뎅기 바이러스 백신 조성물

뎅기 바이러스 백신 조성물 {DENGUE VIRUS VACCINE COMPOSITION}

본 발명은 생명공학 및 약학 산업 분야에 관한 것이며, 특히, 정의된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 재조합 단백질 항원에 기초한 뎅기 바이러스(DV)에 대한 백신 제형을 얻는 것에 관한 것이다.

뎅기열(Dengue fever)은 인간 집단에 영향을 미치는 가장 광범위한 절지동물에 의해 전염되는 바이러스성 질환이다. 해마다, 5천만 내지 1억의 댕기 사례가 보고되고 있고, 이들 중 50만은 뎅기 출혈열로 알려진 질환의 가장 중증형태을 초래한다 (Guzman et al., Lancet Infect.Dis. 2002; 2:33-42). 이 질환의 병원체(causal agent)는 플라비비리대( Flaviviridae )과, 플라비비루스속에 속하는 DV이다. DV는 4 가지 혈청형을 포함하는 바이러스 복합체이다. 이것은, 지질막에 3 종의 구조 단백질 중 2 종, 즉 외피 단백질과 막 단백질을 포함하는 외피 보유 바이러스이다. 이 리포단백질 외피는 이들의 구조 단백질 중 세 번째 것인 캡시드 단백질로 구성된 정20면체 뉴클레오캡시드를 둘러싸고 있다 (Leyssen et al., Clin.Microbiol.Rev. 2000; 13:67-82).

최근 수십년 동안, 이들 바이러스에 의한 감염의 전세계적 확산은 효과적인 백신의 개발을 공중위생 우선순위로 만들었다. 이 목표는 여러가지 요인에 의해 제한되어 왔다. 우선 첫째로, 1 종의 혈청형에 의한 감염은 나머지 혈청형들에 대해 장기 지속형 교차 방어를 유발하지 않으며 (Leyssen et al., Clin.Microbiol.Rev. 2000; 13:67-82), 동시에, 이형 이차 감염은 이 질환의 중증 형태로 발전하기 위한 주요 위험인자이다 (Guzman et al., Lancet Infect.Dis. 2002; 2:33-42; Mongkolsapaya et al., Nat.Med. 2003; 9:921-927). 따라서, DV에 대한 이상적인 백신은 4 가지 바이러스 혈청형 (DV1, DV2, DV3 및 DV4)에 대해 장기 지속형 방어 면역을 유발시키는 것이어야 한다.

가장 발전된 백신 후보는 세포 배양에서 연속 계대를 통해 약독화된 바이러스 균주 (attenuated viral strain)에 기초하거나 또는 재조합 방식에 의해 얻어진 다. 4가 제형에서 4 가지 혈청형 간의 바이러스 간섭은, 4 가지 혈청형에 대한 동등한 기능적 면역 반응의 유도를 어렵게 만드는 이런 유형의 후보들의 주된 한계이며; 또한 이들은, 제안된 2 또는 3 회의 백신 투여 사이에 장기 간격으로 투여하는 것을 필요로 한다 (Bhamarapravati et al., Vaccine. 2000; 18:44-47; Kanesa-Thasan et al., Vaccine. 2001; 19:3179-3188; Morrison et al., J.Infect.Dis. 2010; 201:370-377). 또한, 생 바이러스로서의 그들의 특성 때문에, 한 살 미만의 아동에게는 투여될 수 없다.

매력적인 대체수단으로서, 서브유닛 백신에 기초한 일련의 임상전 연구가 개발되었다. 이러한 접근법은 생 약독화 바이러스에 의한 백신접종에 있어서, 3 가지 주요한 이점을 갖는다: 1) 이들은 잠재적으로 안전한 백신이며, 2) 면역원의 비복제성으로 인해, 바이러스 간섭 현상이 발생되어서는 안되고, 3) 부스터 (booster) 효과를 달성하기 위해, 백신 투여 사이에 장기 간격이 필요한 생 약독화 바이러스의 투여와는 반대로, 단기 백신 접종 계획이 제안될 수 있다.

가장 유망한 서브유닛 백신 후보 중 하나가 Hawaii Biotech/Merck 회사에 의해 개발되었다 (Hombach, Rev.Panam.Salud Publica. 2007; 21:254-260). 이것은 곤충 세포에서 발현되는 4가지 혈청형으로부터 각각의 바이러스 외피 단백질에 의해 생성된 후보이다. 1가 및 4가 제형은 마우스 및 원숭이에서 평가되었고, 면역원성 결과들은 약독화 바이러스에 의해 얻어진 것과 유사하였다(Clements et al., Vaccine. 2010; 28:2705-2715). 그럼에도 불구하고, 1가 제형은 적절한 면역 반응을 유도하기 위해 인간 사용이 승인되지 않은 강력한 아쥬반트(adjuvant)의 첨가를 필요로 하였다. 다음에, 비인간 영장류에서 평가된 4가 제형은 비승인 아쥬반트 뿐만 아니라 DV2로부터의 단백질 NS1를 함유하며, 이것은 내피 인간 세포와 일부 상동성을 가지며, 따라서 자가면역 장애를 유발할 수 있다. 그 외에, 뎅기에 대해 방어 역할을 하는 것으로 최근 확인된, 중요한 면역 부분인 이러한 백신 후보의 투여시, 세포-매개성 면역의 유도에 대해 이용가능한 데이타가 없다 (Gil et al., Viral Immunol. 2009; 22:23-30; Yauch et al., J.Immunol. 2009; 182:4865-4873; Yauch et al., J.Immunol. 2010; 185:5405-5416).

서브유닛 백신과 관련하는 이점들을 유지함과 동시에 베이스 아쥬반트로서 명반(alum)을 함유하는 더욱 안전한 면역성 제형을 찾기 위해, Cuban 연구진은 뎅기 바이러스의 외피 단백질의 도메인 III 및 캡시드 단백질에 기초한 작업 라인 (working line)을 개발하였다 (Guzman et al., Exp.Rev.Vaccines. 2010; 9:137-147).

DV으로부터 캡시드 단백질은 비리온 조립에서 필수적이며, 그의 주된 기능이 되는 바이러스 게놈을 보호한다. 그의 분자량은 9-12 kDa (112-127 아미노산)이고, 25%의 아미노산이 아르기닌 및 리신이므로, 염기성 구조를 갖는다. 상기 단백질은 노출된 영역 없이, 비리온 구조 내에 위치하여 (Kuhn et al., Cell. 2002; 108:717-725), 면역 증강 항체의 표적이 될 수 없기 때문에, 백신 내에 포함되는 것은 매력적이지 않다. 다른 한편, 다양한 인간 CTL 에피토프의 서열이 확인되었으며, 이것은 바이러스에 대한 효과적인 세포-매개성 면역의 유도를 제공한다 (Gagnon et al., J.Virol. 1996; 70:141-147; Gagnon et al., J.Virol. 1999; 73:3623-3629).

이러한 캡시드 단백질의 구조적 특성에 대한 여러가지 연구들이 있었지만, 2007년이 되어서야, 처음으로, 마우스에서 면역원성의 관점에서 평가되었다. 이 연구에서, DV2의 캡시드는 대장균( Escherichia coli )에서 재조합 단백질로서 얻어졌다. 반정제 처리시, 얻어진 제제는 마우스에서 평가되었고, DV2 유발(challenge)후에, 부분적 방어가 중화 항체의 유도없이 얻어졌다 (Lazo et al., Vaccine. 2007; 25:1064-1070). 그 후, 정제 및 시험관내 응집 (aggregation) 과정이 실험실 규모로 확립되었고, 다시 방어의 관점에서 그 기능성을 측정하기 위해, 생성된 단백질이 마우스에서 평가되었다 (Lopez et al., Arch.Virol. 2009; 154:695-698). 면역원성의 분석은, 응집 단백질을 투여받은 마우스의 지라세포에 의한 감마 인터페론 (IFN-γ)의 분비로서 측정되는 세포-매개성 면역의 유도를 밝혀냈다. 이와 같은 분비는 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ 세포에 의존적이었다. 다음에, DV2에 의한 유발시, 응집 단백질에 의해 면역화된 동물에서, 상당한 방어가 얻어졌고, 이와 같은 방어 역시 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ 세포에 의존적이었다 (Gil et al., Int.Immunol. 2009; 21:1175-1183). 전술한 결과들을 토대로, 동일한 유전적 구조물에서, DV2 둘 모두로부터 외피 단백질의 DomIII 영역 및 캡시드 단백질을 조합하는 것이 제안되었고 (Chen et al., J.Virol. 1996; 70:8765-8772), 또한, 이 바이러스 영역을 포함하는 융합 단백질에 의해 면역화된 마우스에서 방어 및 중화 항체의 유도가 보고된 바 있다 (Crill et al., J.Virol. 2001; 75:7769-7773; Hermida et al., J.Virol.Methods. 2004; 115:41-49; Simmons et al., Am.J.Trop.Med.Hyg. 2001; 65:159-161). 다음에, 비인간 영장류 실험에서, 프로인트 아쥬만트(Freund's adjuvant)만을 사용하여, 방어적 면역 반응의 유도가 입증되었다 (Hermida et al., Vaccine. 2006; 24:3165-3171).

