技术的出现，现在有了改进生产菌株 和将这些化合物体内衍生化的新工具。

β-内酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鉴定，对其相应基因 已进行了克隆，如见Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)， 245-246(生物合成途径和酶)，及Aharonowitz，Cohen，和Martin 的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461-495(基因克隆)。

产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是：三种氨基酸L-5-氨基-5- 羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V) 缩合成三肽LLD-ACV，然后该三肽环化成异青霉素N。该化合物含 有典型的β-内酰胺结构。

第三步涉及通过酰基转移酶(AT)的作用以疏水侧链交换L-5- 氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。如EP-A-0448180中所述，由AT介导 的酶促交换反应发生在一种细胞器-微体中。

头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是一些头孢菌素(如 cephalexin)是由青霉素经若干步化学转化而制得的。另一个原因是迄 今只能发酵出具有D-5-氨基-5-羧基戊酰侧链的头孢菌素。在此方面迄 今最重要的起始物头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，这就意 味着使用麻烦而又昂贵的柱技术进行费时费钱的分离工艺。这样获得 的头孢菌素C须经若干化学和酶促转化才能转变为治疗用头孢菌素。

使用复杂的化学步骤使青霉素G发生扩环和衍生是目前工业上制 备中间体7-ADCA的流行方法。生产7-ADCA所需的一个化学步骤5- 元青霉素环结构扩环成为6-元的头孢菌素环结构(参见 US4,003,894)。但这种复杂的化学步骤既昂贵又对环境有害。

所以目前急需用如发酵过程中的酶催化这类酶促反应取代化学方 法。而用生物方法取代化学扩环方法的关键是头孢菌素生物合成途径 中的中心酶-去乙酸头孢菌素C合成酶或扩环酶。

在一些实例中，人们发现来自细菌带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶可在体外使青霉素环结构扩环(Baldwin等， 四面体43(13)，3009，(1987))。在Cantwell等人的文章中(现代遗 传学(Current Genetics)，17，213-221(1990))，描述了在产黄青 霉中表达带棒链霉菌扩环酶。如该文中所示，在发酵过程中表达扩环 酶并没有形成头孢菌素。又如Cantwell等人在 Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289中所描述，只有当扩环酶和带 棒链霉菌异青霉素N异构酶基因一起引入产黄青霉，才能观察到青霉 素N(它的天然底物)的青霉素环结构转化为去乙酸头孢菌素C(它 的天然产物)的头孢菌素环结构。已对扩环酶从生化和功能方面进行 了充分表征(EP-A-0366354)，也对其相应的基因进行了表征。已描 述了cefE基因的物理图谱(EP-A-0341892)和DNA序列，及cefE 在产黄青霉中的转化研究。

扩环酶的另一个来源是细菌Nocardia lactamdurans(早期称为 Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA 序列(分别见Cortes等，J.Gen.Microbiol.133(1987)，3165-3174及 Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453-458)。

既然扩环酶可催化青霉素N的5-元噻唑烷环结构扩环为去乙酸头 孢菌素C的6-元二氢噻嗪环结构，这种酶自然成为取代化学方法扩环 的合理的候选物。但不幸的是，这种酶只作用于头孢菌素生物合成途 径的青霉素N中间体，而不作用于包括青霉素G在内的由产黄青霉产 生的廉价易得的青霉素。青霉素N没有商业供应，而且即使经过扩环， 青霉素酰基转移酶也不能轻易地将其D-氨基己二酰侧链除去。

最近发现扩环酶可将具有特定侧链的青霉素扩环成为相应的7- ADCA衍生物。EP-A-268343描述了使用去乙酸头孢菌素C合成酶对 带有3-羧苯基乙酰或己二酰侧链的青霉素进行扩环的体外方法。而 且，在EP-A-0532341、EP-A-0540210、WO95/04148及WO95/04149

中，扩环酶的这一特性已得到技术开发。在这些专利文件中，由青 霉素G经传统的化学转变制备7-ADCA的方法已被含有扩环酶基因的 重组产黄青霉株内的特定6-氨基青霉烷酸(6-APA)衍生物的体内 转化所替代。

更具体地讲，EP-A-052341描述了扩环酶结合5-羧基戊酰侧链作 为原料在产黄青霉中的体内应用。5-羧基戊酰是产黄青霉中酰基转移 酶的底物。这导致形成5-羧基戊酰-6-青霉烷酸，后者通过引入产黄青 霉株中的扩环酶产生5-羧基戊酰-7-ADCA。最后，提到去除5-羧基戊 酰侧链生成终产物7-ADCA。

