栉孔扇贝的雌核发育诱导方法 |
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| 申请号 | CN201510984966.8 | 申请日 | 2015-12-25 | 公开(公告)号 | CN106916808A | 公开(公告)日 | 2017-07-04 |
| 申请人 | 青岛清泉生物科技有限公司; | 发明人 | 褚方强; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种栉孔扇贝的雌核发育诱导方法，采用 电刺激 法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取1ml卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理；所述电刺激缓冲液为甘露醇缓冲液，具体成分为：0.05mmol/L CaCl2，0.1mmol/L MgCl2，0.5mmol/L Hepes，1%BSA，0.35mmol/L甘露醇；所述电脉冲仪参数为场强1.25kv/cm，电容3µF，1次电脉冲。所述电刺激时的卵子 密度 为3.75×104个/ml。本发明的方法简单有效，经电刺激诱导后，栉孔扇贝的卵裂率可达到28%以上，胚胎存活率可达到98%以上。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种栉孔扇贝的雌核发育诱导方法，其特征在于，采用电刺激法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡 2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取 1ml 卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理； |
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| 说明书全文 | 栉孔扇贝的雌核发育诱导方法[0001] 技术领域背景技术[0003] 人工诱导雌核发育有利于快速建立纯系，因此对于遗传育种及基础生物学的研究具有重要意义。在海产经济贝类方面，该领域的研究相对滞后，目前仅在近十种海洋经济贝类中进行了人工诱导雌核发育的研究。这些研究主要是通过使用各种辐射或化学方法灭活精子，从而诱导卵子的雌核发育。研究中常用的同源精子灭活法难以排除外源精子基因组的干扰，所以近年来有学者尝试采用异源精子诱导来消除这种干扰，如在栉孔扇贝和盘鲍等贝类中的研究。然而，异源精子诱导依赖于物种的特异性，且受多种环境因素的影响，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激动也往往不同步，而且如果灭活不充分的话，其实仍有精子污染的问题，因此限制了其在雌核发育中的应用。 [0004] 与传统的同源或异源精子诱导法相比，电刺激诱导法在整个过程中不需要精子的参与，能彻底排除外源精子基因组的干扰，是理想的诱导方法。该方法已在兔、猪、鼠和牛等哺乳动物中被广泛应用并取得了很大的成功。其机制是采用电刺激的方式，使卵母细胞膜上形成可逆微孔，缓冲液中的钙离子顺细胞内外的浓度梯度而进入卵胞质，引发钙库释放钙离子或者胞质钙离子的迅速转移，从而模拟正常受精时钙离子规律性的波动现象启动卵子发育。但迄今为止，该方法在海洋生物雌核发育研究中，尚无报道。本研究首次尝试采用电刺激法诱导栉孔扇贝雌核发育，对其诱导参数及雌核发育过程中的细胞学机制进行初步探索，旨在建立电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的技术方法。 发明内容[0005] 针对上述问题，本发明旨在建立电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的技术方法。 [0006] 一种栉孔扇贝的雌核发育诱导方法，采用电刺激法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡 2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取 1ml 卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理；所述电刺激缓冲液为甘露醇缓冲液，具体成分为：0.05 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L Hepes，1%BSA，0.35 mmol/L甘露醇； 所述电脉冲仪参数为场强1.25 kv/cm，电容3 µF，1次电脉冲。 [0007] 所述电刺激时的卵子密度为3.75×104个/ml。 [0008] 电刺激后卵子及胚胎的培养方法为：经电刺激后的卵子被放入直径 15 cm 培养皿中，用高温蒸煮的过滤海水培养，水温保持 20℃，培养密度为每个培养皿中每升约 2×105个卵子；培养初期每半小时轻轻搅动海水一次，以后每 3~4h 搅动一次，以促进其孵化。 [0009] 电刺激处理后 2 小时统计各组的卵裂率，24 小时统计胚胎存活率；卵裂率或雌核发育诱导率=发生卵裂和排放极体的卵数/观察总卵数×100%； 胚胎存活率=上浮的原肠胚数量/发生卵裂的总卵数×100%。 [0010] 本发明的方法简单有效，经电刺激诱导后，栉孔扇贝的卵裂率可达到28%以上，胚胎存活率可达到98%以上。 具体实施方式[0011] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 [0012] 亲本的暂养与精卵的收集栉孔扇贝取回后洗刷干净，暂养于14℃循环海水中，雌雄个体分开暂养。投喂饵料。暂养期间每天升温1℃，至16~17℃恒温待产。采用阴干升温法催产获得卵子，具体操作如下： 挑选性腺饱满的成熟雌贝，洗刷干净后阴干 50min，然后将其放入水桶中，在 20℃海水中催产。待卵子产出后，先用 300 目筛绢过滤卵子，然后用 500 目的筛绢过滤收集卵子，稀释后显微镜下观察定量卵子的密度。根据实验需要调整卵子的密度。采用同样的方法催产雄贝，获得精子，精卵受精时，调节好精卵的比例。 [0013] 栉孔扇贝卵子的电刺激处理卵子雌核发育的诱导：采用电刺激法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡 2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取 1ml 卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理。 [0014] 所述电刺激缓冲液为甘露醇缓冲液，具体成分为：0.05 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L Hepes，1%BSA，0.35 mmol/L甘露醇。 [0015] 所述电脉冲仪参数为场强1.25 kv/cm，电容3µF，1 次电脉冲。 [0016] 所述电刺激时的卵子密度为3.75×104个/ml。 [0017] 电刺激后卵子及胚胎的培养经电刺激后的卵子被放入直径 15 cm 培养皿中，用高温蒸煮的过滤海水培养，水温保持 20℃，培养密度为每个培养皿中每升约 2×105个卵子；培养初期每半小时轻轻搅动海水一次，以后每 3~4h 搅动一次，以促进其孵化。 [0018] 电刺激处理后 2 小时统计各组的卵裂率，24 小时统计胚胎存活率。 [0019] 卵裂率或雌核发育诱导率=发生卵裂和排放极体的卵数/观察总卵数×100%胚胎存活率=上浮的原肠胚数量/发生卵裂的总卵数×100%经统计，上述电刺激诱导后，栉孔扇贝的卵裂率为 28.51%，胚胎存活率为98.11%。 |
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