바이러스 외피 단백질의 DomIIII 및 통합 바이러스 캡시드는, 세포성 면역반응 (캡시드) 및 중화항체 (DomIII)를 동시에 유도할 수 있는, 동일한 분자에서 잠재적 방어성이 있는 두 개 영역이 존재하는 것을 가능하게 한다. 이어서 대장균에서 발현된 DIIIC-2 (캡시드 단백질의 N-말단 영역에 융합된 DomIII, 혈청형 2)로 명명되는 유전적 구조물이 얻어졌고; 생성된 단백질은 실험실 규모로 정제되었으며, 미지의 서열의 올리고뉴클레오티드의 혼합물에 의한 응집 과정이 수행되었다. 마우스에서 3회 투여에 의한 접종시, 항바이러스성 중화 항체가 검출되었다. 유사한 방식으로, 응집 단백질에 의해 면역화된 동물로부터의 지라세포에서 상당량의 IFN-γ 분비가 검출되었다. 세포-매개성 면역와 일치되게, 두개내 유발(intracranial challenge)시 상당한 방어가 얻어졌고, 이러한 방어는 면역 과정 동안 유도되는 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ 세포에 의해 매개되었다 (Valdes et al., Virology. 2009; 394:249-258). 종합해보면, 전술한 결과들은, 비인간 영장류에서 후속 연구를 위해, DIIIC-2의 응집 형태를 선택하는 것을 가능하게 하였다. 비인간 영장류에서 최초 연구는 DV2에 의해 이미 감염된 동물을 이용하여 수행되었고, 그의 주요 목적은 DIIIC2의 부스터 능력 (booster capacity)을 알아내는데 있었다. 예상된 바와 같이, DIII-C2 투여 후, 상기 바이러스 감염으로부터 3 개월 후, 동물들은 높은 수준의, 상동 바이러스에 대한 항바이러스성 중화 항체를 발생시켰으며, 이는 재조합 단백질 내의 기능성 에피토프가 존재한다는 것을 나타낸다 (Valdes et al., Clin.Vaccine Immunol. 2011; 18:455-459).

본 발명의 배경으로서, 단백질 DIIIC-2의 응집 변이체를 생성시키기 위해 올리고뉴클레오티드의 첨가는 마우스에서 상동 바이러스에 대한 세포-매개성 면역 및 방어를 보조하는 것으로 알려져 있다 (Valdes et al., Virology. 2009; 394:249-258). 그럼에도 불구하고, 서열이 유도된 면역 반응의 특질에 영향을 줄 수 있는지 여부에 대해서는 알려진 바 없다.

전술한 요소들에 따르면, 4가지 혈청형에 대해 안전하고 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는, DV에 대한 백신의 개발은 해결되지 않은 과제이다. 본 발명은 정확하게는 이러한 목적에 관한 것이다.

본 발명은 전술한 과제를 해결하는 것으로, a) 뎅기 바이러스(DV)의 캡시드 단백질 서열의 적어도 50%를 포함하는 적어도 하나의 항원 및 b) 서열번호 1로 확인된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 백신 조성물은 DV의 캡시드 단백질 서열의 적어도 50%를 포함하는 항원이 이러한 항원의 아미노산 1 내지 99를 포함하는 재조합 항원이기 때문에 특징이 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 백신 조성물은 캡시드 단백질의 아미노산 1 내지 99 및 바이러스 외피 단백질의 DomIII 영역의 아미노산 286 내지 426을 포함하는 키메라 항원을 포함한다. 특정의 일 실시형태에서, 상기 재조합 항원은 서열번호 5 (항원 DIIIC-1), 서열번호 6 (항원 DIIIC-2), 서열번호 7 (항원 DIIIC-3) 및 서열번호 8 (항원 DIIIC-4)로 구성된 그룹 내에서 선택된다.

단백질 응집에 사용된 올리고뉴클레오티드가 더욱 양호한 면역 반응의 유도에 영향을 미치는지 여부를 입증하기 위해, 혈청형 2의 조성물을 모델로서 선택하였다. 당업계에 개시된 바와 같이, 공지 서열의 다양한 올리고뉴클레오티드의 존재하에, 단백질 DIIIC-2 (DV2의 캡시드 단백질의 아미노산 1 내지 99 및 상기 바이러스 외피 단백질의 DomIII를 포함하는 키메라 항원)를 침전시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드 중 일부가 아쥬반트 능력을 갖는다는 것이 알려져 있다 (Klinman, Int.Rev.Immunol. 2006; 25:1-20; Vollmer, Int.Rev.Immunol. 2006; 25:125-134). 언급된 올리고뉴클레오티드 중 2 종의 융합에 의해 생성된 새로운 올리고뉴클레오티드가 본 연구에 추가로 포함되었다 (Krug et al., Eur.J.Immunol. 2001; 31:2154-2163; Verthelyi et al., J.Immunol. 2001; 166:2372-2377). 마우스에서 평가시, 본 발명자들은 상기 새로운 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1)가 IFN-γ 분비에 의해 측정된 최상의 세포-매개성 면역을 보조하였다는 것을 입증하였고; 따라서, 이것은 상동 바이러스에 의한 마우스 뇌염 모델을 사용하여 방어 분석 (protection assay)을 수행하기 위해 선택되었다. 그 결과, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 명반에 보강된 DIIIC-2 제형은 뇌의 바이러스 역가 및 생존 백분율에 의해 측정된 강력한 방어 면역 반응을 유발하였다.

따라서, 본 발명에서 최초로, 올리고뉴클레오티드의 특성이 적절한 세포성 면역 반응의 유도에 중요하고, 따라서 재조합 단백질의 방어능의 유도에서 중요하다는 것이 입증되었다. 여러가지 올리고뉴클레오티드를 시도했음에도 불구하고, 이들 중, 그 서열이 서열번호 1로 확인된 올리고뉴클레오티드 1 종만이 세포성 면역 반응 및 방어의 유도 관점에서 최적의 것으로 판명되었다. CpG 모티프를 함유하거나 함유하지 않고, 그 구조 내에 포스포디에스테르 결합을 갖는, 다른 서열의 여러가지 합성 올리고뉴클레오티드를 시험하였다. 이 마지막 요소는 문헌에 기술된 면역강화제 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드와 상이한데, 그 이유는 이들 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용된 결합들(links)이 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호를 위해, 포스포로티오에이트 형태이기 때문이다. 추가적으로, 19, 20 및 39 염기와 같은 다양한 크기에 대해 시험하였다. 마지막 39 염기의 올리고뉴클레오티드는 서열 내에 한가지 프로비젼(provision) 및 여러 개의 CpG 모티프를 포함하며, 이것은 당업계에서 면역강화제 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드에 대해 기술되는 분류 내에 포함되는 것을 허용하지 않는다. 다른 한편, 모든 경우에, 재조합 항원의 응집을 위해 이들 분자가 이용되었으며, 따라서 이들의 최소량이 첨가되었다. 이것은, 기능을 촉진시키기 위해 많은 양이 요구되므로, 면역계 자극제로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 간의 차이의 또 다른 요소를 구성한다 (Riedl et al., J.Immunol. 2002; 168:4951-4959).