在WO95/04148和WO95/4149中，指出3′-羧甲基硫代丙酸和3′3- 硫代二丙酸被发现是扩环酶的底物，分别生成2-(羧乙基硫)乙酰-和3- (羧甲基硫)丙酰-7-ADCA。

但是，由于青霉素生产菌株具有很高的青霉素G合成能力且提取 苯乙酰-7-ADCA的方法更有利，因此，本发明具有更多优势。而且， 青霉素G的苯乙酰基侧链很容易被产生6-APA的几种微生物的青霉素 G酰胺酶(如EP-A-0453047中所指出的分离酶G)催化裂解。

各种出版物都报告说扩环酶不能以青霉素G作为底物进行扩环 (Baldwin&Abraham(1988)，天然产物报告(Natural Product Reports)， 5(2)，p.129-145；Maeda等(1995)，酶和微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)，17，231-234；Crawford等(1995)，生物技术 (Bio/technology)，13，p.58-61；Wu-KuangYeh等，于“青霉素应用 五十年(50 years Penicillin Application)(Kleinkauf和VonDohren 编)，209(1991)，特别请见表3A)。

但令人惊讶的是，现在发现用扩环酶编码基因转化的产生青霉素G 的产黄青霉能够产生苯乙酰-去乙酸头孢烷酸。

本发明提供一种制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7- ADCA)的方法，包括：

a)在真菌表达信号的转录和翻译调控下，用扩环酶基因转化产黄青 霉菌株；

b)在适于产生青霉素G的培养基中发酵所述菌株并在所述培养基 中加入苯乙酸或其盐或其酯，青霉素G经扩环形成苯乙酰-7-ADCA；

c)从发酵液中回收苯乙酰-7-ADCA；

d)将苯乙酰-7-ADCA脱酰基化；及

e)回收结晶的7-ADCA。

e)步优选为一过滤步骤。

优选在低于约4.5的pH下用一种与水不溶混的有机溶剂萃取发酵 液滤液并在pH为4-10时用水将其反萃取，从发酵液中回收苯乙酰-7- ADCA。

另外，还提供了包含扩环酶编码DNA的重组DNA载体，其中编 码扩环酶之DNA与如构巢曲霉gpdA基因和黑曲霉glcA基因等真菌 基因的转录和翻译控制元件有效地连接，以及用此载体转化的宿主细 胞。

本发明涉及应用产黄青霉中的功能性基因构建物体内扩张青霉素 G环结构形成头孢菌素生物合成的关键中间体：7-氨基去乙酸头孢烷 酸，或7-ADCA的衍生物。该衍生物具有允许进行有效溶剂萃取的化 学组成，从而提供一种在经济效益上有吸引力的回收方法。

产黄青霉的转化原则上可用不同的DNA转移技术如PEG-Ca介导 的原生质体摄入、电穿孔或基因枪技术，及转化子选择来完成。例如， 见Van den Hondel en Punt在真菌的应用分子遗传学 (Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，编)中的“对丝状真菌的基因转移和载 体发展”一文，(Cambridge University Press(1991))。已描述了显性和 非显性选择标记的应用(VandenHondel，同上)。已描述了同源性(产黄 青霉衍生的)和异源性(非产黄青霉衍生的)选择标记(Gouka等， 生物技术杂志，20(1991)，189-200)。

在存在或不存在载体序列时，与非选择性DNA物理连接或不连接 的不同转化子选择标记(同源或异源)在转化子选择中的应用是熟知 的。

按此方法，由扩环酶介导的扩环反应被引入产黄青霉中，并在其中 表达，例如在菌株PanlabsP14-B10，DS18541(保存于CBS，寄存 号为455.95)中。很明显地，如果扩环反应在其突变体中进行，应对 培养基条件稍做调整以得到有效生长。

另外，将cefE基因置于真菌(丝状或非丝状)基因控制元件的转 录和翻译控制之下，优选来自产黄青霉Y基因(如EP-A-0549062所 述)、产黄青霉IPNS基因、β微管蛋白基因、构巢状曲霉gpdA基因、 或黑曲霉glcA基因。

总之，本发明描述了引入产黄青霉中的扩环酶活性如何在体内影响 青霉素G环结构的扩张。

根据本发明，通过在培养基中加入苯乙酸或其盐或酯，在产黄青霉 中产生β-内酰胺中间体苯乙酰基-7-ADCA。适当的盐例如钠盐或钾 盐。通过简单的溶剂萃取从培养基中有效回收7-ADCA，例如以下方 法：

过滤发酵液，向滤液中加入与水不混溶的有机溶剂，调节pH值以 便从水层中萃取头孢菌素。pH范围必须低于4.5；优选在4-1之间， 更优选在2-1之间。这样就将头孢菌素与发酵液中存在的许多其他杂质 分离。优选使用小体积有机溶剂，得到头孢菌素浓溶液，以使体积流 速减小。第二种可能性是在pH4或更低时，萃取全部发酵液，优选在 pH4-1之间用与水不混溶的有机溶剂萃取发酵液。