상술한 바와 같이, 마우스에서 면역학적 평가시, 본 발명자들은 예기치 않게도, 서열번호 1로 확인된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 재조합 단백질 DIIIC-2에 의해 유도되는 세포성 방어 면역 반응을 현저하게 강화시키고, 이것은 사용된 나머지 올리고뉴클레오티드와 비교하여 차이가 있다는 것을 보여주었다.

그 후, 비인간 영장류 뎅기에 대해 음성적이라는 개념이 입증되었다. 동물들에게는 명반에 보강되고, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 DIIIC-2 제형을 4 회 용량으로 투여하였다. 추가적으로, 본 연구에서 포함된 또 다른 그룹의 동물들에게는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 미리 인큐베이션되고, 뉴클레오캡시드형 입자 (NLP-2)가 형성된, DV2의 캡시드 단백질의 아미노산 1-99를 포함하는 재조합 항원이 제공되었다.

DV2의 다른 균주 및 다른 세포주를 이용한 중화 시험에 의해, 반응의 기능성 외에, 항바이러스 및 항단백질 항체의 반응을 측정하였다. 다른 한편, 감염성 DV2를 갖는 모세혈 단핵 세포 (PBMC)의 시험관내 자극 이후, IFN-γ 분비 측정에 의해, 세포-매개성 면역을 또한 평가하였다. 그 후, DV2에 의해, 동물들을 유발시킨 다음, 혈액 내 바이러스의 존재를 측정하였다. 그 결과, 원숭이에서 상기 바이러스에 의한 유발(challenge) 전 및 후에, IFN-γ 분비에 의해 매개되는 적절한 세포-매개성 면역뿐만 아니라, 6 가지의 다른 시스템 (100% 혈전전환 (seroconversion))에 의해 측정된 강력한 중화 활성을 갖는 항체 반응이 상기 단백질에 의해 유도되었다. 면역원성 결과와 일치되게, 면역화된 세 마리 동물 중 2 마리의 경우, 상기 유발 후 어느 때에도 바이러스가 분리되지 않았고, 단지 1/3에서, 밀리미터 당 10 플라크 형성 단위 (pfu/mL) 미만의 바이러스 혈증 값이 하루 나타났으므로, 백신 접종된 동물들은 바이러스 유발에 대해 충분히 방어되지 않았다.

앞에서 뎅기에 대해 음성인 비인간 영장류에서의 본 연구는 바이러스 캡시드 DV 영역을 포함하는 재조합 단백질의 방어 능력에 대한 최초 연구이다. 이러한 발견은, 혈청형 1, 3 및 4에 해당하는, 얻어진 다른 키메라 단백질에 대해서 이러한 조건을 추론할 수 있게 한다.

다음으로, 본 발명자들은, 각각 DIIIC-1, DIIIC-3 및 DIIIC-4로 불리우는 혈청형 1, 3 및 4에 해당하는 재조합 단백질을 설계하고 획득하였다. 모든 분자들은 적절한 발현 백분율에 의해 대장균으로부터 얻었다. 다음에, 이들을 정제하였고, 상동 혈청형에 대해 특이적인 쥐과 폴리클로날 항체에 의해 인식되었다. 또한, DomIII 사슬내 이황화 결합의 시스테인의 환원-카르복시메틸화시 쥐과 폴리클로날 혈청에 대한 인식의 손실 (DIIIC-1, DIIIC-2 및 DIIIC-4) 및 질량 분광 분석 (DIIIC-1, DIIIC-2, DIIIC-3 및 DIIIC-4) 둘 모두에 의해, 각 단백질에서 이황화 결합의 정확한 형성을 측정하였다.

본 발명에 포함된 연구에서, 최초로 기술되는 이들 혈청형 (1, 3 및 4)의 키메라 단백질 DIIIC가 마우스에서 상동 혈청형에 대한 기능적 방어 면역 반응을 또한 유도한다는 것이 입증되었다. 또한, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 미리 제형화되고, 명반에 보강된 4가지 키메라 단백질의 혼합물이, 마우스에서, 항원간의 경쟁 없이, 4가지 혈청형 모두에 대해, 세포성 및 체액성 두 경우 모두에 방어성 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다.

4 가지 키메라 단백질 DIIIC-1, DIIIC-2, DIIIC-3 및 DIIIC-4는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 첨가할 때 응집되었고; 그 후 마우스에서 추가적 평가를 위해, 명반에 보강하였다. 3회 투여 후, 면역화 동물의 100%에서 4가지 혈청형 모두에 대한 항바이러스 항체의 존재를 검출할 수 있었다. 유사하게, 4가지 혈청형에 대해 측정된 중화 활성이 이들 마우스의 혈청에서 검출되었다. 이 결과와 일치되게, 바이러스 혈청형 1 및 4에 의한 두개내 유발을 수행할 때, 현저한 방어가 두 경우 모두에서 얻어졌고, 따라서 마우스에서 평가된 1가 및 4가 제형의 기능성의 개념의 증거가 실증되었다.

또한, 4가 제형은 원숭이에서 체액성 및 세포성 두 경우 모두 기능적 면역 반응을 유도할 수 있었다. 이러한 제형의 면역원성을 평가하기 위해, 뎅기열-음성 비인간 영장류에서 제2 연구를 수행하였다. 연구 그룹에 따라 다른 경로를 통해 4가 제형을 동물에 3 회 투여하였고, 최종 투여로부터 1 개월 후, 유도된 체액성 및 세포성 면역 반응이 측정되었다. 그 결과, 상기 원숭이 100%에서, 상기 바이러스 혈청형 모두에 대해 중화 항체의 항바이러스 면역 반응을 유발한 것으로 밝혀졌다. 또한, 세포성 면역 반응시험에서, 시험된 모든 동물의 경우, 양성 반응을 유발한 것으로 밝혀졌다.

이러한 작업은 전반적으로 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 4 가지 응집 단백질 DIIIC의, DV의 4 가지 혈청형 모두에 대한 방어능을 입증한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키메라 항원 중 2 종을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 포함한다. 본 발명의 추가 목적은, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 확인된 4가지 키메라 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물이다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1로 확인된 서열을 특징으로 하는 핵산을 제공한다. 본 발명에서 충분히 나타낸 바와 같이, 상기 핵산은, DV의 캡시드 단백질의 서열의 적어도 50%를 포함하는 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는데 유용하다. 본 발명의 일 실시형태에서는, DV의 캡시드 단백질의 아미노산 1 내지 99를 포함하는 재조합 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한, 서열번호 1로 확인된 핵산의 용도가 입증된다. 특정의 실시형태에서, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 확인된 키메라 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한, 서열번호 1로 확인된 핵산의 용도가 개시된다.

그 외에, 본 발명의 목적은, a) DV의 캡시드 단백질의 서열의 적어도 50%를 포함하는 적어도 하나의 항원 및 b) 서열번호 1로 확인된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 대상체에게 투여되는 것을 특징으로 하는, DV에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 방법이다. 일 측면에서, 본 발명은, 이러한 조성물이 상기 단백질의 아미노산 1 내지 99를 포함하는 재조합 항원을 포함한다는 것을 특징으로 하는, DV에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법의 일 실시형태에서, 상기 재조합 항원은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 키메라 항원이다.

본 발명에서, 면역화 일정에서, 각각의 DIIIC 단백질의 총 투여량을 감소시킬 목적으로 마우스에서 연구를 수행하였다. 이를 위해, 2 종의 다른 2가 제형을 순차적으로 투여하였고, 제3 부스터 투여를 제공하였다. 그 결과, 4 가지 바이러스 혈청형 중 임의의 것에 대해 시험된 그룹들 사이에, 통계적 유의차가 발견되지 않았고, 이는, 2가 제형의 순차적 투여 및 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 DIIIC의 4가 제형에 의한 부스터에 의해, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 4가 제형 DIIIC의 3 회 투여시, 동일한 수준의 면역원성의 획득이 가능하다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명의 목적은 또한, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 확인된 키메라 항원을 포함하는 상기 백신 조성물이 2가 조성물로 순차적으로 투여되는, DV에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 방법이다. 본 발명은 또한, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 확인된 4 가지 키메라 항원의 4가 조성물을 포함하는 부스터 조성물이 추가로 투여되는 방법을 제공한다.

실시예에서 나타낸 바와 같이, 서열번호 1로 확인된 올리고뉴클레오티드 및 DV의 캡시드 단백질의 적어도 50%를 포함하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물은 상이한 경로를 통해 면역성이 있었으며, 따라서 본 발명의 방법에서, 상기 백신 조성물은, "당업계"의 당업자에 잘 알려져 있는 경로, 예를 들어 피하, 피내 또는 근육내 경로에 의해 투여된다.

도 1. 면역화된 동물의 항바이러스 항체 반응. Y-축은, 로그 역가 항-DV2를 플롯하고, X-축은 제형 DIIIC-2의 다른 변이체를 받은 동물그룹을 나타낸다. 역가는 항원으로서 상기 바이러스를 이용하여 증폭 캡처 ELISA법으로 측정하였다. 통계분석은 Kruskal-Wallis를 이용하여 수행하고 다중비교는 사후 Dunn 테스트를 이용하여 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로 제시된다.
도 2. 음성 대조군 제제 (모의) 또는 DV2로 배양된 DIIIC-2의 다른 제형에 의해 면역화된 마우스의 지라세포의 시험관내 자극 후에, ELISA법으로 측정된 IFN-γ의 농도. Y-축에서는 IFN-γ의 농도 (pg/mL)을 나타낸다. X-축에서는 DIIIC-2의 다른 제형이 제공된 그룹을 나타낸다. 상기 각 세트의 포인트를 반영하는 백분율은 반응동물의 백분율을 나타낸다. 파선은 양성 반응으로 고려되는 것 이상의 값을 나타낸다. 통계분석은 단일 분류 ANOVA를 이용하여 수행하였고, 그룹간의 다중비교는 Tukey 테스트를 통해 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 8).
도 3. DV2에 대한 방어 분석. A. 치사 균주 DV2에 의한 두개내 유발 후에, 면역화된 마우스의 생존곡선. Y-축은 생존 백분율을 나타내고, X-축은 두개내 유발 후에 관찰시간을 나타낸다. B. 유발 후 7일째에, 감염된 뇌로부터 측정된, VERO 세포중의 바이러스 정량화. Y-축은 감염된 마우스의 뇌 세포분쇄액으로부터 VERO 세포상의 플라크 형성(plaquing) 후에 얻어진 pfu/mL 수치를 나타낸다. X-축은 시험그룹을 나타낸다. 생존곡선에서, 통계분석은 로그-랭크 생존 테스트에 따라 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 2 개의 독립 실험의 대표값이다(n = 10). 바이러스 양에 대해, 통계분석은 Kruskal-Wallis을 이용하여 수행하였고, 다중비교는 사후 Dunn 테스트를 이용하여 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적인 차를 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 5). 파선은 100 pfu/mL을 나타낸다.
도 4. 원숭이에서 생성되고 ELISA법으로 측정된 항-DIIIC-2 항체의 운동학. Y-축은 로그 역가를 나타내고, X-축은 분석 과정중의 일 수를 나타낸다. 검정 화살표는 각각의 면역화 시간을 나타낸다.
도 5. 위약 (A), 응집 단백질 DIIIC-2 (B) 또는 NLPs-2 (C)에 의해 면역화된 원숭이에서 캡처 ELISA법으로 측정된 항-DV 항체의 운동학. Y-축은 로그 1/타이틀을 나타내고, X-축은 분석 과정중의 일 수를 나타낸다. 검정 화살표는 바이러스 유발의 일 수를 나타낸다.
도 6. 위약 제제 또는 DIIIC-2 단백질이 제공된 원숭이의 모세혈 단핵 세포의 시험관내 자극 후에, ELISA법으로 측정된 IFN-γ의 농도. Y-축에서는 IFN-γ의 농도 (pg/mL)를 나타내고, X-축에서는 분석시간을 나타낸다. 면역화된 원숭이의 PBMC는 DV2 또는 음성 대조군 제제(모의)로 배양하였다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 3). 파선은 양성 반응으로 고려되는 것 이상의 값을 나타낸다.
도 7. VERO 세포상의 직접 플라크 형성에 의해 측정된, 위약 제형 (A), 응집 단백질 DIIIC-2 (B) 또는 NLP-2 (C)로 면역화된 원숭이의 혈청내 바이러스 양. 우측 축은 원숭이 2, 5 및 9 (파선)에서 검출된 양에 해당한다. 좌측 축은 나머지 동물에서 검출된 양에 해당한다. X-축에서는 유발 후 시간 (일)을 나타낸다.
도 8. 유전적 작제물 pDIIIC-1, pDIIIC-2, pDIIIC-3 및 pDIIIC-4를 획득하기 위한 클로닝 전략.
도 9. ELISA법으로 측정되는 바와 같이, 상동 혈청형에 대한 높은 중화 역가를 갖는 마우스 폴리클로날 항체에 의한, 환원 및 비환원 조건 하의 키메라 단백질 DIIIC의 인식 수준. Y-축에는 흡광도값을 플롯하고, X-축은 시험한 단백질을 나타낸다.
도 10. 최종 면역화 이후, 15일째에 측정된, 면역화된 동물의 항바이러스 항체 반응. Y-축은 로그 역가 항-DV를 나타내고, X-축은 각각의 제형을 받은 동물 그룹을 나타낸다. (A) 항-DV1 항체 반응; (B) 항-DV2 항체 반응; (C) 항-DV3 항체 반응 및 (D) 항-DV4 항체 반응. 역가는 항원으로서 각각의 바이러스를 이용하여 증폭 캡처 ELISA법으로 측정하였다. 통계분석은 Kruskal-Wallis를 이용하여 수행하였고, 다중비교는 사후 Dunn 테스트를 이용하여 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 10).
도 11. 1가 및 4가 제형 DIIIC (서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함함) 또는 위약 제형에 의해 면역화되고, 각각의 단백질 DIIIC에 의해 자극된 마우스의 지라세포의 시험관내 자극 후에, ELISA법으로 측정된 IFN-γ의 농도. Y-축은 IFN-γ의 농도 (pg/mL)를 나타낸다. X-축은 시험그룹을 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다.
도 12. 치사 균주 DV1 (A) 및 DV4 (B)에 의한 두개내 유발 후에, 면역화된 마우스의 생존 곡선. Y-축은 생존 백분율을 나타내고, X-축은 두개내 유발 이후 관찰시간을 나타낸다. 통계분석은 로그-랭크 생존 테스트에 따라 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 2개의 독립실험의 대표 값이다 (n = 9).
도 13. 피하 (SC), 피내 (ID) 및 근육내 (IM) 투여 경로를 이용하여, 비인간 영장류에서 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 4가 제형 DIIIC의 3회 투여 후에, 캡처 ELISA법으로 측정되는 DV의 4가지 혈청형 모두에 대한 항바이러스 항체 반응. Y-축은 로그 역가 항-DV를 나타내고, X-축은 동물 그룹을 나타낸다.
도 14. 비인간 영장류에서, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 4가 제형 DIIIC의 3 회 투여 이후, 재조합 단백질 DIIIC에 의해 시험관내에서 자극된 모세혈 림프구로부터 IFN-γ 생성 세포 빈도. Y-축에서 IFN-γ를 생사하는 세포의 빈도는 스팟/mL의 수치로 나타낸다. X-축은 동물 그룹을 나타낸다.
도 15. 최종 면역화 이후 15일째에 측정된, 면역화 동물의 항바이라스 항체 반응. Y-축은 로그 역가 항-DV를 나타내고, X-축은 각각의 제형을 제공받은 동물 그룹을 나타낸다. (A) 항-DV1 항체 반응; (B) 항-DV2 항체 반응; (C) 항-DV3 항체 반응 및 (D) 항-DV4 항체 반응. 역가는 항원으로서 각각의 바이러스를 이용하여 증폭 캡처 ELISA법으로 측정하였다. 통계분석은 Kruskal-Wallis을 이용하여 수행하였고, 다중비교는 사후 Dunn 테스트를 이용하여 수행하였다. 다른 문자는 그룹 간의 통계적 유의차를 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 10).
도 16. 각각의 단백질 DIIIC에 의해 자극되고, 면역화된 마우스의 지라 세포의 시험관내 자극 후에, ELISA법으로 측정된 IFN-γ의 농도. Y-축은 IFN-γ의 농도 (pg/mL)를 나타낸다. X-축은 시험그룹을 나타낸다. 데이타는 평균 ± 표준 편차로서 제시된다 (n = 5).