可以使用不影响头孢菌素的任何溶剂。适宜的溶剂如：乙酸丁酯、 乙酸乙酯、甲基异丁酮、醇如丁醇等。优选使用乙酸丁酯。

然后在pH4-10，优选在6-9下用水反萃取头孢菌素，再次大大 减小终体积。在0-50摄氏度，优选室温下进行回收。

这样得到的头孢菌素水溶液用适当的酶处理，以除去苯乙酰基侧 链，得到所需的7-ADCA。适当的酶例如EP-A-0453047中所描述的 青霉素G酰基转移酶，也称为青霉素酰胺酶。

优选使用固定化酶以能够重复使用该酶。EP-A-0222462中广泛 描述了这种颗粒的制备方法和酶的固定化方法。水溶液的pH值例如为 4-9，此时头孢菌素的降解反应最小，而所希望的酶转化此时是最优化 的。因此，向头孢菌素水溶液中加入酶的同时保持pH在此适当的水 平，例如通过加入无机碱如氢氧化钾溶液，或应用阳离子交换树脂。 当反应完成后过滤除去固定化酶。另一个可能性是在固定床或流化床 柱中应用固定化酶，或在溶液中使用酶并通过膜过滤除去产物。然后， 在与水不混溶的有机溶剂存在下酸化反应混合物。

调节pH值至0.1-1.5后，分离各层，调节水层的pH值为2-5。然 后过滤出结晶的7-ADCA。

脱酰化还可以按本领域已知的化学方法进行，例如通过在低于10 摄氏度的温度下加入五氯化磷，然后于室温或更低温度下加入异丁醇 形成偕氯代亚胺侧链。

提供以下实施例用于说明，但不限制本发明。

实施例1

苯乙酰基-7-ADCA的发酵生产

使用Panlabs P14-B10产黄青霉菌株(保存于CBS，入藏号为 455.95)作为扩环酶表达框构建物宿主菌株。

Crawford等人的文章(同上)描述了在产黄青霉IPNS基因转录 和翻译调控信号控制下含有扩环酶基因的表达框。Crawford等人的 文章(同上)还描述了转化和培养的条件。同一文章内还描述了通过 测试产生己二酰基-7-ADCA的能力对表达扩环酶的转化子进行纯化和 分析。

产生己二酰基-7-ADCA的转化子如产黄青霉株PC100(保存于 ATCC，入藏号为74182)以2.106分生孢子/ml接种于下列组成的种 子培养基中(g/l)：葡萄糖，30；Pharmamedia(棉籽粉)，10； 玉米浸出物，20；(NH4)2SO4，20；CaCO3，5；KH2PO4， 0.5；乳糖，10；酵母提取物，10，在消毒前，培养基pH为5.6。

将20ml种子培养基置于250ml锥形瓶中，用棉塞将瓶口塞住，在 25摄氏度、220转/分下孵育。48小时后，将1ml种子培养物接种于 15ml如下组成的生产培养基中(g/l)：KH2PO4，0.5；K2SO4， 5；(NH4)2SO4，17.5；乳糖，140；Pharmamedia，20；CaCO3， 10；猪油，10，消毒前pH为6.6。

用种子培养物接种后，在发酵液中加入已用KOH将pH调整为7 的10％苯乙酸溶液0.15-0.75ml。

将生产培养基置于用乳滤纸封口的250ml锥形瓶中，在25摄氏度 220转/分下培养168小时，每隔一天补充一次蒸发掉的水。

生产发酵结束后，用离心或过滤方法除去菌丝体，用高效液相色谱 (HPLC)分析青霉素G和苯乙酰基-7-ADCA。

实施例2

苯乙酰基-7-ADCA产物的分析

用高效液相色谱(HPLC)分析转化过的青霉菌株发酵产物。 HPLC系统含有如下光谱物理组件：P1500

溶剂传送系统，AS1000注射器，UV1000可变波长检测器(设定 于214nm)和ISM100整合器或类似物。固定相采用 ChrompackChrompherC18柱，流动相含有的75％pH2.6磷酸缓冲 液和25％乙腈。产物与苯乙酰基-7-ADCA和青霉素G标准曲线对照 进行定量分析。培养液滤液经酸萃取得到氘代氯仿溶液，用600MHz 核磁共振下确认苯乙酰基-7-ADCA。酸萃取液中苯乙酰基-7-ADCA的 共振现象与生物合成样品相一致。