실시형태/실시예의 상세한 설명

실시예 1. 마우스에서, 정의된 서열의 다른 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질 DIIIC-2의 면역원성 평가.

마우스에서, 단백질의 응집에 대해 무작위로 선택된, 미지의 서열의 대략 50 b의 올리고뉴클레오티드 혼합물을 이용한 DIIIC-2 단백질의 개념 입증에 기초하여 (Valdes et al, Virology 2009; 394:249-258), 정의된 서열의 다양한 올리고뉴클레오티드를 시험하였다. 올리고뉴클레오티드의 아쥬반트 능력과 관련된 문헌의 보고와는 반대로, 본 연구에서 시험된 것은 단지 포스포디에스테르 결합에 의해 이루어진다. 상기 문헌에서 정의된 바와 같이, 아쥬반트 활성을 나타내는 올리고뉴클레오티드로 분류되지 않는, 39개 염기의 올리고뉴클레오티드 2 종이 또한 포함되었다.

시험된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

올리고뉴클레오티드 K3 (서열번호 2): ATCGACTCT CG AG CG TTCTC, 20 머 (인간 및 원숭이의 CpG 모티프를 포함함. 포스포디에스테르 결합의 골격)

올리고뉴클레오티드 2216 (서열번호 3): GGGGGA CG AT CG T CG GGGG, 19 머 (마우스 및 원숭이의 CpG 모티프를 포함함. 포스포디에스테르 결합의 골격)

혼합 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1): ATCGACTCT CG AG CG TTCT CG GGGGA CG AT CG T CG GGGG, 39 머 (올리고뉴클레오티드 K3 및 2216의 서열을 포함함, 포스포디에스테르 결합의 골격)

올리고뉴클레오티드 OriC (서열번호 4): CATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTG 39 머. (포스포디에스테르 결합의 골격)

RNA의 폴리 I:C 골격: ICICICICICICICICICICICICIC 26 머. (포스포디에스테르 결합의 골격)

DNA의 폴리 I:C 골격: ICICICICICICICICICICICICIC 26 머. (포스포디에스테르 결합의 골격)

제형 가용성 및 응집 단백질의 일정 파라미터:동등량을 갖도록, 50%의 단백질을 침전시키는, 올리고뉴클레오티드의 질량에 대한 단백질의 질량비로 수행하였다.

다른 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질 DIIIC-2를 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 그룹은 하기와 같다:

그룹 1: 가용성 DIIIC-2 (비응집 및 올리고뉴클레오티드 불함유) (20 μg 단백질)

그룹 2: 혼합 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1)를 갖는 DIIIC-2: (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 3: 올리고뉴클레오티드 폴리:IC, ARN을 갖는 DIIIC-2 (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 4: 올리고뉴클레오티드 폴리:IC, ADN을 갖는 DIIIC-2 (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 5: 올리고뉴클레오티드 2216 (서열번호 3)을 갖는 DIIIC-2 (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 6: 올리고뉴클레오티드 K3 (서열번호 2)을 갖는 DIIIC-2 (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 7: 올리고뉴클레오티드 OriC (서열번호 4)를 갖는 DIIIC-2 (20 μg 단백질 + 2 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 8: 가열된 DIIIC-2 (올리고뉴클레오티드 불함유 침전 대조군) (침전 단백질 1/2 (10 μg) 절반 및 가용성 1/2 (10 μg) 절반을 포함)

그룹 9: 혼합 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1) (2 μg)를 갖는 위약

그룹 10: 10 ² pfu의 감염성 DV2

모든 변이체는 아쥬반트 베이스로서 명반상에 제형화하고, 복강내 경로에 의해, 15일 마다 3 회 투여를 동물에 제공하였다. 제3 투여 후, 반응 항체 대 DV2의 검출을 캡처 ELISA법으로 측정하여, 이들 동물들의 혈청의 종말점 희석에 의한 역가를 측정하였다. 도 1에서 도시된 바와 같이, 시험된 모든 그룹에서 항바이러스 항체의 높은 역가가 검출되었고, 그들 사이에 통계적 차는 없었으며 (p>0.05), 이는 키메라 단백질 DIIIC - 2의 응집이 항바이러스 항체 반응에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.

면역화에 의해 생성된 항체의 기능성을 결정할 목적으로, 시험관내 바이러스 중화 분석을 또한 수행하였다. 표 1은 DV2에 대한 중화 역가를 나타낸다. 중화 역가는, 플레이트 수의 50% 감소가 도달되는 최고 희석으로서 정의하였다. 도시된 바와 같이, 모든 그룹의 동물들은 1:70 초과의 기하 평균 역가 (GMT) 및 100% 혈전전환의 중화에 의해 양성이었다.

다른 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질 DIIIC-2의 세포-매개성 면역 반응을 발생시키는 능력을 이 계획에서 평가하였다. 이를 위해, 각각의 변이체에 의해 면역화된 동물의 지라 세포를 추출하고, 지라세포의 배양 상청액에서 IFN-γ 분비를, 감염성 DV2에 의한 자극 후에 측정하였다. 도 2는 각 그룹에 의한 사이토킨 분비 값 및 반응동물의 백분율을 나타낸다. 상당한 수준의 분비가 모든 그룹에서 얻어졌지만, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질에 의해 면역화된 그룹만이 음성 대조군 그룹과 비교하여, 통계적 유의차를 나타내었다. 또한, 이 그룹내의 동물의 100%에서 양성 반응이 나타났다. 세포성 면역 반응 테스트에서 IFN-γ 농도의 평균치 및 반응 동물의 백분율 둘 모두를 고려하면, 응집 단백질 DIIIC-2 올리고뉴클레오티드: 혼합 (서열번호 1), 2216 (서열번호 3), K3 (서열번호 2), 및 Ori C (서열번호 4)의 제형이 방어 분석을 위해 선택되었다.

본 연구에서, 15 마리의 마우스의 하기 그룹이 구성되었다:

그룹 1: 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1) 혼합 DIIIC-2(5 μg 단백질 + 0.5 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 2: 올리고뉴클레오티드 2216 (서열번호 3) 혼합 DIIIC-2 (5 μg 단백질 + 0.5 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 3: 올리고뉴클레오티드 K3 (서열번호 2) 혼합 DIIIC-2 (5 μg 단백질 + 0.5 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 4: 올리고뉴클레오티드 OriC (서열번호 4) 혼합 DIIIC-2 (5 μg 단백질 + 0.5 μg 올리고뉴클레오티드)

그룹 5: 혼합 올리고뉴클레오티드 (서열번호 1) 혼합 위약 (0.5 μg)

그룹 6: 102 pfu의 감염성 DV2

모든 변이체는 아쥬반트 베이스로서 명반 상에 제형화하고, 동물은 복강내 경로에 의해 15일 마다 3회 투여를 받았다. 면역화 개시로부터 2 개월 후, 각 그룹 당 10 마리의 동물은, 상동 신경-적응 바이러스의 50 반치사량 (LD ₅₀ )으로 유발시키고, 생존율을 측정하기 위해, 21일 동안 관찰하였다. 도 3A는 얻어진 생존율을 기술한다. 관찰된 바와 같이, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제형 DIIIC-2가 제공받은 마우스 중 80% 이상이 바이러스 유발에서 생존하였고, DV2에 의해 면역화된 양성 대조군 그룹과 비교하여, 통계적 유의차가 없었다 (p>0.05). 다음으로, 음성 대조군 그룹의 동물 중 단지 10%만이 바이러스 유발에서 생존하였으며, 양성 대조군 및 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 DIIIC-2에 의해 면역화된 그룹 간에 통계적 유의차가 존재하였다 (p <0.05). 또한, 올리고뉴클레오티드 2216, K3 및 OriC가 포함된 제형에 의해 면역화된 동물들은 위약 그룹과 비교하여, 통계적으로 유의차가 있는 생존 수준에 도달하지 못했다.

각 그룹의 나머지 5 마리의 동물은 동일한 바이러스의 500 LD ₅₀ 이 제공되었고, 바이러스 유발 이후 7일째에, 뇌를 제거하기 위해, 모든 동물들을 도살하였으며, VERO 세포에서, 바이러스 양을 측정하였다. 도 3A에서 관찰되는 생존율과 일치되게, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제형 DIIIC-2에 의해 면역화된 마우스는 뇌에 소량의 바이러스 양을 가지고 있었고 (<10 ² pfu/mL), 양성 대조군 그룹과 비교하여 통계적 차이는 없었으며, 위약 제형을 투여받은 그룹의 마우스는 평균 값으로, 10 ⁴ pfu/mL 이상의 바이러스 양을 나타내었다 (도 3B). 올리고뉴클레오티드 2216, OriC 및 K3가 포함된 제형에 의해 면역화된 동물들은, 위약 제형에 의한 경우와 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함된 DIIIC-2의 제형에 의한 경우 사이의 중간 수준의 바이러스 양을 나타내었으며, 이들 사이에는 통계적 유의차는 없었다.

실시예 2. 재조합 캡시드 단백질 DV2로부터 얻어진 뉴클레오캡시드형 입자 및 응집 단백질 DIIIC-2에 의해 면역화된 비인간 영장류의 의미의 입증.

마우스에서의 임상전 연구를 토대로, 본 발명자들은 DV에 대해 음성인 비인간 영장류에서 명반에 의해 보강된, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질 DIIIC-2를 평가하였다. 또한, NLP-2 (서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 함유)가 제공된 일 그룹을 평가하였다. 다음에, 위약 그룹은, 명반에 보강된 재조합 단백질의 응집 과정에 이용된, 최대량의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함된 제형이 제공되었다. 3 마리의 동물이 상기 면역화 계획의 모든 그룹에 포함되었다.

DIIIC-2의 선택된 투여량은 100 μg의 단백질 및 10 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드이었고, NLP-2의 경우에는, 50 μg의 단백질 및 10 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드이었다. 2개월마다, 원숭이에 4 회 투여를 피하로 제공하였다. 각각의 투여시 및 그로부터 15일 후에, 유도된 체액성 면역 반응을 측정하기 위해, 혈액을 수집하였다. 도 4는 항-DIIIC-2 항체의 출현 운동학을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 제형 DIIIC-2가 제공된 원숭이에서, 최초 투여량 투여 후 15일째에, 항체가 검출되기 시작하였다. 제2 투여량 접종 후, 10,000을 초과하는 값으로 역가가 증가하였다. 제3 투여 후, 역가가 소폭 증가하였고, 제4 투여 후에는, 동일한 수준으로 유지되었다 (평균: 80,000). N

LP-2에 의해 면역화된 그룹에서, 항-캡시드 항체의 반응은 유사하였다 (도 4). 캡처 ELISA법에 의해, 반응성 항-DV2 항체의 검출을 측정하여, 이들 동물의 혈청의 한계 희석에 의한 역가를 측정하였다. 항바이러스 항체 개발의 운동학적 연구 결과가 도 5에 나타낸다. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함된 제형 DIIIC-2가 제공된 원숭이에서, 제2 용량 투여 후 15일째에, 항바이러스 항체가 검출되기 시작하였고 (평균치: 6,000), 제3 투여 시점, 즉, 면역원의 제2 접종으로부터 2 개월 후에는 검출 불가능한 수준이었다. 그 후, 제3 용량 투여 후, 역가가, 제2 투여 후 15일째에 얻어진 수준과 유사한 수준으로 증가하였으나, 제3 투여로부터 2 개월 후에 해당하는, 제4 투여시에는, 검출가능하였다 (평균: 800). 또한, 제4 접종 제공시, 동물들은, 투여 당시 검출된 수준 보다 다소 큰 값으로 항체를 생성하였고, 이는, 평균치가 5,000인 바이러스 유발 기간까지 유지되었다. 상기 바이러스 투여의 제공시, 유발 후 20일 및 27일째에, 항체 역가의 소폭 증가가 검출되었고, 평균치는 12,000이었다.

또한, 이 바이러스에 대한 방어와 관련 가능성이 있으므로, 본 연구에서, 중화 항체 반응을 측정하였다. 표 2는 Vero 세포주 및 균주 SB8553 DV2를 이용하여, 지정된 시간에 각 샘플에서 얻어진 값을 나타낸다.

관찰된 바와 같이, 중화항체는 DIIIC-2의 제2 용량 투여 후에 검출될 수 있다. 제3 접종 후 15일째에, 더욱 높은 역가가 검출되었고, 이것은 제4 투여 시점에도 유지되었다. 15일 후, 역가가 증가하였으며, 이것은 분명한 부스터 효과를 나타낸다. 다음으로, 최종 투여로부터 1개월 후인, 바이러스 유발 당시, DIIIC-2에 의해 면역화된 모든 동물에서 높은 수준의 중화 항체가 검출되었다. NLP-2가 제공된 그룹의 경우, 바이러스 유발 이전에 평가된 어떤 시점에도, 중화 반응이 검출되지 않았다 (10 미만의 중화 역가, 데이타 미제시). 위약 그룹은 10 미만의 중화 역가와 유사하게 반응하였다 (데이타 미제시).

최종 투여로부터 1 개월 후, DIIIC-2의 그룹의 경우, 3종의 바이러스 균주 및 3종의 다른 세포주를 이용하여, 중화 항체를 또한 측정하였다. 모든 경우에, 100% 혈전전환이 검출되었고, 이것은 강력한 중화 반응의 유도를 나타낸다 (표 3).

사용된 실험 시스템에서 획득된 혈전전환 백분율 및 GMT뿐만 아니라, 각각의 독립 동물의 중화 역가가 제시된다.

세포성 면역 반응은 본 연구에서 측정된 파라미터 중 또 다른 것이다. 제4 투여일, 제4 투여 후 15일째, 바이러스 유발일 및 바이러스 유발 후 27일째의 4 회 시점에서 분리된 모세혈 림프구를 감염성 DV2에 의해 자극하고, IFN-γ의 분비를 배양 상청액에서 측정하였다. 도 6은 시험된 각 시점에서 얻어진 값을 나타낸다. DIIIC-2 및 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 면역화된 3 마리의 동물 중, 한 마리 (원숭이 6)가, 바이러스 유발 전에, 논의된 세 시점에 IFN-γ의 분비를 유도하였다. 다음으로, 감염 후, 27일째에, 이 그룹의 다른 원숭이가 또는 양성이었으며, 이는 기왕성 세포 반응 (anamnestic cellular response)의 측정을 나타낸다.

또한, NLP-2가 제공된 세 마리 중 두 마리가 바이러스 유발일에 IFN-γ에 대해 양성이었다. 다음으로, 감염 후 27일째에, 이 그룹의 세 마리 원숭이가 양성이었고, 이는 또한 이 경우에 기왕성 세포반응의 측정을 나타낸다. 중요하게는, 위약 제형이 제공된 동물중 어느 것도 바이러스 유발 후에 항바이러스 사이토킨을 분비하지 않았다.

DV2에 대한 방어를 측정하기 위해, 모든 실험 동물은 최종 투여로부터 1 개월 후, 바이러스의 감염성 투여에 의해 유발시켰다. 혈액 내 바이러스의 존재는 VERO 세포주에서 직접적 측정에 의해 측정하였다. 도 7은 얻어진 결과를 나타낸다; 위약 제형이 제공된 동물은 3.6일 동안 평균 값으로 바이러스 혈증을 발생시켰고, 평균 바이러스 양은 10 ² pfu/mL이었다. 반대로, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 DIIIC-2 단백질 제형이 제공된 원숭이 중 2 마리에서, 바이러스 혈증이 발생하지 않았고, 따라서 완전히 방어된 것으로 분류된다. 한 마리 동물 (원숭이 5)에서, 5일째에 바이러스가 검출되었고, 바이러스 양은 매우 낮은 값이었으며 (<10 pfu), 이는 또한 상당한 수준의 방어를 나타낸다.

NLP-2가 제공된 그룹의 경우에, 모든 원숭이에서 바이러스의 존재가 검출되었으나, 바이러스 양은, 대조군 그룹에서 검출된 것과 비교하여, 더 작은 양이었다. 사실, 원숭이 9는 매우 작은 바이러스 양을 나타내었고 (<10 pfu), 이는 또한 상당한 수준의 방어를 나타낸다.

일반적으로, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 바이러스 캡시드에 기초한 응집 단백질이 원숭이에서 방어 반응을 유도한다고 말할 수 있다.

실시예 3. 단백질 DIIIC-1. DIIIC-3 및 DIIIC-4의 획득 및 특성화

DV 혈청형 1, 3 및 4의 외피 단백질의 DomIII을 포함하는 유전자 단편 BamHI/HindIII (아미노산 286-426)을, 동일한 바이러스의 캡시드 단백질에 융합된, 플라스미드 pET28의 다중 클로닝 위치에 클로닝하였다. 클로닝된 단백질과 관련되지 않은 아미노산의 번역을 제외하기 위해, 히스티딘 태그를 제외하고, NcoI과 BamHI 위치 사이의 유전자 서열을 제거하여, 이 발현 벡터를 사전에 변형시켰다. 플라스미드의 유전적 작제물은 도 8에 도시된다.

모든 경우에, 단백질을 N-말단에서 히스티딘 태그에 융합시키고, T7 lac 프로모터의 조절 하에 발현시킨다. 이것은, 일단 발현하면, 금속 킬레이트에 의한 친화 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합에 의한 상기 단백질의 정제 과정의 진행을 가능하게 하였다. 사전에 얻어진 단백질 DIIIC-2의 정제를 위해, 동일한 방법을 사용하였다. 4 가지 재조합 단백질의 정제시, 이들의 특성화를 진행하였다. 우선, 각 단백질의 반응성을, 각각의 바이러스 제제, 구체적으로, 각 혈청형의 과면역 복수액 (hyperimmune ascitic fluid, HMAF)에 의해 면역화된 마우스의 폴리클로날 혈청에 대해 분석하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 상동 바이러스 혈청형의 HMAF 대 각 단백질의 ELISA에 의해 반응성을 얻었으며, 이는, 바이러스 외피 단백질에 대해 생성된 항체 대부분이 구조결정기 (conformational)이므로, 캡시드 내 영역 DomIII의 올바른 제시를 시사한다. 또한, 각각의 키메라 분자에 존재해야 하는, DomIII 영역의 이황화 결합 (SS)의 상태를 연구하였다. 우선, 질량 분광 분석법에 의해, 각각의 단백질을 확인하고, 결합이 바르게 형성되었는지를 확인하였다. 그 후, SS 결합이 폴리클로날 혈청 항-DV 대 DomIII의 반응성에 직접 포함된다는 사실을 토대로, 상동 혈청형의 HMAF에 대한 각 재조합 단백질의 반응성을 환원 및 비환원 조건에서 재분석하였다. DIIIC-1, 2 및 4 단백질의 경우, 도 9에 도시된 바와 같이, 단백질이 알킬화에 의해 비가역적으로 환원된 경우, 상동 HMAF에 대한 반응성이 감소되었다. DIIIC-3의 경우, 감소가 관찰되지만, 나머지 단백질에서 보다 현저하지는 않았다. 이들 결과는, SS 결합의 정확한 형성 및 폴리클로날 항-DV 항체에 대한 DomIII의 반응성에서 역할 가능성을 확인시킨다.

실시예 4. 마우스에서 1가 및 4가 제형 DIIIC의 면역학적 평가

이미 응집된 4 가지 분자의 4가 혼합물 및 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 이미 응집된 각각의 키메라 단백질을 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 모든 제제를 아쥬반트 베이스로서 명반 상에 제형화하고, 15일 마다 동물에 3회 용량으로 복강내 투여하였다. 양성 대조군으로서, 각각의 바이러스 혈청형에 의해 면역화된 4개의 그룹이 포함되었다. 음성 대조군으로서, 1개의 그룹에, 명반 상에 보강되고 4가 제형에 포함된 동량의 올리고뉴클레오티드를 갖는 위약을 제공하였다. 4가 제형의 경우 단백질의 양은 각각 20 μg이었으며, 총 8 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함되었다. 1가 제형에는 20 μg의 단백질 및 2 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함되었다.

제3 투여 후, 각각의 바이러스에 반응성인 항체의 검출을 캡처 ELISA법에 의해 측정하였고 (도 10), 이를 통해, 이들 동물의 혈청의 한계 희석(end-point dilution)에 의해 역가를 측정하였다. 1가 제형이 제공된 동물은 혈청형 1, 2 및 3 대 항바이러스 항체의 높은 역가를 가졌으나, DIIIC-4에 의해 면역화된 동물은 상동 혈청형 (DV4)에 대해 역가를 갖지 않았다. 그러나, 4가 제형 테트라-DIIIC가 제공된 동물은 DV4에 대한 항체를 생성시켰으나, 다른 혈청형과 비교하여 역가가 낮았다. 이러한 결과는, 4 가지 단백질의 혼합물이, 가능하다면, 동일한 수준의 다른 혈청형에 대한 교차 반응성을 통해, DV4에 대한 항체의 유도를 촉진한다는 것을 시사한다.

4가 제형 테트라-DIIIC에 의한 면역화에 의해 생성된 항체의 기능성을 측정할 목적으로, 혈청형 1, 2, 3 및 4에 대한 시험관내 바이러스 중화 분석 (표 4)을 수행하였다. 상기 분석은 참조 균주를 사용하여, 세계보건기구 (WHO)의 지침에 따라 수행하였다. DIIIC-1, 2 및 3 단백질에 의해 면역화된 마우스는 대조군 그룹의 마우스의 복제 바이러스에 의해 유도된 경우와 비교하여, 상동 바이러스에 대한 중화 항체의 역가가 높았다. DIIIC-4 단백질에 의해 면역화된 동물은 반응을 나타내지 않았으며, 항바이러스 반응의 결과와 일치되게, DV4에 대한 중화 항체가 검출되지 않았다. 그러나, 4가 제형은 혈청형 1, 2 및 3에 대한 중화 항체를 유도하였고, 이에 더하여 DV4에 대한 기능성 항체를 또한 유도하였다.

모든 경우에, 마우스의 혈청 혼합물을 분석하였다. (-): 비측정

세포성 면역 반응은 본 연구에서 측정된 또 다른 파라미터이었다. 이를 위해, 최종 투여 후 30일째에, 4가 제형 테트라-DIIIC에 의해 면역화된 동물의 지라 세포를 추출하고, 4가지 재조합 단백질에 의한 자극 후, 지라세포의 배양 상청액에서 IFN-γ의 분비를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 위약 제형이 접종된 마우스의 지라세포를 사용하였다. 얻어진 결과는 도 11에 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 4 가지 재조합 단백질에 의한 자극 후, 높은 수준의 IFN-γ가 검출되었으며, 이는 각 혈청형에 대해 얻어진 세포성 반응에서 동일하다는 것을 시사한다.

마지막으로, 마우스에서, 바이러스 뇌염 모델에서, 방어 분석을 수행하였다. 이 실험을 위해, 4가 제형 테트라-DIIIC, 1가 제형 DIIIC-1 및 DIIIC -4에 의해 면역화된 동물, 양성 대조군 동물 (각각 DV1 및 DV4에 의해 면역화됨) 및 위약 제형에 의해 면역화된 동물이 선택되었다. 다음으로, 사용된 유발 바이러스는 동물의 치사를 야기할 수 있는 DV1 및 DV4이었다. 도 12에 제시된 바와 같이, 1가 및 4가 제형 두 경우 모두에서, 혈청형 1 및 4에 대해 높은 수준의 방어가 얻어졌고, 모든 경우에, 바이러스 대조군 그룹과 비교하여 통계적 차이가 없었다 (p>0.05). 이들 결과는, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 응집 단백질 DIIIC를 기초로 하여, 혈청형 1 및 4에 대해 시험된 제형의 방어 능력을 나타낸다.

실시예 5. 4가 제형 테트라-DIIIC의 비인간 영장류에서 면역학적 평가

마우스에서 평가된 4가 제형 테트라 DIIIC를 비인간 영장류에서 유사한 방법으로 평가하였다. 3가지의 다른 항원 투여 경로를 통해, 4가 제형이 제공되는 3 마리의 동물의 3개의 시험그룹을 각각 구성하였다: 그룹 1: 피하, 그룹 2: 피내 및 그룹 3: 근육내. 그룹 1 및 3은, 사전에 5 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 응집되고, 모두 혼합되고, 명반에 보강된 각각의 키메라 단백질 50 μg이 제공되었다. 그룹 2는 다른 두 경로가 아닌 피내 경로에 의해 10 배 적은 면역원이 제공되었다; 각각의 단백질 5 μg 및 총 2 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드로서, 모두 혼합되고, 명반에 보강됨. 위약 그룹은 명반에 보강된, 그룹 1 및 3과 동량의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 근육내로 제공되었다. 유도된 체액성 및 세포성 면역 반응을 측정하기 위해, 각각의 투여 시점 및 이로부터 1 개월 후에, 혈액을 수집하였다.

캡처 ELISA법에 의해, 각각의 바이러스 혈청형에 대한 반응성 항체의 검출을 측정하여, 이들 동물의 혈청의 한계 희석에 의한 역가를 측정하였다. 도 13은 원숭이에서, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드를 갖는 테트라-DIIIC 제형의 3회 투여 후, 생성된 항바이러스 항체 반응을 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 항원 투여 경로와 무관하게, 원숭이에서, 캡처 ELISA 시스템에서 4 가지 바이러스 혈청형을 인식할 수 있는 항체 반응이 유도되었다. 또한, 이러한 반응은 4 가지 DV에 대해 동종성 패턴을 나타내었고, 이것은 이러한 인간 병원균에 대한 백신의 개발을 위해 중요한 단계로서, 균형적 면역 반응이 요구된다.

바이러스 균주 Jamaica DV1, SB8553 DV2, Nicaragua DV3 및 Dominica DV4를 사용하여, VERO 세포에서, 플레이트 환원 중화 테스트 (plate reduction neutralization test, PRNT)를 이용하여, 중화 항체의 측정을 수행하였다. 제3 면역화 후 얻어진 값이 표 5에 나타낸다.

제형 테트라 DIIIC에 의해 면역화된 모든 동물에서, 항원 투여 경로와 무관하게, 시험관 내에서 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 항체 반응이 발생되었다. 4가지 혈청형 모두에 대해 반응하는 동물의 100%에서 중화 항체 반응의 발생은 현재 뎅기에 대한 백신 개발의 전제이다. 위약 그룹에서, 중화 역가는 면역화된 모든 동물에서 20보다 낮았다.

세포성 면역 반응은 측정된 파라미터 중 하나이다. 각각의 재조합 단백질 DIIIC에 의해 PBMC를 자극하고, IFN-γ 생성 세포 빈도를 ELISPOT 분석에 의해 측정하였다. 도 14는 얻어진 값들을 나타낸다. 4가 제형 테트라-DIIIC의 3 회 용량 투여 후, 동물에서, 재조합 단백질에 의한 자극에 대해, 항바이러스 사이토킨을 분비할 수 있는 세포가 생성되었고, 그 반응은 근육내로 면역화된 동물의 경우 보다 상대적으로 더욱 컸다. 평가된 모든 그룹에서, 동물 100%가 시험된 4 가지 단백질에 대해 반응하였다.

실시예 6. 주요-부스터 계획에서, 단백질 DIIIC 및 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 2가 및 4가 제형을 조합 투여한 마우스에서의 면역학적 평가

동일한 면역화 계획에서 각각의 단백질 제형 DIIIC의 2 회 투여만을 제공하기 위해, 하기 실험 설계를 수행하였다:

순차 그룹 I 투여 1: 2가 제형 DIIIC-1/DIIIC-2

투여 2: 2가 제형 DIIIC-3/DIIIC-4

투여 3: 4가 제형 테트라 DIIIC

순차 그룹 II 투여 1: 2가 제형 DIIIC-1/DIIIC-3

투여 2: 2가 제형 DIIIC-2/DIIIC-4

투여 3: 2가 제형 테트라 DIIIC

그룹 테트라 DIIIC: 4가 제형 테트라 DIIIC의 전체 투여

2가 및 4가 제형을 생성하기 위해, 사전에 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드에 의해 응집된 키메라 단백질 DIIIC를 혼합하였다. 면역원에는 2가 제형마다 각 단백질 20 μg 및 4 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 4가 제형에서 단백질의 양은 각각 20 μg 및 총 8 μg의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드이었다. 모든 변이체는 아쥬반트로서 명반에 제형화되었고, 매 15일 마다 복강내로 투여되었다. 양성 대조군으로서, 4가 제형 테트라-DIIIC만이 제공된 그룹이 이용되었고, 음성 대조군으로서 위약 그룹이 이용되었다.

제3 투여 후, 캡처 ELISA법에 의해, 각 바이러스에 반응성인 항체의 검출을 측정하였고 (도 15), 이를 통해, 이들 동물의 혈청의 한계 역가에 의한 역가를 측정하였다. 그 결과, 4가지 바이러스 혈청형 모두에서, 시험된 그룹 간의 통계적 유의차는 존재하지 않았으며, 이는, 2가 제형의 순차 투여 및 4가 테트라-DIIIC에 의한 부스터를 통해, 4가 제형의 3 회 용량 투여와 동일한 수준의 면역원성을 얻을 수 있다는 것을 시사한다.

그 외에, 세포성 면역 반응을 측정하였다. 최종 투여 후 30일째에, 본 연구의 각 그룹의 면역화된 동물의 지라세포를 추출하고, 4가지 재조합 단백질에 의한 자극 후, 지라세포의 배양 상청액에서 IFN-γ의 분비를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 위약 제형이 접종된 마우스의 지라세포가 사용되었다. 얻어진 결과는 도 16에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 모든 그룹 (위약의 경우 제외)에서, 4 가지 재조합 단백질에 의한 자극 후, 높은 수준의 IFN-γ이 검출되었고, 이는, 처음 2 회 투여에서 투여된 2가 제형 및 사용된 면역화 계획과 상관없이, 동일한 세포성 반응이 얻어졌다는 것을 시사한다.

<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> VACCINE COMPOSITION AGAINST DENGUE VIRUS <130> Dengue-tetravalent <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mix Oligonucleotide <400> 1 atcgactctc gagcgttctc gggggacgat cgtcggggg 39 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide K3 <400> 2 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide 2216 <400> 3 gggggacgat cgtcggggg 19 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctg 39 <210> 5 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein DIIIC-1 <400> 5 Met Gly His His His His His His Gly Ser Arg Leu Lys Met Asp Lys 1 5 10 15 Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys 20 25 30 Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln 35 40 45 Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys 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Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro 85 90 95 Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu 100 105 110 Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gl y Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu 115 120 125 Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala 130 135 140 Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Gly Ser Asn Gln Arg Lys Lys Val 145 150 155 160 Val Arg Pro Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser 165 170 175 Thr Pro Gln Gly Leu Val Lys Arg Phe Ser Thr Gly Leu Phe Ser Gly 180 185 190 Lys Gly Pro Leu Arg Met Val Leu Ala Phe Ile Thr Phe Leu Arg Val 195 200 205 Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp Gly Gln Leu 210 215 220 Lys Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ile Leu Ile Gly Phe Arg Lys Glu Ile 225 230 235 240 Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Gly Arg Lys Arg 245 250